CN104569411A - 荧光定量检测mbl的免疫层析试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条和样本稀释液，荧光试纸条包括底板，底板的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫、荧光结合垫、包被膜和吸水纸，样品垫的里端和荧光结合垫的一端搭接相连，荧光结合垫的另一端与包被膜的一端搭接相连，包被膜的另一端与吸水纸搭接相连，包被膜包括检测区和质控区；检测区包被有抗MBL单克隆抗体，质控区包被羊抗兔IgG；荧光结合垫中含有荧光标记的MBL单克隆抗体和荧光标记的兔IgG。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒及其制备方法。
背景技术
甘露(聚)糖结合凝聚素，英文名：mannan-binding lectin，缩写为MBL。甘露(聚)糖结合凝聚素是肝脏产生的一种血清C型凝集素，可以与甘露糖结合的急性期蛋白，可以调理带甘露糖的病原体，激活补体系统，参与固有免疫应答、激活补体、调节炎症、促进调理吞噬和清除凋亡细胞。是免疫系统的重要成分之一，在免疫防御中发挥多重作用。当适应性免疫系统尚不成熟(幼儿期)或已被抑制(例如器官移植后，或癌症化疗期间)通常MBL的缺乏可能导致感染易感性的增加。MBL不足与自身免疫性疾病有重要的相关，如系统性红斑狼疮，类风湿关节炎，预后较差的囊肿性纤维化和肿瘤放化疗后的免疫受损性疾病等。MBL组成了机体先天免疫的第一道防线，在病原微生物感染早期，特异性抗体形成之前，MBL就已经通过其“糖基识别域”结合病原微生物。因此，检测人血清或血浆中的甘露糖结合凝聚素(MBL)含量，监测并评估MBL血清浓度的基础值，以及治疗和干预后的MBL水平，对于整合临床的诊断与治疗，早期发现高患病风险的个体，正确指导并及时调整临床治疗方案，实现疾病的个体化治疗等方面具有重要意义。
关于对MBL的检测手段，目前国内外存在的检测方法包括MBL蛋白浓度检测、MBL生物学功能测定和MBL基因型检测等，但只有对MBL蛋白进行浓度检测是唯一直接的检测手段。
MBL生物学功能的检测：可间接反映MBL含量。目前，检测MBL生物学功能的方法主要是检测MBL对吞噬细胞吞噬过程的调理作用以及对补体系统的活化作用，即补体的MBL激活途径。调理吞噬实验操作非常繁琐，而且只能进行半定量检测，目前很大程度上已被补体活化实验所代替。MBL的补体活化作用最常用溶血实验检测，也可用ELISA法检测MBL补体活化途径中的中间产物在固相载体上的沉积情况，以间接反映MBL的功能活性。但是，由于补体的活化还具有经典途径和替代途径，因此补体活化实验在检测前必须先对补体活化的经典途径和旁路途径进行充分抑制，所以操作也比较繁琐，对结果准确度的影响因素也较多。
MBL基因型的检测：可间接估计MBL的水平。目前，大部分检测MBL基因型的方法均建立于PCR(聚合酶链反应)的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现。早期实验室内部采用的限制性片段长度多态性法、扩增阻碍突变系统和异源双链分析法非常复杂、费力，费用相对昂贵，准确性差。20世纪90年代后期发展的基因芯片技术自动化程度高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大提高，但是成本相对较高，只限于实验室研究，难以临床大范围推广。基因型研究的局限在于其不能证明MBL浓度与疾病之间的关系。
血清MBL浓度的检测：唯一一种可直接检测MBL浓度的方法。MBL蛋白抗原检测方法目前常用的有甘露聚糖捕捉测定法、抗体捕捉ELISA法和酶联凝集素免疫吸附测定法，但都没有成为试剂盒。国际上用于临床诊断的MBL检测试剂仅有丹麦BioPorto公司一家研制的试剂盒，原理是用针对MBL CRD(甘露聚糖结合凝集素糖识别域)的单克隆抗体作为捕捉抗体，生物素标记相同的抗体作为检测抗体，HRP-SA(辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素)作为放大显色系统，该方法检测所需时间较长4小时、操作较繁琐，灵敏度可检测到0.5ng/ml。但需要采用自动化进口仪器和试剂盒进行检测，价格相当的昂贵且无法实现样品大批量快速检测，使推广应用受到限制。而国内尚无自主研制的MBL检测试剂盒。
因此，目前临床上迫切需要一种能对患者血清中MBL水平进行快速、准确检测的方法和工具。荧光微球标记层析检测技术是近年继胶体金标记技术以后，在荧光染料标记技术上发展起来的近患者床旁进行的一种快速检测分析技术，简称POCT。POCT是一类极具潜力的检测技术，它快速简便，效率高，成本低，有检验周期短、标本用量少等优点。同时，其试剂稳定且便于保存和携带，已经被广泛用于临床，甚至自我检测。数据处理和自动化仪器类似，有预先设计编制的软件分析处理，提高了POCT检测的准确性和可靠性。将不同粒径的荧光微球与含有氨基、羧基、羟基、巯基的生物大分子物质结合，当荧光微球标记的蛋白质(抗原/抗体)被包被在硝酸纤维素膜上的抗原/抗体捕获时，荧光微球在相应的区域内聚集，在一定波长范围的激发光照射下，发出特定颜色的可见光。通过检测板条上激光激发的荧光，定量检测以pg/ml为单位的检测板条上单个或多个标志物。检测系统通常由荧光读数仪和检测板组成。检测板多用层析法，分析物在移动的过程中形成免疫复合物，通过检测区域、质控区域的荧光信号值的不同与分析物的不同浓度成一定的比例，获得定标曲线，可检测未知样本中分析物的浓度。