CN104507917B

CN104507917B - 用于制造艾沙康唑或雷夫康唑的方法

Info

Publication number: CN104507917B
Application number: CN201380038886.2A
Authority: CN
Inventors: 萨莫伦 R·范; H·瓦森; D·明克; M·瓦瑟尔
Original assignee: BASLIER PHARMACEUTICAL AG
Current assignee: BASLIER PHARMACEUTICAL AG
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2017-10-17
Anticipated expiration: 2033-07-31
Also published as: EP2882723A1; PT2882723T; BR112015002526B1; US9783508B2; US20190077771A1; CA2878361A1; JP2015527345A; PL2882723T3; HRP20170171T1; JP6334529B2; US20150239852A1; MX2015000744A; WO2014023623A1; BR112015002526A2; KR20150037875A; CA2878361C; HUE031679T2; KR102129150B1; MX360783B; ES2616412T3

Abstract

本发明涉及用于制造非对映异构体以及对映异构体富集的三唑化合物艾沙康唑和雷夫康唑的方法，该方法包括在酮和2‑卤化锌丙酸酯之间进行列福马茨基反应，随后进行拆分步骤，优选是用酯酶进行酶法拆分。

Description

用于制造艾沙康唑或雷夫康唑的方法

本发明涉及用于制造艾沙康唑或雷夫康唑的非对映体以及对映异构体富集的酯中间体的方法。

艾沙康唑和雷夫康唑是三唑抗真菌化合物。在Basilea(巴塞尔)的专利WO 99/45008、WO 2007/062542和WO 03/002498中披露了用于制造艾沙康唑和雷夫康唑的方法。在WO 2011/042827中，披露了用于制造在对映异构体意义上纯的抗真菌唑(例如雷夫康唑和艾沙康唑)的方法，其中通过以下方式对外消旋混合物进行经典拆分：添加对映纯的手性酸，然后收集希望的非对映异构体，随后通过用碱或离子交换树脂进行处理，将盐转化为在对映异构体意义上纯的形式的所希望的化合物。使用此类经典拆分的缺点是，需要以接近的化学计算量应用手性助剂，并且需要额外的工艺步骤，以便回收这些相对高的量的手性试剂，连同将盐转化为游离的对映纯产物。

因此，本发明的目标是提供一种用于制造高非对映异构体过量的以及对映异构体过量的(分别是d.e.和e.e.)艾沙康唑和雷夫康唑的改进的方法。

如在此定义的“对映异构体富集的”等效于术语“光学活性的”并且指与其他对映异构体相比，化合物的对映异构体之一以过量存在。这一过量此后将称为“对映异构体过量”或e.e.(如例如由手性GC或HPLC分析所确定)。对映异构体过量e.e.等于对映异构体的量之间的差除以对映异构体的量之和，该商数可以表示为乘以100之后的百分比。

“非对映异构体富集”指与其他非对映异构体相比，化合物的非对映异构体其中之一以过量存在。这一过量此后将称为“非对映异构体过量”或d.e.。类似地，非对映异构体过量d.e.等于非对映异构体的量之间的差除以非对映异构体的量之和，该商数可以表示为乘以100之后的百分比。

本发明现在涉及用于制造根据式(I)的非对映异构体富集化合物的方法，

其中R₁和R₂各自是氟或氢，并且当R₁是氟时，R₂是氢，而当R₂是氟时，R₁是氢，其中R是C₁-C₁₂烷基、C₅-C₁₂芳基或C₆-C₁₁芳烷基，

该方法包括以下步骤：

(i)制备根据式(II)的2-卤化锌丙酸酯

其中X是溴、碘或氯，

该制备是在一种溶剂存在时，

在低于该溶剂沸腾温度的一个温度下进行，

(ii)引入根据式(III)的酮

(iii)在一种溶剂存在时，在根据式(II)的2-卤化锌丙酸酯和根据式(III)的酮之间进行列福马茨基反应，

移除过量的锌，

生成所希望的、根据式(I)的酯的(2R,3R)/(2S,3S)-非对映异构体的沉淀，

其中，可以互换步骤(i)和(ii)的进行顺序。

更确切地，本发明涉及用于制造根据式(I)的3-羟基-2-甲基-4-[1,2,4]三唑-1-基-3-苯基-丁酸酯衍生物的非对映异构体的混合物的方法：

该混合物富集对应的(2R,3R)/(2S,3S)外消旋体，并且

其中R₁和R₂各自是氟或氢，并且当R₁是氟时，R₂是氢，而当R₂是氟时R₁是氢，其中R是C₁-C₁₂烷基、C₅-C₁₂芳基或C₆-C₁₁芳烷基，

该方法包括以下步骤

(i)制备根据式(II)的2-卤化锌丙酸酯

其中X是溴、碘或氯，

该制备是在一种溶剂存在时，

在低于该溶剂沸腾温度的一个温度下进行，

(ii)引入根据式(III)的酮

在将最后的试剂添加至该混合物后，通过使该混合物静置(搅拌或不搅拌)持续多于0.5小时、优选持续多于2小时，允许生成的反应混合物形成一种沉淀，其中该沉淀富集根据式(I)的外消旋的(2R,3R)/(2S,3S)酯，并且

分离所述沉淀，

其中可以互换步骤(i)和(ii)的进行顺序，并且其中在形成所述沉淀前移除过量的锌。

出人意料地，这一列福马茨基型反应导致生成非对映异构体富集的艾沙康唑和雷夫康唑。与现有技术的方法比较，根据本发明所述的方法要求简单的反应物和条件，并且以高产率实现希望的异构体。

在EP 0199474中，列福马茨基反应被应用于制造三唑化合物。它披露的是，可以按外消旋混合物的形式获得这些化合物，并且可以通过本领域已知的方法将这些混合物分离为单独的异构体。然而，将列福马茨基反应获得的外消旋酯成功进行酶法拆分要求该酯是规模可变的并且是以高非对映异构体纯度有成本效益地产生的。如通过披露于EP 0199474中的列福马茨基反应获得的酯并不满足这一要求，并且在这一申请的对比实例B中已经加以证明。出人意料地，我们已经发现，应用列福马茨基反应，其中在低于溶剂沸腾温度的温度下获得列福马茨基试剂2-卤化锌丙酸酯，并且然后允许根据本发明所述的沉淀，可以单个步骤以非常高的d.e.(>97％)直接获得酯(I)的希望的非对映异构体。

