CN104586911B - 含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物，该组合物为注射用组合物，该组合物按照重量计含有咖啡酸酯45-95％、灯盏花乙素5-25％；本发明还提供了该组合物在制备治疗心脑血管疾病中的应用。

Description

含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域的药用制剂，具体是一种含有特殊工艺制得的注射用组合物的配方及制备工艺和应用。

背景技术

缺血性心脑血管疾病如中风、冠心病是人类死亡的主要原因，急性发作致死率极高，存活者多会不同程度留下偏瘫、失语、口眼歪斜、视力模糊或者频发心绞痛、心律失常，降低生活质量，给病人及家属带来沉重的身心和经济负担。据统计，我国约有4000万患者，随着人口老龄化发展，发病人群还在快速增长，每年新发病人数高达450万。开发此类预防治疗药物是世界新药研究的热点。心脑缺血后影响能量代谢，继发乳酸堆积、钙超载、自由基损伤等多种变化。多靶点逆转或改善这些变化，提高综合治疗效是药物治疗的重要目标。病毒性肝炎也是一种严重危害人类健康的传染性疾病，其流行范围之光、发病率之高、传染性之强是其它疾病所不能比拟的，目前尚缺乏真正有效的治疗药物。植物药化学组成具多样性特征，结构各异的有效成分通过作用于不同靶点或病理环节联合奏效，常发挥明显的协同效应。从历史悠久的中草药或民族药开发新药有其独特优势。本发明的目的即是通过对云南苗族植物药灯盏细辛(灯盏花)(Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.–Mazz)的研究为上述疾病的预防和治疗提供一种成分明确、质量可控、安全有效的药用组合物及其制剂。

灯盏花为菊科飞蓬属草本植物，主要分布于云南省，民间广泛用于治疗中风后遗症、风湿病、胸痹等症，取得了较好效果。早在1976年云南学者即开始对灯盏花的化学成分进行研究，分离鉴定了灯盏花乙素(即野黄芩苷，scutellarin)、焦袂康酸、飞蓬甙等成分，其中灯盏花乙素经药理筛选被证明是治疗中风的有效成分，在此基础上研制成功以灯盏花素为原料(黄酮类有效部位，主成分为野黄芩甙)约占90％的药品“灯盏花素片”，后来一些厂家又开发了“灯盏花素注射液”和“注射用灯盏花素”。与灯盏花素相关的专利有CN1053609、CN10595934、CN1133180、CN1252277、CN1228959、CN1191730、CN1187356等，涉灯盏花素原料提取及口服、注射制剂的制备工艺。但，对灯盏花化学成分的认识还远未充分。

目前，我国已有该品种的小容量注射剂在生产，生产厂家很少，主要是受制于原料及制剂工艺的不完善，经常出现例如制剂不稳定，有关物质超标、不符合注射制剂的相关要求等一系列的问题。

发明内容

本发明目的是寻找一种合理有效的咖啡酸酯和灯盏花乙素的注射剂配方及工艺以克服现有的该制剂存在的问题，期望生产一种质量稳定可控的小容量注射用制剂，尤其是水针剂型。

本发明的配方的有效成分由咖啡酸酯和灯盏花乙素组成。

本发明提供了一种含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物，该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1～19:1；以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，在这些干物质中(即10ml注射液含有的干物质)，咖啡酸酯为8-18.5mg，灯盏花甲素为0.2-1.5mg，灯盏花乙素4-6mg，总黄酮4.2-7.5mg；该咖啡酸酯中的二咖啡酸酯含量为7.0-15mg。

本发明上述的药用组合物，其中，该组合物含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1～5.5:1。

进一步地，本发明提供了一种含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物，其中咖啡酸酯中的二咖啡酸酯包括3,4-O-二咖啡酰奎宁酸，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，4,5-O二-咖啡酰奎宁酸，飞蓬酯乙及灯盏细辛酯。

上述药用组合物，该组合物以10ml注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg；二咖啡酸酯含量为7.2-14.0mg；其中，该二咖啡酸酯中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg，4,5-O二-咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg，飞蓬酯乙1-2.6mg，灯盏细辛酯2.2-5.1mg。

本发明的含有灯盏花乙素和咖啡酰奎宁酸注射用组合物制剂，解决了业内存在多年的由于灯盏细辛中有效成分不稳定而导致的制剂澄明度等一系列问题，尤其解决了由于单咖啡酸酯附近的杂质导致的澄明度低以及制剂颜色深等问题，在组合物中去除了水溶性杂质时也去除了焦袂康酸，达到更精准地除去杂质的目的。

