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CN104560766A - 一种游动放线菌菌株及其应用 - Google Patents

一种游动放线菌菌株及其应用 Download PDF

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CN104560766A CN201310501389.3A CN201310501389A CN104560766A CN 104560766 A CN104560766 A CN 104560766A CN 201310501389 A CN201310501389 A CN 201310501389A CN 104560766 A CN104560766 A CN 104560766A
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Abstract

本发明公开了一株游动放线菌菌株及其应用，该菌株命名为游动放线菌(Actinoplanes？sp.)HS-16-20，保藏编号为CGMCC？NO.7294。本发明的游动放线菌HS-16-20可产生非达霉素(Fidaxomicin)，该化合物对各种革兰氏阳性细菌病原体，特别是针对艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium？difficile)具有很好的抑制作用，可有效治疗艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)，显示出很好的商业开发前景。

Description

一种游动放线菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及一株游动放线菌及其在制备非达霉素(Fidaxomicin)中的应用。 
背景技术
由艰难梭菌感染所导致的腹泻及结肠炎和其他肠道疾病具有高致病性和高致死率的特性。早在2003年，艰难梭菌就在加拿大多个省引起感染疫情暴发。截至2008年10月，高致病性和高病死率的艰难梭菌核糖体027型，至少引起了美国40个州的医院内感染暴发。在北美发现027型后不久，欧洲有17个国家也相继出现了艰难梭菌的暴发流行。欧洲已将艰难梭菌列为强制监测病原体，在欧洲疾病预防控制中心(ECDC)领导下分别于2002年、2005年、2008年进行了三次全欧洲流行病学调查。长期以来，艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)治疗一直是医学界研究的重大课题，寻找治疗CDAD的新药更是药物研究人员的重要任务。 
2011年美国FDA批准Optimer药业公司生产的大环内酯类新药非达霉素(Fidaxomicin)，其商标名为Dificid，用于治疗艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)。非达霉素为R-台勾霉素B。Robert等人1986年在US4918174专利首次公开了指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL18085)能够发酵产生一种能够有效抑制革兰氏阳性菌的抗生素台勾霉素(Tiacumicin)及其结构。闰年霉素(Lipiarmycins)是一族与Tiacumicin非常相关的一系列化合物，闰年霉素(Lipiarmycins)A3和B3分别与台勾霉素(Tiacumicins)B和C相同(J.Antibiotics，1988，308-315.)。US3978211专利公开了闰年霉素(Lipiarmycins)及其生产菌德干高原游动放线菌(Actinoplanes deccanensis A／10655ATCC21983)。J.Antimicrobial Chemotherapy2008，62,713-719，报道了Lipiarmycin A3的生产菌Catellatospora sp.Bp3323-81。以上Tiacumicin和Lipiarmycin的产生菌存在目的产物(Tiacumicin和Lipiarmycin)效价低、产量波动性大、不稳定、生产成本高等缺点，因此寻找一种新的高效非达霉素(Fidaxomicin)的生产菌种的工作仍然在继续进行中。 
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的游动放线菌HS-16-20(Actinoplanes sp.HS-16-20)，具有生产非达霉素的能力，其保藏编号为CGMCC NO.7294。 
本发明的目的还在于提供了一种游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)(Actinoplanes sp.HS-16-20)，其可应用于生产非达霉素或其类似物，或者应用于生产含有非达霉素的药物组合物。 
