CN104561022B - 家猪肿瘤坏死因子突变体的构建及蛋白表达纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及家猪肿瘤坏死因子(TNF‑α)基因定点突变与蛋白制备方法和应用，本发明所述的猪肿瘤坏死因子(TNF‑α)的一个突变体基因，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。此突变体基因翻译蛋白氨基酸序列具有SEQ ID NO.3所示的序列，将此突变体连接到pET28a原核表达质粒中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，Ni+‑NTA柱纯化后得到的重组蛋白His6‑PmTNF‑α，CCK‑8、LDH检测等实验均证明该突变体蛋白与TNF‑α野生型蛋白相比，能够明显增强对L929细胞的细胞毒活性并降低对正常细胞L02的毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及家猪肿瘤坏死因子突变体基因的构建、表达、蛋白纯化及活性鉴定技术。
背景技术
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是1975年发现的一种具有抗肿瘤效果的细胞因子，是迄今发现的对肿瘤细胞杀伤性最好的细胞因子，属于肿瘤坏死因子超家族成员。TNF-α除对肿瘤细胞具有直接的抑制增殖和细胞坏死作用外，对其他细胞(包括心肌细胞)的生长分化也有影响，同时还有抗病毒及细菌感染；刺激T细胞、B细胞、单核巨噬细胞等，使其功能增强；诱发炎症反应，促进IL1、IL2、IL6等的产生及分泌；促进EGFR及主要组织相容性抗原Ⅱ类抗原(MHCⅡAg)等的表达等，在宿主防御反应中起重要作用。TNF-α主要是通过与靶细胞膜上肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)结合,实现其细胞毒性、抗病毒细菌感染、免疫调节等生物学功能，具有广泛的生物学活性。
人用TNF-α能被肾脏快速排泄及被各种蛋白酶分解,在体内半衰期很短(15-30min),而发挥作用需要12-36h。若频繁大剂量注射,则会导致严重的不良反应,如发热、恶心呕吐、头痛、低血压等,甚至能引起休克、死亡。TNF-α在人体的耐受量仅为其有效量的1/10～1/50。因此,用TNF-α治疗癌症被局限于肿瘤组织内给药,以获得较高的局部浓度。为了更好的利用TNF-α，提高其生物学活性，降低其系统毒副作用，近年来，国内外科学家通过定点突变技术对TNF-α基因进行定点突变，从而达到增加TNF-α活性并降低其毒性的目的。2003年第四军医大学生物技术中心的张英起教授通过蛋白质工程技术对TNF-α重组改造之后获得高活性低毒性的新型突变体，突变后的肿瘤坏死因子与天然重组人肿瘤坏死因子相比，毒性降低了100到1000倍，但对肿瘤细胞的杀伤活性和抑瘤作用达到60％以上。该研究已经获得国家一类新药物制品证书，这是目前世界上第一个被批准生产的重组改构人肿瘤坏死因子药物，也是我国第一个上市的一类基因工程抗肿瘤药物。
肿瘤坏死因子(TNF-α)作为迄今为止发现的抗肿瘤效果最好的细胞因子，一直是国内外研究的热点，但是几乎所有的研究都是围绕着人TNF-α，很少涉及到家畜的肿瘤坏死因子。猪是我国肉类重要来源，是我国畜类养殖业的重要组成部分，但是近年来，猪的一些常见病(如发热、痢疾甚至猪瘟、蓝耳病、口蹄疫等)对其养殖的影响日益严重。本课题从国内外研究的现状以及增强猪的免疫力和抗病毒细菌感染的方面考虑，提出对猪TNF-α基因进行突变体构建、原核重组表达及功能进行研究，针对免疫力低下和炎症感染疾病的猪，有望开发成相关的免疫增强剂和疫苗佐剂。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种家猪肿瘤坏死因子突变体基因(PmTNF-α)构建方法，并提供家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体蛋白的表达及纯化方法和活性检测。
本发明所述猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因序列如SEQ ID NO.2所示，突变基因翻译蛋白氨基酸序列和野生型相比，N端缺少7个氨基酸，第8位的Ser、第9位的Asp和第156位的Ile分别突变为Lys、Arg和Phe，其序列如SEQ ID NO.3所示。
家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因构建方法如下：
(1)提取猪脾脏组织总RNA，并逆转录为第一链cDNA；
(2)设计包含突变位点的大片段引物：
F1：5’-AAGCGCAAGCCCGTCGCCCA-3’(SEQ ID NO.4)
R1：5’-TCAGAAGGCAATGATCCCAA-3’(SEQ ID NO.5)
(3)将上述引物的PCR扩增产物，克隆入pMD-19T载体(TaKaRa)，并进行碱基序列测定，得到了猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因序列(PmTNF-α)。