用于制备外消旋酯(I)的一种替代方法是使用有机锂盐的偶联反应。例如，WO9217474披露了一种通过在-70℃下进行二异丙胺锂(LDA)介导的、丙酸乙酯至酮(III)(R₂是F)的偶联来制备酯(I)(R₂是F)的一种方法。应用柱色谱法来分离在该反应中形成的两种非对映异构体(d.e.未报道)，这被认为是大规模的无效率的并且昂贵的纯化方法。在内部获得了类似结果(参见对比实例A)：当在-78℃下，在LDA存在下，将丙酸乙酯偶联至酮(III)(R₁是F)时，以61％的产率分离了希望的酯(I)(R₁是F)，具有29％的不良的非对映异构体过量(d.e.)。因此，鉴于以下

a)该反应不良的非对映异构选择性和伴生的低产率；

b)反应之后，没有一种成本效益以及规模可变的方法来增加d.e.以及

c)在与高成本有关的低温下使用无水条件

涉及强碱(例如LDA(LiHMDS等等))的偶联反应并不提供生成通式结构(I)的酯的工业相关的途径。

在根据本发明所述的方法的列福马茨基反应后，测量的非对映异构体过量从50％至60％d.e.变化。在沉淀后，分离的产物具有在97％和99.9％d.e.之间变化的非对映异构体过量。

可以根据任何已知方法，包括例如酯的皂化后酯混合物的非对映异构体结晶和获得的酸混合物与光学纯的碱(像1-苯乙胺或2-氨基-1-丁醇)的反应，或手性HPLC，拆分根据本发明所述的方法的步骤(iii)后获得的产物。

然而，随后用酯酶进行酶法拆分(2R,3R)/(2S,3S)-酯(I)是优选的，因为它导致获得具有多于99％的d.e.和多于99％的e.e.的艾沙康唑或雷夫康唑的特别吸引人的工业上规模可变的途径。对于基于三唑的抗真菌剂(朝向其的中间体)从未报道过这样一种酶法拆分方法，尽管存在以下事实：这类化合物30多年来一直是制药行业的核心关注点，并且尽管存在以下事实：酶法拆分是在其他方面频繁用于制药工艺中的技术。而且本领域中的非常近的专利申请(WO 2011/042827)，它具有如本发明主题的拆分步骤，仅披露了经典拆分，而没有披露酶法拆分。可能地，基于三唑的抗真菌剂的相对苛刻的空间属性使它们成为总体上针对酶的挑战性的底物。这清楚表明，无法直接找到适合用于这类底物的酶。事实上，对于根据本发明的方法，筛选了超过200种水解酶，并且仅有一类酶家族(即酯酶)对于关于通式(I)的酯既提供了活性又提供了选择性。

总之，工业制备抗真菌剂艾沙康唑和雷夫康唑对于引入非对映异构体选择性和对映异构体选择性都需要有效并且规模可变的方法。在此报道的非对映异构体选择性的列福马茨基沉淀实验方案与酶法拆分程序相结合而提供了这两项。

在本发明的一个优选实施例中，式(I)表示艾沙康唑的酯中间体。当在式(I)中R₁是氟并且R₂是氢时，表示了艾沙康唑的酯中间体。当在式(I)中R₁是氢并且R₂是氟时，表示了雷夫康唑的酯中间体。

在根据式(II)的2-卤化锌丙酸酯中，R可以是分支或不分支的C₁-C₁₂烷基、C₅-C₁₂芳基或C₆-C₁₁芳烷基，优选是分支或不分支的C₁-C₈烷基或C₅-C₈芳基，更优选是分支或不分支的C₁-C₄烷基。分支或不分支的C₁-C₄烷基可以来自以下项中任一项：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基。2-卤丙酸锌芳酯的实例是2-卤丙酸锌苯酚酯。优选地，R是甲基或乙基，更优选地，R是乙基。

在根据式(II)的2-卤化锌丙酸酯中，X可以是来自以下项中的任一个：溴、碘或氯。更优选地，X是溴。

在本发明的一个实施例中，在式(II)中，R是乙基，并且在式(II)中，X是溴。

应用于根据本发明所述的列福马茨基反应的，并且更确切地，应用于制造2-卤化锌丙酸酯的温度最好是低温，并且可以在-30℃和所用溶剂在大气压下的沸腾温度之间变化。至少该温度低于该溶剂在大气压下的沸腾温度。在更高温度下，列福马茨基试剂的形成被阻碍，例如，因为酯的自身偶联以及锌盐的伴生释放抑制了该反应，于是阻止了完全转化并且影响了沉淀。优选地，该温度优选在-30℃和85℃之间，更优选是在-10℃和40℃之间，并且最优选是在-10℃和10℃之间。甚至更优选地，该温度接近0℃，例如在-2℃和2℃之间。

因此，在根据本发明所述的方法的步骤(i)中应用的温度可以在-30℃和所用试剂在大气压下的沸腾温度之间变化。优选地，步骤(i)中的温度低于该溶剂在大气压下的沸腾温度。更优选地，步骤(i)中的温度是在-30℃和85℃之间，仍更优选地，是在-10℃和40℃之间，并且最优选地，是在-10℃和10℃之间。甚至更优选地，步骤(i)中的温度接近0℃，例如在-2℃和2℃之间。

另外，优选地，应用于根据本发明所述的方法的步骤(iii)的温度可以在-30℃和所用溶剂在大气压下的沸腾温度之间变化。更优选地，步骤(iii)中的温度低于该溶剂在大气压下的沸腾温度。甚至更优选地，步骤(iii)中的温度是在-30℃和85℃之间，最优选地，是在-10℃和40℃之间，并且甚至更优选地，是在10℃和30℃之间。仍更优选地，步骤(iii)中的温度是室温，例如在15℃和25℃之间。

应用于本发明的方法的步骤(i)和(iii)的溶剂是非质子溶剂。优选地，这些溶剂是极性非质子溶剂。在替代方案中，与极性非质子溶剂组合使用非极性非质子溶剂。适合的溶剂是四氢呋喃、2-甲基-四氢呋喃、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二乙基醚、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷或甲苯。本发明的方法的步骤(i)和(iii)中优选的溶剂独立地是四氢呋喃和2-甲基-四氢呋喃。

应用于根据本发明的方法的步骤(i)和(iii)中的溶剂可以是相同的或不同的。更优选地，应用于根据本发明的方法的步骤(i)和(iii)的溶剂是相同的。甚至更优选的，步骤(i)和(iii)中的溶剂是四氢呋喃或2-甲基-四氢呋喃。