本发明上述的药用组合物具有如下的指纹图谱：

色谱条件为：色谱柱是十八烷基硅烷为填料，采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱程序如下：

0分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

15分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

45分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

55分钟时，0％流动相A,55％流动相B,45％流动相C；

65分钟时，0％流动相A,15％流动相B,85％流动相C；

65.1分钟时，5％流动相A,92％流动相B，3％流动相C；

80分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

其中，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液，C为乙腈溶液，

检测条件为：流速1.0mL/min，检测波长335nm，柱温30℃；

在上述条件下，得到该药用组合物的指纹图谱，该指纹图谱的特征在于：所述组合物的有效成分具有如下保留时间：灯盏花乙素27.5-29.5min，3,4-O-二咖啡酰奎宁酸30.0-32.0min，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸32.0-34.0min，飞蓬酯乙37.5-40.5min，灯盏花甲素42.5-46.0min，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸44.5-48.0min，灯盏细辛酯48.0-51.5min。

具体地说，本发明的上述药用组合物具有如图1所示的指纹图谱。

本发明还提供了上述的药用组合物的制备方法，该方法为：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏；取清膏调节pH直至溶解，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～5，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，控制pH值反复多次溶解、沉淀以除去杂质，得到干膏粉为灯盏花乙素，控制灯盏花乙素的纯度50-95％；

取滤液，过聚酰胺柱，用水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％浓度乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，用水溶解性≤80g/L(20℃)有机溶剂萃取，收集有机溶剂提取液，回收有机溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯；

上述灯盏花乙素与咖啡酸酯浸膏加入注射用水，调节pH7～9，滤过，滤液备用；另取氯化钠加注射用水煮沸滤过，与上述备用滤液合并，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

在本发明优选实施例中，该方法优选为：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75℃下相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％～95％的乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％～95％浓度的乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用有机溶剂萃取，收集有机溶剂提取液，回收溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯；

上述干膏粉与咖啡酸酯浸膏加入注射用水，调节pH7～9，滤过，滤液备用；另取氯化钠加注射用水煮沸滤过，与上述备用滤液合并，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

在本发明优选实施例中，该方法优选为：

取灯盏细辛以800g计，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％乙醇洗脱，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45℃下相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；上述干膏粉和咖啡酸酯加注射用水，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

在本发明另一优选实施例中，该方法优选为：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75℃下相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7～12，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～5，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％以上的高浓度乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，再加碱溶液调pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％以上的高浓度乙醇洗涤，干燥，得到的干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用至少2倍量的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，得到的清膏为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用碱溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取适量的氯化钠、活性炭，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物，该组合物为注射用制剂。

在本发明又一优选实施例中，该方法优选为：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸溶液调节pH小于1～2，滤过，沉淀用浓度90％～95％的乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用浓度90％～95％浓度的乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用2-10倍量的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取适量的氯化钠、活性炭，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的注射用组合物。

在本发明最优选实施例中，该方法优选为：

取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，得干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40％乙醇、2倍量70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液、70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，加5％氢氧化钠溶液，调节pH7.5～8.5，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层用10％盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

即，本发明提供了一种含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物，该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1～19:1；以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，在这些干物质中(即10ml注射液含有的干物质)，咖啡酸酯为8-18.5mg，灯盏花甲素为0.2-1.5mg，灯盏花乙素4-6mg，总黄酮4.2-7.5mg；该咖啡酸酯中的二咖啡酸酯含量为7.0-15mg；

其中，该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏；取清膏调节pH直至溶解，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～5，滤过，得滤液和沉淀；上述清膏调节pH7～12至溶解；

取沉淀，控制pH值多次(至少两次)溶解、沉淀以除去杂质，得到干膏粉为灯盏花乙素，控制灯盏花乙素的纯度50-95％；

取滤液，过聚酰胺柱，用水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％浓度乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，用水溶解性≤80g/L(20℃)有机溶剂萃取，收集有机溶剂提取液，回收有机溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯；上述20℃下水溶解性≤80g/L的有机溶剂主要是正丁醇或乙酸乙酯；

上述干膏粉与咖啡酸酯浸膏加入注射用水，调节pH7～9，滤过，滤液备用；另取氯化钠加注射用水煮沸滤过，与上述备用滤液合并，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

进一步地，本发明提供了一种含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物，该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1～19:1；以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，在这些干物质中(10ml注射液中含有的干物质)，咖啡酸酯8-18.5mg，灯盏花甲素0.2-1.5mg，灯盏花乙素4-6mg，总黄酮4.2-7.5mg；该咖啡酸酯中的二咖啡酸酯含量为7.0-15mg；其中二咖啡酸酯包括3,4-O-二咖啡酰奎宁酸，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，4,5-O二-咖啡酰奎宁酸，飞蓬酯乙及灯盏细辛酯；