本发明还公开了一种重组表达载体pET28-mTNF-α的构建方法，以猪第一链cDNA为模版，F2、R2为引物进行PCR，F2、R2的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.6所示，得到目的基因，即带酶切位点家猪肿瘤坏死因子突变体基因PmTNF-α，和pET28a载体用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切,T4 DNA Ligas连接酶切后的载体和目的基因，得到pET28-PmTNF-α重组质粒。
一种家猪肿瘤坏死因子突变体蛋白的表达纯化方法，包括以下步骤：
(1)把含有pET28-PmTNF-α重组质粒的菌种复苏、扩大培养及诱导表达取-80℃冻存菌种50μl接种到加有5μlKan的5ml LB培养基中复苏12小时，把复苏后的菌液加到500ml灭菌LB培养基中，并加500μlKan抗生素，37℃，200rpm，摇2h；加1M IPTG 100μl，使终浓度达到0.2mM，16℃，150rpm，诱导20h。收菌，-70℃，冻存过夜。
(2)超声破碎：30ml PBS重悬冻存菌体，超生破碎，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。
(3)镍柱层析：配制洗脱缓冲液20mM、50mM、100mM、250mM咪唑各200ml，先用20mM咪唑平衡柱子，上样结束后，开始洗脱。先用20mM咪唑洗脱，之后分别用50mM、100mM咪唑洗脱，最后250mM，此时洗脱峰为目的蛋白。
(4)透析并浓缩：将收集到的250mM咪唑洗脱蛋白，放到透析袋中，于4℃，1L PBS中透析24小时，之后用PEG20000浓缩到合适浓度。
本发明进一步公开了所述家猪肿瘤坏死因子突变体基因PmTNF-α的重组应用，是通过基因工程方法，生产重组His6-PmTNF-α蛋白，作为猪免疫增强剂或相关疾病的免疫佐剂，或者生物药物制剂。
通过现有基因工程方法将该基因的胞外功能区克隆连接到pET28a原核质粒中并转到大肠杆菌BL21(DE3)中表达，本发明通过多次预表达实验摸索出了合适的表达条件(调节IPTG的浓度、温度及转速使融合蛋白尽可能多的以可溶形式表达)，超声破碎后离心收集上清过Ni+-NTA柱纯化，梯度洗脱之后我们得到了家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体蛋白(His6-PmTNF-α)。并进行Western-blot鉴定。体外WST-8染料生物活性检测及LDH检测结果显示，该突变型蛋白和野生型蛋白相比不仅提高了对肿瘤细胞L929的细胞毒活性，而且降低了对正常细胞(L02)的细胞毒性。
附图说明
图1 重组质粒图(A、野生型TNF-α，B、突变型TNF-α)
图2 镍柱层析洗脱图(A、野生型重组蛋白，B、突变型重组蛋白)
图3 家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)成熟区片段表达及纯化、Western blot鉴定图(M、蛋白Maker，1、未诱导，2、诱导，3、纯化后蛋白，4、Western blot结果。A、野生型重组蛋白，B、突变型重组蛋白)
图4 CCK-8法分析不同浓度家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)对L929细胞的细胞毒活性。(PwTNF-α为野生型重组蛋白，PmTNF-α为突变型重组蛋白)
图5 10×10倍倒置显微镜下拍摄L929细胞
图6 酶标仪法分析猪肿瘤坏死因子(TNF-α)对L02细胞的毒副作用。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例1
猪肿瘤坏死因子突变体(PmTNF-α)基因的构建，猪脾脏取自南京栖霞尧化生猪屠宰场，为长白猪：
(1)提取总RNA：应用RNA抽提试剂盒(TIANGEN)按照其操作手册提取猪脾脏组织总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。SMARTTM RACE试剂盒(TaKaRa)逆转录为第一链cDNA。
(2)设计包含突变位点的大片段引物，通过PCR方法构建肿瘤坏死因子突变体基因。引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用逆转录所得cDNA模板进行PCR：
①反应体系为50μl，10μmol/L F1、R1各2μl，2.5mmol/L dNTP 8μl，2×GC bufferⅡ25μl，cDNA模板3μl，DreamTaq酶0.5μl，ddH2O 9.5μl。反应程序为：94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃1min)，35个循环，最后72℃延伸7min。
②反应完成后将产物于1％琼脂糖凝胶中电泳检测，用割胶回收试剂盒回收得到PCR产物，克隆入pMD19-T载体(TaKaRa)，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定。多次实验结果测序之后，通过序列对比确定所构建的猪肿瘤坏死因子突变体基因序列。如构想的一样，由包含突变位点的引物(序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)引发了特定突变，突变体基因序列如SEQ IDNO.2。
实施例2：
家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达及纯化鉴定；