可以经由2-卤丙酸酯和金属锌之间的反应获得2-卤化锌丙酸酯。Fürstner(菲尔斯特纳)描述了锌的活化(第14章，The Reformatsky reaction in Organozinc Reagents(有机试剂中的列福马茨基反应)，Knochel(诺切尔)和Jones(琼斯)，Oxford UniversityPress(牛津大学出版社)，第287-305页，1999年)。有利地，可以通过对锌进行酸或碘处理，或通过对锌盐进行还原处理，来活化在根据本发明的方法中所使用的锌。可以用例如锂、钠、钾或二异丁基氢化铝对锌盐进行还原处理。

另外，根据本发明的方法中应用的金属锌的粒径优选尽可能小。较小的粒子提供较大的表面积，因此增强反应中的相互作用。优选地，锌粒子具有小于50μm、更优选小于10μm、甚至更优选小于5μm的直径。这些大小的锌粒子通常称为锌粉。在根据本发明的方法中，与溶剂组合，锌通常呈现为一种悬浮液。在列福马茨基反应期间，可以搅拌这种悬浮液。

在2-卤丙酸酯和金属锌之间的反应中，相对于2-卤丙酸酯，以1至3摩尔当量，优选以1至2摩尔当量，更优选相对于2-卤丙酸酯，以1至1.2摩尔当量应用锌。

在替代方案中，可以经由在适合的金属催化剂存在下，2-卤丙酸酯与二烷基锌的反应，获得根据式(II)的2-卤化锌丙酸酯。作为一个实例，可以采用如由Yang(杨)等人，在Tetrahedron:Asymmetry(四面体：非对称性)(2007,18,949-962)所述的二乙基锌和乙缩醛丙酮酸镍(II)。

在根据本反应的方法的步骤(iii)中，无水条件是优选的。可以通过在惰性气氛下工作，例如通过应用氮或氩，获得此类条件。在根据本发明所述的惰性气氛下，存在尽可能少的水。气氛是惰性的在于：它在根据本发明的化学合成中是非反应性的。

在根据本发明的方法中，制备根据式(II)的酯(步骤(i))和添加根据式(III)的酮(步骤(ii))的顺序可以互换。在本发明的一个实施例中，在2-卤丙酸酯与锌反应后，添加酮，以形成列福马茨基试剂(WO 2009035684)。在替代方案中，该酮已经存在并且之后添加用于制备2-卤化锌丙酸酯的试剂(Barbier(巴比尔)条件)。在完成步骤(i)之后并且在沉淀开始之前移除过量的锌。可以通过过滤掉，完成对过量的锌的移除。

在列福马茨基反应后，允许根据式(I)的酯的希望的非对映异构体沉淀。允许酯沉淀的多个因素之一是使反应混合物静置某一时段。优选地，在添加最后的试剂后，让该反应持续多于12小时，更优选持续多于6小时，甚至更优选持续多于2小时，并且最优选持续多于0.5小时。在等候时间期间，可以如之前那样继续搅拌该反应混合物。可以通过添加之前获得的包含希望的非对映异构体的小量的沉淀来增强沉淀。另外，通过添加非质子非极性溶剂(例如叔丁基甲基醚或正庚烷)，可以刺激沉淀并且可以改进产率。

通过过滤，分离在根据本发明的方法的步骤(iii)中获得的沉淀。随后，通过萃取进入一种有机溶剂，例如乙酸乙酯，获得酯(I)的希望的非对映异构体。有利地，这一萃取涉及用一种水性酸溶液进行处理。任选地，在随后的酶法拆分步骤之前，浓缩包含酯(I)的有机溶液，以给出一种固体。

特别优选的是根据本发明的方法，其中用于拆分的酯酶是包含SEQ ID No.4中示出的氨基酸序列的具有酯酶活性的分离多肽或具有至少90％氨基酸一致性的其同系物。

SEQ ID No.4:

MGQPASPPVVDTAQGRVLGKYVSLEGLAQPVAVFLGVPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSFVKNTTSYPPMCCQEPIGGQMLSDLFTNRKERLIPEFSEDCLYLNIYTPADLTKRGRLPVMVWIHGGGLVVGGASTYDGLALAAHENVVVVAIQYRLGIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQENIANFGGDPGSVTIFGESAGGESVSVLVLSPLAKNLFHRAISESGVAFTAGLVRKDMKAAAKQIAVLAGCKTTTSAVFVHCLRQKSEDELLDLTLKMKFFALDLHGDPRESHPFLTTVVDGVLLPKMPEEILAEKDFNTVPYIVGINKQEFGWLLPTMMGFPLSEGKLDQKTATSLLWKSYPIANIPEELTPVATDKYLGGTDDPVKKKDLFLDLMGDVVFGVPSVTVARQHRDAGAPTYMYEFQYRPSFSSDKKPKTVIGDHGDEIFSVFGFPLLKGDAPEEEVSLSKTVMKFWANFARSGNPNGEGLPHWPMYDQEEGYLQIGVNTQAAKRLKGEEVAFWNDLLSKEAAKKPPKIKHAEL

SEQ ID No.4中示出的酯酶及其同系物描述于WO 2009/004039和WO 2010/122175中。

优选地，所述酯酶与SEQ ID NO 4具有至少95％一致性，更优选地，与SEQ ID No.4具有至少97％，甚至更优选地，至少98％，并且最优选地多于99％的一致性。

甚至更优选的是根据本发明所述的一种方法，其中该酯酶是包含SEQ ID No.2中示出的氨基酸序列的、具有酯酶活性的分离多肽，或其具有至少90％氨基酸一致性的同系物，该同系物在所述序列的位置239或与其对应的位置包含缬氨酸作为氨基酸。

SEQ ID No.2:

MGQPASPPVVDTAQGRVLGKYVSLEGLAQPVAVFLGVPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSFVKNTTSYPPMCCQEPIGGQMLSDLFTNRKERLIPEFSEDCLYLNIYTPADLTKRGRLPVMVWIHGGGLVVGGASTYDGLALAAHENVVVVAIQYRLGIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQENIANFGGDPGSVTIFGESAGGESVSVLVLSPLAKNLFHRAISESGVAFTAGVVRKDMKAAAKQIAVLAGCKTTTSAVFVHCLRQKSEDELLDLTLKMKFFALDLHGDPRESHPFLTTVVDGVLLPKMPEEILAEKDFNTVPYIVGINKQEFGWLLPTMMGFPLSEGKLDQKTATSLLWKSYPIANIPEELTPVATDKYLGGTDDPVKKKDLFLDLMGDVVFGVPSVTVARQHRDAGAPTYMYEFQYRPSFSSDKKPKTVIGDHGDEIFSVFGFPLLKGDAPEEEVSLSKTVMKFWANFARSGNPNGEGLPHWPMYDQEEGYLQIGVNTQAAKRLKGEEVAFWNDLLSKEAAKKPPKIKHAEL