能达到与常规实验室酶联免疫法测定相当的敏感度和特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条和样本稀释液，荧光试纸条包括底板，底板的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫、荧光结合垫、包被膜和吸水纸，样品垫的里端和荧光结合垫的一端搭接相连，荧光结合垫的另一端与所述包被膜的一端搭接相连，包被膜的另一端与所述吸水纸搭接相连，所述包被膜包括检测区和质控区；所述检测区包被有抗MBL单克隆抗体，所述质控区包被羊抗兔IgG；所述荧光结合垫中含有荧光标记的MBL单克隆抗体和荧光标记的兔IgG。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述检测区包被的抗MBL单克隆抗体由用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生，用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.10091，所述荧光结合垫中含有荧光标记的MBL单克隆抗体由用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生，用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCCNo.10092，用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株与用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株具有不同的结合表位。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述质控区包被羊抗兔IgG的包被液浓度为0.2-4mg/ml，用量为30μl/30cm；所述检测区的MBL单克隆抗体的包被液浓度为0.2-4mg/ml，用量为30μl/30cm。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述质控区包被羊抗兔IgG的包被液浓度为0.5-1.5mg/ml，所述检测区的MBL单克隆抗体的包被液浓度为1-2mg/ml。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述荧光结合垫包括玻璃纤维，荧光结合垫由荧光标记的MBL单克隆抗体和荧光标记的兔IgG混合后喷涂于玻璃纤维上经冻干制成，玻璃纤维上标记物中的荧光标记的MBL单克隆抗体的浓度为2-5μg/ml，荧光标记的兔IgG的浓度为2-5μg/ml。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述样本稀释液包括磷酸氢二钠浓度20mmol，氯化钠浓度150mmol，牛血清白蛋白浓度1％-2％，吐温-20浓度0.1％，其余为水。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述荧光结合垫上荧光标记的激发电磁波的波长为310-550nm，发射波长为340-620nm的电磁波。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述荧光结合垫采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球与50mgMBL单克隆抗体混合后，边搅拌边缓慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使其整个反应体系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺含量为0.1-0.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺的含量为0.1-0.2mg，在4℃避光反应过夜；用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球与50mg兔IgG混合后，边搅拌边缓慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使其整个反应体系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺含量为0.1-0.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺的含量为0.1-0.2mg，在4℃避光反应过夜；用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述荧光结合垫亦可采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球标记物与65mgMBL单克隆抗体，置于4℃，调节体系pH6.8-9.0，一边搅拌一边缓慢加入0.2-1％戊二醛；反应2-5小时，用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光胶乳标记物与兔IgG混合后，置于4℃，调节体系pH6.8-9.0，一边搅拌一边缓慢加入0.2-1％戊二醛；反应2-5小时，用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述荧光结合垫还可采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解45mg