根据已经构建TNF-α突变体序列(基因序列如SEQ ID NO.2)，设计引物F2、R2。其中F2的5’端具有BamHⅠ酶切位点，R2的5’端具有HindⅢ酶切位点，以猪第一链cDNA为模版，F2、R2为引物(F25’–CGCGGATCCAAGCGCAAGCCCGTCGCCCACGTTGT-3’(SEQ ID NO.6)，R25’-CCCAAGCTTTCAGAAGGCAATGATCCCAAAATAGT-3’(SEQ ID NO.7)，PCR扩增该基因(10×pfuBuffer 5μl，dNTP(2.5mM)4μl，F2(10μmol/L)2μl，R2(10μmol/L)2μl，H2O 33.5μl，cDNA 3μl，pfu Taq 0.5μl)反应条件如下：94℃5min，(94℃30s，59℃30s，72℃1min)，35个循环，最后72℃延伸7min，之后将PCR产物割胶回收，回收产物和pET28a载体(Invitrogen,USA)，用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切，T4 DNA Ligase(TaKaRa)连接，得到重组质粒(命名为pET28a-PmTNF-α)(图1B)，连接产物转化E.coli DH5a中，获得含有重组质粒pET28a-PmTNF-α的菌株。挑选阳性重组菌株测序，测序正确的菌株扩大培养提取pET28a-PmTNF-α重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性菌株诱导表达。
以同样方法构建家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)野生型蛋白原核表达载体，命名为pET28a-PwTNF-α(图1A)。根据家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)基因序列设计引物F3、R3，其中F3的5’端具有BamH Ⅰ酶切位点，R3的5’端具有HindⅢ酶切位点。以猪第一链cDNA为模版，F3、R3为引物(F35’–CGCGGATCCCTCAGATCATCGTCTCAAACCTCAGATA-3’(SEQ ID NO.8)，R35’-CCCAAGCTTTCACAGGGCAATGATCCCAAAATAGA-3’(SEQ ID NO.9)构建出家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)野生型表达基因，序列如SEQ ID NO.1所示，
经过多次预表达实验，当IPTG浓度为0.2mM,诱导温度16℃，转速150rpm诱导20h，有较多的目的蛋白以可溶形式表达。16℃，6000rpm离心收菌，-70℃冻存一夜后，30ml PBS重悬，冰上超声破碎(200W，工作4s，暂停8s，共150次)表达菌体，4℃，12000rpm，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，上清过Ni+-NTA柱。简要过程是：Binding Buffer(20mmol/LImidazole，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris HCl，pH 8.0)平衡Ni+-NTA柱后，将含有可溶性重组蛋白的上清缓慢上样，上样结束后先用Binding buffer(20mmol/L Imidazole，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑Tis-HCl洗脱，目的蛋白主要在洗脱浓度为250mmol/L Imidazole，0.5mol/L NaCl，20mmol/L TrisHCl，pH 8.0洗脱下来(洗脱曲线如图2所示)。分管收集洗脱目的蛋白，PBS透析过夜除盐。SDS-PAGE检测各收集管蛋白纯度，紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图3(条带3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni+-NTA柱纯化得到纯度达97％的目的蛋白。
Western印记分析：
Western-blot中所用一抗为鼠抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG。其简要步骤是：将样品先进行SDS-PAGE，以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然后依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与一抗孵育1h，与HRP标记的二抗IgG孵育1h，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图3(条带4)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。将获得的目的蛋白抽滤分装后保存于-70℃。
实施例3
CCK-8法分析His6-PmTNF-α对L929细胞的细胞毒活性；