从WO 2010/122175已知SEQ ID No.4的酯酶的突变(APLE)，这是通过用缬氨酸替代所述序列的位置239的亮氨酸。

如已知的那样，氨基酸的编号取决于该蛋白所源自的物种。由于删除或插入，编号还可以改变。然而，对于普通技术人员已知的是如何比对序列。因此，为了本申请的目的，短语“或与其对应”用于描述除了编号与SEQ ID No.2中的位置239相同的氨基酸位置。

优选地，该酯酶与SEQ ID NO 2具有至少95％一致性，更优选地，与SEQ ID No.2具有至少97％，甚至更优选地，至少98％，并且最优选地多于99％的一致性。

属于这一类别的酶大多是猪肝酯酶或其变体。因此，在一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中用猪肝酯酶或其变体进行步骤(iv)中的酶法拆分，具体地是用SEQ ID NO 2或4的、最优选地是SEQ ID NO 2的酯酶。

在本申请中，“与(一个参考序列)的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的酯酶”是指，这样的蛋白是具有一个氨基酸序列的各个的参考序列的同系物，其是针对如用序列比对工具(例如BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)、ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2)或Align Plus 5(Scientific&Educational Software,Cary(卡里)，北卡罗来纳州，美国)进行序列比对时确定，与该参考序列的氨基酸序列至少90％一致。

为了本申请的目的，术语同系物还意在包括由于遗传密码简并性而彼此不同并且编码同一多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。

在此将序列一致性或相似性定义为如通过比较这些序列所确定，两个或更多个多肽序列或两个或更多个核酸序列之间的关系。通常，在序列的全长上比较序列一致性或相似性，然而，还可以仅对彼此比对的一部分序列进行比较。在本领域，按照可能的情况，如通过此类序列之间的匹配来确定，“一致性”或“相似性”还指多肽序列或核酸序列之间的序列相关性的程度。用于确定一致性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。在本发明的上下文中，用来确定两个序列之间的一致性和相似性的优选计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul,S.F.(阿尔丘尔)等人，J.Mol.Biol.(分子生物学期刊)1990,215,403-410)，从NCBI和其他来源公开地可获得(BLAST手册，Altschul,S.(阿尔丘尔)等人，NCBI NLM NIH，Bethesda(贝塞斯达)，马里兰州，美国)。用于使用BLASTP的多肽序列比较的优选参数是缺口开放10.0，缺口延伸0.5，Blosum 62矩阵。用于使用BLASTN的核酸序列比较的优选参数是缺口开放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩阵(DNA一致性矩阵)。

在根据本发明所述的酶法拆分中，若干反应参数可以变化，这些参数例如是溶剂、助溶剂、pH、温度、和底物浓度，以优化该反应。

总体而言，该溶剂可以是水与一种和水混溶的溶剂的混合物，例如与醇，醇例如是甲醇、乙醇、异丙醇或叔-丁醇，或与二噁烷、四氢呋喃、丙酮或二甲亚砜，或水与一种不和水混溶的溶剂的一个两相系统，这些不和水混溶的溶剂例如是一种芳香族化合物(例如甲苯或二甲苯)，一种烷烃(例如正己烷、正庚烷或环己烷)，或一种醚(例如二异丙醚或甲基叔-丁基醚)。

在根据本发明所述的酶法拆分中，助溶剂的性质起到关键作用，因为例如当使用2-甲基四氢呋喃时，没有观察到转化。优选地，将叔丁醇、乙酸叔丁酯、甲基异丁基酮或甲苯用作助溶剂。更优选地，将甲苯用作用于酶法拆分的助溶剂。

pH对酶活性的影响不是关键的。反应溶液的pH值是在4和11之间，优选在6和9之间。然而，更优选的，用于根据本发明所述的酶法拆分的pH最佳值在pH 7.5和8之间的范围内。

用于本发明的转化的反应温度正常是在0℃和90℃之间，优选是在10℃和60℃之间。根据本发明所述的酶法拆分反应在更高温度下更快。然而，在37℃，酶活性随时间下降。因此，在酶法拆分反应期间，温度更优选是在28℃和37℃之间。

用于酶法拆分的底物浓度可以从0.1至50重量百分比，优选从1至25重量百分比，更优选从2至10重量百分比变化。最优选地，底物浓度是在4和6重量百分比之间。

可以按任何形式使用根据本发明所述的酯酶。例如可以按分散体、溶液的形式或以固定化的形式使用酯酶。另外，该酯酶可以例如以下来使用：作为粗酶，作为可商购的酶，作为从可商购的制剂进一步纯化的酶，作为通过已知纯化方法的组合从其来源获得的酶，以全细胞(透性化的和/或固定的)，该细胞天然地或通过遗传修饰具有要求的酯酶活性，或者以具有此活性的细胞裂解物。

在酶法拆分步骤后，可以用常规方法，例如萃取、结晶、柱色谱法和/或蒸馏，进行产物分离。

可以通过本领域已知的方法，例如通过用氨处理，将根据本发明所述的方法的步骤(iv)之后获得的酯转化为对应的酰胺。随后，经由已知方法，例如，如在WO 03/002498中所披露，将该酰胺进一步转化为艾沙康唑或雷夫康唑。可以将该酰胺脱水为对应的氰化物，并且通过例如与硫化盐(例如硫化铵)反应，该氰化物可以转化为对应的硫代酰胺，并且可以经由与适当地取代的4-氰基乙酰苯试剂(例如像α-溴-4-氰基乙酰苯)反应，将该硫代酰胺转化为艾沙康唑或雷夫康唑。

本发明进一步涉及如在此描述的依据根据本发明的方法所述的不同实施例和/或优选特征的所有可能组合。

将参考以下实例解释本发明，然而，没有用这些限制本发明的意思：

实例

用GC确定酯(I)的非对映异构体过量：GC：HP-5柱(30m x 0.32mm x0.25μm)；初始温度：50℃，0min.，20℃/min至150℃，150℃持续0min.；10℃/min至190℃，190℃持续2min.；20℃/min至300℃，300℃持续0min.；保留时间：2.06min.：丙酸乙酯；3.25min.：2-溴丙酸乙酯；9.17min.：酮II(R₁＝F)；12.82min.：RS/SR-酯I；12.90min.：RR/SS-酯I