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛原药材(例如全草或者地上植株)，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7～12，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～5，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱(溶液)调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％以上的高浓度乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，再加碱(溶液)调pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％以上的高浓度乙醇洗涤，干燥，得到的干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用至少2倍量的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30(45℃)的清膏，得到清膏为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用碱溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取适量的氯化钠、活性炭，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

该适量的氯化钠、活性炭的“适量”是指本领域普通技术人员制备注射剂所需的常规量。

上述的碱液优选氢氧化钠，更优选5％的氢氧化钠。

本发明的特殊工艺制得的灯盏花乙素和咖啡酰奎宁酸注射用组合物制剂，解决了业内存在多年的由于灯盏细辛中有效成分不稳定而导致的制剂澄明度等一系列问题，尤其解决了由于单咖啡酸酯附近的杂质导致的澄明度低以及制剂颜色深等问题，以控制了二咖啡酸酯的含量为基础，精细化纯化过程，通过去除了水溶性杂质时也去除了焦袂康酸，以控制柱层析酒精度而除去脂溶性成分，再以乙酸乙酯等萃取精制过程达到进一步除去杂质的目的。这是业内一直无法解决的难题，也是困扰灯盏细辛注射液多年的疑难问题。

本发明的发明人通过深入系统的提取分离精制纯化，以及相对应的用理化试验和指纹图谱鉴定试验，发现其中含量更高的二咖啡酸酯是重要活性成分，具有明显的抗氧化、抑制胆固醇合成、降低血清甘油三酯浓度、抑制15-脂氧酶、舒张平滑肌、抗血小板聚集、抑制组胺释放等活性，而且对乙肝病毒也有显著抑制作用。但是这类成分包括多种单、二咖啡酰奎宁酸化合物，其中与单咖啡酸酯极性相近的水溶性成分实验证明属于杂质，并且长期试验证明与单咖啡酸酯极性相近的物质含量直接影响药液澄明度。本发明的发明人还确定了二咖啡酸酯的组成为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，4,5-O二-咖啡酰奎宁酸，飞蓬酯乙及灯盏细辛酯。根据国家食品药品监督管理总局2007年12月6日发布的《关于印发中药、天然药物注射剂基本技术要求的通知》中第(四)项质量研究中第2项要求：“注射剂中所含成分应基本清楚。应对注射剂总固体中所含成分进行系统的化学研究。有效成分制成的注射剂，其单一成分的含量应不少于90％；多成分制成的注射剂，总固体中结构明确成分的含量应不少于60％。”基于上述要求，本专利申请人首次将灯盏细辛注射液这一多成分注射剂的固体物质化学结构阐明，并将其含量范围做了限定，以高效液相指纹图谱对其中12个成分含量加以控制，基于灯盏花乙素及甲素为入药的活性黄酮类成分，二咖啡酸酯类成分(3,4-O-二咖啡酰奎宁酸，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，4,5-O二-咖啡酰奎宁酸，飞蓬酯乙及灯盏细辛酯)入药的活性成分，更着重对这7个物质加以控制含量。

本发明的目的是最大限度去除与单咖啡酸酯极性相近(指在高效液相图谱上出峰时间相近的)的杂质同时最大限度保留二咖啡酸酯成分，使得注射液的有效成分更精纯以及更精准。

本发明提供的如上所述的工艺得到的灯盏花乙素和咖啡酸酯，在满足灯盏花乙素的纯度以及二咖啡酸酯的纯度达到的同时，利用聚酰胺柱梯度洗脱，最大限度地除去了水溶性杂质，除去了极性大和极性小的有关物质，与同类文献提供的提取精制方法所得到的提纯物质相比，具备上述优点的同时，还除去了灯盏细辛注射液中不希望含有的焦袂康酸等难以去除的杂质，这是现有技术所难以企及的高收率+高纯度的技术和高度。

本发明的组合物以10ml注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg(平均值12.5mg)；二咖啡酸酯含量为7.2-14.0mg(平均值10.6mg)；其中，该二咖啡酸酯中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O二-咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。

即，本发明意在提供一种含有符合注射剂要求纯度的灯盏花乙素和咖啡酸酯，且不含有焦袂康酸的组合物，该组合物为注射用组合物制剂。

优选地，本发明提供了一种药用组合物，其中，该组合物为含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的注射用制剂；

所述灯盏花乙素、咖啡酸酯是由以下步骤制得的：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～4，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH小于1～3，滤过，沉淀用浓度90％以上的高浓度乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加碱溶液调pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～3，滤过，沉淀用浓度90％～98％(优选90％～95％)浓度乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用2-10倍量的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次(也可以大于3次，成本考虑1～3次为优选)，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取1～2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30(45℃)的清膏，即为咖啡酸酯。

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用碱溶液例如5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取适量的氯化钠、活性炭，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得本发明的注射用组合物。

