CN104491855B

CN104491855B - 一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品

Info

Publication number: CN104491855B
Application number: CN201410643314.3A
Authority: CN
Inventors: 吕宏亮; 张澍
Original assignee: INNER MONGOLIA BIWEI ANTAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: INNER MONGOLIA BIWEI ANTAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-11-07
Also published as: CN104491855A

Abstract

本发明公开了一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品。所述方法包括：a)收获病毒液；b)深层膜过滤、超滤、核酸酶解；c)强阴离子交换吸附床或吸附膜纯化；d)PEG沉淀、氯仿异戊醇抽提；e)灭活；f)蔗糖密度梯度离心纯化；g)超滤透析，除菌过滤；h)原液储备或乳化配制。本发明提供的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗抗原为均一完整的口蹄疫病毒颗粒，注入机体能够完全区别动物感染和免疫，不含口蹄疫病毒非结构蛋白和其他病毒颗粒，不含动物源性的外源蛋白、多肽、寡肽，有效降低了疫苗注射引起动物潜在过敏反应、致癌以及引起动物传染病如疯牛病的潜在风险，对动物食品安全和贸易没有影响。

Description

一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的制备方法及其产品，特别涉及一种大规模制备高产率、高纯度、高安全口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品，本发明属于医药生物技术领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染病，主要危害牛、羊、猪、骆驼等，发病率极高，传播速度极快，世界动物卫生组织将其列为A类人兽共患病首位。虽然该病的死亡率不高(幼畜除外)，但可造成动物生产性能下降，且扑杀动物需花费大量的人力、物力和财力，还会影响国际贸易，造成严重的经济损失和生物恐怖。

口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属。目前已知有7个血清型，A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、ASIA1，每个血清型又有很多亚型，不同毒株间的遗传变异可导致抗原性差异。我国流行3个血清型且致病力最强、分布最广泛，分别为A型、O型以及ASIA1型。

纯化口蹄疫疫苗配方中口蹄疫非结构蛋白L、B2、C3、D3、A3、AB123、3ABC含量甚微，含高度纯化灭活完整口蹄疫病毒146S颗粒，不引起动物产生抗非结构蛋白的抗体，自然感染动物产生非结构蛋白抗体，因此检测动物体内的3AB1或3ABC非结构蛋白的抗体存在与否，可区别动物口蹄疫病毒免疫和感染，发挥口蹄疫防控的免疫和检测作用。

疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，制备安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但在疫苗制备过程中和产品中的一些宿主细胞残余蛋白、核酸、牛血清白蛋白、化学试剂等如果不加以控制，免疫动物则引起动物严重副反应甚至死亡、特别是可能使动物致癌或影响肉类动物的食品安全。

用合适的宿主细胞培养病毒制备疫苗抗原或重组药物，从用药安全性考虑，必须纯化抗原去除影响口蹄疫病毒疫苗安全性的杂质，以使其符合药品质量规范和安全要求，同时尽量减少工艺或原辅材料中可能潜在的影响疫苗效果和安全的物质，特别是尽量避免使用动物源性的原辅材料，降低传播动物疫病如口蹄疫、蓝耳病、疯牛病、猪瘟等传染病风险。

用生物反应器生产口蹄疫病毒抗原提高了细胞密度、病毒抗原产量，同时增加了细胞杂质和添加物的量，也增加分离、浓缩纯化口蹄疫病毒的步骤或工艺。过去因为口蹄疫抗原库建立和生物大分子分离技术发展程度不高，纯化口蹄疫病毒多为硫酸铵等浓缩、纯化技术。现代规模化浓缩、纯化病毒抗原技术，如柱层析、蔗糖梯度超速离心技术、切向流中空纤维柱、深层过滤模块几乎没有在兽用疫苗生产中使用，这些技术和设备的应用易于疫苗质量控制和保证、GMP认证和工艺验证。

现行生产灭活口蹄疫病毒抗原多采用BHK-21细胞为疫苗抗原生产基质，采用悬浮培养\后继灭活、浓缩工艺达到部分纯化、乳化制成疫苗供使用。尽管该疫苗的免疫效果达到疫苗规程要求，但按现代疫苗的安全性要求，杂质含量高、总蛋白含量高，有效抗原146S颗粒含量低，对有效抗原量、BHK-21细胞残余DNA、BHK-21细残余蛋白、牛血清白蛋白、灭活剂、防腐剂以及生产过程化学添加物没有明确界定和定量，尽管2013年实行了新的疫苗质量标准，但疫苗的质量标准和工艺应不断提高，以保证疫苗稳定、安全、有效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大规模制备高产率、高纯度、高安全口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品。

本发明的一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

a)100000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到3-5×10⁶/毫升时按照病毒感染复数MOI0.01-0.1接种口蹄疫病毒细胞适应株，制备病毒原液，搅拌速度不超过40rpm，培养4天收获病毒液，使用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片，同时收获上清液和沉淀；沉淀在Triton-X-100存在的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细胞膜碎片，所述Triton-X-100的终浓度为0.1-0.2％，反复冻融3次后超声3次，用制备型低速连续流离心机离心收集上清液，合并上清液；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为≥10⁷logTCID₅₀/mL，总蛋白量为5-7克，口蹄疫病毒146S含量为70-85μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤25ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤100ng/ml，BHK-21细胞残余蛋白量≤100ng/ml，BHK-21细胞残余DNA量≤5000pg/ml，Triton-X-100残余量≤6000μg/ml，内毒素≤150EU/毫升；