RR/SS-酯I的¹H-NMR(CDCl₃,300MHz)δ＝1.04(d,J＝7.2Hz,3H),1.34(t,J＝7.2Hz,3H),3.30(q,J＝7.2Hz,1H),4.25(q,J＝7.2Hz,2H),4.60(d,J＝14.1Hz,1H),4.89(d,J＝14.4Hz),6.95(m,2H),7.20(m,1H),7.75(s,1H),8.11(s,1H)ppm。

RS/SR-酯I的¹H-NMR(CDCl₃,300MHz)δ＝0.98(t,J＝7.2Hz,3H),1.41(d,J＝7.2Hz,3H),3.37(q,J＝7.2Hz,1H),3.95(m,2H),4.61(d,J＝13.8Hz,1H),4.83(d,J＝14.1Hz),6.97(m,3H),7.71(s,1H),8.08(s,1H)ppm。

对比实例A：通过有机锂偶联制备外消旋酯(I)

a)在四氢呋喃(THF)中制备二异丙胺锂(LDA)的母液：

将二异丙胺(716mg、7.1mmol、1.05eq)溶解在无水THF(21.3mL)中，并且在氮气氛下将生成的溶液冷却至-78℃。随后，以逐滴的方式经15分钟添加n-BuLi(在正庚烷中的2.7M溶液，2.5mL，6.7mmol，1.0eq)，并且在-78℃，将反应混合物搅拌持续另外的15分钟。然后将该溶液加温至0℃，并且搅拌持续30分钟，此后再次将母液冷却至-78℃。

b)偶联反应：

将由此获得的LDA溶液(3.66mL、0.98mmol、1.1eq)转移至一个Schlenk(施伦克)容器，并且在-78℃，在氮气氛下，以逐滴的方式添加丙酸乙酯(100mg、0.98mmol、1.1eq.)。在-78℃将生成的混合物搅拌持续30分钟，并且然后经15分钟，以逐滴的方式添加THF(3.66mL)中的1-(2,5-二氟苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)乙酮(200mg、0.90mmol、1.0eq.)。在-78℃，将反应混合物搅拌2小时，并且然后用乙酸淬灭并且加温至室温。用水性饱和NH₄Cl和乙酸乙酯稀释该混合物。用乙酸乙酯萃取水层(2x)，并且用盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并且真空浓缩以给出包含外消旋酯I的一种黄色油，具有29％的非对映异构体过量，偏向于希望的RR/SS非对映异构体。用柱色谱法进一步纯化(正庚烷EtOAc/MeOH60/40/5v/v/v)提供了RR/SS非对映异构体(浅黄色固体)连同RS/SR非对映异构体(灰白色固体)，具有组合的总产率179mg(0.55mmol，61％)。

对比实例B：用已存在的酮，在升高的温度下(Barbier(巴比尔)条件)，根据步骤 (i)、(ii)和(iii)所述的列福马茨基(Reformatsky)反应

用锌(1.1g、17mmol、8eq.)填充一个2颈烧瓶，并且在真空下使用一个热枪(hotgun)加热(3个氮-真空循环)。随后，添加THF(60mL)，并且然后是三甲基硅烷基氯化物(0.15mL)。在室温下，在氮气氛下搅拌生成的悬浮液15分钟，此后添加在THF(30mL)中的酮III(R₁＝F、1.0g、4.5mmol、1.0eq.)溶液。然后将反应混合物加热至66℃，此后移除加热源。随后，经10分钟滴加THF(20mL)中的2-溴丙酸乙酯溶液(0.87mL、1.2g、6.7mmol、1.5eq.)。在66℃搅拌反应混合物1.5小时，此后将其冷却至室温。通过添加饱和的水性氯化铵溶液(100mL)淬灭反应，并且用甲基叔丁基醚(MTBE、100mL)进行稀释。将各层分离并且将水层用MTBE(2×100mL)萃取。用盐水(100mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并且真空浓缩以给出包含外消旋酯I的一种黄色油(1.4g)。¹H-NMR-和GC-分析示出80％的酮III的转化(R₁＝F)和60％的酯I的d.e.，偏向于希望的RR/SS非对映异构体。不进一步纯化产物。

实例1：根据步骤(iii)的列福马茨基反应，其中在低温下预形成列福马茨基试剂，随后与酮加成

a)制备列福马茨基试剂的母液：

在氮气氛下，用锌(5.8g、89mmol、2.0eq.)填充一个2颈烧瓶，并且添加无水THF(101mL)，并且然后添加三甲基硅烷基氯化物(TMSCl、1.12mL)。在室温下搅拌生成的悬浮液30分钟，并且然后冷却至0℃。随后，经30分钟，以逐滴的方式将2-溴丙酸乙酯(5.8mL、8.1g、44.7mmol、1.0eq.)添加至该悬浮液。将反应混合物搅拌另外的15分钟，并且然后在氮气氛下过滤进一个Schlenk(施伦克)容器，以移除残余的锌。

将酮III(R₁＝F、1.0g、4.5mmol、1.0eq.)填充进一个Schlenk(施伦克)容器，并且在氮气氛下，添加无水THF(10mL)。在室温下，伴随搅拌，经30分钟，以逐滴的方式向生成的溶液添加20mL的预先制备的列福马茨基试剂的母液(见上，8.36mmol、1.9eq.)。在完成添加后，在氮气氛下，搅拌生成的反应混合物36小时(澄清溶液)。GC分析示出，酯I(R₁＝F)已经形成，基于酮III(R₁＝F)具有80％转化，并且具有60％的非对映异构体过量，偏向于希望的RR/SS非对映异构体。真空浓缩反应混合物至10mL的体积，此后添加正庚烷，直至观察到固体形成。搅拌生成的悬浮液16小时，此后经过滤分离该固体。然后将该固体溶解在水性HCl(pH＝1)和乙酸乙酯的混合物中，生成澄清的两相系统。分离这些相并且将水层用乙酸乙酯(2x)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并且真空浓缩以给出外消旋RR/SS酯I(R₁＝F)，为一种浅黄色固体，如通过GC确定，具有>99％d.e.。