MBL单克隆抗体，用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解或悬浮18-22mg荧光素或480-520mg荧光微球；边搅拌边将上述溶解的荧光素或荧光微球渐渐加入抗体溶液中，加完后，继续避光搅拌10-14小时，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水透析过夜，用荧光保护剂复溶，经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解45mg兔IgG，用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解或悬浮18-22mg荧光素或480-520mg荧光微球；边搅拌边将上述溶解的荧光素或荧光微球渐渐加入抗体溶液中，加完后，继续避光搅拌10-14小时，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水透析过夜，用荧光保护剂复溶，经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫。
本发明的用作包被的人甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2014年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.10091，建议的分类命名为：产生用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本发明的用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2014年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.10092，建议的分类命名为：产生用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒的检测原理是双抗体夹心法，荧光素或荧光微球与MBL单克隆抗体共价结合。将检测样本(血清或血浆)用样本稀释液稀释100倍后加入加样孔中，其荧光标记MBL单克隆抗体可与血液中的MBL结合，形成复合物；向上层析与包被膜上检测区T的MBL单克隆抗体形成抗体-抗原-抗体复合物。当含MBL样本滴加至试纸条的样品垫上，向上层析与荧光标记垫上的荧光标记MBL单抗结合，混合液继续沿着包被膜向前移动，样本中所含MBL量越多，可与MBL抗体结合的荧光标记抗体就越多，从而使测得荧光检出值升高。结果判断：a.当检测线T和质控线C在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性；b.当检测线T在450nm激发光照射下不显现绿色荧光印迹，只有质控线C在激发光下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阴性；c.质控线C在激发光下不显现绿色荧光印迹时，该试纸条不能用。当通过荧光检测仪扫描荧光信号强度，可检测出样本中MBL含量。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒的MBL荧光免疫层析试纸条与GC/MS、HPLC等色谱仪器以及酶免法检测MBL相比，具有简单操作一步完成、适合不同数量样本检测、快速，15分钟左右即可有结果、灵敏度更高等优点。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，采用荧光标记液冻干处理均匀铺涂在进口玻璃纤维上的方法，与其他干燥工艺相比，其批量生产的精密度和准确度达到最好效果，相较于荧光标记物液体保存稳定性更好，操作简便。在荧光定量检测仪上可以达到仅10秒就能对MBL进行灵敏的定量测定，更快更精确的测定样品中所含MBL量；MBL层析试纸条具有良好的准确度，回收率为90％-110％，定量偏差小，定量偏差在20％以内，高灵敏度，需要的样品量少，仅为100ul，操作非常简便，检测结果极其准确可靠，具有突出的实质性特点和显著的进步。
下面结合附图对本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的荧光定量检测MBL层析试剂盒中荧光试纸条的结构示意图的立体图；
图2是图1俯视图；
图3是本发明的荧光定量检测MBL层析试剂盒中用于放置试纸条检测卡的示意图。
具体实施方式
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条和样本稀释液，如图1和图2所示，荧光试纸条包括底板7，底板7的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫1、荧光结合垫2、包被膜3和吸水纸6，样品垫1的里端和荧光结合垫2的一端搭接相连，荧光结合垫2的另一端与所述包被膜3的一端搭接相连，包被膜3的另一端与所述吸水纸6搭接相连，所述包被膜3包括检测区4和质控区5；所述检测区4包被有抗MBL单克隆抗体，所述质控区5包被羊抗兔IgG；所述荧光结合垫2中含有荧光标记的MBL单克隆抗体和荧光标记的兔IgG。