在上述工艺中，提取灯盏乙素和咖啡酸酯，关键步骤在于调节pH值，是一个反复除杂精制的过程，水煮后加碱调节pH7.5～9，目的是为了灯盏乙素形成盐并以盐的形式转移至水溶液中，实验证明，pH7.5～9时，尤其是pH7.5～8.5时，转移率最高；再用稀酸把灯盏花乙素沉淀出来，实验证明，加硫酸或盐酸溶液调节pH2～4，优选为2～3时，优选硫酸，沉淀最彻底，分析是因为形成强酸弱碱盐转移且在溶液中比较稳定。

进一步的精制灯盏花乙素的过程，关键步骤也在于pH值的选择，加碱溶解，加酸沉淀，尤其在加硫酸或盐酸溶液调节pH小于1～3优选2～3，沉淀的非常完全，沉淀用高浓度乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，再加碱溶液调pH5～6，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～3，优选pH1～2得到的灯盏乙素，纯度完全达到此制剂要求；特别是，第一次加酸是硫酸，第二次加酸是加盐酸，去除灯盏花乙素中不同类型的杂质，使得成品灯盏乙素真正达到符合注射剂的要求并且适合工业化生产，纯度高，得率高，这是本发明的创新点之一。

在精制纯化咖啡酸酯的过程中，关键技术在于聚酰胺柱。同类产品中某专利技术是过大孔吸附树脂，在注射液中，大孔吸附树脂残留一直是难以解决的难题，这也是该项技术的拥有者没能成功得到灯盏细辛产品新药批件的原因之一。本发明经过一次上柱，梯度洗脱，尤其是设定了依次用2-10倍量(优选3～5倍量)的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液，以及70％乙醇洗脱的洗脱液，即，当流出的洗脱液是40％乙醇洗脱出来的溶液即为本发明予以收集保留的有效部位溶液，直至用70％乙醇洗脱，收集40％～70％梯度段的洗脱液，该洗脱液中含有的咖啡酸酯既去除了其他水溶性大分子杂质以及极性小的杂质，还去除了有肝毒副作用的焦袂康酸，尤其是在灯盏细辛提取物中去除焦袂康酸，这是本领域技术至今没有企及的，本发明取得了二咖啡酸酯在咖啡酸酯浸膏中纯度达到60％以上，这是令人惊喜的结果，且完全阐明了在此制剂中的二咖啡酸酯成分并且控制了干物质含量，也是至今为止所有的公开技术以及本领域技术人员公知常识难以达到的效果，此为本发明的又一重要创新点。

在本发明的优选实施例中，提供了该组合物为以下方法制得：

取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40％乙醇、2倍量70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液、70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加5％氢氧化钠溶液，调节pH7.5～8.5，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层用10％盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30(45℃)的清膏，与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

本发明上述工艺得到的灯盏花乙素纯度完全达到此制剂要求，特别是，上述精制工艺第一次加酸加的是硫酸，第二次加酸加的是盐酸，实验证明确实能去除灯盏花乙素中不同类型的杂质，使得成品灯盏花乙素真正达到符合注射剂的要求并且适合工业化生产。

本发明的上述工艺，在提纯咖啡酸酯成分时，在梯度洗脱的条件下，第二次用乙酸乙酯萃取是收集乙酸乙酯层的步骤，即富集二咖啡酸酯，含在乙酸乙酯层溶液里，发明人发现，第二次用乙酸乙酯萃取，只有萃取2次，得到的咖啡酰奎宁酸最纯，萃取1次，乙酸乙酯层的杂质没有除净，而萃取3次或者3次以上，乙酸乙酯层竟然杂质又开始返回增多的趋势，无数次实验证明，在收集萃取液的第二次加乙酸乙酯萃取的过程，优选萃取2次，得到的有效咖啡酸酯纯度高、杂质少、得率高，创下咖啡酸酯精制史上的三高，这是意想不到的结果，也是具有非显而易见性，无法被本领域技术人员结合公知常识进行预知和推测，这是本发明的又一个创新点。

在本发明又一优选实施例中，该组合物由以下方法制得：

取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40％乙醇、2倍量70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液、70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加5％氢氧化钠溶液，调节pH7.5～8.5，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层用10％盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30(45℃)的清膏，与上述备用的干膏粉，分别加注射用水，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

以上均为重量百分比或者份数。其中，灯盏花乙素和咖啡酸酯为该组合物的主药，其余为辅料，所用主药和辅料均符合国家相关药品标准。

上述的药用组合物中，所述的辅料仅为氯化钠，干物质含量仅8～9克，是注射液的形式，在本发明的实施例中，规格是10ml小水针。因此，本发明选用对血管刺激小安全性高的氯化钠配成等渗溶液作为本发明注射用制剂的唯一辅料，起到了事半功倍的效果，此为本发明的创新点之一。