实例2：根据步骤(iii)的列福马茨基反应，其中在添加酮之前将锌移除

在一个250mL 3颈烧瓶中，将锌(11.7g、179mmol、4.0eq.)悬浮在THF(200mL)中并且在环境温度下，在氮气氛下，在TMSCl(2.25mL)的存在下，搅拌30分钟。随后，将该悬浮液冷却至0℃，并且经45分钟，经由一个注射泵添加2-溴丙酸乙酯(11.6mL、89.6mmol、2.0eq)。在0℃，搅拌反应混合物另外的15分钟(用GC检查转化达到100％)，此后，在氮气流下，在一个玻璃滤器上，经由套管将该悬浮液过滤进反应容器(500mL3颈烧瓶)。随后，在室温下，经1小时，将THF(130mL)中的酮III(R₁＝F、10g、44.8mmol、1.0eq.)的溶液添加至该反应混合物中。搅拌该混合物持续另外的72小时，在这个点已经形成一种固体。过滤该悬浮液并且将灰白色固体悬浮在EtOAc中，并且通过添加水和水性HCl进行溶解，直至获得澄清的两相系统(pH 1)。分离各层并且将水层用EtOAc(2x)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并且真空浓缩以给出外消旋RR/SS酯I(R₁＝F、8.8g、27mmol、60％)，为一种浅黄色固体，如通过GC确定，具有>99％d.e.。滤液经历相同的水性处理(work-up)。GC分析示出，在滤液中存在剩余的酮，连同外消旋酯I，具有-25％的d.e.(偏向于不希望的RS/SR非对映异构体)。

实例3：根据步骤(iii)的列福马茨基反应，在添加酮之后但在开始沉淀之前将锌移除

将锌(98g、1.5mol、4.0eq.)悬浮在THF(1.7L)中并且在环境温度下，在氮气氛下，在TMSCl(18.7mL)的存在下，机械搅拌30分钟。随后，将该悬浮液冷却至0℃，并且经1小时，经由一个注射泵添加2-溴丙酸乙酯(96.6mL、744mmol、2.0eq)。在0℃搅拌反应混合物15分钟(用GC检查转化达到100％)，此后在室温，经20分钟，添加酮III(R₁＝F、83g、372mmol、1.0eq.)在THF(830mL)的溶液。搅拌该混合物另外的15分钟(用GC检查转化达到>90％)，并且然后用硅藻土(celite)过滤。用GC确定反应混合物的d.e.达到60％。搅拌该反应混合物后，在5小时后开始形成一种悬浮液。搅拌该悬浮液88小时，在这个点，母液的d.e.已经下降至-10％(偏向于不希望的RS/SR非对映异构体)。过滤该悬浮液，并且用MTBE(2x 125mL)洗涤灰白色固体。随后将该固体悬浮在EtOAc(2.1L)中，并且通过添加水(1.25L)和水性HCl(10％w/w；76g)进行溶解，直至获得澄清的两相系统(pH 1.3)。分离各层并且用水性HCl(1.1L、pH 1.1)、水性NaHCO₃(500mL，包含0.60g NaHCO₃)、水(2x 250mL)和盐水(250mL)洗涤有机层。然后干燥有机层(Na₂SO₄)，过滤并且真空浓缩以给出外消旋RR/SS酯(54g、167mmol、45％)，具有97％d.e.。

实例4：根据步骤(iv)的酶法拆分

向磷酸钾缓冲溶液(500mL、50mM、pH 7.8)添加包含SEQ ID NO 1的酯酶(10g、表达编码SEQ ID NO 2的酯酶的SEQ ID NO 1的重组酯酶基因的完整大肠杆菌细胞，如在WO2010/122175中所述而制备)的悬浮液(100mL)。将pH调适至7.8，并且随后添加在甲苯(400mL)中的外消旋RR/SS酯I(R₁＝F、40g、123mmol、97％d.e.)的溶液。在28℃搅拌生成的混合物，同时经由用NaOH(1M、aq.)滴定，将pH维持在7.8。用HPLC进行分析，示出在22小时后，R,R-酯I的e.e.为98.5％。在26小时后，如以下处理该反应。注意，在20小时内具有2:1和3:1的S/C-比率的反应都完成了，R,R-酯I的e.e>99％。

SEQ ID NO 1:

ATGGGACAACCAGCTTCGCCGCCTGTCGTTGATACCGCTCAAGGACGAGTCTTGGGTAAGTACGTCTCTTTAGAGGGATTGGCACAACCGGTTGCTGTCTTCTTGGGAGTCCCTTTTGCTAAGCCACCTCTTGGATCTTTGAGGTTTGCCCCGCCGCAACCAGCAGAGCCATGGTCTTTCGTTAAGAACACTACTTCCTACCCTCCAATGTGTTGTCAAGAACCAATCGGAGGACAAATGCTTTCAGACCTATTCACTAACAGAAAGGAAAGGCTTATCCCGGAGTTCTCTGAGGATTGCCTTTACCTAAATATTTACACTCCTGCCGATTTGACAAAGAGGGGTAGGTTGCCGGTTATGGTTTGGATTCATGGAGGAGGTTTGGTTGTTGGCGGAGCATCCACTTATGACGGATTGGCTCTTGCCGCGCACGAGAACGTTGTTGTTGTTGCTATTCAATACCGTTTGGGTATTTGGGGATTTTTCTCCACAGGAGATGAGCATTCCCGTGGAAACTGGGGCCATTTAGATCAAGTTGCTGCATTGCATTGGGTCCAAGAAAACATTGCTAACTTCGGAGGTGATCCAGGTTCTGTTACTATTTTCGGAGAATCAGCAGGCGGAGAGAGTGTCTCTGTATTGGTTTTATCACCATTAGCTAAGAACCTTTTTCATCGTGCTATTTCCGAAAGTGGTGTTGCTTTTACCGCCGGTGTGGTCAGGAAGGATATGAAGGCCGCAGCCAAGCAGATCGCTGTCCTTGCAGGATGCAAAACTACTACTTCGGCAGTCTTCGTGCATTGTTTGCGTCAAAAGTCGGAAGATGAACTTTTAGACCTCACGTTGAAGATGAAATTCTTTGCCCTTGACTTACACGGAGATCCAAGGGAATCTCACCCTTTTTTGACCACTGTTGTTGACGGAGTTTTGTTGCCTAAGATGCCTGAGGAAATCTTGGCCGAGAAGGACTTTAACACCGTCCCATACATTGTTGGAATTAACAAGCAGGAGTTCGGATGGCTTTTGCCAACGATGATGGGATTTCCTCTTTCCGAGGGAAAGTTGGATCAAAAGACGGCTACGTCACTTTTGTGGAAGTCCTACCCAATTGCCAACATTCCTGAAGAGTTGACCCCAGTTGCTACCGATAAGTATTTAGGAGGAACAGATGATCCTGTCAAAAAGAAAGATTTGTTTTTGGATCTGATGGGAGACGTTGTTTTCGGCGTCCCATCAGTTACGGTTGCTCGTCAGCATAGGGACGCAGGAGCTCCAACTTACATGTATGAGTTCCAATATCGTCCATCTTTTTCATCGGATAAGAAACCTAAGACGGTTATTGGAGATCATGGAGACGAAATTTTTTCCGTCTTCGGCTTCCCATTGCTCAAAGGTGACGCTCCAGAGGAAGAAGTCAGTCTTTCTAAGACGGTTATGAAATTTTGGGCTAACTTCGCCCGTAGTGGAAACCCTAATGGAGAAGGATTGCCTCACTGGCCGATGTACGATCAAGAGGAGGGATACCTTCAAATTGGTGTCAACACTCAAGCAGCTAAGAGGTTGAAAGGCGAGGAGGTTGCTTTTTGGAACGACCTGTTGTCCAAGGAAGCAGCAAAGAAGCCACCTAAGATAAAGCACGCCGAATTGTAA