b)膜深层过滤、超滤、核酸酶解：

步骤a)得到的病毒上清液，依次经过0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜深层过滤和截留值为100，000-300，000MWCO的膜包或中空纤维柱10倍超滤；高度特异、高活性的核酸酶按20-50×10³单位/升加入到过滤后的上清液中，2-8℃作用9-18小时；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL，总蛋白量为6-6.5克，口蹄疫病毒146S含量为50-60μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤7ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤30ng/ml，BHK-21细胞残余蛋白量≤90ng/ml，BHK-21细胞残余DNA量≤4500pg/ml，Triton-X-100残余量≤510μg/ml，内毒素≤500EU/毫升；

c)强阴离子交换吸附床或吸附膜纯化：

经步骤b)酶解后的病毒上清液，经0.22μm膜过滤，然后通过强阴离子交换吸附膜或吸附床，进行分步洗脱；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL，总蛋白量为2-3克，口蹄疫病毒146S含量为30-40μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤5ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤75ng/ml，BHK-21细胞残余蛋白量≤50ng/ml，BHK-21细胞残余DNA量≤2500pg/ml，Triton-X-100残余量≤850μg/ml；

d)PEG沉淀、氯仿异戊醇抽提；

经步骤c)处理后的病毒上清液用PEG沉淀，缓冲液重悬沉淀，病毒重悬液经含抽提液抽提，所述抽提液是通过将三氯甲烷和异戊醇按24∶1体积比混合后得到的；

该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL，总蛋白量为3-4.2克，口蹄疫病毒146S含量为50-60μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤15ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤90ng/ml，BHK-21细胞残余蛋白量≤60ng/ml，BHK-21细胞残余DNA量≤3500pg/ml，Triton-X-100残余量≤400μg/ml，PEG残余量≤250μg/ml，三氯甲烷残余量≤350μg/ml，内毒素≤55EU/毫升；

e)灭活；

0.025％二乙烯亚胺，4℃灭活48小时或37℃灭活2小时；

f)蔗糖密度梯度离心纯化；

步骤e)的灭活液通过连续流60％蔗糖等密度梯度超速离心纯化，该步骤质量控制指标为：总蛋白量2-2.5克，口蹄疫病毒146S含量为20-30μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤4ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤50ng/ml，BHK-21细胞残余蛋白量≤60ng/ml，BHK-21细胞残余DNA量≤2000pg/ml，Triton-X-100残余量≤250μg/ml，PEG残余量≤200μg/ml，三氯甲烷残余量≤400μg/ml，内毒素≤800EU/毫升；

g)超滤透析、除菌过滤

经步骤f)纯化后的病毒液经超滤透析并浓缩25-50倍，病毒液经0.22μm膜除菌过滤，该步骤质量控制指标为：总蛋白量2-2.5克，口蹄疫病毒146S含量为20-30μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤3ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤50ng/ml，BHK-21细胞残余蛋白量≤30ng/ml，BHK-21细胞残余DNA量≤100pg/ml，三氯甲烷残留量≤20μg/ml、PEG残余量≤10μg/ml、TritonX-100残余量≤15μg/ml，内毒素≤35EU/毫升；

h)原液储备或乳化配制。

蔗糖梯度超速离心一直以来是病毒颗粒或抗原纯化的标准方法，广泛用于狂犬病、甲肝、乙脑、流感疫苗的工艺中，由于规模化制备层析，以及膜浓缩过滤技术的发展，工业化层析技术、超速离心技术、膜超滤浓缩技术在一些传统的灭活疫苗中使用，这样一方面利于规模化工艺的建立、优化和验证，另一方面促成了产品质量和数量的提高，尽管这样由于口蹄疫病毒以及疫苗的特殊性，上述生产病毒抗原方法、工艺难以分离纯化吸附在宿主细胞膜系统上的病毒、提高细胞培养病毒的产量，获得高纯度的口蹄疫病毒抗原，清除疫苗原液中细胞碎片、细胞蛋白和核酸。

采用传统聚乙烯甘油(PEG)沉淀浓缩和纯化，疫苗原液中的杂质只能除去一部分。

本发明提供的方法在整个过程中合理使用去污剂TritonX-100，浓度0.1-0.2％，使口蹄疫病毒不产生凝集或多聚体或吸附在其他蛋白和杂质上，提高了完整病毒收率。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤c)中所述的分步洗脱中洗液为含有90mM氯化钠的pH6.5-7.0的4.7mM磷酸钠缓冲液，用pH7.5含0.35M氯化钠的120mM的磷酸钠和1mMEDTA的缓冲液分步洗脱，每1000毫升介质处理40-50ml的病毒液。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤d)中所述的PEG为PEG-8000或PEG-6000，经核酸酶消化、层析纯化洗脱的病毒液用PEG沉淀，使PEG在病毒液里的浓度2.7-10％(W/V)，氯化钠浓度为0.35-1M，2-8℃剧烈搅拌1小时，制备型离心机以1000g离心10分钟，倒去上清，用含120mM氯化钠、6.2mM磷酸钠、1mMEDTA(pH7.5)缓冲液重悬沉淀，体积为病毒培养液的10-20％。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤f)中灭活液通过连续流60％蔗糖等密度梯度超速离心纯化，所用离心机为生产制备型系列，大容量转头容积为3.2-8升，批处理抽提液2000升；口蹄疫病毒灭活液采用密度梯度超速离心，超速离心方式为连续流，梯度为不连续梯度，包括(1)离心力36000-60000g形成的梯度；(2)离心力90000-120000g形成的梯度；(3)口蹄疫病毒灭活液的流速10L/小时；所用平衡缓冲液为0.04MPBS(pH7.2-7.6)，60％蔗糖溶液采用pH7.6的含有100mMNaCl，0.1％Triton-X-100的0.04M磷酸缓冲液配制，转子注入1.6升配好的60％蔗糖溶液；以20升/小时上样，处理口蹄疫病毒PEG沉淀重悬液2000升，转速32000rpm。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤i)中所述的乳化采用的佐剂为V201。