本发明的创新点之二是，建立了本发明上述药用组合物，即，含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的注射液剂型的指纹图谱，并完全阐明了二咖啡酸酯的所有成分，采用高效液相色谱进行用指纹图谱对灯盏细辛注射液的质量监控。

色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液，C为乙腈溶液；

梯度洗脱程序如下：

0分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

15分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

45分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

55分钟时，0％流动相A,55％流动相B,45％流动相C；

65分钟时，0％流动相A,15％流动相B,85％流动相C；

65.1分钟时，5％流动相A,92％流动相B，3％流动相C；

80分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C。

流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。

经过反复试验，确定了本发明含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的上述药用组合物注射液剂型的指纹图谱，在上述色谱条件下，该组合物有效成分中主要七种成分(组分)保留时间如下：

灯盏花乙素27.5-29.5min，3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸30.0-32.0min，3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸32.0-34.0min，飞蓬酯乙37.5-40.5min，灯盏花甲素42.5-46.0min，4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸44.5-48.0min，灯盏细辛酯48.0-51.5min。

在本发明的一个实施例中，色谱条件如上所述，得到的指纹图谱如图1所示。30批灯盏细辛注射液的共有指纹图谱。

其中，1是3-O-咖啡酰奎宁酸；2是绿原酸；3是4-O-咖啡酰奎宁酸；4是咖啡酸；5是灯盏花苷；6是野黄芩苷；7是3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸；8是3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；9是飞蓬酯乙；10是灯盏花甲素；11是4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；12是灯盏细辛酯。

因此，本发明还提供一种含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物，该组合物为注射用组合物，该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1～19:1；以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg；该干物质中，咖啡酸酯为8.0-18.5mg，灯盏花甲素为0.2-1.5mg，灯盏花乙素4-6mg，总黄酮4.2-7.5mg；该咖啡酸酯中的二咖啡酰奎宁酸含量为7.2-14.0mg；该组合物在色谱柱填料为十八烷基硅烷、流速1.0mL/min、检测波长335nm、柱温30℃的色谱条件下，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液，C为乙腈溶液；梯度洗脱步骤为，

0分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

15分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

45分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

55分钟时，0％流动相A,55％流动相B,45％流动相C；

65分钟时，0％流动相A,15％流动相B,85％流动相C；

65.1分钟时，5％流动相A,92％流动相B，3％流动相C；

80分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

该组合物有效成分中七种成分的保留时间为，野黄芩苷27.5-29.5min，3,4-O-二-咖啡酰奎宁酸30.0-32.0min，3,5-O-二-咖啡酰奎宁酸32.0-34.0min，飞蓬酯乙37.5-40.5min，灯盏花甲素42.5-46.0min，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸44.5-48.0min，灯盏细辛酯48.0-51.5min。

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏；取清膏调节pH直至溶解(pH7～12)，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～5，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，控制pH值反复溶解、沉淀以除去杂质，得到干膏粉为灯盏花乙素，控制灯盏花乙素的纯度50-95％；

取滤液，过聚酰胺柱，用水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％浓度乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，用水溶解性≤80g/L(20℃)有机溶剂(例如:正丁醇或乙酸乙酯)萃取，收集有机溶剂提取液，回收有机溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯；

上述干膏粉与咖啡酸酯浸膏加入注射用水，调节pH7～9，滤过，滤液备用；另取氯化钠加注射用水煮沸滤过，与上述备用滤液合并，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

上述的药用组合物，其中该组合物优选为含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比1.2:1～5.5:1的注射液。

上述的药用组合物，该组合物以10ml注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg(平均值12.5mg)；二咖啡酰奎宁酸7.2-14.0mg(平均值10.6mg)；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二-咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O-二-咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O-二-咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。

在本发明的优选实施例中，药用组合物的灯盏乙素、咖啡酸酯是由以下步骤制得的：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75℃下相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸溶液调节pH小于3(1-3)，滤过，沉淀用浓度90％～95％的乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加盐酸溶液调节pH小于3(1-3)，滤过，沉淀用浓度90％～95％浓度的乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2(例如2-10)倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％(例如40％、70％)乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH7～10，用水溶解性≤80g/L(20℃)有机溶剂(例如:正丁醇或乙酸乙酯)萃取，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用有机溶剂(优选乙酸乙酯)萃取，收集有机溶剂提取液，回收溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯(包括二咖啡酰奎宁酸、灯盏花甲素、飞蓬酯乙和灯盏细辛酯)；

上述干膏粉与咖啡酸酯浸膏加入注射用水，调节pH7～9，滤过，滤液备用；另取氯化钠加注射用水煮沸滤过，与上述备用滤液合并，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得。