专利申请号为201310390393.7、发明名称为“抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体及试剂盒”的中国发明专利申请，公开了一种杂交瘤细胞株，其包括用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.7592，还包括用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.7591，用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株与用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株具有不同的结合表位。
上述抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体，包括用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，还包括用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
上述甘露糖结合凝集素定量检测试剂盒，包括用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，还包括用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒中的所述检测区4包被的抗MBL单克隆抗体，可以利用专利申请号为201310390393.7、发明名称为“抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体及试剂盒”公开的保藏号为CGMCC No.7592、用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
本发明的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒中的所述荧光结合垫2中含有荧光标记的MBL单克隆抗体，可以利用专利申请号为201310390393.7、发明名称为“抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体及试剂盒”公开的保藏号为CGMCC No.7591、用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
使用保藏号为CGMCC No.7592杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体以及保藏号为CGMCC No.7591的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，完全可以满足本发明的检测要求，但其灵敏度通常只能达到1.0ng/ml的水平，灵敏度不如本发明重新保藏的杂交瘤细胞株。
作为本发明的改进，上述检测区4包被的抗MBL单克隆抗体由用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生，用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.10091，所述荧光结合垫2中含有荧光标记的MBL单克隆抗体由用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生，用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.10092，用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株与用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株具有不同的结合表位。利用夹心法的原理检测标本。
使用上述本发明新的保藏号为CGMCC No.10091杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体以及新的保藏号为CGMCC No.10092的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其灵敏度可达0.2ng/ml。
作为本发明的进一步改进，上述质控区5包被羊抗兔IgG的包被液浓度为0.2-4mg/ml，用量为30μl/30cm；所述检测区4的MBL单克隆抗体的包被液浓度为0.2-4mg/ml，用量为30μl/30cm。
作为本发明的进一步改进，上述质控区5包被羊抗兔IgG的包被液浓度优化为0.5-1.5mg/ml，所述检测区4的MBL单克隆抗体的包被液浓度优化为1-2mg/ml。
作为本发明的进一步改进，上述荧光结合垫2包括玻璃纤维，荧光结合垫2由荧光标记的MBL单克隆抗体和荧光标记的兔IgG混合后喷涂于玻璃纤维上经冻干制成，玻璃纤维上标记物中的荧光标记的MBL单克隆抗体的浓度为2-5μg/ml，荧光标记的兔IgG的浓度为2-5μg/ml。
上述样本稀释液包括磷酸氢二钠浓度20mmol，氯化钠浓度150mmol，牛血清白蛋白浓度1％-2％，吐温-20浓度0.1％，其余为水。
上述荧光结合垫2上荧光标记的激发电磁波的波长为310-550nm，发射波长为340-620nm的电磁波。