BHK-21细胞无论全悬浮培养、微载体培养、贴壁培养口蹄疫病毒，培养基中有动物源性的蛋白或酶，宿主细胞残余成分有DNA、核酸、蛋白质，培养、纯化过程中的去污剂、聚乙醇、氯仿、灭活剂的残余、抗生素残余，通过纯化达到降低动物群体过敏副反应以及动物长期、大量注射潜在的致癌风险。口蹄疫病毒抗原包括但不限于口蹄疫病毒A型、O型、亚1型、C型、SAT1-3型以及亚型、拓扑型。

疫苗中146S抗原精确定量为20-25微克/毫升，进行快速配制苗，克服过去根据体内效力试验，按体积进行经验型培苗的不科学做法，另一方面抗原精确定量结合长期积累的本动物数据可取代本动物的攻击试验。最主要是达到体内免疫效果和降低过敏反应。

本发明所提供制备方法容易控制和验证，分离、浓缩、纯化口蹄疫病毒的方法包括化学试剂、切向流或中空纤维柱、离心、层析等方法，根据疫苗工艺质控和疫苗质量要求，对每一工艺步骤优化和组合，并验证，形成工艺。目前已知规模化浓缩、部分纯化制备口蹄疫抗原的方法是采用PEG沉淀或氯仿，其特点是处理量小、操作难以工业化和自动化，多为人工操作，不能控制污染和质量控制。另外口蹄疫病毒的膜吸附性质决定了前期工艺采用PEG沉淀或氯仿去除部分杂蛋白、核酸、脂类，建立初纯抗原库，以此抗原进行灭活、乳化配制口蹄疫疫苗。疏水反应、凝胶分子筛2-3步层析，或者2步超速离心技术，且多为小量分析时使用，并未在口蹄疫疫苗抗原生产中规模化使用，这些方法步骤多，病毒抗原收率低，不宜规模化生产和质量控制，也不符合药品GMP生产认证和工艺过程验证要求。

本发明提供了生产工艺过程质控指标和方法，特别是BHK-21细胞残余蛋白、残余DNA含量检测以及添加物残留检测则是按质量控制方法验证首次在兽用疫苗使用，是质控方法和质量保证方面创新。

本发明提供的口蹄疫病毒抗原去除了生产过程使用去污剂、外源的酶、牛血清蛋白、宿主细胞残余蛋白、宿主细胞残余DNA，残余化学添加物，易于口蹄疫病毒疫苗质量控制和工艺的规模化放量生产，加强了疫苗工艺的质量控制。用该方法生产的疫苗抗原纯度高、临床使用副反应率低。

本发明的目的之二是提供根据以上任一项所述的方法制备得到的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗。

在本发明中，优选的，每毫升疫苗中中蛋白总量100微克/毫升，口蹄疫病毒146S含量20-25微克/毫升，内毒素含量≤50EU/毫升，BHK-21细胞蛋白残留量≤30纳克/毫升、BHK-21细胞DNA残留量≤100皮克/毫升、牛血清白蛋白残留量≤50纳克/毫升、三氯甲烷残留量≤20微克/毫升、PEG残余量≤10微克/毫升、二乙烯亚胺残余≤5微克/毫升、TritonX-100残余≤15微克/毫升、抗生素残余≤50纳克/毫升，非结构蛋白3ABC残余≤5纳克/毫升。

本发明提供的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗中口蹄疫病毒为均一完整病毒颗粒(146S)，效力高，且纯度高，不含病毒培养中口蹄疫的非结构蛋白和不成熟的病毒颗粒、不含动物源性的外源蛋白、多肽、寡肽。有效降低了疫苗注射引起动物潜在过敏反应、致癌的风险，降低了引起动物传染病如疯牛病、口蹄疫的潜在风险，完全区别动物感染和免疫，对动物食品安全和贸易没有影响。

本发明提供的口蹄疫标记疫苗中口蹄疫非结构蛋白L、B2、C3、D3、A3、AB123、3ABC含量甚微，含高度纯化灭活完整口蹄疫病毒146S颗粒，注入动物机体产生口蹄疫结构蛋白抗体或中和抗体，使动物产生较强的体液免疫，检测动物体内的3AB123或3ABC非结构蛋白的抗体，可区别动物口蹄疫病毒免疫和感染，成为一种高度安全、高效价、高产率的标记疫苗，发挥防控中的有效免疫和监测作用。

本发明提供的标记疫苗优选为水包油包水的佐剂乳化而成，能增强偶蹄类动物对口蹄疫病毒的全面免疫，即增强中和抗体生成、增强细胞免疫。

本发明提供了一种大规模制备高产率、高纯度、高安全口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品涉及病毒学、免疫学、疫苗学和过程工艺学，特别涉及标记疫苗、组分以及制法包括规模化口蹄疫病毒的纯化工艺、质量控制方法和指标。制法包括生物反应器全悬浮无血清培养BHK-21细胞和口蹄疫病毒疫苗生产种子批病毒，经过反复冻融、裂解或超声、核酸酶解、深层过滤、强阴离子交吸附床床或膜、灭活、PEG沉淀、氯仿抽取、蔗糖密度梯度离心纯化、超滤透析、除菌过滤、稀释乳化配制，可用于商用BHK-21适应或减毒株口蹄疫苗的纯化，也包括在其他敏感细胞系增殖的各型或亚型口蹄疫病毒。BHK-21细胞系主要作为口蹄疫疫苗生产基质的各型或亚型的口蹄疫病毒标记抗原制备。

