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CN104507502A - 基于凝集素的递送系统 - Google Patents

基于凝集素的递送系统 Download PDF

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CN104507502A
CN104507502A CN201380038879.2A CN201380038879A CN104507502A CN 104507502 A CN104507502 A CN 104507502A CN 201380038879 A CN201380038879 A CN 201380038879A CN 104507502 A CN104507502 A CN 104507502A
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CN
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xcl
lectin
fruiting body
variant
protein
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CN201380038879.2A
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L·帕克罗
G·格罗斯
C·朗迪朗蒂
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NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH
Universite de Toulouse
Original Assignee
NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH
Universite Toulouse III Paul Sabatier
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Publication date
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Abstract

本发明涉及真菌子实体凝集素或其变体用于将活性剂递送到生物靶标的用途。

Description

基于凝集素的递送系统
技术领域
本发明总体上涉及递送系统，更具体的，涉及基于凝集素的递送系统。
本发明尤其是在癌症治疗中具有应用。
现有技术
最近医药领域的研发关注基于蛋白质的递送系统。这些基于蛋白质的平台是用于医疗领域的非常好的候选者。实际上，这些系统显示出良好的生物相容性、生物降解性和低毒性。
大量蛋白质已经被用作用于递送药物(包括铁蛋白/脱铁铁蛋白、各种病毒的衣壳、白蛋白、麦醇溶蛋白等)的系统。这些蛋白质递送系统具有多种形式，例如微球、纳米颗粒、水凝胶、膜和蛋白笼。
基于蛋白质的递送系统(尤其是蛋白笼)似乎是有前景的递送系统，由于它们的均匀尺寸、它们的生物利用度和它们的生物降解性使得可以避免基于聚合物的递送系统的某些缺点(Maham等,2009)。
因此需要新的基于蛋白质的递送系统。除了它们的生物利用度和生物降解性特性，这些递送系统必须能够以简单和可重复的方式大量制备。
此外，这些递送系统必须设计为将治疗剂特异性递送到待处理的细胞以限制与该治疗相关的副作用。
因此，递送系统必须将治疗剂约束于它们的蛋白笼内并在其到达待治疗靶标时将其释放。
最后，递送系统必须易于表征，且它们的安全性必须说明。
发明简述
真菌子实体凝集素(也称为第2组蘑菇凝集素)家族是同时具有序列和结构同源性的真菌凝集素的家族。
该凝集素家族成员的序列同源性在Birck C等(2004)、Trigueros等(2003)和Khan等(2011)中有大量描述。
此外，某些成员的三维结构分析显示了结构相似性。因此，已表明红绒盖牛肝菌(Xerocomus chrysenteron)凝集素(XCL)(Birck C等(2004))、双孢菇(Agaricus bisporus)凝集素(ABL)(Carrizo M.等(2004))、和美味牛肝菌(Boletus edulis)凝集素(BEL)(Michele Bovi等(2011))这三个形成具有中央腔的四聚体。
该真菌子实体凝集素家族尤其包括双孢菇凝集素(ABL)、少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)凝集素(AOL)、美味牛肝菌凝集素(BEL)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)凝集素(GZL)、红绒盖牛肝菌凝集素(XCL)、姬菇(Pleurotus cornucopiae)凝集素(PCL)和卷缘网褶菌(Paxillus involutus)凝集素(PIL)(Birck等,2004)(Crenshaw等,1995)。
本发明人已经成功地将活性剂约束于真菌子实体凝集素多聚体的腔室中，并表明如此限制的活性剂能够被递送到生物靶标。
真菌子实体凝集素用作约束络合物使得可以抑制，或至少减少，现有技术递送系统的全部或部分缺点。
实际上，这些凝集素具有对上皮肿瘤标志物的亲和性和特异性。
在该家族的成员中，有存在于蘑菇双孢菇(即白蘑菇)的凝集素ABL。这种蘑菇是世界上消费最多的蘑菇之一。因此，推理可以排除这种蛋白质对于人类的毒性或致敏性。
该家族的凝集素及其变体易于重组生产，因此可以达到极大量的生产和纯化(g/升)。
尤其是，这些凝集素随时间稳定(在4℃几个月，在室温几周)，且能很好地抵抗恶劣的物理化学条件(SDS、温度、离子强度)。
最后，除了它们可逆地约束活性剂的能力及其低毒性，这些凝集素形成具有可以包含活性剂的腔室的多聚体而不需要在该多聚体和它包含的活性剂之间的共价键。
因此，本发明的第一个方面涉及真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素的变体用于将作为治疗剂或诊断剂的活性剂递送到生物靶标的用途。
在第二个方面，本发明还涉及包含作为治疗剂或诊断剂的活性剂和真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素的变体的络合物。
希望改进这些凝集素在约束活性剂中的表现的同时，本发明人发现XCL(一种特别适于用作递送系统的凝集素)的某些变体具有改善的约束能力，且仍然保留其在到达靶标时释放活性剂的能力。本发明涉及此类变体，更具体的具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的XCL变体。
本发明的另一个方面还提供：
–包含根据本发明的络合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
–用于治疗人体或动物体的方法，尤其是治疗癌症的方法中的根据本发明的真菌子实体凝集素、其变体或络合物。
发明详述
真菌子实体凝集素用于递送活性剂的用途
本发明人已经成功控制某些真菌子实体凝集素多聚体的结构，使得活性剂能以稳定的方式插入它们的腔室中并在该多聚体-活性剂络合物到达指定的生物靶标时释放。
因此，本发明涉及真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素的变体用于将作为治疗剂或诊断剂的活性剂递送到生物靶标的用途。
术语“治疗剂”是指当其以治疗有效量施用时具有药理活性或对健康有益的试剂。
在一个优选的实施方案中，所述治疗剂是化疗剂。
所述化疗剂可以是细胞毒性化疗剂诸如，例如，破坏DNA的试剂、抗代谢物、抗有丝分裂物或长春花生物碱(Cancer immunotherapy:immune suppression and tumor growth,George C.等)(道兰氏医学词典中的化疗)。
破坏DNA的试剂可以是烷化剂，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、苏消安和塞替派，拓扑异构酶抑制剂例如喜树碱、伊立替康和拓扑替康或安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷或铂基化合物例如顺铂、卡铂、奥沙利铂。
抗肿瘤抗生素的实例是蒽环类化合物例如多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星或丝裂霉素。
抗代谢物的实例是叶酸拮抗剂例如氨甲喋呤、嘌呤拮抗剂例如氟达拉滨、和嘧啶拮抗剂例如5-氟脲嘧啶。
抗有丝分裂物的实例是紫杉烷类化合物例如紫杉醇和多西他赛。
长春花生物碱的实例是长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛。
术语“诊断剂”是指当其以有效量施用时可以鉴定受试者是否患有或疑似发展指定的病理。
在一个实施方案中，所述诊断剂可以是放射性试剂或荧光剂。
所述诊断剂可以包括，例如碘(I)如123I、125I、131I等、钡(Ba)、钆(Gd)、锝(Tc)包括99Tc、磷(P)包括31P、铁(Fe)、锰(Mn)、钛(TI)、铬(Cr)包括51Cr、碳(C)包括14C的或荧光标记的化合物的放射性同位素。
在一个优选的实施方案中，当所述诊断剂被约束在凝集素多聚体中时它不能或很难被检测到，且只有当它在生物靶标水平释放时它才变成明显可检测到的。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的活性剂是治疗剂。
术语“变体”是指具有与是其变体的蛋白质氨基酸序列至少80％一致性的氨基酸序列的蛋白质，且其具有约束基本上大于或等于是其变体的蛋白质的活性剂的能力。
通常，蛋白质变体与是其变体的蛋白质氨基酸序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致性。
一致性百分比是指氨基酸序列的比较，且通过在窗口鉴别器上比较两个最佳对准序列来测定，其中窗口鉴别器中的部分氨基酸序列在两个序列的最佳对准中对于参考序列(其不包含任何添加或缺失)可以包含添加或缺失(例如，差异)。所述百分比可以通过测定两个序列中的相同氨基酸残基的位置数以获得窗口鉴别器中的总位置数并将该结果乘以100以获得序列一致性百分比来计算。或者，所述百分比可以通过测定其氨基酸残基按照差异对齐的两个序列中的相同氨基酸残基的位置数以获得对应的位置数，将该对应的位置数除以窗口鉴别器中的总位置数并将该结果乘以100以获得序列一致性百分比来计算。本领域技术人员了解用于对准两个序列的几种已知算法。可以通过，例如，Smith和Waterman局部对准算法，1981,Adv.Appl.Math.2:482、Needleman和Wunsch算法,1970,J.MoI.Biol.48:443、Pearson和Lipman相似性搜索方法,1988,Proc.Natl.Acad.ScL USA 85:2444、这些算法的计算机化实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或视觉验证(Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.,eds.,(1995Supplement)(Ausubel)进行用于比较的序列的最佳对准。适于测定序列一致性和相似性百分比的算法的实例是分别在Altschul等,1990,J.MoI.Biol.215:403-410和Altschul等,1977,Nucleic Acids Res.3389-3402中描述的BLAST和BLAST2.0算法。在生物技术信息国家中心的网页上可获得用于进行BLAST分析的软件。
约束活性剂的能力可以根据实施例中描述的荧光法测量。
在一个优选的实施方案中，本发明的真菌子实体凝集素选自ABL、AOL、GZL、XCL、PCL、BEL和PIL或其变体。
优选地，真菌子实体凝集素是XCL、ABL、BEL或其变体。
红绒盖牛肝菌凝集素XCL是属于由人采用可食用蘑菇红绒盖牛肝菌分离的真菌子实体凝集素家族的蛋白质。
该蛋白以其杀虫活性而闻名，尤其是在Wang M等(2002)、Trigueros V等(2003)和Birck C等(2004)中被描述。
该蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。
XCL具有SEQ ID NO：5的异构体XCL2。
Birck C等(2004)已经表明，XCL在溶液中以四聚体结构形式出现，在其中央产生腔室，该腔室的壁由每个单体限制。在双孢菇凝集素ABL(Carrizo M.等(2004)和美味牛肝菌凝集素BEL(Michele Bovi等(2011)中发现该相同结构。
本发明人发现XCL的某些变体具有用作约束络合物的最优特征。
这三种优选的变体是其中苏氨酸12被半胱氨酸取代和/或丙氨酸38被半胱氨酸取代的XCL突变体。这些变体在改进保持其闭合形式下的XCL四聚体组装时仍然能够控制其打开。
本发明人尤其表明，变体A38C的链间二硫桥提供了两种类型的结构限制。一方面，该共价键降低了关闭进入蛋白笼腔的环的活动自由，这防止被约束的活性剂的渗漏。另一方面，单体之间加入的键意味着被氧化的变体的分解只有在四个界面都破裂时才会发生。因此，该变体有高度稳定的四聚体结构。
因此，本发明涉及具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的XCL变体。
表1.序列概述
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的XCL变体用于将作为治疗剂或诊断剂的活性剂递送到生物靶标的用途。
在一个优选的实施方案中，所述XCL变体具有氨基酸序列SEQID NO：2。
在一个优选的实施方案中，所述生物靶标是癌细胞。
实际上，大多数真菌子实体凝集素包括XCL(Damian等(2005))和ABL(Milton等(2001))特异性识别抗原Thomsen Friedenreich(TF)(Damian L等(2005))。所述TF抗原(Galβ1-3GalNAcα/β1)或其直接前体Tn(Gal-NAc-O-丝氨酸)在大多数癌中表达，尤其是在膀胱(Langkilde NC等(1992))、结肠直肠(Itzkowitz SH,等(1989))、胃肠道、前列腺、卵巢(MacLean GD,等(1992))、乳腺(Wolf BC,等(1989)和Carraway KL,等(2005))、肺(Stein R等,(1989))、皮肤(Heimburg J,等(2006))癌症中表达。
相反，所述TF抗原很少或不在正常组织中表达(Springer GF(1984)and Cao Y等(1996))。
因此，本发明的凝集素对TF的特异性允许将后者递送到癌细胞。
本发明还涉及将作为治疗剂或诊断剂的活性剂递送到生物靶标的方法，其中将所述活性剂与真菌子实体凝集素或其变体接触。
优选地，在本发明的一个实施方案中，将所述活性剂约束在真菌子实体凝集素多聚体或其变体中。
络合物
本发明还涉及包含作为治疗剂或诊断剂的活性剂和真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素变体的络合物。
所述活性剂是如上所定义的治疗剂或诊断剂。
通常，根据本发明的络合物的真菌子实体凝集素或凝集素变体是多聚体的形式。
通常，所述凝集素多聚体具有设置活性剂的内腔。
优选地，在所述凝集素多聚体和所述活性剂之间没有共价键。
在一个优选的实施方案中，所述多聚体是同源多聚体。
在另一个实施方案中，所述多聚体可以是异源多聚体。在该实施方式的一个优选的可选方式中，所述异源多聚体由真菌子实体凝集素和该凝集素的变体组成。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的络合物的多聚体是四聚体，更优选同源四聚体。
优选地，根据本发明的络合物包含选自ABL、AOL、GZL、XCL、PCL、BEL和PIL或其变体的真菌子实体凝集素。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的络合物的真菌子实体凝集素是XCL、ABL或其变体。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的络合物的真菌子实体凝集素是XCL或XCL变体。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的络合物的真菌子实体凝集素是具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的XCL变体。
本发明还涉及制备根据本发明的络合物的方法，其特征在于其包括将真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素的变体与作为治疗剂或诊断剂的活性剂接触的步骤。
所述制备络合物的方法可以进一步包括去除没有被约束的活性剂的步骤。
所述方法可以包括在与活性剂接触步骤之前的还原真菌子实体凝集素或其变体的步骤和与活性剂接触步骤之后的氧化步骤。
该步骤允许二硫桥的生成，以稳定该凝集素多聚体，尤其是对由一个或几个半胱氨酸修饰的变体而言，从而能够产生这种桥。
药物组合物
本发明还涉及包含根据本发明的络合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
所述赋形剂根据药物形式和期望的施用方法从常用赋形剂中选择。
根据本发明的组合物可以通过，例如注射、喷雾或经口施用。
根据本发明的药物组合物可以是，例如液体、固体、凝胶或冻干物的形式。
在这些组合物中，所述活性剂有利地以生理有效量存在。
优选地，这些药物组合物意欲用于非全身施用，例如肠内施用。
治疗方法
本发明还涉及根据本发明的络合物用于治疗人体或动物体的方法。
术语“治疗(treatment)或治疗(treat)”是指预防或减缓目标疾病或病理状态的治疗和预防(preventive)或预防(prophylactic)措施。
需要治疗的受试者包括已经患有所述疾病的受试者和容易患所述疾病的受试者或必须要预防所述疾病的受试者。因此，待治疗的受试者可能已经被诊断为患有所述疾病或可以倾向或容易患所述疾病。
本发明还涉及治疗受试者的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的络合物。
本发明还涉及根据本发明的络合物在制备药物中的用途。
已知该家族的某些凝集素有效地渗透进入上皮癌细胞。实际上，与细胞表面结合后，凝集素通过网格蛋白依赖性通路内在化，并转移到这些细胞的晚期内涵体或溶酶体(Francis F.等,2003)。这些腔室的酸性和蛋白酶条件导致凝集素多聚体中包含的活性剂的释放。
本发明涉及根据本发明的络合物用于治疗癌症的方法中。
在一个实施方案中，所述癌症选自膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤和肺癌。
优选地，所述癌症选自结肠直肠癌、膀胱癌、胃肠道癌和卵巢癌。
本发明还涉及治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的络合物。
本发明涉及根据本发明的络合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明还涉及向受试者施用活性剂的方法，包括向所述受试者施用根据本发明的络合物的步骤。
所述施用尤其可以通过口服或通过注射进行。
附图说明
本发明的其他特征和优势将进一步通过阅读以下说明来体现。后者仅仅是为信息的目的，且必须与所附附图一起阅读，其中：
–图1示出了暴露于XCL表面且属于不同蛋白质亚基的两个-氨基基团之间的最小和最大距离。
–图2示出了FITC-XCL和RITC-XCL的发射光谱。A-连续曲线：FITC-XCL(λmax 520nm)和RITC-XCL(λmax 580nm)的发射光谱；非连续曲线：(B)中获得的发射光谱的反褶积。B-连续曲线：(A)中获得的FITC-XCL和RITC-XCL光谱的数字相加；非连续曲线：混合FITC-XCL和RITC-XCL所获得的发射光谱。
–图3示出了FITC-A38C和RITC-A38C的发射光谱。A-连续曲线：FITC-A38C(λmax 520nm)和RITC-A38C(λmax 580nm)的发射光谱；非连续曲线：(B)中获得的发射光谱反褶积。B-连续曲线：(A)中获得的FITC-A38C和RITC-A38C光谱的数字相加；非连续曲线：混合FITC-A38C和RITC-A38C所获得的发射光谱。
–图4示出了580nm/520nm强度比随着蛋白质XCL浓度的变化。
–图5示出了排阻色谱的洗脱体积随着XCL浓度的变化。
–图6示出了在580nm测量XCL的FRET的交换动力学。
–图7示出了XCL和还原以及非还原的变体A38C中荧光素的约束。
–图8示出了XCL的Trp在346和330nm随着温度的相对荧光强度。
–图9示出了DOSY实验。
具体实施方式
设备和方法：
制备蛋白质
使用Quickchange突变试剂盒(Stratagene)进行所有的突变。使用天然XCL蛋白的cDNA构建XCL的突变体A38C和T12C。如文献Trigueros等(2003)所述制备并纯化蛋白。在流速为3ml.mn-1下用50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH7.2平衡的尺寸排阻色谱(Sephacryl S300)中进行额外的纯化步骤。纯化的蛋白最终在Vivaspin 15R 30,000MWCO柱(Sartorius stedim)上浓缩至60μM。在50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH8.5和10mM氧化谷胱甘肽(GSSG)中培养8小时来氧化突变体A38C。在用50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl平衡、pH7.2平衡的PD-10sephadex G-25M柱(GE Healthcare)上去除过量的谷胱甘肽。
用FITC和RITC标记XCL和A38C蛋白
在由磷酸盐缓冲液(50mM、pH9)和FITC(1mM)或RITC(1mM)组成的缓冲培养基中于25℃下在搅拌下孵育XCL或A38C(30μM)1小时。加入Tris-HCl(10mM、pH9)停止反应。在事先用50mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)平衡的PD-10sephadex G-25M柱(GEHealthcare)上纯化标记的蛋白。标记的化学计量用分光光度计法在pH8.5测定。与蛋白相连的荧光基团的浓度用以下消光系数计算：FITC的ε494nm＝77,000cm-1M-1，RITC的ε560nm＝85,000cm-1M-1。标记后XCL和A38C的浓度用ε278nm＝120,000cm-1M-1计算，并考虑到在该波长下荧光探针的吸收。
FRET实验
平衡的FRET
荧光能量转换用于揭示XCL单体的交换。该交换反应通过在50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH8.5中于25℃下混合相同体积的XCL-RITC(1μM或仅有缓冲液作为参考)和XCL-FITC(1μM)来启动。孵育1小时后，用荧光光谱测定法(Photon TechnologyInternational QM-4)记录样品在490nm激发的发射光谱。对A38C-RITC和A38C-FITC进行同样的实验。
FRET动力学
用相同技术测量亚基的交换速度。该反应通过在50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH8.5中于25℃下混合相同体积的XCL-RITC(1μM)和XCL-FITC(1μM)来启动。在468nm进行激发，每0.5秒记录580nm处的荧光发射。荧光强度使用以下方程来归一化：
F norm ( t ) = F ( t ) - F 0 F ∞ - F 0
其中F(t)代表考虑时间的实验荧光，F0是初始荧光值，和F∞是达到平衡状态时的最终荧光值。动力学数据用GOSA软件(Czaplicki等(2006))建模。获得了双指数方程的最佳模型：
F = 1 - [ a × e - k 1 t + ( 1 - a ) × e - k 2 t ]
其中，a代表慢解离的分子比例，k1是慢解离的动力学常数，和k2是快解离的动力学常数。
尺寸排阻色谱法
在GE-Healthcare Superose 12PC 3.2/30柱上进行尺寸牌组色谱实验。在测试缓冲液(即50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH7.2或pH4.4，不存在或存在0.003％SDS)中预平衡该柱。流速是0.5mL/min。用BSA和RNase A作为尺寸标记。
约束
通过与待测试分子一起孵育野生型蛋白(XCL)或突变体(A38C)来进行约束实验。为了用突变体A38C进行对照实验，在存在GSSG的50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH7.2、OVN中进行氧化步骤。然后在用50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH8.5预平衡的PD-10sephadex G-25M柱(GE Healthcare)上去除GSSG。洗脱液在Vivaspin 15R 30,000MWCO(Sartorius stedim)上浓缩至1ml。添加NaOH至最终pH为8.5将一批A38C还原为TCEP(在氩气下)。用浓度为10mM的荧光素进行约束的概念证明。在50mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl中于25℃下进行孵育1小时。对于还原的突变体A38C，用GSSG、OVN进行额外的氧化步骤。在PD-10sephadexG-25M柱(GE Healthcare)上去除游离荧光素。然后在Vivaspin 15R30,000MWCO(Sartorius stedim)上浓缩样品。用分光光度法进行约束的测量。用吸收系数ε511nm＝75,000cm-1M-1测定荧光素的量。约束后的XCL和A38C的浓度用ε278nm＝120,000cm-1M-1计算。通过形成荧光素/蛋白浓度的比例来计算约束百分比。
结果
之前的研究表明XCL是以具有内腔的四聚体形式组织的。本发明人表明，可以在不存在该分子和XCL之间的共价键的情况下将分子约束在该腔室内。此外，本发明人设计了可以长时期保持四聚体形式的XCL变体。本发明人还表明约束的分子可以在与靶细胞中遇到的相似条件中释放。
设计和制备由二硫桥稳定的四聚体
为了提高XCL四聚体结构的稳定性，本发明人设计了其中单体共价结合的XCL变体。
本发明人测试了在于通过用半胱氨酸替代野生型XCL氨基酸残基在单体之间形成二硫桥的策略。为了使替代数最小化，本发明人不得不测定与其相反单体中的相对物临近的氨基酸。如XCL的3D结构揭示，两个氨基酸具有这种性质。苏氨酸12的β碳与其相对物之间的距离是3.9埃，丙氨酸38与其相对物之间的距离是3.4埃。这些距离是二硫桥中涉及的半胱氨酸的β碳的典型范围(Galat等(2008))。此外，这些残基的侧链在蛋白质的表面上，且完全能接近氧化剂。用WINCOTT软件分析能量的最小化表明，苏氨酸12和丙氨酸38的侧链方向及其结构环境与二硫桥的形成是相容的。
通过制备这些如此修饰的分子，本发明人想获得不能解离的四聚体组装。变体A38C的特殊性基于两个额外二硫桥的存在导致整个四聚体的稳定性这一事实。如果考虑XCL结构是正方形，其中每个单体是一个角，则二硫桥A38C会对角线结合单体。氧化的四聚体A38C的解离只有当所有界面都破裂时才是有可能的。可以考虑四聚体的强稳定性，使其解离高度不可能。
使用XCL质粒作为基质通过定向突变获得克隆A38C，并利用与制备XCL相同的方案制备并纯化该蛋白质(Trigueros等(2003))。每升培养物获得25mg纯化蛋白的产量。方案的最后部分在于在10mM氧化的谷胱甘肽的存在下氧化12小时的步骤。该步骤是在单体之间产生二硫桥所必需的。用SDS-PAGE验证这些共价键的形成。准备两次SDS-PAGE。在第一个凝胶样品中加入β-巯基乙醇，而在第二个凝胶中不加入β-巯基乙醇。当上样前5分钟将XCL加热到95℃时，在两个凝胶上都观察到一条带，其分子量略大于20kDa。这条带对应于单体形式的类型。相反，当上样前没有加热XCL时，观察到一条分子量大约为80kDa的带，这意味着XCL在2％SDS的严格条件下保持了四聚体的形式。
在还原条件下，A38C表现出与XCL完全相同的性能。在非还原条件下，当加热样品时，观察到3条带。最大强度的带像40kDa的蛋白质，即像二聚体类型一样迁移。这些类型对应于由二硫桥的建立共价结合的2个单体。在A38C的情况下，它代表90％的类型。另一条带代表5％的类型，且观察到其分子量为21kDa。这条带对应于来自非氧化类型的单体。第三条带也代表5％的类型，具有明显的对应于四聚体类型的60kDa分子量。所有这些结果表明通过基因工程的XCL合理修饰策略可以获得大约90％的氧化率。
利用XCL质粒为基质通过定向突变以制备A38C相同的方法制备变体T12C。通过采用相同的方案，每升培养物制备了10mg蛋白质。采用与A38C相同的SDS-PAGE方法寻求变体T12C的氧化率。将这些比率与变体A38C获得的比率相比。用不同还原谷胱甘肽浓度测试了几种氧化条件。实际上，添加还原谷胱甘肽通过允许还原二硫桥(通过其他相互作用不能充分稳定)而防止了形成不正确的键。在将样品在95℃加热5分钟后，在非还原条件下用SDS-PAGE测试每个样品的氧化率。与A38C一样，T12C中观察到3条带。因此，T12C获得的氧化率与A38C获得的氧化率相当。然而，当还原的谷胱甘肽以10mM的浓度加入氧化缓冲液时，A38C中观察到氧化率的强烈下降。该结果表明氧化的T12C的额外的二硫桥不如A38C的二硫桥稳定。
四聚体的可逆打开
如前所述，XCL在溶液中以四聚体的形式组织。本发明人确定了在四聚体形式和可能的少数二聚体或单体形式之间是否存在自发交换。
XCL的自发打开和闭合的说明
XCL的寡聚合平衡通过测量分别标记有FITC(FluoresceinIsoThioCyanate)或RITC(Rhodamine IsoThioCyanate)的两个XCL群体之间福斯特共振能量转移(FRET)的出现来表征。
当分析XCL的结构(图1)时，暴露于表面且属于不同蛋白质亚基的两个-氨基基团之间的最小和最大距离分别是21和67埃，因此它们均在与FRET的出现相容的距离范围内。
根据设备和方法中描述的程序分别用FITC或RITC标记两个XCL样品。标记化学计量是，每mol XCL 4mol FITC和每mol XCL0.9mol RITC。对A38C获得相同的化学计量。
图2A(连续曲线)示出了FITC-XCL和RITC-XCL的发射光谱。这些光谱的数字相加得到图2B中所示的连续曲线。在这同一个图中，也示出了通过由供体或受体(虚线曲线)混合标记的蛋白获得的光谱。将该光谱解卷积，得到如图2A虚线所示的光谱。
观察到对应于荧光发射的荧光强度的降低，且同时观察到罗丹明荧光发射强度的增加，揭示了在两个荧光团之间能量转移的存在。
只要转移的效力取决于供体/受体到能量6的距离，且只要XCL分子的尺寸是在福斯特距离的量级，这种能量转移只有在FITC-XCL和RITC-XCL单体重新分布并在实验结束时属于同一个四聚体时才可能发生。因此，进入腔室可能是自发的。
出于比较目的，用变体A38C进行相同实验。该变体通过两个额外的二硫桥共价结合。图3A(连续曲线)示出了FITC-XCL和RITC-XCL的发射光谱。这些光谱的数字相加得到图3B中所示的连续曲线。在混合供体和受体标记的蛋白并于室温下孵育该混合物1小时后，获得了完美重叠的光谱(图3B中的虚线)。当解卷积时，所述光谱得到虚线所表示的光谱(图3A)，表明没有观察到FRET。
该实验表明A38C氧化的单体没有重新分布，仍然是四聚体。
四聚体解离反应平衡常数的测定
FRET测量
在之前的段落中已经说明产生了XCL的解离且其是可逆的。因此，该平衡可以向解离移动，且能量转移的效力应该降低。本发明人利用该现象计算了XCL四聚体的解离常数(Kd)。
将FITC-XCL和RITC-XCL的混合物稀释至各种浓度并于室温下孵育1小时。在468nm激发光下记录荧光谱。为了实质上测定能量转移的降低并归一荧光强度，在考虑XCL浓度的情况下对每个浓度计算I580/I520比(图4)。能量转移强度的过渡在接近微摩尔的浓度出现。显然，只要在最大浓度的点上没有达到炮和，该滴定曲线是不完整的。由于XCL和标记方案的溶解度限制，该实验中蛋白质的浓度不能超过10μM。
尺寸排阻色谱法测量
为了证实FRET中获得的数据，用凝胶排阻色谱评估平衡的位移。用牛血清白蛋白(BSA)和核糖核酸酶A校准柱。分别得到12.6ml和15.5ml的洗脱体积。在高浓度下(这里是30μM)，XCL的洗脱体积是13.2ml，如对四聚体类型期望的一样接近BSA的洗脱体积。首先，在四聚体和二聚体(或单体)类型之间平衡的存在将意味着经由排阻色谱法的两个峰的洗脱。然而，通过数字模拟已经显示，根据结合速率、解离速率、流速和柱的分离特征，交换的两个分子群可导致经由尺寸排阻色谱的单峰(Yu等,(2006))。本发明人采用不同浓度的XCL进行几次上样，并观察到确实获得了单峰。然而，该峰随着浓度降低迁移到较长洗脱体积，表明分子量较小。当对于XCL浓度记录洗脱体积时(图5)，观察到接近微摩尔浓度的过渡，这与之前在FRET中所获得的结果一致。
微量热法实验
为了精确测量四聚体化的平衡常数并测定XCL四聚体化的热力学，本发明人采用了等温滴定量热法(Burrows等,(1994)Lovatt等,(1996)Barranco-Medina等(2009))。在该方法中，将XCL浓缩液在缓冲液中稀释，并测量二聚体(或单体)的解离热。每次上样释放的热量受四聚体到二聚体的焓交换和四聚体-二聚体平衡常数的控制。这些结果的建模可以提取平衡解离常数(Kd＝4.5μM)和每摩尔四聚体16.6千卡的焓变化。
该焓变化在该尺寸的寡聚蛋白中通常观察到的值范围内。然而，当与其他多聚体蛋白质所获得的平衡解离常数比较时，该平衡解离常数很低，这表明该蛋白组装的显著稳定性。
这些结果的总和表明，XCL不断经历二聚体形式和四聚体形式之间的交换，即使是在高蛋白浓度下。
为了验证四聚体的打开和闭合以与约束实验相容的速度发生，我们测定了该交换的动力学参数。
四聚体解离动力学常数的测定
通过混合ECL-FITC和XCL-RITC并测量580nm下的荧光发射强度作为时间的函数来研究四聚体的解离动力学(图6)。观察到该荧光强度一直增加直到在反应超过300秒后达到平衡，这表明亚基之间的交换很慢。
荧光强度的增加以及因此在荧光素和罗丹明之间的转移效力是两个连续现象的结果：首先四聚体解离成二聚体，其次它们的重新结合。考虑到曲线的形状(图6)，在动力学开始时没有观察到滞后时间，这意味着重新结合的速度远远快于解离的速度。因此在这种情况下可以考虑重新结合的速度是可忽略的。用GOSA软件建模所获得的动力学数据。描述观察到的现象的最适合的模型是具有不同速度的两个解离反应的双指数增长：
F＝1-[axe-k1t+(1-a)×e-k2t]
其中：
a：慢反应中涉及的分子比例，
k1：最慢解离反应的动力学常数，
k2：最快解离反应的动力学常数。
所得常数优化后的值是：
a＝0.39；k1＝0.72min-1；k2＝2.52min-1.
这种通过双指数的增长表明XCL可以遵循两条解离途径。由XCL形成的四聚体ABCD可以以两种不同的方式解离：解离成二聚体AB和CD或解离成二聚体AD和BC。
将试剂约束在腔室中
本发明人用荧光素来验证XCL四聚体的约束能力。
荧光素的优点是小且在水性溶剂中高度溶解(因此其可能在约束期间以高浓度放置)。此外，它在511nm处吸收可见光，这使得可以检测到它。本发明人更愿意采用该分子的吸光度而不是它的荧光。实际上，分子的荧光取决于它的化学环境，因此，一旦被约束，该荧光素的荧光输出可能明显改变。
对XCL和变体A38C进行约束。
在XCL的情况下，本发明人将蛋白(15μM)与荧光素(10mM)一起孵育，然后通过两次连续的凝胶过滤柱分离蛋白与未约束的荧光素分子。在此之前，本发明人已经验证如果这两个柱的荧光溶液在10mM进行，则检测不到残留的游离荧光素。因此在约束期间检测到的荧光素必然与蛋白相连或被后者包含。
蛋白A38C也被用于进行约束，其中方案是相同的，除了初始氧化的蛋白在放入荧光素存在的溶液之前被还原，然后在氧化剂(氧化的谷胱甘肽)的存在下第二次氧化过夜这一事实。该蛋白记录为图7中的A38R。
还用在放入荧光素存在的溶液之前没有被还原，然后在第二步骤中在氧化剂(氧化的谷胱甘肽)的存在下氧化过夜的蛋白A38C进行约束实验。该蛋白记录为图7中的A38NR。
约束步骤和去除游离的荧光素后，用511nm和280nm的UV吸光度测定荧光素和蛋白的各自浓度。对于XCL和A38C，进行了11次独立实验。对于XCL和A38R分别获得9％和14％约束的约束率(图7)。