本发明还提供了上述药用组合物的制备方法，其中，该方法包括：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7～12，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1～5，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱(溶液)调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％以上的高浓度乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，再加碱(溶液)调pH5～6，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％以上的高浓度乙醇洗涤，干燥，得到的干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用至少2倍量的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30(45℃)的清膏，得到清膏为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用碱溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取适量的氯化钠、活性炭，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物，该组合物为注射用制剂。

优选地，上述含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物的制备方法为：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75℃下相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸溶液调节pH小于1～2，滤过，沉淀用浓度90％～95％的乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用浓度90％～95％浓度的乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用2-10倍量的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45℃下相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取适量的氯化钠、活性炭，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的注射用组合物。

更优选地，本发明的含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物为注射剂，制备方法为：

取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，得干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40％乙醇、2倍量70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液、70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加5％氢氧化钠溶液，调节pH7.5～8.5，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层用10％盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30(45℃)的清膏，为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

本发明的含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物(也称“灯盏细辛注射液”)参与了“中药注射剂上市后安全性检测登记注册式研究”项目，是第一批进行安全性评价的中药注射剂，现已完成28975例临床研究，不良反应例数仅19例，且无严重不良反应，不良反应率为0.06％。本领域技术人员均知晓，中药注射液不良反应率在0.1-0.01％之间为罕见，低于0.01％为非常罕见，本发明的产品不良反应发生率是0.06％，验证了本发明的灯盏花乙素和咖啡酰奎宁酸注射用组合物制剂确实解决了业内存在多年的质量问题，达到进一步除去杂质降低不良反应率的目的，这是业内一直无法解决的难题，也是困扰灯盏细辛注射液多年的疑难问题。

本发明属医药领域，涉及一种含咖啡酰奎宁酸和灯盏花乙素的药物组合物及其制备方法和在预防、治疗各种缺血性心脑血管病、老年痴呆、高血脂、病毒性肝炎方面的用途。

本发明尤其提供了上述药用组合物在制备治疗心脑血管疾病中的应用。

附图说明

图1：本发明组合物所得到的指纹图谱；

其中，1是3-O-咖啡酰奎宁酸；2是绿原酸(5-O-咖啡酰奎宁酸)；3是4-O-咖啡酰奎宁酸；4是咖啡酸；5是灯盏花苷；6是野黄芩苷；7是3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸；8是3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；9是飞蓬酯乙；10是灯盏花甲素；11是4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；12是灯盏细辛酯。

具体实施方案

实施例1.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为水针剂型。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1～19:1(1.2:1～5.5:1)；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg(平均值12.5mg)；二咖啡酰奎宁酸7.2-14.0mg(平均值10.6mg)；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛以800g计，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2(例如2-10)倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％(例如40％、70％)乙醇洗脱，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45℃下相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；

上述干膏粉和咖啡酸酯加注射用水，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

实施例2.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为5.5:1；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg(平均值12.5mg)；二咖啡酰奎宁酸7.2-14.0mg(平均值10.6mg)；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O二-咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛以800g计，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2(例如2-10)倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％(例如40％、70％)乙醇洗脱，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45℃下相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；上述干膏粉和咖啡酸酯加注射用水，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例3.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg(平均值12.5mg)；二咖啡酰奎宁酸7.2-14.0mg(平均值10.6mg)；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛以800g计，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2(例如2-10)倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％(例如40％、70％)乙醇洗脱，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45℃下相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；上述干膏粉和咖啡酸酯加注射用水，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例4.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为3.5:1；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg(平均值12.5mg)；二咖啡酰奎宁酸7.2-14.0mg(平均值10.6mg)；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛以800g计，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用2倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％(例如40％、70％)乙醇洗脱，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45℃下相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；上述干膏粉和咖啡酸酯加注射用水，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例5.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为7.5:1；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg(平均值12.5mg)；二咖啡酰奎宁酸7.2-14.0mg(平均值10.6mg)；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛以800g计，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2(例如2-10)倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％(例如40％、70％)乙醇洗脱，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45℃下相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；上述干膏粉和咖啡酸酯加注射用水，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例6.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为19:1；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为145mg；

该干物质中，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为20.0mg，二咖啡酰奎宁14mg；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为2.3mg，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.4mg,4,5-O-二咖啡酰奎宁酸2.6mg，飞蓬酯乙2.6mg，灯盏细辛酯5.1mg；

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由以下步骤制得：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75℃下相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸溶液调节pH小于3(1-3)，滤过，沉淀用浓度90％～95％的乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加盐酸溶液调节pH小于3(1-3)，滤过，沉淀用浓度90％～95％浓度的乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2(例如2-10)倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％(例如40％、70％)乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH7～10，用水溶解性≤80g/L(20℃)有机溶剂(例如:正丁醇或乙酸乙酯)萃取，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用有机溶剂(优选乙酸乙酯)萃取，收集有机溶剂提取液，回收溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯(包括二咖啡酰奎宁酸、灯盏花甲素、飞蓬酯乙和灯盏细辛酯)；