本发明提供了从BHK-21宿主细胞杂质分离、纯化口蹄疫病毒颗粒的方法，步骤包括1)100000L生物反应器培养感染细胞；2)用核酸酶和裂解剂处理细胞培养上清液；溶解口蹄疫病毒感染细胞，包括采用裂解剂；3)采用深层膜过滤、超滤组合、强阴离子交换床或膜去除大量的小分子蛋白杂质和核酸杂质；控制可规模化操作体积；4)采用PEG和三氯甲烷组合除去病毒原液的脂类、分离吸附在细胞膜上或聚合的口蹄疫病毒；5)进一步纯化采用连续流蔗糖密度梯度离心；发明提供了纯化完整口蹄疫病毒方法，该发明提供了完整、稳定、高度纯化、具有良好抗原性、免疫原性的口蹄疫病毒抗原。现行发明也提供了无菌、GMP条件下纯化有高活性、稳定、高纯度的口蹄疫病毒工业化生产方法。

用传代细胞生产疫苗，其组分应无对人和健康动物有害的蛋白和核酸，应不产生不良副反应，应对生产过程中潜在的外源因子细菌、真菌、支原体、病毒、寄生虫、疯牛病原加以控制。目前国内外灭活纯化标记口蹄疫疫苗尚无质量标准或规程。

在本发明中，通过纯化，疫苗中的宿主细胞BHK-21蛋白≤30纳克/毫升，BHK-21细胞DNA残留量≤100皮克/毫升，对动物更加安全。考虑到生产过程中外源因子污染的风险和一些化学物质添加物残余可能的安全风险，发明提供了大量的安全检验方法。也提供了疫苗生产过程的关键指控点。

BHK-21细胞是口蹄疫疫苗生产的基质，对传代细胞生产疫苗，世界动物卫生组织OIE和国内兽药质控部门没有严格规程，发明参照世界卫生组织WHO、美国药品食品监督管理署、中国的药典要求，对口蹄疫疫苗的纯化工艺进一步改进，加强了工艺以及质控方法验证，从疫苗指标上达到国际标准并建立了企业标准。蛋白总量100微克/毫升，口蹄疫病毒146S含量20-25微克/毫升，内毒素含量≤50EU/毫升，BHK-21细胞蛋白残留量≤30纳克/毫升、BHK-21细胞DNA残留量≤100皮克/毫升、牛血清白蛋白残留量≤50纳克/毫升、三氯甲烷残留量≤20微克/毫升、PEG残余量≤10微克/毫升、二乙烯亚胺残余≤5微克/毫升、TritonX-100残余≤15微克/毫升、抗生素残余≤50纳克/毫升，非结构蛋白3ABC残余≤5纳克/毫升。

本发明中，提供了规模化连续操作的口蹄疫标记疫苗制备方法，改进的密度区带离心、切向流过滤、超滤、离子交换吸附床。

目前国内口蹄疫病毒纯化主要采用凝胶层析，规模化生产用离心和超滤方法，凝胶层析上样量小，多在实验室使用，不能满足传代细胞疫苗的质量和安全要求，国内外上市使用的疫苗宿主细胞残余DNA不大于10纳克/剂或不大于100皮克/剂，根据口蹄疫标记疫苗原理，疫苗中口蹄疫结构蛋白要求为完整病毒，几乎没有缺陷病毒、非结构蛋白，为满足此标准，需要新工艺和新方法。本发明中提供了宿主细胞BHK-21去除的方法和质控，采用蔗糖等密度区带心、PEG沉淀、氯仿抽提、离子交换吸附膜。层析法分子筛凝胶层析多用于重组蛋白、病毒疫苗。离子交换吸附膜或柱床大量去除DNA，。

Benzonase核酸酶处理大量减少病毒原液中的大分子DNA，进一步降低疫苗的致癌风险。发明中的方法克服了目前已知口蹄疫疫苗生产工艺的瓶颈，可生产高活性、高纯度的口蹄疫病毒抗原，在产量、工艺流程时间、纯度、优于已知口蹄疫病毒纯化疫苗方法，如透析、蔗糖垫离心、分子筛层析以及非特异性离子交换层析。

提供了纯化完整全病毒颗粒稳定、高产率、高纯度的制备方法。提供了投入/产出效果明显的工艺和方法。

溶解宿主细胞

由于口蹄疫病毒在BHK-21细胞中增殖，形成细胞病变裂解了细胞，部分病毒释放，部分病毒在细胞内或细胞碎片上，本发明采用连续低速离心机收集病毒上清，对沉淀进行超声、冻融裂解后再进行低速离心，合并2部分上清。有许多方法如冻融、高渗、超声、裂解剂裂解可溶解细胞、释放口蹄疫病毒，但从规模化生产的方便和是用考虑，采取冻融、超声、裂解剂溶解细胞，提高口蹄疫病毒产量。

裂解剂

按照本发明，几乎除培养工艺中没有使用裂解剂，纯化和分离的步骤使用裂解剂，选取药学、兽医学认为安全的表面活性剂TritonX-100，浓度为0.1-0.2％。

核酸酶

许多核酸酶在实验室使用，如Benzonase、Pulmozyme或其他DNA酶、核酸酶，但考虑兽医学、药学的可认为安全，本发明选用Benzonase，可通过磷酸酯键断裂水解核酸。使用浓度1-100units/ml，发明提供了口蹄疫培养液在裂解和纯化过程中，通过加入核酸酶和非离子表面活性剂增强口蹄疫杂质的去除方法；优选的，核酸酶为Benzonase；

深层过滤

本发明的工艺中，裂解液和病毒培养液需要过滤澄清，除去细胞碎片和一部分杂质，许多工业化的滤膜和滤器可供选择，包括深层过滤或终端过滤，本发明提供口蹄疫深层过滤或膜过滤的组合，在实例中对其优点进行了比较，选用0.8μm、0.45μm、0.22μm膜。

超滤和透析

本发明的实例中，口蹄疫病毒培养液、原液、纯化液至少需要透析，去除小分子杂质和化学物质残留，也需要控制可行的操作体积，发明中提供了透析和超滤浓缩的步骤，使口蹄疫病毒达到部分纯化和浓缩，发明中的超滤优先采用切向流的中空纤维超滤柱，超滤膜的孔径的截留值为100,000-300,000MWCO，在实例中体现比传统膜包具有对口蹄疫病毒剪切小、病毒破损少的优点。

用超滤透析和缓冲液交换除去生产过程中溶液中的糖、盐、非液体溶剂、低分子物质，改变稳定口蹄疫病毒的粒子和pH环境，本发明在收获裂解后的工艺步骤中在纯化步骤转接之前、疫苗配制之前都用超滤，调整缓冲液、调整体积。浓缩病毒液适合后续纯化的载量要求。

高度纯化

按照发明标记疫苗，单一的层析和连续流超速离心已经不能满足口蹄疫标记疫苗的质量要求和标准，如多数专利公开的分子筛层析、小量获得口蹄疫病毒146S的方法。对口蹄疫病毒液中去除DNA效果，强阴离子离子交换适合大量病毒原液的处理。

本发明的实例中在口蹄疫病毒纯化采用了一种强阴离子交换吸附床或膜，通过阴离子交换后除去了大量的核酸，并浓缩了病毒原液。发明实例中用QSepharoseXL离子交换吸附床或层析，达到了纯化口蹄疫病毒的目的。由于分子筛层析载量极限为柱体积的20％，且分离效果依赖蛋白浓度，限制了分子筛层析在口蹄疫疫苗工业化生产的使用。本发明选择的阴离子交换层析(i)流速快(ii)结合能力强(iii)收率高，(iv)不需安装和清洁验证(v)做成滤芯，没有使用寿命和贮存安全的担忧；在实例中阴离子交换滤芯纯化口蹄疫病毒优于离子交换柱，一些口蹄疫结构蛋白和完整口蹄疫结构蛋白分离，达到标记疫苗质量部分要求。这种效果也是本发明的创新之处。因此本发明提供了口蹄疫结构、非结构蛋白和口蹄疫完整病毒颗粒146S分离、纯化的方法，也是对口蹄疫病毒纯化相关专利公开方法的改进。

本发明中有许多步骤需要换缓冲液，一是直接加入配制的溶液如核酸酶、TritonX-100、PEG-80000、三氯甲烷，发明中对其使用进行了组合和优化，保证了口蹄疫病毒不凝聚、不变性，对脂类、核酸其他杂质有较强的分离作用。发明的另一方面，在精纯的步骤之前和之后多用疏水滤器DuraporePVDF滤器(MillipacfromMillipore)或Sartopore2滤器，孔径在0.8微米、0.45微米或0.22微米，去除部分杂质并换液。

使用高盐溶液去除DNA结合蛋白是本发明的一方面，也适合其他病毒类纯化疫苗，因此离子交换层析之前使用不同孔径的滤器或中空纤维柱超滤或过滤，用至少1MNaCl洗脱离子交换床的DNA结合蛋白。不同浓度的盐对口蹄疫的纯化效果在实例中体现。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1.提供标记疫苗抗原中总蛋白含量、有效完整标记抗原含量、BHK-21细胞残余DNA，残余牛血清白蛋白，残余BHK-21细胞蛋白含量，残余BHK-21细胞DNA含量、残余二乙烯亚胺、残余聚乙醇6000含量、残余三氯甲烷含量，，使小分子物质或化学物质如PEG\氯仿等降至最低，保证了疫苗的高效、标记、安全、稳定和动物的安全性、因而保证动物性食品安全和人类的安全。

2.不含外源性的蛋白、多肽、寡肽，如果添加使用则都被大量除去，降低了动物疫病的传播风险。

3.发明提供的方法包括现代浓缩、超滤、纯化技术组合，工艺流程合理，口蹄疫完整病毒收率高且纯度高，易于大规模化生产和质量控制；发明提供的质控方法都是成熟经过建立和多次验证的质量检验方法，准确、灵敏、简便、快速。

附图说明

图1为本发明的一种大规模制备高产率、高纯度、高安全口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法流程图；

图2为本发明的一种大规模制备高产率、高纯度、高安全口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法质控方法和质控点。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1高产量、高纯度口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的制备