上述荧光结合垫2可以采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球与50mgMBL单克隆抗体混合后，边搅拌边缓慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使其整个反应体系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺含量为0.1-0.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺的含量为0.1-0.2mg，在4℃避光反应过夜；用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球与50mg兔IgG混合后，边搅拌边缓慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使其整个反应体系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺含量为0.1-0.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺的含量为0.1-0.2mg，在4℃避光反应过夜；用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫2。
上述荧光结合垫2也可以采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球标记物与65mgMBL单克隆抗体，置于4℃，调节体系pH6.8-9.0，一边搅拌一边缓慢加入0.2-1％戊二醛；反应2-5小时，用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球标记物与兔IgG混合后，置于4℃，调节体系pH6.8-9.0，一边搅拌一边缓慢加入0.2-1％戊二醛；反应2-5小时，用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫2。
上述荧光结合垫2还可以采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解45mgMBL单克隆抗体，用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解或悬浮18-22mg荧光素或480-520mg荧光微球；边搅拌边将上述溶解的荧光素或荧光微球渐渐加入抗体溶液中，加完后，继续避光搅拌10-14小时，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水透析过夜，用荧光保护剂复溶，经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解45mg兔IgG，用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解或悬浮18-22mg荧光素或480-520mg荧光微球；边搅拌边将上述溶解的荧光素或荧光微球渐渐加入抗体溶液中，加完后，继续避光搅拌10-14小时，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水透析过夜，用荧光保护剂复溶，经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫2。
本发明所述荧光标记垫2为荧光素与蛋白的标记物或荧光微球与蛋白的标记物喷涂于玻璃纤维材料上制成，其中所使用的荧光素可为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、多甲藻绿素蛋白、镧系螯合物、羧基荧光素、香豆素等其中的一种或几种。
实施例一
在该实施例中，荧光定量检测MBL免疫层析试剂盒，包括有荧光试纸条制作和样本稀释液的配制。
在该实施例中，包被膜的检测区T线处用0.5mg/ml抗MBL单克隆抗体包被液，使用量为30ul/30cm。在包被膜的质控区C线处使用浓度为1mg/ml的抗兔IgG进行包被，使用量同为30ul/30cm。用于结合荧光标记的兔IgG，用于检测试纸条的有效性。
在该实施例中，荧光标记液受310nm激发，发射波长为340nm。在该实施例中，荧光标记液的制备采用含羧基的荧光微球标记物(本实施例用到的荧光素为7-羟基香豆素微球)的制备方法(A)，步骤如下：
将500mg的7-羟基香豆素微球分别与50mgMBL抗体或50mg兔IgG混合后，边搅拌边缓慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，EDC加0.2mg，NHS加0.1mg，使其整个反应体系中EDC的含量为0.2mg，NHS含量为0.1mg，在低温下2-8℃避光反应过夜。用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质；用荧光保护剂复溶。
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在玻璃纤维上，冻干保存备用。
将裁切好的样品垫、荧光结合垫、包被膜和吸水纸依次相互搭接地粘贴在底板上，用切条机裁切成均匀的3--4mm宽膜条，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳(检测卡)中即成为成品的荧光检测试纸条。配合由磷酸氢二钠浓度20mmol，氯化钠浓度150mmol，牛血清白蛋白浓度1％-2％，吐温-20浓度0.1％，其余为水配制成的样品稀释液即可对临床血液样本进行检测。
