CN104558097A - 肽的酰化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酰化肽或蛋白质的氨基的方法，该方法包括：a)在碱存在下，在质子溶剂中，将具有至少一个游离氨基的肽或蛋白质与通式I所示的酰化试剂反应，其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是亲脂部分；R3表示与羧基连接后形成活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯的基团如N-羟基丁二酰亚胺基；和R4选自氢、C1-12烷基和苄基；和b)如果R4不是氢，在碱性条件下皂化酰化了的肽酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽。本发明酰化肽或蛋白质的氨基的方法采用质子溶剂，收率高，如通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有85％以上(峰面积)的产品，且质子溶剂毒性低价格低廉。
Description
技术领域
本发明涉及将一个或多个酰基引入肽或蛋白质中的方法。更具体地说，本发明涉及将天然存在的GLP-l或其类似物中含有赖氨酸残基的ε-氨基酰化的改进方法。
背景技术
利拉鲁肽(liraglutide，1)是人胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的类似物，由丹麦诺和诺德公司研制，适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的2型糖尿病患者。
利拉鲁肽(liraglutide，1)的结构式为Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]。
中国专利申请CN1344248提供了酰化肽或蛋白质上的一个或多个氨基的方法，该方法包括：在碱性条件下，在非质子传递极性溶剂和水的混合物中，将具有至少一个游离氨基的肽(或蛋白质)与酰化试剂反应；该方法采用高沸点的N-甲基吡咯烷酮(NMP)与水的混合溶剂作为反应溶剂，其收率通过分析RP-HPLC，发现反应混合物含有77％(峰面积)的Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]。
发明内容
术语定义
术语“C3-39烷基”、“C3-39链烯基”和“C3-39链二烯基”分别包括C3-39直链和支链烃基，优选为直链饱和、单不饱和二不饱和的C3-39烃基。C3-39烷基的具体实例为庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。
术语“甾族残基”是指亲脂基团，其与和R2相连的羰基一起衍生于甾族羧酸，即，衍生于三-、四-和五环全饱和或部分不饱和C16-36烃，所述基团R2-C(＝O)-的实例是石胆酸酰基(lithocholoyl)、脱氧胆酸酰基(deoxycholoyl)和胆酸酰基(choloyl)。
术语“约”或“大约”通常是指在给定的值或范围的10％以内，适当地在5％以内或者是在3％以内。或者，对于本领域普通技术人员而言，术语“约”或“大约”表示在平均值的可接受的标准误差范围内。
一种酰化肽或蛋白质的氨基的方法，该方法包括：
在碱存在下，在质子溶剂中，将具有至少一个游离氨基的肽或蛋白质与通式I的酰化试剂进行酰化反应，
其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是亲脂部分；R3表示羧基的保护基团，可以是C1-C10的烷基或N-羟基丁二酰亚胺基式(a)和R4选自氢、C1-12烷基和苄基；和b)如果R4不是氢，在碱性条件下皂化酰化了的肽酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽。
在一些实施例中，所述的肽或蛋白质为GLP-1和其类似物，诸如Arg26-GLP-1[7-37]、Arg34-GLP-1[7-37]、Lys26-GLP-1[7-37]、Arg26,34Lys36-GLP-1[7-37]、Arg26,34Lys38-GLP-1[7-38]、Arg26,34Lys39-GLP-1[7-39]、Arg26,34Lys40-GLP-1[7-40]或Arg26Lys36-GLP-1[7-37]，在一些实施例中，所述GLP-1的类似物为Arg34-GLP-1[7-37]。
在一些实施例中，所述的肽或蛋白质为GLP-2和其类似物，诸如Lys20GLP-2(1-33)、Lys20Arg30GLP-2(1-33)、Arg30Lys34GLP-2(1-34)、Arg30Lys35GLP-2(1-35)、Arg30,35Lys20GLP-2(1-35)或Arg35GLP-2(1-35)。
在一些实施例中，所述的肽或蛋白质为exendin和其类似物。根据本发明，可被N-酰化的exendin和其类似物的实例是exendin类似物和其截短的类似物，例如，exendin-3和exendin-4。
在一些实施例中，在通式I中，整数n为0-8；在一些实施例中，n为0-6；优选n是0-4，例如，n＝0-2，例如，当n为0时是天冬氨酸，当n为1时是谷氨酸。
在一些实施例中，通式I中的R1表示游离酸基(COOH)或酯基(COOR4)。当R1是酯基时，R4选自可在碱性条件下通过水解(以相应的醇的形式)除去的基团。所述基团的实例是C1-12烷基，例如，甲基、乙基、丙-1-基、丙-2-基、丁-1-基、丁-2-基、2-甲基丙-1-基、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)和己-1-基或苄基。
在一些实施例中，通式I中的R2表示被引入到肽或蛋白质中的亲脂部分，在一些实施例中，所述亲脂部分选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基。在一些实施例中，C3-39烷基是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基或十九烷基。在一些实施例中，所述的亲脂部分是C7-25烷基、C7-25链烯基、C7-25链二烯基或甾族残基。在一些实施例中，所述的亲脂部分是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、石胆酸酰基(lithocholoyl)、脱氧胆酸酰基(deoxycholoyl)和胆酸酰基(choloyl)。
在一些实施例中，所述的酰化试剂是N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯，其结构如式(Ia)所示：
在一些实施例中，在碱性条件下，在质子溶剂中，进行通式I所示的酰化试剂与肽或蛋白质进行酰化反应。