处理：

将硅藻土(Dicalite)4208(20g)添加至反应混合物，并且将生成的悬浮液搅拌5分钟。随后，用预涂布的(硅藻土4108)玻璃滤器过滤该混合物。用甲苯(2x 200mL)洗涤滤饼，并且分离合并的滤液。在这个阶段，甲苯层略微乳化，所以用预涂布的滤器进行第二过滤。分离生成的双相滤液，并且将水层添加至更早获得的水相。然后用甲苯(250mL)萃取合并的水层，给出完全乳化的有机相。在预涂布的滤器上过滤甲苯层两次，此时获得澄清的两相系统。分离各层并且用水性NaHCO₃(100m、5wt％)洗涤合并的有机层。最终，真空浓缩有机层，以给出R,R-酯I，为一种灰白色固体：

使用由此获得的实验方案，将210g的外消旋RR/SS-酯I(d.e.97％)分五个批次进行转化，每个批次包含40-45克的起始材料。以48％产率分离对映体纯的酯R,R-酯I(d.e.95％；e.e.>99.5％)(101g、311mmol)。

分析：

用手性HPLC完成酯I的e.e.的确定。开发了分离外消旋RR/SS-酯I的对映异构体连同对应的羧酸的对映异构体的单一方法：

柱Daicel AD，2x 50x 4.6mm ID，粒径：10μm，洗脱液：庚烷/MeOH/EtOH 95:2.1:2.9v/v/v+0.05％三氟乙酸+0.05％二乙胺；运行时间：15min，压力：10巴，流速：1.8mL/min，温度：20℃，在210nm UV检测。保留时间：SS-对映异构体酯I：2.15min；SS-对映异构体羧酸：3.02min；RR-对映异构体羧酸：4.31min；RR-对映异构体酯I：8.21min。

通过用HPLC测量酯I连同羧酸这二者的浓度，确认转化：

柱Hypersil BDS-3，250x 4.6mm ID，粒径，5μm，洗脱液A：Milli-Q中的0.15％甲酸和0.025％三乙胺；洗脱液B：乙腈中的0.15％甲酸和0.025％三乙胺；经10min，梯度A:B＝95:5(v/v)至5:95，在5:95维持5min，经3min至95:5，在95:5维持5min(t＝23min)。流速：1.0mL/min，温度：40℃，在210nm UV检测。保留时间：羧酸：9.55min；酯I 12.35min。

实例5：酶筛选

在用于水解酯I的多于200种水解酶(脂肪酶、酯酶、蛋白酶)的筛选中，在加盖的玻璃小瓶中，将225μl的100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5中的每种单独的酶与按250μl的终体积溶解在叔丁醇中的2mg的酯I一起孵育，并且在400rpm，在一台IKA KS 130振动器(IKA公司，Staufen(施陶芬)，德国)上，在28℃孵育。在过夜孵育后，将40μl 0.5M磷酸添加至每个小瓶，随后用710μl甲基叔丁基醚(MTBE)稀释，并且在装备有JS-5.3转子的Avanti J-20XPI离心机上(Beckman Coulter(贝克曼库尔特)公司，Woerden(武尔登)，荷兰)，在3500rpm离心20min。

用HPLC确定剩余的酯连同生成的羧酸的对映异构体过量(e.e.)(如以上所述)。用这两个e.e.值的比较计算转化：

转化＝[e.e.酯/(e.e.酯+e.e.羧酸)]*100％

这一大水解酶集合中，仅8个重组猪肝酯酶可以优先水解酯I的不希望的对映异构体(表1)。

表1：酶筛选的结果

这一实例示出，若干重组猪肝酯酶对映选择性地水解酯I。可以使用表达分别编码根据WO 2009/004093和WO 2010/122175中的说明书的所述酯酶的SEQ ID No.3、5、7、9或11的重组酯酶基因的大肠杆菌细胞，制备示出SEQ ID No.4、6、8、10或12的酯酶。

实例6：重组猪肝酯酶的重复测试

基于初始酶筛选的结果，选择5个酶用于在250mg规模的重复测试。基于针对酯I的活性和选择性选择这些酶。对于每个单独的反应，将250mg的酯I溶解在1ml叔丁醇中。随后，按每1mg酯I 1mg总蛋白的酶/底物比率，将5ml100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5和包含各自过表达的重组猪肝酯酶的4ml无细胞提取物添加进Metrohm 718 STAT Titrinos(Metrohm(万通)公司，Schiedam(斯希丹)，荷兰)中。用1M NaOH，将pH保持恒定在7.5。在规则的时间点分析样品，以便用HPLC确定剩余的酯连同生成的羧酸的对映异构体过量(e.e.)(如以上所述)。用这两个e.e.值的比较计算转化。结果给出在表2中。

表2：酯I至对应的羧酸的猪肝酯酶催化的水解反应的转化和e.e.。-＝未确定的。

根据下式，从产生的羧酸的转化和e.e.计算单独的酯酶反应的对映选择性(E)：

E＝ln((1-(转化/100)*(1+(e.e._酸/100))))/ln((1-(转化/100)*(1-(e.e.酸/100))))

并且给出在表3中。

表3：酯I的猪肝酯酶催化的水解的对映选择性

SEQ ID NO.2的重组猪肝酯酶被鉴定为具有以下的最佳候选：50％转化，在5h后，针对酯I的99.5％的e.e，以及E>500的优秀对映选择性。

实例7：溶剂对猪肝酯酶反应的影响

使用如在WO 2010/122175中所述已经产生的表达SEQ ID NO.1的基因的重组大肠杆菌细胞研究有机溶剂对通过SEQ ID NO.2的猪肝酯酶进行的酯I的水解的影响。在28℃，向0.5g的酯I，添加7.5ml的50mM磷酸钾缓冲液pH7.8、0.1g的包含SEQ ID NO.1的酯酶的湿重组大肠杆菌细胞(在1ml 50mM磷酸钾缓冲液pH 7.8中)、和2.5ml的有机溶剂。在分开的反应中，将甲苯、甲基异丁基酮、乙酸叔丁酯抑或2-甲基-四氢呋喃作为有机溶剂进行添加。作为对照，代替有机溶剂，添加2.5ml的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.8。

