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CN104531598B - 一种重组链霉菌、其构建方法及提高抗生素产量的方法 - Google Patents

一种重组链霉菌、其构建方法及提高抗生素产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组链霉菌、其构建方法及提高抗生素产量的方法。所述重组链霉菌过表达乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。通过该重组菌过量表达乙酰乳酸合酶调节亚基基因，可显著提高以L‑异亮氨酸和/或L‑缬氨酸和/或L‑亮氨酸为前体进行次级代谢的产物(如抗生素)的产量。

Description

一种重组链霉菌、其构建方法及提高抗生素产量的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种重组链霉菌及其应用，具体涉及通过改造抗生素前体的合成途径中的关键基因来提高抗生素的产量。
背景技术
链霉菌属革兰氏阳性放线菌，在系统生物学上归于链霉菌属(Strptomyces)，具有复杂生活周期和次生代谢途径。该属的许多成员都能产生多种具有生物活性的次级代谢产物。目前已知的上万种抗生素中，有70％以上是由链霉菌产生的。除此之外，它还能产生免疫抑制剂、抗肿瘤剂、杀虫剂和多种胞外水解酶，如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等。
在链霉菌产生次级代谢产物的过程中，氨基酸既可以作为碳源，也可以作为氮源，还有许多氨基酸是一些次级代谢产物的前体，如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸，它们的代谢产物包括乙酰CoA、丙酰CoA、丁酰CoA与异戊酰CoA等，这些物质是大环内酯类抗生素生物合成的前体。如阿维菌素的生物合成(Hafner E W,Holley B W,Holdom K S,et al.Branched-chain fatty acid requirement for avermectin production by a mutant ofStreptomyce avermitilis lacking branched-chain 2-oxo acid dehydrogenaseactivity[J].J Antibiot(Tokyo),1991,44(3):349～356)、螺旋霉素链霉菌产生必特螺旋霉素(李桢林,江维,王永红,等.Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响[J].中国抗生素杂志,2007,32(11):660～668)、醌霉素的生物合成(Yoshida T,KatagiriK.Influence of Isoleucine upon quinomycin biosynthesis by Streptomyces sp.732[J].J Bacteriol,1967,93(4):1327～1331)等。
阿维菌素(avermectin)是一种由阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的一类大环内酯类抗生素，具有广泛的驱虫和杀虫活性。阿维菌素链霉菌发酵液中通常含有8种阿维菌素组分A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a，B2b，其中，杀虫效果以B1组分最佳，尤其是B1a组分。阿维菌素的作用机制独特，与常规化学杀虫剂不同，杀虫效果是一般化学农药的几十倍，且不易使害虫产生抗性。阿维菌素的作用靶点是线虫及节肢动物类寄生虫的神经传导介质γ-氨基丁酸。它对哺乳动物的毒性很小、选择性很高，且在植物中的残留时间很短，土壤中的微生物能很快将其分解成无毒物质。由于阿维菌素的广谱、高效、无残留、对动植物高度安全等突出优点，已在农业、畜牧业、医药等领域广泛应用，具有广阔的市场前景和应用价值。
此外，以阿维菌素作为母体，还开发出了一系列活性更高、选择性更强、对动植物更安全的衍生产品，已经商业化的产品包括多拉菌素、伊维菌素、埃玛菌素等。
阿维菌素在国内已经实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但是，阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题。如何提高阿维菌素的产量，降低生产成本，是阿维菌素研究中的一个重要课题。
发明内容
针对现有技术中的需求，本发明提供一种重组链霉菌，该重组链霉菌通过过表达乙酰乳酸合酶小亚基来促进乙酰乳酸合酶对该重组链霉菌中的L-异亮氨酸、L-缬氨酸和/或L-亮氨酸的生物合成，从而提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物产量。本发明还提供一种提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物(如阿维菌素、必特螺旋霉素、醌霉素等)产量的方法。
根据本发明的第一方面，提供一种重组链霉菌，其中所述重组链霉菌过表达序列表的氨基酸序列2所示的乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。
根据一种实施方式，通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因克隆到表达载体，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉菌。
所述出发链霉菌是以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体产生抗生素的链霉菌。例如可以为野生型链霉菌，或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉菌。