在一些实施例中，所述的质子溶剂为醇类溶剂或水，或醇类溶剂与水的混合溶剂；在一些实施例中，所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、或其组合；在一些实施例中，所述的质子溶剂为甲醇，在一个实施例中，所述的质子溶剂为水。在一些实施例中，在混合溶剂中，醇类溶剂与水的体积比为大约7:1至大约1:10，在一个实施例中，所述醇类溶剂与水的体积比为大约1:1。
在一些实施例中，相对于待酰化的肽的氨基数量，通常使用稍稍过量的通式I所示的酰化试剂。考虑到肽中的氨基数量，上述比例通常为大约1∶1至大约1∶10，在一些实施例中为大约1∶2.0至大约1∶5.0，在另一些实施例中为大约1∶3.0至大约1∶4.0。
在一些实施例中，反应温度一般保持在5℃-35℃，在某些实施例中为大约20℃。
在一些实施例中，所述的碱为烷基胺选自三乙基胺、二乙胺、N，N-二异丙基乙基胺或苯胺的一种或几种；在一个实施例中，所述的碱为三乙胺；在一些实施例中，相对于1.0摩尔的肽，所述烷基胺的用量为40.0摩尔以上，在一些实施例中为大约50摩尔至大约300摩尔，在一个实施例中为大约60摩尔。
在一些实施例中，所述酰化反应是使用1∶1-1∶5摩尔比的蛋白质和通式I所示的酰化试剂。通常在15-30℃，例如，在20℃，预先将肽溶解在质子溶剂中，三烷基胺，随后加入酰化试剂。通常要使反应完全进行(用HPLC监控)，反应完全进行所需时间通常为0.2-4小时，例如，0.2-1小时。当使用R4是氢的酰化试剂时，直接得到带有亲脂部分和游离羧基的N-酰化的肽或蛋白质。
另外，即，当R4是C1-12烷基或苄基时，在碱性条件下将N-酰化的肽酯(或蛋白质酯)皂化，以得到N-酰化的肽或N-酰化的蛋白质。皂化反应通常在0.01-4.0M的诸如氢氧化钠或氢氧化钾的碱金属氢氧化物溶液中进行。溶液pH一般为10-14。反应通常在0-40℃，例如，在室温下，进行0.1-12小时，优选进行0.5-4小时。反应完成后，通过例如在等电pH值下沉淀和/或通过制备HPLC可提纯产物。因此，R4是C1-12烷基或苄基的各种酰化试剂是本发明方法的优选实施方案。
本发明酰化肽或蛋白质的氨基的方法采用质子溶剂，收率高，如通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有85％以上(峰面积)的产品，且质子溶剂毒性低价格低廉；另外，本发明的制备方法，在加酰化试剂之前无需加入氢氧化钠溶液对肽进行预处理，操作简便。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得，如Arg34-GLP-1[7-37]根据PCT专利申请WO/9808872公开的方法制备；N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯根据CN 00805003.1公开的方法制备。
本发明中，mg表示毫克，h表示小时，g表示克，ml表示毫升，min表示分钟，M表示mol/L。
实施例1Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]的制备
将2.62g的Arg34-GLP-1[7-37]溶解于水(187ml)和乙醇(187ml)的混合溶液中，控温15℃，搅拌下加入4.73g三乙胺，然后加入1.13g的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯。反应2h后，取反应液0.5ml，加入乙腈:水＝1:1溶液稀释至1.5ml，送RP-HPLC检测，当液相检测Arg34-GLP-1[7-37]的含量低于1％(峰面积)后，终止反应。后处理：用1M HAc溶液调pH至中性，淬灭反应。
收率：通过RP-HPLC分析，表明反应混合物含有88.33％(峰面积)的Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
实施例2Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]的制备
将2.62g的Arg34-GLP-1[7-37]溶解于370ml的甲醇中，控温35℃，搅拌下加入4.73g N，N-二异丙基乙胺，然后加入1.13g N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯。反应2h后，取反应液0.5ml，加入乙腈:水＝1:1溶液稀释至1.5ml，送RP-HPLC检测，当液相检测Arg34-GLP-1[7-37]的含量低于1％(峰面积)后，终止反应。后处理：用1mol/L HAc溶液调pH至中性，淬灭反应。
收率：通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有88.33％(峰面积)的Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]。
实施例3Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]的制备
将2.62g的Arg34-GLP-1[7-37]溶解于370ml的水中，控温20℃，搅拌下加入4.73g三乙胺，然后加入N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯(1.13g)。反应2h后，取反应液0.5ml，加入乙腈：水＝1:1溶液稀释至1.5ml，送RP-HPLC检测，当液相检测Arg34-GLP-1[7-37]的含量低于1％(峰面积)后，终止反应。后处理：用1mol/L HAc溶液调pH至中性，淬灭反应。
收率：通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有87.76％(峰面积)的Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]。
实施例4Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]的制备
将200mg的Arg34-GLP-1[7-37]溶解于20ml乙醇/水溶液体系(体积比＝1:2)中，搅拌下加入1359mg三乙胺，然后加入85.6mg的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯。在大约30℃下反应2h后，取反应液0.5ml，加入乙腈:水＝1:1溶液稀释至1.5ml，送HPLC检测，当液相检测Arg34-GLP-1[7-37]的含量≤于0.5％(峰面积)后，终止反应。后处理：用1mol/L HAc溶液调pH至中性，淬灭反应。经柱层析纯化，得Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]固体.
