[go: up one dir, main page]

CN104471060B - 用于建立诱导性多能干细胞的高效方法 - Google Patents

用于建立诱导性多能干细胞的高效方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104471060B
CN104471060B CN201380026797.6A CN201380026797A CN104471060B CN 104471060 B CN104471060 B CN 104471060B CN 201380026797 A CN201380026797 A CN 201380026797A CN 104471060 B CN104471060 B CN 104471060B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
nucleic acid
acid encoding
vector
episomal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380026797.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104471060A (zh
Inventor
山中伸弥
冲田圭介
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University NUC filed Critical Kyoto University NUC
Publication of CN104471060A publication Critical patent/CN104471060A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104471060B publication Critical patent/CN104471060B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/608—Lin28
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了iPS细胞的产生方法以及用于改进iPS细胞建立效率的方法，其每一种涉及将(1)携带核重编程因子的附加型载体和(2)不同于附加型载体(1)且携带EBNA‑1的附加型载体引入体细胞的步骤。还提供：iPS细胞建立效率改进试剂，其包含携带编码EBNA‑1的核酸的附加型载体；以及用于产生iPS细胞的试剂盒，其包含携带编码核重编程因子的核酸的附加型载体。

Description

用于建立诱导性多能干细胞的高效方法
技术领域
本发明涉及有效建立诱导性多能干(以下被称为iPS)细胞的方法和用于其的试剂等。更具体地，本发明涉及iPS细胞的产生方法，其包括将以下引入体细胞的步骤，(1) 含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体；和(2) 不同于(1)的含有编码EBNA-1的核酸的附加型载体，和进一步，当期望时，含有编码p53功能的抑制剂的核酸的附加型载体。本发明还涉及用于改进iPS细胞建立效率的试剂，其包含含有编码EBNA-1的核酸的附加型载体，等。
背景技术
近年来，小鼠和人iPS细胞已相继地建立。Yamanaka等人通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因转入来自小鼠和人的成纤维细胞内而诱导iPS细胞(专利文献1和非专利文献1和2)。另一方面，Thomson等人组使用Nanog和Lin28替代Klf4和c-Myc产生人iPS细胞(专利文献2和非专利文献3)。
已经进行了各种尝试来增强iPS细胞建立效率。其中之一是优化重编程因子的组合。本发明人报道，iPS细胞建立的效率可以通过使用Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28的5种因子的组合作为重编程因子并通过RNAi技术敲低p53的表达而显著地改进(专利文献3和非专利文献4)。一些人认为，期望的是，避免抑制癌抑制基因p53，即使是瞬时的，特别是考虑将人iPS细胞应用于再生医学时，因为应当尽可能降低肿瘤化风险。另一方面，Maekawa等人报道，与使用OSK的3种因子相比，iPS细胞建立的效率可以通过将Glis1与Oct3/4、Sox2和Klf4 (OSK)一起引入体细胞而更显著地改进(专利文献4和非专利文献5)。此外，Maekawa等人报道，通过使用Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28和Glis1 (OSKULG)的6种因子建立人iPS细胞的效率是p53 shRNA与Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28 (OSKUL)的5种因子的组合的效率的约2倍(美国临时专利申请号61/521,153)。
逆转录病毒、慢病毒等的病毒载体具有相比于非病毒载体高的转基因效率，因此，是优异的载体，因为它们可以容易产生iPS细胞。然而，因为逆转录病毒和慢病毒被并入染色体中，所以考虑到iPS细胞的临床应用，它们具有安全性问题。尽管已经报道了通过使用非病毒载体诸如腺病毒载体、质粒等而无需并入染色体的iPS细胞(非专利文献6-8)，但建立效率相比于逆转录病毒和慢病毒低。此外，将重编程因子并入染色体的稳定表达株系以特定频率获得，甚至当使用通常被认为对并入有抗性的附加型载体时，这可能是由于在选择iPS细胞下所要求的重编程因子的持续高表达(非专利文献7和9)。