实施例二
在该实施例中，荧光定量检测MBL免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条的制作和样本稀释液配制。
在该实施例中，包被膜的检测区T线处用1mg/ml抗MBL单克隆抗体包被液，使用量为30ul/30cm。在包被膜的质控区C线处使用浓度为1mg/ml的抗兔IgG进行包被，使用量同为30ul/30cm，用于结合荧光标记的兔IgG，用于检测试纸条的有效性。
在该实施例中，荧光标记液受550nm激发后，发射波长为620nm。在该实施例中，荧光标记液的制备采用含氨基的荧光微球标记物(本实施例用到的荧光素为四甲基异硫氰酸罗丹明微球)的制备方法，步骤如下：
将500mg荧光胶乳标记物分别与65mgMBL抗体或65mg兔IgG混合后，置于4℃环境，调节体系pH7.0-8.5，一边搅拌一边缓慢加入0.4-0.6％戊二醛；反应2-5小时，用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶。
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以致两种抗体浓度分别都为5ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在玻璃纤维上，冻干保存。
将裁切好的样品垫、荧光结合垫、包被膜和吸水纸依次相互搭接地粘贴在底板上，用切条机裁切成均匀的3--4mm宽膜条，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳(检测卡)中即成为成品的荧光检测试纸条。配合由磷酸氢二钠浓度20mmol，氯化钠浓度150mmol，牛血清白蛋白浓度1％-2％，吐温-20浓度0.1％，其余为水配制成的样品稀释液即可对临床血液样本进行检测。
实施例三
在该实施例中，荧光定量检测MBL免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条的制作和样本稀释液配制。
在该实施例中，包被膜的检测区T线处用1.5mg/ml抗MBL单克隆抗体包被液，使用量为30ul/30cm。在包被膜的质控区C线处使用浓度为2mg/ml的抗兔IgG进行包被，使用量同为30ul/30cm，用于结合荧光标记的兔IgG，用于检测试纸条的有效性。
在该实施例中，荧光标记液受490nm激发，发射波长为530nm。在该实施例中，荧光标记液的制备采用含硫碳酰氨基的荧光素(本实施例用到的荧光素为异硫氰酸荧光素)的制备方法，步骤如下：
用pH8.0-pH9.6碳酸缓冲液分别溶解45mgMBL抗体或45mg兔IgG，用pH8.0-PH9.6碳酸缓冲液溶解或悬浮20mg异硫氰酸荧光素；边搅拌边将上述的异硫氰酸荧光素渐渐加入球蛋白溶液中，加完后，继续避光搅拌12小时左右，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水在低温下透析过夜，用荧光保护剂复溶。
将上述制备好的荧光物标记的MBL抗体和荧光胶乳微粒标记兔IgG混合，以致两种抗体浓度分别都为3ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在玻璃纤维上，冻干保存备用。
本发明所述的MBL免疫层析检测试剂盒，在具体实例中，半成品通过以下工序组装而成：由样品垫、荧光结合垫、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，构成试纸条，可再用现有技术中的7卡外壳，如图3所示，固定成检测卡，所述卡外壳涂有可供荧光仪扫描识别的产品信息喷码。与写入信息的ID芯片。现有技术中的ID芯片采用的定量计算公式为检测信号值与计算浓度的半对数直线方程式或其他计算方程式，可自动进行结果判定。分装好的样本稀释液和其他配件组装成试剂盒。
本发明所述荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，在使用时，如图3所示，可将荧光试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳7(检测卡)中，塑料上壳设有两个开孔，加样孔9和显示窗8，加样孔9正对着荧光试纸条的样品垫1，结果显示窗8对着包被膜3的检测区和质控区，该荧光试纸条可以从该塑料卡外壳7中取出。
用来测试免疫层析试纸条的荧光定量光谱检测系统(免疫荧光检测仪)，主要包含荧光光源系统、检测系统及自动软件分析控制系统。
本发明的一个实施例中，检测样本需要通过以下操作：吸取一定量例如10ul的样本(血清或血浆)与990ul样本稀释液混合，混匀后吸取100ul，往水平放置检测卡加样孔加入，不要带入气泡，开始层析反应。反应15分钟，由荧光检测仪读取测试结果。
本发明的实施例1-3所述的定量MBL免疫层析检测试剂盒与免疫荧光检测仪对200例样本(血清/血浆)的测定结果比较表明：在0.2-100ng/ml范围内测定MBL的准确性高：定量曲线线性系数均大于0.99，样本中含0.5与1ng/ml浓度的MBL其准确度为80％-120％，试剂盒检出限为0.2ng/ml。相对一般采用的胶体金法(定性)和酶联免疫检测法检测试剂盒的检测结果具有更好的灵敏度和特异性。具体如下表。