优选地，上述出发链霉菌选自阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis、螺旋霉素链霉菌Streptomyces spiramyceticus和链霉菌Streptomyces sp.732中的一种菌株。
最优选，所述出发链霉菌是阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)。
所述表达载体优选为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。
根据一种实施方式，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体为pSET152，将启动子和ilvH基因片段插入pSET152的多克隆位点，得到重组表达载体。
所述ilvH基因最优选是阿维菌素链霉菌中编码乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因，即序列表中的核苷酸序列1；所述启动子为序列表中的核苷酸序列3所示的红霉素抗性基因强启动子ermE*p。
最优选地，所述重组链霉菌为阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis AV-2320-8，于2014年12月08日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 10146。
根据本发明的又一方面，提供一种制备上述重组链霉菌的方法，包括在出发链霉菌中过表达序列表的氨基酸序列2所示的乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。
根据一种实施方式，通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因克隆到表达载体，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉菌。
将所述重组表达载体引入出发链霉菌的方法可以采用生物工程领域的常用方法，例如结合转移法、电转化法、原生质体转化法等。
优选为结合转移法。优选地，首先将表达载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，收集抗性菌落再与所述出发链霉菌做结合转移。
所述出发链霉菌是以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体产生抗生素的链霉菌。例如可为野生型链霉菌，或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉菌。
优选地，上述出发链霉菌选自阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis、螺旋霉素链霉菌Streptomyces spiramyceticus和链霉菌Streptomyces sp.732中的一种菌株。
最优选，所述出发链霉菌是阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)。
所述表达载体优选为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152。
所述ilvH基因最优选是阿维菌素链霉菌中编码乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因，即序列表中的核苷酸序列1；所述启动子为序列表中的核苷酸序列3所示的红霉素抗性基因强启动子ermE*p。
根据本发明的另一方面，提供一种提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物产量的方法，所述方法包括利用上述重组链霉菌进行发酵的步骤。
根据本发明，以阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)))为出发菌株，得到的重组阿维菌素链霉菌，在摇瓶培养240小时后，阿维菌素产量可达到3486.32±497.97μg/mL，是出发菌株阿维菌素产量的5.13倍。
本发明具体实例所构建的重组阿维菌素链霉菌基因工程菌可直接用于阿维菌素链霉菌的发酵生产，使阿维菌素的产量提高，从而降低生产成本。本领域的技术人员应理解，本发明的方法，通过过表达乙酰合酶小亚基，提高链霉菌中L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸合成途径中乙酰乳酸合酶的酶量，从而提高L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸的产量，并进一步提高以这些氨基酸为前体进行次级代谢的产物产量，该方法适于那些产生次级代谢产物(如抗生素)时需要经过该合成途径的链霉菌，从而获得目标产物的高产重组菌，并因此获得提高目标产物的效果。
附图说明
参照以下附图，将更好地理解本发明。
图1A和1B分别为含有ilvH基因及红霉素抗性基因强启动子的重组质粒pH-19和pH-152的质粒图谱。
图2为阿维菌素链霉菌菌株Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)及其根据本发明制备的重组阿维菌素链霉菌(CGMCC10146)经发酵得到的阿维菌素产量。
图3A为阿维菌素B1a标准品HPLC图谱，图3B和3C分别为出发阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)和根据本发明制备的重组阿维菌素链霉菌产生的阿维菌素B1a的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体的优选实施方式对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
基于阿维菌素优异的特性和广泛的应用，本发明主要以阿维菌素链霉菌为实施例进行研究，通过在阿维菌素链霉菌中过表达乙酰乳酸合酶小亚基，获得了阿维菌素产量显著提高的菌株。