收率：通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有87.11％(峰面积)的Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-1[7-37]。
实施例5本发明中产品纯度RP-HPLC检测方法
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C8150*4.6mm 3.5um
流速：1.0mL/min 柱温：35℃
检测波长：210nm 运行时间：31min
流动相A：乙腈 流动相B：0.1％磷酸水溶液
稀释剂为乙腈:水＝1:1
梯度洗脱：
| 时间(min) | A | B |
| 0 | 25 | 75 |
| 5 | 40 | 60 |
| 16 | 50 | 50 |
| 19 | 90 | 10 |
| 25 | 90 | 10 |
| 26 | 25 | 75 |
| 31 | 25 | 75 |
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (10)
1.一种酰化肽或蛋白质的氨基的方法，该方法包括：
在碱存在下，在质子溶剂中，将具有至少一个游离氨基的肽或蛋白质与通式I所示的酰化试剂进行酰化反应，
其中，n＝0-8；R1是COOR4；R4选自氢；
R2是亲脂部分；R3表示羧基的保护基团，可以是C1-C10的烷基或N-羟基丁二酰亚胺基式(a)所示
2.根据权利要求1所述的方法，所述的酰化试剂是N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯，其结构如式(Ia)所示：
3.根据权利要求1所述的方法，所述的肽或蛋白质为GLP-1和其类似物，其为Arg26-GLP-1[7-37]、Arg34-GLP-1[7-37]、Lys26-GLP-1[7-37]、Arg26,34Lys36-GLP-1[7-37]、Arg26,34Lys38-GLP-1[7-38]、Arg26,34Lys39-GLP-1[7-39]、Arg26,34Lys40-GLP-1[7-40]，或者为Arg34-GLP-1[7-37]。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的质子溶剂为醇类溶剂或水，或醇类溶剂与水的混合溶剂，或者为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、或其组合；或者为甲醇，或者为水。
5.根据权利要求1所述的方法，所述的质子溶剂为乙醇与水的混合溶剂。
6.根据权利要求1所述的方法，在所述的混合溶剂中，醇类溶剂与水的体积比为大约7:1至大约1:10，。
7.根据权利要求1所述的方法，所述的碱为烷基胺，选自三乙基胺、二乙胺、N，N-二异丙基乙基胺或苯胺的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的方法，相对于1.0摩尔的肽，所述烷基胺的用量为40.0摩尔以上，或者为大约50摩尔至大约300摩尔，或者为大约60摩尔。
9.根据权利要求1所述的方法，所述酰化反应温度为5℃-35℃，或者为大约20℃。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其包括：将2.62g的Arg34-GLP-1[7-37]溶解于370ml的水中，控温20℃，搅拌下加入4.73g三乙胺，然后加入N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基丁酰亚氨酯(1.13g)，反应2h后，取反应液0.5ml，加入乙腈:水＝1:1溶液稀释至1.5ml，送RP-HPLC检测，当液相检测Arg34-GLP-1[7-37]的含量低于1％(峰面积)后，终止反应，后处理：用1mol/L HAc溶液调pH至中性，淬灭反应。2 -->
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1163574A (zh) * | 1994-11-17 | 1997-10-29 | 伊莱利利公司 | 酰化的胰岛素类似物 |
| CN1171742A (zh) * | 1994-11-17 | 1998-01-28 | 伊莱利利公司 | ε－氨基的选择性酰化 |
| CN1344248A (zh) * | 1999-03-17 | 2002-04-10 | 诺沃挪第克公司 | 肽的酰化方法和新酰化剂 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |