CN104557647B

CN104557647B - 维生素d肟类衍生物、合成方法及其应用

Info

Publication number: CN104557647B
Application number: CN201510015969.0A
Authority: CN
Inventors: 方志杰; 李红亮
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2015-01-13
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2035-01-13
Also published as: CN104557647A

Abstract

本发明公开了一种维生素D肟类衍生物、合成方法及其应用。将化合物Ⅰ与盐酸羟胺进行肟化反应得到两种不同构型的维生素D₂的A环肟类衍生物(Z)-3-肟维生素D₂和(E)-3-肟维生素D₂;将化合物1.2与甲氧胺盐酸盐反应得到两种不同构型的维生素D₂的A环肟醚类衍生物(Z)-3-甲基肟醚维生素D₂和(E)-3-甲基肟醚维生素D₂。这四种维生素D类衍生物对人的肝癌细胞Hep G2和人乳腺癌细胞MCF-7具有很好抑制作用，具有潜在的药用价值。

Description

维生素D肟类衍生物、合成方法及其应用

技术领域：

本发明涉及维生素D肟类衍生物、合成方法及其应用，属于医药化学领域。

背景技术：

维生素D类化合物主要通过胆固醇类化合物(如：7-脱氢胆固醇，麦角固醇)在皮肤表层经紫外线下生成的。维生素D进入人体后再通过血液输送到肝脏被25-位羟基化酶被代谢为25-羟基维生素D₃，进而在肾脏通过1α-位羟基化得到1α,25-双羟基维生素D₃(其结构如下式所示)。1α,25-双羟基维生素D₃被广泛认为是维生素D在人体内生物活性代谢物。它具有调节人体内钙平衡、免疫系统、骨骼矿化和一些细胞的增殖及分化。这些生物功能都是通过一种维生素D受体来调节。但是长时间服用会引起高钙尿、高钙血、肾钙质沉着、肾石病和软组织钙化等副作用，使其应用受到限制。为了减少它所带来的副作用，人们开始对1α,25-双羟基维生素D₃进行修饰改性，其中一些被用来治疗癌症，另一些则被用来治疗骨质疏松症、牛皮藓以及免疫系统疾病。而进一步的研究表明，骨化三醇的主要代谢场所位于C、D环的侧链，因此人们开始关注对1α,25-双羟基维生素D₃的侧链修饰，尤其是烯、炔、酮与肟等类似物已经被合成。

其中，由于肟类衍生物具有非常好的生物活性，引起了我们极大的兴趣。首先，维生素D类肟具有良好的新陈代谢作用。例如25-酮肟具有低血钙的性质、24-肟衍生物作为一种有效的维生素拮抗剂，能够用来避免由代谢、肿瘤疾病或维生素D中毒引起的高血钙。他们通过改变与VDR结合方式控制细胞分化、分裂等。其次，许多天然存在的具有生物活性的甾体含有肟类似结构。角鲨烯-藿烯环化酶抑制剂、洋地黄、细胞色素P450抑制剂等以及合成的具有抗癌活性的甾体肟。最后，一些含肟或肟醚类物质展现出多样的生物活性。肟类具有肟具有抗癌活性、可作为脱氢奎尼酸酶的抑制剂、和抗高血糖抑制剂；肟醚具有抗菌性、治疗风湿性关节炎与抗痉挛等作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种维生素D肟类衍生物、合成方法及其应用。所述衍生物能够对人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌细胞MCF-7具有抑制作用，是一种潜在具有抗癌活性的药物候选物。

为了达到本发明的目的，本发明的技术解决方案是：一种维生素D肟类衍生物，所述的衍生物分别为(Z)-3-肟维生素D₂(1.3)、(E)-3-肟维生素D₂(1.4)、(Z)-3-甲基肟醚维生素D₂(2.1)和(E)-3-甲基肟醚维生素D₂(2.2)，其结构分别如下:

一种维生素D肟类衍生物的合成方法，包括如下步骤：

将化合物1.2、盐酸羟胺或甲氧胺盐酸盐、三乙胺或醋酸钠溶于乙醇中，加热回流搅拌，反应结束后经萃取，洗涤、干燥、浓缩后经柱层析分离得到目标化合物，其中，化合物1.2结构如下：

其中，化合物1.2、盐酸羟胺或甲氧胺盐酸盐、三乙胺或醋酸钠的投料摩尔比为1:1.2:1.3～1:2:3。

上述维生素D肟类衍生物在抑制人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌细胞MCF-7上的应用。