同样的，在其他以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体产生次级代谢产物的链霉菌中也相信能够有效提高相应次级代谢产物的产量。这样的链霉菌如产生比特螺旋霉素的螺旋霉素链霉菌、产生醌霉素的链霉菌Streptomyces sp.732等。
阿维菌素是一组由十六元环内酯与一个二糖(齐墩果糖)所生成的苷，在十六元内酯周围还有一个含2个六元环的螺缩酮系及六氢苯并呋喃环系。糖基配体骨架是由一个a支链脂肪酸S(+)-甲基丁酰脂肪酸或异丁酰脂肪酸为起始，7个乙酸盐和5个丙酸盐头尾聚合而成。C-25位的不同的取代基分为a、b组分，a组分的二甲基丁酰基来源于S(+)-甲基丁酰CoA，b组分的异丁酰基来源于异丁酰CoA。S(+)-甲基丁酰CoA和异丁酰CoA分别由L-异亮氨酸、L-缬氨酸通过脱氨、转氨和脱羧作用形成。
乙酰乳酸合酶是生物催化L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸生物合成第一步反应的酶，在以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢产物生物合成的过程中，提高乙酰乳酸合酶的活性或酶量，都会提高相应次级代谢产物的产量。
在阿维菌素链霉菌中，乙酰乳酸合酶含有3个大亚基，1个小亚基，大亚基起催化作用，小亚基起激活和反馈调节作用。本发明通过研究发现，过表达乙酰乳酸合酶的小亚基能够显著增加以L-异亮氨酸、L-缬氨酸为前体的阿维菌素的产量。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、ilvH基因表达载体的构建
1、ilvH结构基因的扩增
设计引物，用于扩增位于阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)染色体上的ilvH结构基因[NC_003155.4(3353885..3354412)]，即，序列表中序列1。
上游引物Primer F1：ATGAGCAAGCACACCCTCTCCGTCCT，
下游引物Primer R1：TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTTACGCGGATCGGTCCAGCGCGCGC，
带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点，扩增产物应为557bp。
以阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)的总DNA为模板，Primer F1和Primer R1为引物，采用New England Biolabs公司的Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase，进行PCR扩增，扩增条件为98℃，3min；(98℃，10s；72℃，40s)×30个循环；72℃，2min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约500bp处有一条特异性的扩增条带。
2、红霉素抗性基因强启动子(ermE*p)的扩增
设计引物，用于扩增位于pZW221质粒(李佳,向四海,杨秀山,杨克迁，报告基因法比较两种放线菌启动子的活性，微生物学报,2009,49(11):1454-1458.)上的ermE*p基因(即，序列表序列3)。
上游引物Primer F2：GCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGAGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTT，
下游引物Primer R2：GGACGGAGAGGGTGTGCTTGCTCATATGTGGATCCTACCAACCGGCACGGTT。
带下划线碱基为限制性内切酶XbaI的酶切位点，扩增产物应为235bp。
以pZY125质粒为模板，Primer F2和Primer R2为引物，采用New England Biolabs公司的Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase，进行PCR扩增，扩增条件为98℃，3min；(98℃，10s；72℃，30s)×30个循环；72℃，2min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约250bp处有一条特异性的扩增条带。
3、重组质粒pH-152的构建
用DNA回收试剂盒(OMEGA，D2500-02)回收ilvH基因和ermE*p的PCR扩增片段，pUC19载体经XbaI和EcoRI酶切，回收约2660bp的片段。将这三个片段用Gibson Assembly试剂盒(New England Biolabs公司)进行连接，命名为pH-19(参见图1A)。经过测序比对表明，扩增的片段确实为ermE*p和ilvH基因。将含有ermE*p和ilvH基因的pH-19载体经XbaI和EcoRI酶切，回收约710bp的ermE*p和ilvH基因的连接片段，将此片段与经XbaI和EcoRI酶切的载体pSET152(Bierman M,Logan R,O’Brien K,et al.Plasmid cloning vector forthe conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.Gene,1992,116:43-49)连接，连接产物分别转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(TransGen Biotech公司)，从转化子中提取质粒进行PCR和酶切验证，将正确的重组质粒命名为pH-152(参见图1B)。pH-152为整合型质粒，这个质粒中的ilvH基因置于红霉素抗性基因强启动子ermE*p之下。
实施例2、重组质粒的转化
由于阿维菌素链霉菌中存在很强的限制修饰作用，用E.coli DH5α直接与阿维菌素链霉菌进行结合转移，转化效率极低，有时候甚至得不到转化子。而使用没有限制修饰作用的E.coli ET12567(PUZ8002)进行结合转移，转化效率明显提高。因此，将构建好的重组质粒转化到E.coli ET12567(PUZ8002)(Kieser T,Bibb M J,Buttner M J,etal.Practical Streptomyces Genetics,2000,Norwich:The John Innes Foundation.)中以获得非甲基化的DNA，然后进行结合转移。
本例中选用阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)，作为出发菌株，该菌在平板上产灰白色孢子。
将含有实施例1中构建的ilvH基因表达质粒pH-152的E.coli ET12567(PUZ8002)与上述阿维菌素链霉菌进行结合转移，涂布于含有10mM MgCl2的MS平板上，28℃培养16～20h后，用1mL含1000μg萘啶酮酸和1000μg安普霉素的无菌水均匀覆盖，在28℃培养5～7天，长出的菌落即为转化子，转化子经质粒提取及PCR验证正确后，进行下一步的发酵研究。
所得转化子即根据本发明的构建方法获得的重组链霉菌。该重组链霉菌命名为阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis AV-2320-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC10146。该菌株最佳培养条件为28℃，pH接近中性，在固体培养基(如MS)上培养5-7天，会产生灰白色孢子，气丝少，基丝少。
实施例3、重组菌株的发酵研究
1、阿维菌素链霉菌的摇瓶发酵
阿维菌素链霉菌出发菌株阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267)及实施例2获得的重组菌在斜面培养基上长出丰富的孢子后，对阿维菌素链霉菌转化子的阿维菌素产量水平进行测试。挖取斜面菌苔1cm2，将其接入装有40mL灭过菌的种子培养基的种子瓶，28℃摇床培养44～48小时，转速200rpm，旋转半径为50mm，得到种子培养液。取上述种子培养液按5％(体积百分比)的接种量接种于装有30mL灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，28℃摇床培养10天，放瓶，用HPLC法测定阿维菌素的发酵单位，具体HPLC分析如下述步骤2所述。
本实验中的斜面培养基(葡萄糖1.5％、牛肉膏0.3％、天冬酰胺0.05％、KH2PO40.05％、琼脂1.8％)，种子培养基(终浓度为30g/L的玉米淀粉、终浓度为g/L的黄豆饼粉、终浓度为10g/L的花生饼粉、终浓度为4g/L的酵母粉、终浓度为0.03g/L的CoCl2)和发酵培养基(终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度为28g/L的豆粕粉、终浓度为9g/L的酵母粉、终浓度为0.25g/L的(NH4)2SO4、终浓度为0.02g/L的CoCl2、终浓度为0.022g/L的Na2MoO4、终浓度为0.0023g/L的MnSO4、终浓度为4000U/L的淀粉酶和终浓度为0.8g/L的CaCO3)。(参见中国专利申请No.200810227639.8,一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株，该专利申请的全文通过引用合并于本文中。)
2、发酵产物的HPLC分析
1)样品处理：取1.0mL发酵液，加入9.0mL甲醇，超声波震荡30分钟以上，静置10-20分钟；
2)取1mL上清液，用0.2μm的微孔滤膜过滤，获得滤液进行HPLC(Agilent 1200高效液相色谱仪)分析。
3)HPLC分析条件：C18反向柱(Agilent)，柱长150mm，柱内径4.6mm，流动相为甲醇：水(90:10)，流速为1.0mL/min，自动进样器进样，进样量为10μL，检测波长为245nm。在此条件下，阿维菌素B1a标准品(DR,Germany)的保留时间为6分钟左右，计算发酵滤液中保留时间为6分钟左右出的峰面积，计算阿维菌素B1a产量。实验设3次重复，结果取平均数。
图2的发酵结果表明，含有ilvH表达载体的转化子的阿维菌素发酵单位与出发菌株相比明显提高，增加了4倍左右。
应理解，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤和条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims (7)

1.一种重组链霉菌，所述重组链霉菌为阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)AV-2320-8，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC10146。
2.一种构建权利要求1所述的重组链霉菌的方法，包括在出发链霉菌中过表达序列表的氨基酸序列2所示的乙酰乳酸合酶小亚基ilvH，所述出发链霉菌为阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA4680。
3.根据权利要求2所述的方法，其中通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因克隆到表达载体大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉菌。
4.根据权利要求3所述方法，其中，将表达载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌ET12567 pUZ8002中，收集抗性菌落再与所述出发链霉菌做结合转移。