包括以下步骤：

a)100000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到3-5×10⁶/毫升时，按照病毒感染复数MOI0.01-0.1接种口蹄疫病毒细胞适应株(猪口蹄疫病毒/Mya98-XJ-2010株，内蒙古必威安泰生物科技有限公司制备)，制备病毒原液，搅拌速度不超过40rpm，培养4天收获病毒液，使用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片，同时收获上清和沉淀，沉淀在0.2％Triton-X-100存在的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细胞膜碎片，反复冻融3次后、超声3次(最大输出功率3×30s)；用制备型低速连续流离心机离心收集上清液，合并上清液，其中口蹄疫病毒滴度为≥10^7.0logTCID₅₀/mL；

b)核酸酶解；

经步骤a)的病毒液，依次经过0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤和截留值100，000-300，000MWCO的膜包或中空纤维柱10倍超滤；

高度特异、高活性的核酸酶Benzonase按20-50×103单位/升加入到病毒裂解液中，2-8℃作用9-18小时；其中口蹄疫病毒滴度为10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL；

c)深层过滤和超滤、强阴离子交换；

经步骤b)的病毒液，经0.22μm膜过滤，通过QSepharoseXL离子交换吸附床或吸附膜，1000毫升介质处理40-50ml的病毒液，洗液为含有90mM氯化钠的4.7mM磷酸钠缓冲液(pH6.5-7.0)，用含0.35M氯化钠的120mM的磷酸钠和1mMEDTA的缓冲液(pH7.5)分步洗脱；其中口蹄疫病毒滴度为10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL；

病毒裂解液经过滤和超滤除去了小分子量的物质，再经核酸酶消化大分子的病毒RNA以及细胞RNA，在多数情况下，阴离子交换树脂除去病毒液中的宿主细胞DNA或核酸，一些阴离子介质包括但不限于DEAE纤维素、DEAE琼脂糖、DEAE生物胶、DEAE葡聚糖。

d)PEG沉淀、氯仿抽取；

经步骤c)的病毒液用PEG-8000或PEG-6000沉淀，PEG-8000或PEG-6000配成40％的贮存液，6.2mM磷酸钠、1mMEDTA缓冲液配制5M氯化钠，本实施例中经核酸酶消化、层析纯化洗脱的病毒液用PEG-8000沉淀，使PEG-8000在病毒液里的浓度4％(W/V)，氯化钠浓度在100mM，剧烈搅拌后2-8℃1小时，制备型离心机以1000g离心10分钟，倒去上清，用含120mM氯化钠、6.2mM磷酸钠、1mMEDTA(pH7.5)缓冲液重悬沉淀，体积为病毒培养液的10-20％。

上述的病毒收获液作为口蹄疫病毒原液，加入抽提液，所述抽提液是通过将三氯甲烷和异戊醇按24∶1体积比混合后得到的，使大量的口蹄疫病毒颗粒停留在水相和水乳界面。病毒原液加入等体积的抽提液，上下混合1分钟，用制备型带有多管转头的离心机在20℃条件下3,000rpm离心10分钟，收获水相，对界面进行2次抽提，合并水相获得口蹄疫病毒抽提液。其中口蹄疫病毒滴度为10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL；

e)灭活；

0.025％二乙烯亚胺，4℃灭活48小时或37℃灭活2小时

f)蔗糖密度梯度离心纯化；

步骤e)的原液一步连续流蔗糖等密度梯度超速离心纯化，所用离心机为生产制备型系列，大容量转头容积为3.2-8升，批处理抽提液2000升；口蹄疫病毒灭活液采用密度梯度超速离心，超速离心方式为连续流，梯度为不连续梯度，包括(1)离心力36000-60000g形成的梯度；(2)离心力90000-120000g形成的梯度；(3)蔗糖梯度和口蹄疫灭活液的总体积为8L，灭活液中有微量的BHK-12细胞杂质和前段步骤中的残余；(4)口蹄疫病毒灭活液的流速10L/小时；步骤g)所用平衡缓冲液为0.04MPBS(pH7.2-7.6)，60％蔗糖溶液用缓冲液(0.04M磷酸，100mMNaCl，0.1％Triton-X-100，pH7.6)配制，转子注入1.6升配好的60％蔗糖溶液；以20升/小时上样，处理口蹄疫病毒PEG沉淀重悬液2000升，转速32000rpm；

g)超滤透析、稀释、除菌过滤

步骤f)原液经超滤透析并浓缩25-50倍，浓缩后的原液经0.22μm膜除菌过滤；

i)原液储备或乳化配制；

原液储备或经稀释乳化配制，乳化采用的佐剂为V201。

口蹄疫病毒标记疫苗规模化生产流程图及质控方法和质控点如图1和图2所示，其中，具体的口蹄疫病毒标记疫苗规模化生产过程中各步骤的质量控制指标制如下表1所示。

实施例2.核酸酶解步骤的作用

100000L生物反应器口蹄疫病毒培养液离心沉淀经冻融、超声，工艺操作中加入0.1％TritonX-100(Sigma公司产品)，合并上清液和沉淀处理液，加入Benzonase(MerckKgaA，50units/ml)和MgCl₂(2mM)，作用1小时。用连续流离心除去沉淀。深层过滤依次采用0.8微米、0.45微米滤器过滤(德国Sartorius公司产品)，用0.05微米中空纤维柱浓缩5倍用6倍体积缓冲液含1.0MNaCl/50mMTris，pH7.5和4倍体积缓冲液含0.4MNaCl/50mMTris透析换液，pH7.5.浓缩透析液上样SepharoseQ-XL(Amersham)柱，口蹄疫病毒液用缓冲液含0.55MNaCl/50mMTris，pH7.5洗脱和收集，收集液进一步用蔗PEG/CH₃Cl纯化，通过试剂盒检测残余DNA。