在产生本发明新的保藏号为CGMCC No.10091杂交瘤细胞株以及新的保藏号为CGMCCNo.10092的杂交瘤细胞株的过程中，发明人用甘露糖结合凝聚素(MBL)作为免疫原，免疫小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、山羊或者绵羊等动物，从被MBL免疫动物的脾细胞或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，获得了本发明的上述2种杂交瘤细胞株。
上述脾细胞或淋巴细胞的分离，可采用已知的方法进行，对杂交瘤的筛选，可采用已知的方法进行。
本发明新的保藏号为CGMCC No.10091杂交瘤细胞株以及新的保藏号为CGMCCNo.10092的杂交瘤细胞株，是按照以下方法得到：将小鼠，用含有MBL的免疫原，在三脚掌和皮下常规免疫，3至4周后重复免疫，2周后尾静脉加强免疫一次，3至4天后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照常规方法融合，杂交瘤细胞以有限稀释法克隆化；挑选出高滴度杂交瘤细胞。
本发明的单克隆抗体可通过本发明的杂交瘤产生。从本发明的杂交瘤产生本发明的单克隆抗体的方法是本领域常规或已知的方法，例如：可以从培养本发明的杂交瘤的组织培养液中获得，也可以通过接种到小鼠体内繁殖、从收集的腹水或血清中分离获得。所述培养本发明的杂交瘤可以按照本领域常规或已知方法进行。所述接种、收集腹水或血清、从腹水或血清中分离本发明的单克隆抗体的方法可以是本领域常规或已知的方法。
实施例
保藏号为CGMCC No.10091杂交瘤细胞株以及保藏号为CGMCC No.10092的杂交瘤细胞株的建立
免疫：8-12周龄的雌性BALB/c小鼠，以每只20ugMBL(自健康中国人血浆中纯化)的量，在三脚掌和皮下常规免疫，3-4周后重复免疫，2周后尾静脉加强免疫一次。
融合：从最后一次加强免疫3天后的小鼠取脾细胞，与骨髓瘤细胞(中国药品生物制品检定所细胞室提供)以5∶1的比例混合，用50％PEG液融合。在HAT培养液中37℃5％CO2培养。
杂交瘤细胞的检测与选择性培养：培养3-4天后用HAT培养液半量换液，直到细胞生长至1/3-1/2孔时进行检测，包被抗原MBL，取杂交瘤上清(一抗)与抗原共同孵育，洗涤去除未结合的抗体，加酶标羊抗鼠二抗，显色反应阳性(OD值，即吸光度值，与阴性对照比大于2)为待选克隆。第一次克隆后换HT培养液，第二次克隆后换DMEM培养液培养。
杂交瘤细胞以有限稀释法克隆化：将96孔板中待克隆的杂交瘤细胞用培养液洗下，计数并稀释至20个细胞/ml，每孔0.1ml接种96孔板，经3次对倍稀释即每孔含有0.5个细胞，37℃5％CO2培养。3-5天后有细胞生长的孔补加培养液继续培养，肉眼可见细胞克隆时，进行抗体检测，此时克隆为100％阳性，可建株。
共挑选出2株高滴度杂交瘤细胞。
单克隆抗体的制备和纯化
接种：取8周龄雄性BALB/c小鼠，腹腔注射无菌蜡油0.5ml/只，5天后分别接种2*107/ml由实施例1所得杂交瘤细胞。出现较多腹水后收集，可多次收集。
正辛酸沉淀法提纯单抗：用4倍体积的醋酸缓冲液(冰醋酸1.8ml+500ml蒸馏水)稀释收集到的腹水，用0.1N NaOH调ph4.5。搅拌下，每ml稀释后的样品缓慢加入25ul正辛酸。放置30分钟后，室温10000rpm离心30分钟。过滤上清，除去细渣。加10倍浓缩的PBS(9份样品+1份10*PBS)，用5N NaOH调ph7.5。上清冷却至4℃，45％饱和硫酸铵沉淀(0.277g/ml)，搅拌30分钟，4℃，5000rpm离心15分钟。用少量PBS溶解沉淀，用50-100倍体积的PBS透析过夜，4℃。透析后样品加0.1％硫柳汞，4℃保存，即分别得到单克隆抗体B3和B10。
蛋白A层析柱法单抗：HiTrap rProtein A FF(Amersham Bioscinces)装柱后用5倍以上柱体积的结合缓冲液(1.5M甘氨酸，3M NaCl，ph8.9)洗柱平衡，经辛酸沉淀提取后的单抗样品用注射器上样，10倍柱体积的结合缓冲液洗柱，流速1ml/min，5倍柱体积的洗脱液(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH5)洗柱，监测收集蛋白峰，得到纯化抗体，SDS-PAGE鉴定纯度。
标记HRP(辣根过氧化酶)：将上述步骤得到的纯化抗体8-10mg装入透析袋，用0.01MpH9.5的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜。取HRP4mg，溶于1.0ml的纯水中，缓慢加入0.1MNaIO4，加入量为0.1ml，室温下避光搅拌40分钟，装入透析袋，用0.001M pH4.5的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜。向HRP(辣根过氧化酶)中加入0.1M的碳酸钠0.05ml调pH至9.5，然后与抗体混合，避光搅拌2小时。加入4mg/ml的NaBH4 0.1ml，4℃静置3小时，4℃PBS透析过夜。加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌40分钟，4℃静置3小时，3000rpm离心30分钟，弃上清。所得沉淀再用50％的硫酸铵重复前述操作一遍。所得沉淀溶于1ml PBS中，4℃PBS透析48小时，得酶标单克隆抗体HRP-B3和HRP-B10.
酶标抗体效价的测定：已包被纯化抗原的反应板，将酶标抗体做系列稀释，37℃反应1小时显色，判定酶标抗体效价，其结果为：HRP-B3为1∶8000、HRP-B10为1∶2000.