上述干膏粉与咖啡酸酯浸膏加入注射用水，调节pH7～9，滤过，滤液备用；另取氯化钠加注射用水煮沸滤过，与上述备用滤液合并，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

实施例7.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为上述实施例1～6任一的比例；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg；

该干物质中，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为12.5mg，二咖啡酰奎宁酸10.6mg；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg(平均值1.873mg)，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg(平均值1.063mg)，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg(平均值2.079mg)，飞蓬酯乙1-2.6mg(平均值1.828mg)，灯盏细辛酯2.2-5.1mg(平均值3.619mg)。

该组合物在色谱柱填料为十八烷基硅烷、流速1.0mL/min、检测波长335nm、柱温30℃的色谱条件下，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液，C为乙腈溶液；梯度洗脱步骤为，

0分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

15分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

45分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

55分钟时，0％流动相A,55％流动相B,45％流动相C；

65分钟时，0％流动相A,15％流动相B,85％流动相C；

65.1分钟时，5％流动相A,92％流动相B，3％流动相C；

80分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

该组合物有效成分中七种成分的保留时间为，野黄芩苷27.5-29.5min，3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸30.0-32.0min，3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸32.0-34.0min，飞蓬酯乙37.5-40.5min，灯盏花甲素42.5-46.0min，4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸44.5-48.0min，灯盏细辛酯48.0-51.5min；

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由实施例1～6的任一制备方法步骤制得。

实施例8.

一种含有咖啡酸酯和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为3.5:1；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg；

该干物质中，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为12.5mg；二咖啡酰奎宁酸10.6mg；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.873mg，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.063mg，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸2.079mg，飞蓬酯乙1.828mg，灯盏细辛酯3.619mg。

该组合物在色谱柱填料为十八烷基硅烷、流速1.0mL/min、检测波长335nm、柱温30℃的色谱条件下，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液，C为乙腈溶液；梯度洗脱步骤为，

0分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

15分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

45分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

55分钟时，0％流动相A,55％流动相B,45％流动相C；

65分钟时，0％流动相A,15％流动相B,85％流动相C；

65.1分钟时，5％流动相A,92％流动相B，3％流动相C；

80分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

该组合物的指纹图谱参见图1，其中，该组合物有效成分中七种成分的保留时间为：野黄芩苷27.5-29.5min，优选28min；3,4-O-二咖啡酰奎宁酸30.0-32.0min，优选31min；3,5-O-二咖啡酰奎宁酸32.0-34.0min，优选33min；飞蓬酯乙37.5-40.5min，优选39min；灯盏花甲素44-44.5min，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸45-46min，灯盏细辛酯49-50min；

该咖啡酸酯和灯盏花乙素由实施例1～6的任一制备方法步骤制得。

实施例9.

一种含有咖啡酸和灯盏乙素的药用组合物，该组合物为注射液。

该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为3.5:1；

以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg；

该干物质中，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为12.5mg；二咖啡酰奎宁酸10.6mg；其中，该二咖啡酰奎宁酸中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.873mg，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸1.063mg，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸2.079mg，飞蓬酯乙1.828mg，灯盏细辛酯3.619mg。

该组合物在色谱柱填料为十八烷基硅烷、流速1.0mL/min、检测波长335nm、柱温30℃的色谱条件下，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液，C为乙腈溶液；梯度洗脱步骤为，

0分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

15分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

45分钟时，15％流动相A,73.5％流动相B,11.5％流动相C；

55分钟时，0％流动相A,55％流动相B,45％流动相C；

65分钟时，0％流动相A,15％流动相B,85％流动相C；

65.1分钟时，5％流动相A,92％流动相B，3％流动相C；

80分钟时，5％流动相A,92％流动相B,3％流动相C；

该组合物指纹图谱参见图1，其中，该组合物有效成分中七种成分保留时间约为：野黄芩苷28min；3,4-O-二咖啡酰奎宁酸31min；3,5-O-二咖啡酰奎宁酸33min；飞蓬酯乙39min；灯盏花甲素44-44.5min，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸45-46min，灯盏细辛酯49-50min；

该组合物的制备方法如下：

取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(75℃)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，干膏粉备用；取滤液，通过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40％乙醇、2倍量70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液、70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(70℃)的清膏，加5％氢氧化钠溶液，调节pH7.5～8.5，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层用10％盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30(45℃)的清膏，与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用5％氢氧化钠调节PH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

以上旨在进一步说明本发明，并不对本发明的范围加以限制。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (8)