TritonX-100/Benzonase处理结合后续的离子交换层析、纯化使成品的杂质含量达到标记疫苗的要求，多个批次DNA残余量≤100pg/剂。工艺步骤中没有TritonX-100/Benzonase核酸酶，则最后成品BHK-21细胞DNA残余为20-80倍，达2-16纳克/剂。说明TritonX-100/Benzonase大量减少了成品口蹄疫原液中BHK-21细胞DNA残余。同时TritonX-100增强DNA从细胞释放，Benzonase消化1小时，增强了释放到培养液中的DNA的降解。

工艺优化中，我们从试验了各种阴离子交换介质，从QAE550C、SuperQ650M(Tosoh公司产品)、QSepharoseHP，ANXSepharose4FF、DEAESepharose、QSepharoseXL、QSepharoseBigBead、QSepharoseFF(Amersham公司产品)，尽管这些介质适合病毒纯化，但Q-SepharoseXL较为适合口蹄疫工业化大规模除去BHK-21细胞蛋白、DNA，且流速快、结合能力强，口蹄疫病毒颗粒损失少于30％。

分子筛层析如SephacrylS300、SephacrylS500Sepharose4FF、Sepharose6FF(allpurchasedfromAmersham公司产品)，尽管在分离口蹄疫病毒和其他小分子杂质上效果明显，但处理量小、口蹄疫病毒损失达30-40％，对前期工艺病毒液蛋白要求浓缩因此基于以上结果，工艺流程步骤如图1和图2。

实施例3缓冲液液体置换或超滤、浓缩、透析

100000L生物反应器培养液经离心、冻融、超声、离心步骤、Benzonase核酸酶(50units/mi)消化1小时，0.1％TritonX-100作用30分钟，用0.5微米滤器、MillistakDE30/60滤器(Millipore公司购买)澄清，澄清液用同体积缓冲液含(0.6MNaCl/50mMHEPES，pH7.5)稀释至含0.3MNaCl，300kD滤器(Biomax300，Pellicon2module，Millipore公司产品)浓缩10倍，用2倍体积透析液含(0.3MNaCl/50mMHEPESpH7)、2倍体积透析液含(0.6MNaCl/50mMHEPESpH7.5)、2倍体积透析液(1.0MNaCl/50mMHEPESpH7.5)、3倍体积透析液(0.3MNaCl/50mMHEPESpH7.5)分别透析，测定导电性和蛋白含量发现NaCl盐浓度在0.6-0.8M时，10-20KD蛋白流穿，适合口蹄疫病毒液中小分子物质和大分子物质的分离。

实施例4口蹄疫病毒标记抗原纯化用单一过滤方法

BHK-21细胞在1000000L生物反应器培养，培养3天后细胞密度达到2-3百万个/毫升，以0.01MOI感染细胞，培养3天。离心机收获病毒液，沉淀加入0.1％TritonX-100反复3次冻融、超声裂解、重悬离心，上清液和病毒液合并，加入Benzonase(50U/ml)在37℃消化10分钟，B/T收获液经深层过滤、膜过滤后按实例2检测。澄清液用中空纤维柱(0.05微米孔径，纤维素长度20厘米，面积1.50平方米)，以剪切速率2000s、7升/平方米进样，渗透阀部分关闭，产生渗透面压力(进口压力38kPa、出口压力P31kPa、渗透压17kPa)，跨膜压力17kPa，浓缩50-100倍，用10倍体积透析液和6倍体积的疫苗配制缓冲液透析，所用滤器孔径0.8、0.45、0.22微米。

口蹄疫病毒纯度和产量检测按图2方法，口蹄疫完整病毒收获率为69％，病毒纯化液中宿主细胞DNA残余量为10ng/剂，含有0.0135％的TritonX-100，属于药学可接受范围。数据表明单一超滤透析去除标记疫苗杂质有限，需要进一步纯化或组合其他方法。

实施例5口蹄疫疫苗纯化工艺和质量控制

按图1、图2流程，蛋白测定方法：中国药典2005版附录29VIB，外源性DNA残留量测定法：中国药典2005版附录46IXB，聚乙二醇残留量测定法，中国药典2005版附录32VIG，三氯甲烷测定法，中国药典2005版附录35VIO，抗生素残留量测定法，中国药典2005版附录45IXA，水分测定方法中国药典2005版附录38VIID，游离甲醛测定≤0.2g/L中国药典2005版附录34VIL，分子排阻高压液相层析在线分析疫苗抗原纯度，在线的FMD病毒抽提液、原液100微升、浓缩原液100微升、纯化液100微升注入分析型分子排阻层析柱(TSK-GelPWcolumnG6000PW.sub.XL，particlesize17.mu.，poresize1000.ANG)(ToshoBiosciencesLLC.；Montgomeryville，Pa.)，平衡液PBS(无Ca2+orMg2+)平衡柱子，流速1ml/分，紫外光吸收值215nm，蠕动泵采用Agilent1100^TM附带ChemStation^TM软件(AgilentTechnologiesInc.；PaloAlto，Calif.)，BHK-21细胞残余DNA检测采用PicoGreen^TM定量试剂盒(InvitrogenCorp.；Carlsbad，Calif.)，lambdaDNA作为标准。BHK宿主细胞蛋白测定试剂盒(CygnusTechnologies，Inc.4701SouthportSupplyRd.SE，Suite7Southport，NC28461USA)按操作说明进行。工艺中的质量控制和检验结果见表1。标记抗原原液质量检验结果见表2。