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：配制5.5％分离胶和5％浓缩胶，灌制凝胶，另配制电泳冲液(25mmol Tris-Cl，250mmol甘氨酸，0.1％SDS)。将样品悬于SDS-PAGE加样缓冲液，煮沸5min，12000rpm离心1min后上样，上样体积为20ul/孔。电泳时，样品位于浓缩胶时电压设为70V，样品进入分离胶后电压设为100V，带溴酚兰到达分离胶底部时停止电泳。将凝胶浸泡于考马斯亮蓝R-250染液中染色2-3小时候，用含20％乙醇和10％冰醋酸的脱色液脱色至背景无色后观察。
根据分子量标准，计算出两株单抗的分子量，通过凝胶成像分析得出单抗的程度，结果表明本发明单克隆抗体的纯度可用于制备体外诊断试剂。
Claims (10)
1.荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：包括荧光试纸条和样本稀释液，荧光试纸条包括底板(7)，底板(7)的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫(1)、荧光结合垫(2)、包被膜(3)和吸水纸(6)，样品垫(1)的里端和荧光结合垫(2)的一端搭接相连，荧光结合垫(2)的另一端与所述包被膜(3)的一端搭接相连，包被膜(3)的另一端与所述吸水纸(6)搭接相连，所述包被膜(3)包括检测区(4)和质控区(5)；所述检测区(4)包被有抗MBL单克隆抗体，所述质控区(5)包被羊抗兔IgG；所述荧光结合垫(2)中含有荧光标记的MBL单克隆抗体和荧光标记的兔IgG。
2.根据权利要求1所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述检测区(4)包被的抗MBL单克隆抗体由用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生，用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCCNo.10091，所述荧光结合垫(2)中含有荧光标记的MBL单克隆抗体由用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生，用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.10092，用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株与用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株具有不同的结合表位。
3.根据权利要求2所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述质控区(5)包被羊抗兔IgG的包被液浓度为0.2-4mg/ml，用量为30μl/30cm；所述检测区(4)的MBL单克隆抗体的包被液浓度为0.2-4mg/ml，用量为30μl/30cm。
4.根据权利要求3所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述质控区(5)包被羊抗兔IgG的包被液浓度为0.5-1.5mg/ml，所述检测区(4)的MBL单克隆抗体的包被液浓度为1-2mg/ml。
5.根据权利要求1至4中任何一项所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述荧光结合垫(2)材质为玻璃纤维，荧光结合垫(2)由荧光标记的MBL单克隆抗体和荧光标记的兔IgG混合后喷涂于玻璃纤维上经冻干制成，玻璃纤维上标记物中的荧光标记的MBL单克隆抗体的浓度为2-5μg/ml，荧光标记的兔IgG的浓度为2-5μg/ml。
6.根据权利要求5所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液包括磷酸氢二钠浓度20mmol，氯化钠浓度150mmol，牛血清白蛋白浓度1％-2％，吐温-20浓度0.1％，其余为水。
7.根据权利要求6所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述荧光结合垫(2)上荧光标记的激发电磁波的波长为310-550nm，发射波长为340-620nm的电磁波。
8.根据权利要求7所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述荧光结合垫(2)采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球与50mgMBL单克隆抗体混合后，边搅拌边缓慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使其整个反应体系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺含量为0.1-0.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺的含量为0.1-0.2mg，在4℃避光反应过夜；用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球与50mg兔IgG混合后，边搅拌边缓慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使其整个反应体系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺含量为0.1-0.3mg，N-羟基琥珀酰亚胺的含量为0.1-0.2mg，在4℃避光反应过夜；用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫(2)。
9.根据权利要求7所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述荧光结合垫(2)亦可采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球标记物与65mgMBL单克隆抗体，置于4℃，调节体系pH6.8-9.0，一边搅拌一边缓慢加入0.2-1％戊二醛；反应2-5小时，用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
将18-22mg的荧光素或480-520mg荧光微球标记物与兔IgG混合后，置于4℃，调节体系pH6.8-9.0，一边搅拌一边缓慢加入0.2-1％戊二醛；反应2-5小时，用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光标记物进行纯化，去除杂质，用荧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫(2)。
10.根据权利要求7所述的荧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述荧光结合垫(2)还可采用以下方法制成：
制备荧光微粒标记的MBL抗体：
用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解45mg MBL单克隆抗体，用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解或悬浮18-22mg荧光素或480-520mg荧光微球；边搅拌边将上述溶解的荧光素或荧光微球渐渐加入抗体溶液中，加完后，继续避光搅拌10-14小时，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水透析过夜，用荧光保护剂复溶，经冻干保存备用；
制备荧光微粒标记兔IgG：
用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解45mg兔IgG，用pH8.0-pH9.6碳酸盐缓冲液溶解或悬浮18-22mg荧光素或480-520mg荧光微球；边搅拌边将上述溶解的荧光素或荧光微球渐渐加入球蛋白溶液中，加完后，继续避光搅拌10-14小时，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水透析过夜，用荧光保护剂复溶，经冻干保存备用；
将上述制备好的荧光微粒标记的MBL抗体和荧光微粒标记兔IgG混合，以使两种抗体浓度分别都为2ug/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃纤维截断制成所述荧光结合垫(2)。
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