用1M NaOH，将pH保持恒定在7.8。在规则的时间点分析样品，以便用HPLC确定剩余的酯连同生成的羧酸的对映异构体过量(e.e.)(如以上所述)。用这两个e.e.值的比较计算转化(如以上所述)。结果给出在表4中。

表4：有机溶剂对通过SEQ ID No.2的重组猪肝酯酶进行的R,R/S,S-酯I的水解的作用。

溶剂乙酸叔丁酯，并且尤其是甲苯对酯I水解的速率具有清晰的正效应。用甲苯，在22小时后，以50.0％转化和99.2％e.e.获得了酯I。

Claims

1.用于制造根据式(I)的3-羟基-2-甲基-4-[1,2,4]三唑-1-基-3-苯基-丁酸酯衍生物的非对映异构体的混合物的方法：

该混合物富集对应的(2R,3R)/(2S,3S)外消旋体，并且

该方法包括以下步骤

(i)制备根据式(II)的2-卤化锌丙酸酯

其中X是溴、碘或氯，

该制备是在一种溶剂存在时，

在低于该溶剂沸腾温度的一个温度下进行的，

(ii)引入根据式(III)的酮

在将最后的试剂添加至该混合物后，通过使该混合物在搅拌或不搅拌下静置多于0.5小时，而允许所生成的反应混合物形成一种沉淀，其中该沉淀富集根据式(I)的外消旋(2R,3R)/(2S,3S)酯，并且

分离所述沉淀，

其中可以互换步骤(i)和(ii)进行的顺序，并且其中在形成所述沉淀前移除过量的锌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在将最后的试剂添加至该混合物后，使该混合物在搅拌或不搅拌下静置多于2小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在将最后的试剂添加至该混合物后，使该混合物在搅拌或不搅拌下静置多于12小时。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中式(I)中的R₁是氟，并且R₂是氢。

5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中式(II)中的R是乙基和/或式(II)中的X是溴。

6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中步骤(i)中的温度是在-10℃和40℃之间。

7.根据权利要求6所述的方法，其中该温度是在-10℃和10℃之间。

8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中步骤(iii)中的温度低于该溶剂的沸腾温度。

9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在步骤(ii)之前进行步骤(i)。

10.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中步骤(i)和/或步骤(iii)中的溶剂是一种极性非质子溶剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中该溶剂是四氢呋喃、2-甲基-四氢呋喃、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二乙基醚、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷或甲苯。

12.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中经由2-卤丙酸酯与金属锌的反应获得步骤(i)的2-卤化锌丙酸酯。

13.根据权利要求1、2或3所述的方法，该方法随后是

(iv)通过在一种有机溶剂中溶解和/或萃取步骤(iii)中获得的沉淀，以及在所述溶液中将(2R,3R)/(2S,3S)非对映异构体进行拆分，以获得一种富集所希望的、式(I)的酯的(2R,3R)对映异构体的产物：

14.根据权利要求13所述的方法，其中使用一种酯酶将根据式(I)的酯的非对映异构体进行酶法拆分。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述酯酶是包含SEQ ID No.4中示出的氨基酸序列的、具有酯酶活性的一种分离多肽，或其具有至少95％的氨基酸一致性的一种同系物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述同系物具有至少98％的氨基酸一致性。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述酯酶是包含SEQ ID No.2中示出的氨基酸序列的、具有酯酶活性的一种分离多肽，或其具有至少95％氨基酸一致性的一种同系物，该同系物在位置239或与其对应的位置包含缬氨酸作为氨基酸。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述同系物具有至少98％的氨基酸一致性，并且在根据SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置239或在与其对应的同系物的序列的位置包含缬氨酸作为氨基酸。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述同系物具有至少99％的氨基酸一致性。

20.根据权利要求17所述的方法，其中该具有酯酶活性的分离多肽包含SEQ ID No.2中示出的氨基酸序列。

21.根据权利要求20所述的方法，其中该具有酯酶活性的分离多肽是SEQ ID No.2中示出的氨基酸序列。

22.根据权利要求17所述的方法，其中用于该酶法拆分的一种有机助溶剂选自叔丁醇、乙酸叔丁酯、甲基异丁基酮和甲苯。

23.根据权利要求13所述的方法，随后是通过用氨处理，将在步骤(iv)中获得的、富集所希望的式(I)的酯的(2R,3R)对映异构体的产物转化为对应的酰胺。

24.根据权利要求23所述的方法，随后是将该酰胺脱水为对应的氰化物。

25.根据权利要求24所述的方法，随后是将该氰化物转化为对应的硫代酰胺。

26.根据权利要求25所述的方法，随后是通过与一种α-酮基-取代的4-氰基乙酰苯试剂反应使所述硫代酰胺进行反应。

27.根据权利要求26的方法，其中所述硫代酰胺的苯基部分是2,5-二氟-取代的，并且所述硫代酰胺转化为艾沙康唑。

28.根据权利要求26的方法，其中所述硫代酰胺的苯基部分是2,4-二氟-取代的，并且所述硫代酰胺转化为雷夫康唑。

29.式(I)的3-羟基-2-甲基-4-[1,2,4]三唑-1-基-3-苯基-丁酸酯非对映异构体的混合物：

以非对映异构体过量而包含(2R,3R)/(2S,3S)酯的外消旋混合物，如通过GC确定，该非对映异构体过量是在97％和99.9％之间，其中R₁和R₂各自是氟或氢，并且当R₁是氟时，R₂是氢，而当R₂是氟时，R₁是氢，其中R是C₁-C₁₂烷基、C₅-C₁₂芳基或C₆-C₁₁芳烷基。

30.根据权利要求29的式(I)的3-羟基-2-甲基-4-[1,2,4]三唑-1-基-3-苯基-丁酸酯非对映异构体的混合物，以99％和99.9％之间的非对映异构体过量而包含(2R,3R)/(2S,3S)酯的外消旋混合物。

31.根据式(I)的(2R,3R)-3-羟基-2-甲基-4-[1,2,4]三唑-1-基-3-苯基-丁酸酯衍生物：

其中

R是C₁-C₁₂烷基或C₅-C₁₂芳基，

R₁是氟并且

R₂是氢。