7ml 1640(10％FBS)培养基培养L929细胞，24小时。除去培养基后，1ml胰酶消化30s，加1ml培养基终止消化，重悬细胞，吸取到15ml离心管中，1000g，20℃，3min。出去上清之后再加2ml培养基(1640,10％FBS)，重悬细胞，吸取1ml到50ml离心管中，加10％FBS 1640培养基稀释，计数板计数，使胞数目为3×105个/ml。吸取上述稀释的细胞悬液种入96孔板中，每孔100μl，37℃，5％CO2，培养24h。除去培养液。用10％FBS 1640培养基配置不同浓度TNF-α稀释液(分野生型和突变型两组)，之后每孔加100μl，使TNF-α终浓度达到105、104、103、102、10、100、10-1、10-2、10-4ng/ml，每孔加Act.D(放线菌素D)使终浓度达到0.4μl/ml，设置空白、PBS、Act.D对照组。37℃，5％CO2，培养24小时，于倒置显微镜下，通过微拍，直接对每孔细胞生长状况进行拍摄，结果如图5所示，之后加CCK-8(10％比例)，培养箱里放置1h之后，于酶标仪上测450nm吸光度值。进行细胞毒活性计算之后，结果如图4所示。
实施例4
酶标法分析His6-PmTNF-α对L02细胞的毒副作用
7ml 1640(10％FBS)培养基培养L02细胞，24h。除去培养基后，1ml胰酶消化30s，加1ml培养基终止消化，重悬细胞，吸取到15ml离心管中，1000g，20℃，3min。出去上清之后再加2ml培养基(1640,10％FBS)，重悬细胞，吸取1ml到50ml离心管中，加10％FBS 1640培养基稀释，计数板计数，使胞数目为3×105个/ml。吸取上述稀释的细胞悬液种入24孔板中，每孔500μl，37℃，5％CO2，培养24h。除去培养液，用10％FBS 1640培养基配置不同浓度TNF-α稀释液(分野生型和突变型两组)，之后每孔加500μl，使TNF-α终浓度达到105、104、103、102、10、100、10-1、10-2、10-4ng/ml，设置空白、PBS对照组。37℃，5％CO2，培养24小时，之后按照南京建成生物工程研究所乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒步骤检测TNF-α对L02细胞的细胞毒副，作用结果如图6所示。
Claims (6)
1.一种家猪肿瘤坏死因子TNF-α突变体基因，其特征在于它的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种由权利要求1所述家猪肿瘤坏死因子TNF-α突变体基因编码的蛋白，其特征在于它的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种家猪肿瘤坏死因子TNF-α基因定点突变方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取家猪脾脏组织总RNA，试剂盒转录为第一链cDNA
(2)设计长片段引物进行突变体基因的构建
正义寡核苷酸引物F1：5’-AAGCGCAAGCCCGTCGCCCA-3’
反义寡核苷酸引物R1：5’-TCAGAAGGCAATGATCCCAA-3’
(3)以F1、R1为引物，逆转录所得的cDNA为模板，进行PCR扩增；所得的PCR产物克隆入pMD-19T载体，并进行碱基序列测定；得到家猪肿瘤坏死因子—TNF-α—突变体基因，其序列SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组表达载体pET28-mTNF-α的构建方法，其特征在于：以猪第一链cDNA为模版，F2、R2为引物进行PCR，F2、R2的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，得到目的基因，即带酶切位点家猪肿瘤坏死因子突变体基因PmTNF-α，和pET28a载体用BamHⅠ和HindⅢ酶切,T4DNA Ligas连接酶切后的载体和目的基因，得到pET28-PmTNF-α重组质粒。
5.一种家猪肿瘤坏死因子突变体蛋白的表达纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)把含有pET28-PmTNF-α重组质粒的菌种复苏、扩大培养及诱导表达，取-80℃冻存菌种50μl接种到加有5μl Kan的5ml LB培养基中复苏12小时，把复苏后的菌液加到500ml灭菌LB培养基中，并加500μl Kan抗生素，37℃，200rpm，摇2h；加1M IPTG 100μl，使终浓度达到0.2mM，16℃，150rpm，诱导20h；收菌，-70℃，冻存过夜；所述pET28-PmTNF-α重组质粒通过权利要求4的方法构建得到；
(2)超声破碎：30ml PBS重悬冻存菌体，超生破碎，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清；
(3)镍柱层析：配制洗脱缓冲液20mM、50mM、100mM、250mM咪唑各200ml，先用20mM咪唑平衡柱子，上样结束后，开始洗脱；先用20mM咪唑洗脱，之后分别用50mM、100mM咪唑洗脱，最后250mM咪唑，此时洗脱峰为目的蛋白；
(4)透析并浓缩：将收集到的250mM咪唑洗脱蛋白，放到透析袋中，于4℃，1L PBS中透析24小时，之后用PEG20000浓缩到合适浓度。
6.一种权利要求1所述家猪肿瘤坏死因子TNF-α突变体基因在制备猪免疫增强剂或相关疾病的免疫佐剂、或者生物药物制剂中的应用。
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