5.根据权利要求3所述方法，其中所述ilvH基因是序列表中的核苷酸序列1所示的阿维菌素链霉菌中编码乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因，启动子为序列表中的核苷酸序列3所示的红霉素抗性基因强启动子ermE*p。
6.一种提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物产量的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的重组链霉菌进行发酵的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物是阿维菌素。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520821B (zh) * 2016-12-07 2019-10-22 西南大学 适用于链霉菌的T7RNA聚合酶表达盒PhT7及其表达载体和应用
CN111019965B (zh) * 2018-10-10 2022-05-13 中国科学院微生物研究所 新霉素生物合成基因簇遗传改造的工程菌及其应用
JP6604584B1 (ja) * 2018-12-12 2019-11-13 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 バリン生成能が向上したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体
WO2021037190A1 (zh) 2019-08-29 2021-03-04 天津科技大学 一种2-异丙基苹果酸合成酶及其工程菌与应用
CN110551670B (zh) * 2019-09-19 2020-09-25 天津科技大学 一种生产l-亮氨酸的基因工程菌及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101386829A (zh) * 2008-10-20 2009-03-18 中国农业大学 一种阿维链霉菌基因工程菌及其应用
CN101457229A (zh) * 2009-01-13 2009-06-17 南京农业大学 乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因ilvBN
CN101613712A (zh) * 2009-07-30 2009-12-30 中国农业大学 提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株
CN102162003A (zh) * 2011-03-02 2011-08-24 中国农业大学 一种提高阿维菌素产量的方法及其生产菌株
CN102216453A (zh) * 2008-09-26 2011-10-12 巴斯夫农化产品有限公司 除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法
CN103710328A (zh) * 2013-12-27 2014-04-09 西北大学 大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法
CN104254606A (zh) * 2012-01-11 2014-12-31 韩国科学技术院 新型合成-调控sRNA及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216453A (zh) * 2008-09-26 2011-10-12 巴斯夫农化产品有限公司 除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法
CN101386829A (zh) * 2008-10-20 2009-03-18 中国农业大学 一种阿维链霉菌基因工程菌及其应用
CN101457229A (zh) * 2009-01-13 2009-06-17 南京农业大学 乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因ilvBN
CN101613712A (zh) * 2009-07-30 2009-12-30 中国农业大学 提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株
CN102162003A (zh) * 2011-03-02 2011-08-24 中国农业大学 一种提高阿维菌素产量的方法及其生产菌株
CN104254606A (zh) * 2012-01-11 2014-12-31 韩国科学技术院 新型合成-调控sRNA及其制备方法
CN103710328A (zh) * 2013-12-27 2014-04-09 西北大学 大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Acetohydroxyacid Synthase: A Proposed Structure for Regulatory Subunits Supported by Evidence from Mutagenesis;Sharon Mendel 等;《JMB》;20041231;465－477 *
BRANCHED-CHAIN FATTY AGID REQUIREMENT FOR AVERMECTIN PRODUCTIONBY A MUTANTOF Streptomyces avermitilis LACKING BRANCHED-CHAIN 2-OXO ACID DEHYDROGENASEACTIVITY;Edmund W. Hafner 等;《THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS》;19910331;第44卷(第3期);第351页图2 *
阿维菌素前体代谢工程的研究;刘钇君;《中国优秀硕士学位论文》;20160215;全文 *

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