表2.3批标记抗原半成品主要质量检验结果

疫苗的质量标准：口蹄疫病毒146S含量20微克/毫升，内毒素含量≤50EU/毫升，BHK-21细胞蛋白残留量≤30纳克/毫升、BHK-21细胞DNA残留量≤100皮克/毫升、牛血清白蛋白残留量≤50纳克/毫升、三氯甲烷残留量≤20微克/毫升、PEG残余量≤10微克/毫升、二乙烯亚胺残余≤5微克/毫升、TritonX-100残余≤15微克/毫升、抗生素残余≤50纳克/毫升，非结构蛋白3ABC残余≤5纳克/毫升。

实施例6口蹄疫病毒标记疫苗安全、效力以及诱导口蹄疫病毒非结构蛋白的能力试验

按照实施例1的方法制备口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗，制备得到的抗原用PBS(pH7.6)稀释至3.5-10微克146S/毫升，乳化需采用Seppic公司按佐剂V206：抗原＝1∶1(重量∶重量)混合，疫苗乳化具体如下：

1)佐剂和疫苗原液分别水浴加温31±1℃；

2)佐剂按350rpm搅拌，在5秒内加入疫苗原液并持续搅拌5分钟；

3)停止搅拌在室温放置1小时；

安全试验：动物牛、猪各5头皮下注射各种疫苗8ml，观察局部和一般反应10天，并记录。

效力试验：各选取12-18月无口蹄疫抗体的牛，分成5组，每组6头牛肌肉免疫1ml疫苗，3头牛不免作为对照，观察10天，第30天用含10⁴ID50的病毒舌头皮内攻击。

非结构蛋白抗体产生能力试验：以含3-7微克/毫升146S的疫苗注射牛和猪各5头，免疫后7、21天分别再注射一次，最后一次免疫的一周后，用商用口蹄疫病毒ABC抗体检测试剂盒检测3ABC抗体。

结果：猪\牛均没有检查到口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体。因此根据检测试剂盒灵敏度和口蹄疫病毒疫苗纯度，口蹄疫标记疫苗最多含3ABC在1-4ng之间，可作为标记疫苗使用，对猪和牛反复三次注射免疫不产生抗体，区别感染猪、牛的感染和免疫。标记疫苗的安全、效力、诱导口蹄疫非结构蛋白抗体能力见表3。

表3

Claims

1.一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

b)膜深层过滤、超滤、核酸酶解：

步骤a)得到的病毒上清液，依次经过0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜深层过滤和截留值为100,000-300,000MWCO的膜包或中空纤维柱10倍超滤；高度特异、高活性的核酸酶按20-50×10³单位/升加入到过滤后的上清液中，2-8℃作用9-18小时；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL，总蛋白量为6-6.5克，口蹄疫病毒146S含量为50-60μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤7ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤30ng/ml，BHK-21细胞残余蛋白量≤90ng/ml，BHK-21细胞残余DNA量≤4500pg/ml，Triton-X-100残余量≤510μg/ml，内毒素≤500EU/毫升；

c)强阴离子交换吸附床或吸附膜纯化：

d)PEG沉淀、氯仿异戊醇抽提：

经步骤c)处理后的病毒上清液用PEG沉淀，缓冲液重悬沉淀，病毒重悬液经含抽提液抽提，所述抽提液是通过将三氯甲烷和异戊醇按24:1体积比混合后得到的；

e)灭活；

0.025％二乙烯亚胺，4℃灭活48小时或37℃灭活2小时；

f)蔗糖密度梯度离心纯化：

g)超滤透析、除菌过滤：

h)原液储备或乳化配制。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的分步洗脱中洗液为含有90mM氯化钠的pH6.5-7.0的4.7mM磷酸钠缓冲液，用pH7.5含0.35M氯化钠的120mM的磷酸钠和1mMEDTA的缓冲液分步洗脱，每1000立方厘米离子交换吸附床或膜处理40-50ml的病毒液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中所述的PEG为PEG-8000或PEG-6000，经核酸酶消化、强阴离子交换吸附床纯化洗脱的病毒液用PEG沉淀，使PEG在病毒液里的浓度2.7-10％(W/V)，氯化钠浓度为0.35-1M，2-8℃剧烈搅拌1小时，制备型离心机以1000g离心10分钟，倒去上清，用含120mM氯化钠、6.2mM磷酸钠、1mMEDTA(pH7.5)缓冲液重悬沉淀，体积为病毒培养液的10-20％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤f)中灭活液通过连续流60％蔗糖等密度梯度超速离心纯化，所用离心机为生产制备型系列,大容量转头容积为3.2-8升，批处理抽提液2000升；口蹄疫病毒灭活液采用密度梯度超速离心，超速离心方式为连续流，梯度为不连续梯度，包括(1)离心力36000-60000g形成的梯度；(2)离心力90000-120000g形成的梯度；(3)口蹄疫病毒灭活液的流速10L/小时；所用平衡缓冲液为pH7.2-7.6的0.04MPBS，60％蔗糖溶液采用pH7.6的含有100mMNaCl,0.1％Triton-X-100的0.04M磷酸缓冲液配制，转子注入1.6升配好的60％蔗糖溶液；以20升/小时上样，处理口蹄疫病毒PEG沉淀重悬液2000升，转速32000rpm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的强阴离子交换吸附床或膜是指QSepharoseXL离子交换吸附床或膜。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤h)中所述的乳化采用的佐剂为V201。