本发明具有以下显著优点：(1)(Z)-3-肟维生素D₂、(E)-3-肟维生素D₂、(Z)-3-甲基肟醚维生素D₂和(E)-3-甲基肟醚维生素D₂为四种新的具有潜在生理活性的维生素D衍生物；(2)首次公开了四种维生素D衍生物的合成方法；(3)合成原料易得、反应条件温和，且产率较高。(4)这四种维生素D衍生物对人肝癌细胞(HepG2)和人乳腺癌细胞(MCF-7)具有明显的抑制作用。

附图说明

图1为(Z)-3-肟维生素D₂的(¹HNMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图2为(Z)-3-肟维生素D₂的(¹³CNMR，126MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图3为(E)-3-肟维生素D₂的(¹HNMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图4为(E)-3-肟维生素D₂的(¹³CNMR，126MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图5为(Z)-3-甲基肟醚维生素D₂的(¹HNMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图6为(Z)-3-甲基肟醚维生素D₂的(¹³CNMR，126MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图7为(E)-3-甲基肟醚维生素D₂的(¹HNMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图8为(E)-3-甲基肟醚维生素D₂的(¹³CNMR，126MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

具体实施方式

如下合成路线1.1所示，(Z)-3-肟维生素D₂(1.3)和(E)-3-肟维生素D₂(1.4)的合成路线。

试剂与条件：(a)异丙醇铝，丙酮，甲苯；(b)盐酸羟胺，三乙胺，乙醇

化合物1.3和1.4的合成路线

步骤如下：

步骤a化合物1.2的合成：将维生素D₂、异丙醇铝溶于甲苯中，加入丙酮，回流反应。向反应液中缓慢加入的稀盐酸终止反应，用乙酸乙酯萃取，水洗涤两次，氯化钠水溶液洗涤两次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经柱层析后得到化合物1.2。

步骤b化合物1.3和1.4的合成：将化合物1.2、盐酸羟胺、三乙胺或醋酸钠溶于乙醇中，加热回流搅拌，反应结束后经萃取，洗涤、干燥、浓缩后经柱层析分离得到化合物1.3和1.4。

如合成路线1.2所示，(Z)-3-甲基肟醚维生素D₂和(E)-3-甲基肟醚维生素D₂的合成路线。

试剂与条件：(a)甲氧胺盐酸盐，三乙胺，乙醇

化合物2.1和2.2的合成路线

步骤如下：

将化合物1.2、甲氧胺盐酸盐、三乙胺或醋酸钠溶于乙醇中，加热回流搅拌，反应结束后经萃取，洗涤、干燥、浓缩后经柱层析分离得到化合物2.1和2.2。

以上合成步骤中，均以TLC跟踪反应进程，判断反应终点。

实施例1：化合物1.2的合成

将维生素D₂(500mg,1.26mmol)、异丙醇铝(510mg)溶于甲苯中，加入丙酮(50mL)，回流反应。TLC跟踪反应结束后，向反应液中缓慢加入的稀盐酸终止反应，用乙酸乙酯萃取，合并有机层后，有机层经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后，剩余物经柱层析(SiO₂，PE:EA＝20:1)得到化合物1.2(0.15g,30.17％)的白色固体。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ7.26(s,1H),5.92(s,2H),5.41(s,3H),5.33(s,3H),5.29–5.07(m,7H),4.94(s,3H),3.15(t,J＝6.9Hz,6H),2.72(t,J＝6.9Hz,7H),2.50(d,J＝7.2Hz,10H),2.06–1.91(m,11H),1.85(d,J＝6.4Hz,5H),1.66(t,J＝18.6Hz,24H),1.54–1.39(m,15H),1.35–1.20(m,22H),1.01(d,J＝6.6Hz,13H),0.92(d,J＝6.8Hz,11H),0.84(dd,J＝15.9,8.6Hz,22H),0.56(s,10H).¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ199.73,157.85,142.32,141.61,135.52,131.93,126.61,114.91,56.31,55.74,42.78,40.29,40.18,33.02,31.90,27.68,22.14,21.05,19.88,19.58,17.55,0.94.MS(ESI,m/z)[M+H]⁺:395.28。