本发明还提供了一种采用游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)制备非达霉素或其类似物的方法。该方法包括采用游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)在含有可同化的碳源、氮源的营养培养基里进行有氧发酵的过程。 
优选的，上述可同化的碳源选自蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、工业糖蜜、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、糊精、淀粉、山梨醇、水杨苷、肌醇、甘露醇、甘油、甘氨酸、菊粉之一或者上述物质的组合。 
优选的，上述可同化的氮源选自牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母抽提物、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐、硝酸盐之一或上述物质的组合。 
优选的，所述发酵培养的温度为20℃-40℃，优选25℃-30℃，pH为6.0-8.0，优选7.0，培养时间为144-240小时，通气量为0.5-1.0vvm。 
优选的，所述发酵方式为液体深层发酵。 
本发明还提供了分离纯化非达霉素的方法。该方法包括将发酵液通过萃取、浓缩、柱层析纯化等步骤制备该化合物。 
非达霉素可通过以下条件进行HPLC检测： 
色谱柱为C18柱，5μm，4.6×250nm； 
流动相A相：0.05％磷酸(v／v)； 
流动相B相：90％乙腈(v／v)； 
流速：1.00ml／min； 
检测波长：250nm； 
程序：0-20min：5％-100％B相；20-21min：100％B相；21-22min：100％-5％B相； 
进样量：10μl。 
本发明所采用的非达霉素产生菌为游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)。 
本发明游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)的微生物菌种于2013年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.7294，分类命名为游动放线菌Actinoplanessp.，并登记入册，证明存活。 
本发明游动放线菌HS-16-20的主要生物学特征为：菌落颜色橘黄色，菌落形态较圆整，表面有皱褶凸起，直径大小为中型(6mm左右)，菌落稍湿润，菌丝与培养基结合较疏松，易挑取。 
本发明描述了游动放线菌HS-16-20的形态学和分子水平上的特征，经过与已知台勾霉素和闰年霉素产生菌进行形态学和分子水平的比较，可以认定游动放线菌HS-16-20属于游动放线菌，但它不同于已知的台勾霉素和闰年霉素产生菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL18085，Actinoplanes deccanensis A／10655ATCC21983，Catellatospora sp.Bp3323-81，而是一种全新的菌种。 
本发明游动放线菌HS-16-20与现有技术中非达霉素的产生菌相比具有以下优点： 
本发明游动放线菌HS-16-20提高了发酵单位。本发明游动放线菌HS-16-20产生非达霉素或其类似物的产量较原始菌种有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。 
附图说明
图1为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的HPLC图谱。 
图2为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的ESI／MS图谱。 
图3为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的1H-NMR图谱。 
图4为本发明实施例8制备得到的非达霉素纯品的13C-NMR图谱。 
具体实施方式
实施例1：菌株来源 
游动放线菌HS-16-20(Actinoplanes sp.HS-16-20，CGMCC NO.7294)系从浙江台州白云山顶土壤样品中分离得到的一株放线菌。 
在台州白云山划定的区域内进行交叉采样，随机取5个采样点，每个点取土壤样品10g，放入锥形瓶内，混合均匀后取样品10g，加入到一个装有90mL去离子水的锥形瓶中(瓶中有一个磁力搅拌器)，旋涡搅拌30min，使其充分混匀制成悬浊液，即为10-1菌液。用稀释涂布平板法将上述悬浊液与无菌水按体积比1：9稀释成10-2，10-3，10-4，10-5浓度，取不同稀释倍数菌液0.1mL，涂布于IPS2培养基平板中，用无菌涂棒在培养基表面轻轻涂布，室温下静置30min后置于28℃恒温培养箱。待菌落长出后，观察记录菌落颜色、透明度、菌落表面、边缘形态，检查其特征是否一致。挑选形态特征一致的菌落进行点种操作，并将点种后的平板置于28℃恒温培养箱培养8天，待菌丝成熟后挑出1000株初筛菌株，然后在无菌条件下用接种铲将上述初筛菌株刮下，分别接种到250mL锥形瓶中(每瓶含有25mL种子培养基)，于28℃条件下振荡培养28小时，得种子液。将种子液以15-20％的移种量分别接种到250mL锥形瓶中(每瓶含有20mL发酵培养基)，于28℃条件下振荡培养8天后，经HPLC检测所得发酵液中非达霉素的含量，挑选出最高产菌株即游动放线菌HS-16-20(Actinoplanes sp.HS-16-20)。 
实施例2：游动放线菌HS-16-20(Actinoplanes sp.HS-16-20，CGMCC NO.7294)的形态学和培养学特征 
参照《常见细菌系统鉴定手册》、《分子克隆实验指南》及《中国药典》(2010版)等书中的有关内容进行实验。菌株的形态学和培养学特征实验采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一号、苹果酸钙、LB、YMS和查氏培养基10种培养基，28℃培养7～10天后，观察菌丝体的颜色及色素情况。结果见表1。 
表1菌株HS-16-20在10种培养基上的培养特征 
实施例3：游动放线菌HS-16-20(Actinoplanes sp.HS-16-20，CGMCC NO.7294)的生理生化特征 
碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％。其结果见表2。 
无机氮源的利用：采用ISP9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％。其结果见表2。 
降解试验和NaCl耐受实验采用基础培养基为GYEA(pH6.8)，降解实验结果见表3；NaCl耐受实验结果为：NaCl耐受性良好，10％的NaCl存在仍能生长。 
氧化酶和过氧化氢酶试验、pH试验和温度试验均采用YMS培养基。其结果为：菌株在14℃到45℃之间均能生长，最适生长温度为28℃；pH5.0-7.5均能够生长，最适宜的范围为pH6.5-7.0；氧化酶和过氧化氢酶试验结果见表4。 
M.R、V-P和脲酶试验：采用《常见细菌系统鉴定手册》方法。其结果见表4。 
生理生化试验：除温度实验外，均为28℃培养7～9天。其结果见表4。 
表2菌株HS-16-20的碳源和氮源的利用情况 
碳源 生长情况 碳源 生长情况 无机氮源 生长情况
D-葡萄糖 3 水杨苷 3 硫酸铵 +
D-棉子糖 1 D-乳糖 3 硝酸钾 +
D-木糖 1 半乳糖 3    
D-山梨醇 2 肌醇 2    
L-阿拉伯糖 1 甘露醇 2    
甘油 2 甘氨酸 1    
麦芽糖 3 木聚糖 3    
D-果糖 2 菊粉 2    
D-蔗糖 2 鼠李糖 2    
表3菌株HS-16-20的降解试验结果 
降解物 降解物浓度 结果 降解物 降解物浓度 结果
[0049] 
腺嘌呤 0.5％ 0 酪蛋白 1.0％ 1，-
鸟嘌呤 0.5％ 4，- 酪氨酸 1.0％ 4，-
黄嘌呤 0.4％ 4，- Tween-40 1.0％ 3，-
次黄嘌呤 0.4％ 4，- Tween-60 1.0％ 3，-
木聚糖 0.4％ 4，+ Tween-80 1.0％ 3，+
表4菌株HS-16-20主要的生理生化特征 
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 - 硫化氢产生 - 过氧化氢酶 -
淀粉水解 + V.P实验 - 氧化酶 -
牛奶凝固 - M.R实验 - 脲酶试验 +
牛奶胨化 - 硝酸盐还原 +    
备注：表1-4中：0：无生长；1：生长很弱；2：能生长；3：生长良好；4：生长最好；+：阳性；-：阴性。 
实施例4：16SrDNA序列分析以及菌种鉴定 
收集待测菌株的新鲜菌体，采用溶液菌酶法改进的Pitcher法(Letters in Applied Microbiology,1989，8：151-156)提取总DNA模板，采用通用引物(27F和1495R)进行16S rRNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，直接进行序列测定，测序由上海生工生物工程技术有限公司进行。所测的16S rDNA序列经校对后与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。 
菌株HS-16-20(CGMCC NO.7294)16S rDNA序列与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表5(表中只列出同源性较高的菌株)。 
表5菌株HS-16-20和相关菌株的同源性 
菌株HS-16-20(CGMCC NO.7294)通过16S rDNA区域测序发现其和游动放线菌(Actinoplanes sp.)有很高同源性，最高的达99％，同时对菌株HS-16-20 (CGMCC NO.7294)进行表观特征试验，发现该菌株和游动放线菌(Actinoplanes sp.)分类相关参数非常接近，故将菌株HS-16-20(CGMCC NO.7294)鉴定为游动放线菌(Actinoplanes sp.)菌株。 
游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)和其他台勾霉素和闰年霉素产生菌的比较 
据US4918174报道，台勾霉素产生菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL18085菌种能够在苹果酸钙培养基中生长，而在查氏蔗糖培养基中较少生长，基质菌丝呈橘黄色，无气生菌丝，其生理生化特征为：明胶液化阴性(-)、淀粉水解阳性(+)、牛奶凝固阴性(-)、牛奶胨化阳性(+)、硫化氢产生阳性(+)、硝酸盐还原为阳性(+)；而游动放线菌HS-16-20在查氏培养基中能生长，有气生菌丝、牛奶胨化阴性(-)、硫化氢产生阴性(-)。 
US3978211报道闰年霉素产生菌Actinoplanes deccanensis A／10655ATCC21983在苹果酸钙培养基和查氏蔗糖培养基中较少生长，在不同培养基中菌落颜色从浅黄到橘黄，无气生菌丝，其生理生化特征为：明胶液化阳性(+)、淀粉水解阳性(+)、牛奶凝固阴性(-)、牛奶胨化阴性(-)、硫化氢产生阴性(-)、硝酸盐还原阳性(+)；而游动放线菌HS-16-20在苹果酸钙培养基能生长和查氏蔗糖培养基能生长、在不同的培养基有气生菌丝、明胶液化阴性(-)。 
Antimicrobial Chemotherapy2008，62,713-719和西北农林科技大学学报(自然科学版)2007,35(10)，213-218报道闰年霉素产生菌Catellatospora sp.能够在高氏一号培养基中生长，在其他培养基中生长状况未见报道，基质菌丝不断裂，在琼脂表面直接长出单个或成丛的短孢链，无气生菌丝，其生理生化特征为：淀粉水解阳性(+)、牛奶凝固阴性(-)、牛奶胨化阳性(+)、硫化氢产生为阴性(-)；而游动放线菌HS-16-20在高氏一号培养基中有气生菌丝、牛奶胨化阴性(-)。 
结合前述本发明中的游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)的形态学、培养特征、生理生化特征和DNA序列鉴定结果可知，菌株HS-16-20(CGMCC NO.7294)属于游动放线菌属，它不同于已知的台勾霉素(Tiacumicin)和闰年霉素(Lipiarmycins)产生菌，故游动放线菌HS-16-20(Actinoplanes sp.HS-16-20)(CGMCC NO.7294)是一株全新的菌种。 
实施例5：制备非达霉素 
(1)平板菌落的制备与培养 
平板采用ISP2培养基(g/L)：葡萄糖4，酵母抽提物4，麦芽抽提物10，琼脂15，蒸馏水1000mL，pH7.3，灭菌压力1.05kg／cm2，20min，冷却到50-60℃倒平板，接入一环菌体经28±1℃培养8天后，菌丝成熟。 
(2)种子液的制备与培养 
种子培养基配方(g／L)：蔗糖2，山梨醇3，棉籽饼粉3，花生饼粉1.5，CaCO30.6，MgSO4.7H2O0.3，pH7.2，摇瓶装液量为25mL／250mL，经121℃灭菌30分钟。菌体接种量为105106c.f.u.／mL，培养温度28±1℃，250rpm，摇床振荡培养28小时，此时培养液pH6.8-7.0，菌丝浓度25-30％(体积百分比)。 
(3)发酵液的制备与培养 
发酵培养基配方(g/L)：蔗糖10，山梨醇2，可溶性淀粉3，(NH4)2SO40.5，牛肉膏2，花生饼粉1，KH2PO40.04，pH7.0，摇瓶装液量为20mL／250mL，经121℃灭菌20分钟。将种子液以15-20％(体积百分比)的接种量接入。在28±1℃，250rpm摇床振荡培养8天，发酵结束后进行HPLC检测，测得发酵单位为5250μg／mL。 
实施例6：制备非达霉素 
平板菌落的制备与种子液的制备见实施例5。 
发酵培养基的配方组成(g／L)：麦芽糊精6，可溶性淀粉8，乳糖2，黄豆饼粉1.5，麸质粉1，酵母粉1，CaCO30.4，KCl0.2，MgCl2.7H2O0.2，pH7.0，摇瓶装液量为25mL／250mL，经121℃灭菌20分钟。将种子液以20％(体积百分比)的接种量接入。在30±1℃，250rpm摇床振荡培养8天，发酵结束后进行HPLC检测，测得发酵单位为3892μg／mL。 
实施例7：制备非达霉素 
平板菌落的制备与种子液的制备见实施例5。 