1.一种含有咖啡酸酯和灯盏花乙素的药用组合物，该组合物以灯盏细辛为原料药，制备为注射用组合物，该组合物中含有的咖啡酸酯和灯盏花乙素的重量比为1.2:1～5.5:1；以10ml的注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，在这些干物质中，咖啡酸酯为8-18.5mg，灯盏花甲素为0.2-1.5mg，灯盏花乙素4-6mg，总黄酮4.2-7.5mg；该咖啡酸酯中的二咖啡酸酯含量为7.0-15mg。

2.如权利要求1所述的药用组合物，该组合物以10ml注射液为计量单位，其中干物质含量为115-145mg，总咖啡酸酯和灯盏花甲素的干物质含量为8.2-20.0mg；二咖啡酸酯含量为7.2-14.0mg；其中，该二咖啡酸酯中的3,4-O-二咖啡酰奎宁酸含量为1.4-2.3mg，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.8-1.4mg，4,5-O二-咖啡酰奎宁酸1.5-2.6mg，飞蓬酯乙1-2.6mg，灯盏细辛酯2.2-5.1mg。

3.如权利要求2所述的药用组合物，该组合物具有如下的指纹图谱：

色谱柱为十八烷基硅烷为填料，采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱程序如下，

0分钟时，5％流动相A，92％流动相B，3％流动相C；

15分钟时，15％流动相A，73.5％流动相B，11.5％流动相C；

45分钟时，15％流动相A，73.5％流动相B，11.5％流动相C；

55分钟时，0％流动相A，55％流动相B，45％流动相C；

65分钟时，0％流动相A，15％流动相B，85％流动相C；

65.1分钟时，5％流动相A，92％流动相B，3％流动相C；

80分钟时，5％流动相A，92％流动相B，3％流动相C；

其中，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液，C为乙腈溶液，

在流速1.0mL/min，检测波长335nm，柱温30℃的检测条件下，得到该药用组合物的指纹图谱，其中，上述组合物的有效成分具有如下保留时间，灯盏花乙素27.5-29.5min，3,4-O-二咖啡酰奎宁酸30.0-32.0min，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸32.0-34.0min，飞蓬酯乙37.5-40.5min，灯盏花甲素42.5-46.0min，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸44.5-48.0min，灯盏细辛酯48.0-51.5min。

4.如权利要求3所述的药用组合物，该组合物具有如图1所示的指纹图谱。

5.权利要求1所述的药用组合物的制备方法，其中，该方法为：

取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75℃下相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％～95％的乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加盐酸溶液调节pH小于3，滤过，沉淀用浓度90％～95％浓度的乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用有机溶剂萃取，收集有机溶剂提取液，回收溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯；

上述干膏粉与咖啡酸酯浸膏加入注射用水，调节pH7～9，滤过，滤液备用；另取氯化钠加注射用水煮沸滤过，与上述备用滤液合并，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的组合物。

6.如权利要求5所述的制备方法，其中，取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7.5～9，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用水溶解，加碱溶液调节pH5～6，滤过，滤液加硫酸溶液调节pH小于1～2，滤过，沉淀用浓度90％～95％的乙醇洗涤，再用60-70％乙醇溶解，加氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用浓度90％～95％浓度的乙醇洗涤，干燥，干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用2-10倍量的水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集浓度为40％乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70％乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，加碱溶液，调节pH7～10，用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，即为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取适量的氯化钠、活性炭，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水，滤过，灌封，灭菌，即得所述的注射用组合物。

7.如权利要求6所述的制备方法，其中，该方法为：

取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25的清膏；取清膏加3倍量水稀释，加5氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.5，滤过，滤液加10％硫酸溶液调节pH2～3，滤过，得滤液和沉淀；

取沉淀，用等量水溶解，加10％氢氧化钠溶液调节pH5～6，滤过，滤液加20％硫酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用90％乙醇等量洗涤4次，再用适量的65％乙醇溶解，加0.5％氢氧化钠溶液调pH5～6，滤过，滤液加10％盐酸溶液调节pH1～2，滤过，沉淀用的90％乙醇等量洗涤4次，真空干燥，得干膏粉为灯盏花乙素；

取滤液，通过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40％乙醇、2倍量70％乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40％乙醇洗脱液、70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，加5％氢氧化钠溶液，调节pH7.5～8.5，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层用10％盐酸溶液调节pH2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1.20～1.30的清膏，为咖啡酸酯；

与上述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用5％氢氧化钠调节pH7.5～8.5，滤过，滤液备用；另取氯化钠8g、活性炭0.2g，加适量注射用水溶解煮沸，滤过，滤液与上述备用滤液合并，混匀，再加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得。

8.权利要求1-4任一项所述的药用组合物在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。