实施例2：化合物1.3的合成

将化合物1.2(500mg,1.27mmol)、盐酸羟胺(106mg,1.52mmol)、三乙胺(2mL)溶于乙醇中，加热回流搅拌，TLC跟踪反应结束后，待反应混合物冷却后向反应体系中加入乙酸乙酯和水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层后，有机层经水洗、饱和的食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、将溶剂旋干后得到黄色的油状物。柱分离后(SiO₂，PE:EA＝20:1)得到淡黄色黏稠物1.3(270mg,51.90％)。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ7.26(s,1H),6.05(s,2H),5.25–5.11(m,6H),5.05(s,2H),4.97(t,J＝7.1Hz,2H),4.11(t,J＝7.1Hz,1H),2.69(d,J＝7.4Hz,4H),2.49(s,4H),2.05(s,2H),1.46(s,4H),1.32–1.20(m,8H),1.02(d,J＝6.6Hz,6H),0.92(d,J＝6.9Hz,7H),0.83(t,J＝7.2Hz,13H),0.57(s,6H).见图1¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ157.32,144.55,142.47,141.16,135.63,131.84,122.04,116.22,111.17,77.19,76.94,76.68,60.35,56.33,55.77,45.06,42.78,40.34,40.29,33.03,30.62,30.34,28.53,27.75,23.20,22.18,21.04,19.89,19.58,17.56,12.08.见图2。MS(ESI,m/z)[M+H]⁺:410.25.

实施例3：化合物1.4的合成

将化合物1.2(500mg,1.27mmol)、盐酸羟胺(106mg,1.52mmol)、三乙胺(2mL)溶于乙醇中，加热回流搅拌，TLC跟踪反应结束后，待反应混合物冷却后向反应体系中加入乙酸乙酯和水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层后，有机层经水洗、饱和的食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、将溶剂旋干后得到黄色的油状物。柱分离后(SiO₂，PE:EA＝20:1)得到淡黄色黏稠物1.4(170mg,32.68％)。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ6.77(s,1H),5.24(s,1H),5.19(t,J＝6.7Hz,2H),5.09(s,1H),4.97(s,1H),3.14(d,J＝7.4Hz,2H),2.65–2.50(m,3H),2.45(dd,J＝8.4,5.1Hz,2H),2.10–1.90(m,5H),1.85(d,J＝6.3Hz,2H),1.02(d,J＝6.6Hz,4H),0.58(s,4H).见图3¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ153.86,147.04,142.45,141.18,135.63,131.84,116.28,114.72,112.85,77.20,76.95,76.69,60.36,56.34,55.78,45.12,42.77,40.30,33.03,31.74,30.99,28.58,28.39,27.76,23.78,23.20,22.19,21.03,19.88,19.58,17.55,14.11,12.05,7.84.见图4。MS(ESI,m/z)[M+H]⁺:410.26.

实施例4：化合物2.1的合成

将化合物1.2(500mg,1.27mmol)、甲氧胺盐酸盐(530mg,6.35mmol)、三乙胺(5mL)溶于乙醇中，加热回流搅拌，TLC跟踪反应结束后，待反应混合物冷却后向反应体系中加入乙酸乙酯和水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层后，有机层经水洗、饱和的食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、将溶剂旋干后得到黄色的油状物。柱分离后(SiO₂，PE:EA＝20:1)得到淡黄色黏稠物2.1(250mg,46.46％)。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ6.66(s,1H),5.24(s,1H),5.23–5.13(m,3H),5.08(s,1H),4.95(t,J＝7.1Hz,1H),3.86(s,3H),3.19–2.95(m,2H),2.55(dd,J＝12.9,6.7Hz,3H),2.44(dd,J＝8.3,5.2Hz,2H),2.09–1.89(m,4H),1.87–1.78(m,1H),1.21(s,2H),1.15(d,J＝12.2Hz,2H),1.08–0.99(m,3H),0.59(s,3H).见图5¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ153.22,146.85,142.50,141.22,135.60,131.86,116.25,115.23,112.69,77.19,76.93,76.68,61.31,56.36,55.78,45.15,42.78,40.31,33.03,31.83,30.91,28.57,28.46,28.38,27.71,24.61,23.75,23.21,22.19,21.06,19.89,19.57,17.55,11.98,7.83.见图6MS(ESI,m/z)[M+H]⁺:410.28.

实施例5：化合物2.2的合成

将化合物1.2(500mg,1.27mmol)、甲氧胺盐酸盐(530mg,6.35mmol)、三乙胺(5mL)溶于乙醇中，加热回流搅拌，TLC跟踪反应结束后，待反应混合物冷却后向反应体系中加入乙酸乙酯和水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层后，有机层经水洗、饱和的食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、将溶剂旋干后得到黄色的油状物。柱分离后(SiO₂，PE:EA＝20:1)得到淡黄色黏稠物2.2(250mg,46.46％)，m.p.45～48℃。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ6.66(s,1H),5.20(dd,J＝15.0,7.9Hz,3H),5.08(s,1H),4.95(s,1H),3.86(s,4H),3.23–2.92(m,2H),2.54(d,J＝7.0Hz,3H),2.44(d,J＝7.6Hz,2H),1.21(s,2H),1.14(s,1H),1.03(s,3H),0.83(s,7H),0.59(s,3H).见图7¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ156.49,144.30,142.53,141.03,135.62,131.84,122.13,116.28,110.96,77.19,76.93,76.68,61.60,56.31,55.76,45.06,42.78,40.31,33.03,30.72,30.44,28.53,27.74,23.18,22.77,22.16,21.06,19.89,19.58,17.55,12.09.见图8MS(ESI,m/z)[M+H]⁺:410.27.

(一)体外抗人肝癌HepG2细胞活性实验：

1、对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

取对数生长期的HepG2细胞，用含10％小牛血清的完全高糖DMEM培养液培养细胞，加入96孔平底细胞培养板，每孔100μL(约10⁴个细胞)，放入37℃，5％二氧化碳培养箱中过夜。次日，将含不同药物的PBS溶液加入96孔板中，每孔25μL，每种药物组合设三个平行孔，药物的终浓度为10^-10mol/L、5×10^-10mol/L、10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、10^-8mol/L、5×10^- ⁸mol/L、10^-7mol/L、5×10^-7mol/L、10^-6mol/L，对照组只加培养液。放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48小时。

2、MTT实验

培养结束后每孔加入50μLMTT溶液(5mg/mL)继续培养4小时，取出96孔板，弃去孔内全部上清液，并用干净的纸巾轻轻蘸干96孔板内的残留液。每孔加入150μLDMSO，平板摇床震荡10分钟，然后用酶标仪取波长550nm时的吸光值。记录实验结果，处理数据。

(二)体外抗人肝癌MCF-7细胞活性实验：

1、对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用

取对数生长期的MCF-7细胞，用含10％胎牛血清的RMPI-1640培养液培养细胞，加入96孔平底细胞培养板，每孔100μL(约10⁴个细胞)，放入37℃，5％二氧化碳培养箱中过夜。次日，将含不同药物的PBS溶液加入96孔板中，每孔25μL，每种药物组合设三个平行孔，药物的终浓度为10^-10mol/L、5×10^-10mol/L、10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、10^-7mol/L、5×10^-7mol/L、10^-6mol/L，对照组只加培养液。放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48小时。

2、MTT实验

实施例6、7的IC₅₀值如表1所示。

表1每种物质对不同癌细胞的IC₅₀(nM)值

化合物编号	Hep G2	MCF-7
			1.3	2.95	39.8
1.4	240	85.1
			2.1	15.8	109
2.2	36.3	3.63

根据新药(西药)临床前研究指导原则，IC₅₀是以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度。合成化合物IC₅₀＜10μg/mL则可认为该新化合物在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。这四种化合物的IC₅₀均小于10μg/mL，都是潜在具有抗癌活性的药物候选物。

Claims

1.一种维生素D肟类衍生物，其特征在于，所述的衍生物结构分别如下:

R＝(E)-OH,(Z)-OH,(E)-OCH₃,(Z)-OCH₃。

2.一种如权利要求1所述的维生素D肟类衍生物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

将化合物Ⅰ、盐酸羟胺或甲氧胺盐酸盐、三乙胺或醋酸钠溶于乙醇中，加热回流搅拌，反应结束后经萃取，洗涤、干燥、浓缩后经柱层析分离得到目标化合物，其中，化合物Ⅰ结构如下：

3.如权利要求2所述的维生素D肟类衍生物的合成方法，其特征在于，化合物Ⅰ、盐酸羟胺或甲氧胺盐酸盐、三乙胺或醋酸钠的投料摩尔比为1:1.2:1.3～1:2:3。

4.如权利要求1所述的维生素D肟类衍生物在制备用于抑制人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌细胞MCF-7的药物上的应用。