发酵培养基的配方组成(g／L)：工业糖蜜8，果糖2，甘油3，麦芽糖3，蛋白胨1，胰蛋白胨1.5，酵母浸膏0.5，牛肉浸膏0.5，尿素0.2，柠檬酸三胺0.5，MgSO4.7H2O0.2，CaCl20.4，pH7.0，摇瓶装液量为40mL／500mL， 经121℃灭菌20分钟。将种子液以10％(体积百分比)的接种量接入。在30±1℃，250rpm摇床振荡培养9天，发酵结束后进行HPLC检测，测得发酵单位为3156μg／mL。 
实施例8：制备和分离纯化非达霉素 
(1)种子罐种子液的制备 
在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比同实施例5)，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入100mL摇瓶种子液，培养温度为28±1℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm，培养24小时，此时培养液pH6.8-7.0，菌丝浓度25-30％(v／v)。 
(2)发酵罐培养基的配制与培养 
发酵培养基的配方与前述实施例5相同，但要添加1％PPG作为消泡剂，发酵罐体积50L，投料体积为35L，pH7.0，于121℃条件下蒸汽灭菌20分钟，冷却后，接入约3.5L种子罐培养液，发酵温度28±1℃，搅拌转速200-300rpm，通气量0.8-1.0vvm，发酵培养8天，放罐，测得非达霉素发酵单位为4855μg／mL。 
(3)发酵液萃取 
取上述放罐后的发酵液30L进行板框过滤，滤饼加入30L无水乙醇浸泡，搅拌均匀，室温静置30min，收集上清液有机相，合并另存。 
(4)浓缩有机相和树脂柱柱层析纯化 
上述合并后的有机相，在40℃水浴下，-0.1Mpa真空浓缩至15L左右。浓缩液采用4L大孔吸附树脂HZ20吸附，采用无水乙醇洗脱，收集洗脱液，并真空浓缩至干，得到粗品72.8g。 
(5)粗品的纯化和纯品的结构鉴定 
将上述粗品全部溶于甲醇，并上样于制备柱(该制备柱中加入100目-200目的C18反相制备填料120g)，采用50％乙腈(v／v)为洗脱液，洗脱，分段收集馏分，其中色谱纯度高于99％，各杂质低于0.1％的馏分作为主馏分。将主馏分干燥后得到纯品29.1g，纯度为99.7％。所得的纯品经HPLC分析，HPLC图谱如图1所示。HPLC条件为：色谱柱为C18柱，5μm，4.6×250nm；流动相A相： 0.05％磷酸(v／v)；流动相B相：90％乙腈(v／v)；流速：1.00ml／min；检测波长：250nm；程序：0-20min：5％-100％B相；20-21min：100％B相；21-22min：100％-5％B相；进样量：10μl。所得的纯品经过MS分析确定其分子量为1058.04，通过 1H-NMR及13C-NMR分析，确定其为非达霉素(Fidaxomicin)，结构如下： 
实施例9：几种不同菌种生产非达霉素能力比较 
分别采用上述实施例5的培养基配方和培养条件培养本发明游动放线菌HS-16-20(CGMCC NO.7294)和其他非达霉素产生菌，分别测得其效价，结果见表6。 
表6不同菌种生产非达霉素的产能对比表 
结合前述四种菌种在形态学、培养特征、生理生化特征和DNA序列鉴定结果可知，这种产能的不同可能是由于其菌种特性的不同导致的，反过来这种产能的不同也可间接证明本发明Actinoplanes sp.HS-16-20(CGMCC NO.7294)菌种是一株全新的菌种。 
综合对比上述各菌种，本发明Actinoplanes sp.HS-16-20(CGMCC NO.7294)产非达霉素的能力较其他菌种有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。 

Claims (6)

1.一种游动放线菌(Actinoplanes sp.)HS-16-20，其保藏编号为CGMCC NO.7294。
2.根据权利要求1所述的游动放线菌HS-16-20在制备非达霉素中的应用。
3.一种发酵生产非达霉素的方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的游动放线菌HS-16-20在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、工业糖蜜、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、糊精、淀粉、山梨醇、水杨苷、肌醇、甘露醇、甘油、甘氨酸、菊粉之一或者上述物质的组合。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母抽提物、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐、硝酸盐之一或上述物质的组合。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为20℃～40℃，pH为6.0-8.0，培养时间为144-240小时。
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