然后将样品于室温下孵育4天，再次去除游离的荧光素，然后计量约束的荧光素。XCL和A38C的约束率保持不变。
荧光素在XCL上的固定可以与两种类型的相互作用相关。荧光素可以以非特异性的方式结合到蛋白表面或腔室中。维持约束4天表明荧光素不是以不稳定的方式结合，否则它会在这段时间之后解离。
这些约束率表明，一方面试剂可以被约束在腔室中，另一方面该腔室对于该测试分子具有非共价结合亲和力。实际上，对于通过被动扩散的约束，期待的理论约束效力是大约0.3％。采用约束后的氧化形式的A38C，使得可以将约束率乘以2。因此，本发明人提出的四聚体工程策略可以显著提高约束率。
在对应溶酶体酸性pH的酸性pH下络合物的解离
为了在细胞中利用XCL运输并递送试剂，需要对解离条件深入了解。
在恒温生物中于治疗中利用约束络合物的条件意味着这些载体可以在靶标生物的温度条件下维持它们的结构。由于XCL来自变温生物(或异温)，即不是以内源的方式进行热调节，因此分析了根据温度的四聚体的性能，尤其是超过45℃时它的性能。
热解离
色氨酸的荧光
通过测量色氨酸的固有荧光跟踪XCL的热解离。每个XCL单体包含3个色氨酸残基：一个在疏水腔中(Trp77)，两个位于两个单体(Trp27和Trp35)之间的相同界面上。本发明人利用它们在四聚体结构中的位置使用这后两个Trp作为XCL四级结构的探针。为了增加测量的灵敏度，根据温度测量荧光强度的比例346nm/330nm(图8)。在50℃之前没有观察到该比例的变化，表明Trp的环境在达到该温度前没有改变且该凝集素仍然是四聚体形式。加热之后样品的肉眼分析表明，高于45℃在色氨酸暴露之前，XCL以四聚体形式沉淀出来。
RMN-DOSY
还用DOSY(扩散序谱)跟踪热解离。根据温度测量XCL和二氧六环的流体动力学半径的比例(图9)。
如果四聚体通过升高温度解离，期待该比例的降低以及XCL的流体动力学半径的降低。相反，结果表明当温度升高时，该比例线性增加。这个与直觉相反的结果反应了可能与非结构环的运动增加相关的XCL流体动力学半径的增加。在任何情况下，没有观察到流体动力学半径的迁移。在50℃之后，蛋白样品如已经在色氨酸的荧光实验中所描述的一样沉淀出来。
这两个实验表明，该凝集素在高于45℃是稳定的，因此它满足对于体内应用完全足够的热稳定标准。
化学解离
本发明人研究了在接近溶酶体中遇到的变性化学条件下XCL的性能。经由具有酸性pH(pH4.4)的排阻色谱进行分析。XCL在这些变性条件下的洗脱峰似乎迁移到较大的洗脱体积，表明较小尺寸的出现。当加入0.003％SDS，洗脱峰迁移到具有接近XCL单体的分子量的RNAseA的洗脱体积。因此，pH的降低导致四聚体解离成二聚体，且只用非常少量的洗涤剂，这些二聚体就解离成单体。
还分析了氧化的突变体A38C的性能。在中性pH下，A38Cox具有与XCL相当的洗脱体积。当pH降低到4.4，没有观察到洗脱体积的变化。因此，二硫桥的添加提高了蛋白组装的稳定性。加入0.003％SDS导致四聚体解离成由通过二硫桥结合在一起的单体构成的二聚体。
溶酶体构成了亚细胞降解细胞器。它们的内容物是酸性的，还原性的，且包含酸性水解酶、降解包含在其中的蛋白质的蛋白酶。所得结果表明在这些还原性和酸性条件下，XCL或其突变体A38Cox解离成二聚体，允许在溶酶体中释放约束在腔室中的活性剂。
本发明在发明详述和附图中描述并说明。本发明不限于所示的实施方案。本领域技术人员在阅读本说明书和所附附图时可以推测和实施其他替代方案和实施方案。
参考文献
在本申请中，各种文献描述了本发明的现有技术。这些文献的描述在此通过引用并入本说明书。
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Claims (10)

1.真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素的变体用于将作为治疗剂或诊断剂的活性剂递送到生物靶标的用途。
2.络合物，包含：
-作为治疗剂或诊断剂的活性剂，和
-真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素的变体。
3.根据权利要求2所述的络合物，其特征在于，所述活性剂是治疗剂。
4.根据权利要求2所述的络合物，其特征在于，所述活性剂是诊断剂。
5.根据权利要求2-4任一项所述的络合物，其特征在于，所述凝集素选自ABL、AOL、GZL、XCL、PCL、BEL和PIL，或所述变体是选自ABL、AOL、GZL、XCL、PCL、BEL和PIL的真菌子实体凝集素的变体。
6.制备根据权利要求2-5任一项所述的络合物的方法，其特征在于，它包括将真菌子实体凝集素或真菌子实体凝集素的变体与作为治疗剂或诊断剂的活性剂接触的步骤。
7.XCL变体，具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的氨基酸序列。
8.药物组合物，包含根据权利要求2-5任一项所述的络合物和药学上可接受的赋形剂。
9.用于治疗人体或动物体的方法的根据权利要求2-5任一项所述的络合物。
10.用于治疗癌症的方法的根据权利要求2-5任一项所述的络合物。
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