另一方面，使用在染色体外可稳定且自主复制的附加型载体的方法显示上述iPS细胞建立的低效率，由于药物选择中止而导致载体的自发消失的低频率，并且需要长时间(非专利文献8)。因此，期望在短时间内有效去除载体连同改进iPS细胞建立效率的方法。在这方面，本发明人发现了从细胞迅速脱落的早期自消失载体，并且已经报道了该载体(专利文献3、非专利文献4和美国临时专利申请号61/521,153)。
然而，与使用其它载体的方法相比，使用附加型载体的方法与从特定细胞(例如，血细胞)的极低iPS细胞建立效率的问题相关。由于血细胞是非常可用于构建iPS细胞库的体细胞来源之一，所以能够有效建立iPS细胞的附加型载体方法，不论细胞种类，一直是期望的。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1: WO 2007/069666
专利文献2: WO 2008/118820
专利文献3: WO 2011/016588
专利文献4: WO 2011/102531
[非专利文献]
非专利文献1: Takahashi, K. 和Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
非专利文献2: Takahashi, K.等人, Cell, 131: 861-872 (2007)
非专利文献3: Yu, J.等人, Science, 318: 1917-1920 (2007)
非专利文献4: Okita, K.等人, Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)
非专利文献5: Maekawa, M.等人, Nature, 474: 225-229 (2011)
非专利文献6: Stadtfeld, M.等人, Science, 322: 945-949 (2008)
非专利文献7: Okita, K.等人, Science, 322: 949-953 (2008)
非专利文献8: Yu, J.等人, Science, 324: 797-801 (2009)
非专利文献9: Kaji, K.等人, Nature, 458: 771-775 (2009)。
发明概述
本发明待解决的问题
鉴于上述情况，本发明旨在有效建立适合于临床应用的安全人iPS细胞。因此，本发明的第一个问题是提供改进iPS细胞特别是人iPS细胞的建立效率的工具，和使用该工具有效产生iPS细胞的方法。本发明的第二个问题是提供从血细胞有效建立iPS细胞，从而能够非侵入性获得用于应用于再生医学的体细胞来源的方法。
解决问题的方式
本发明人已经进行了深入研究，以试图解决上述问题，并且首次发现，iPS细胞建立效率可以通过在iPS细胞建立步骤中使用含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体连同含有编码EBNA-1的核酸的附加型载体(下文也被称为“额外EBNA-1载体”)(其不同于上述载体)而显著增强。此外，本发明人已经首次发现，iPS细胞可以通过使用所述方法从血细胞有效建立，尽管这对于传统方法极其困难的。本发明基于已经此类发现得以完成。
相应地，本发明包括下述内容。
[1] 产生iPS细胞的方法，其包括将以下(1)和(2)引入体细胞的步骤：
(1) 含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体；和
(2) 不同于(1)的含有编码EBNA-1的核酸的附加型载体。
[2] [1]的方法，其进一步包括引入以附加型载体形式的编码p53功能的抑制剂的核酸。
[3] [2]的方法，其中前述p53功能的抑制剂是p53 shRNA或p53的显性失活突变体。
[4] [3]的方法，其中前述p53的显性失活突变体是p53DD。
[5] [1]-[4]中任一项的方法，其中前述核重编程因子是选自Oct家族、Klf家族、Sox家族、Myc家族、Lin家族和Glis家族的成员的一种或多种。
[6] [5]的方法，其中前述核重编程因子是Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc和Lin28。
[7] [6]的方法，其中前述核重编程因子是Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28和Glis1。
[8] [1]-[7]中任一项的方法，其中将前述编码核重编程因子的核酸分开并包含在2或3个附加型载体中。
[9] [1]的方法，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCEB-hSK-O和pCEB-hUL-G。
[10] [1]的方法，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL。
[11] [2]的方法，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL。
[12] [2]的方法，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSK和pCE-hUL。
[13] [2]的方法，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型质粒载体是pCE-hOCT3/4、pCE-hSK和pCE-hUL，且前述含有编码p53功能的抑制剂的核酸的附加型载体是pCE-mp53DD。
[14] [9]-[11]中任一项的方法，其中前述含有编码EBNA-1的核酸的质粒载体是pCXWB-EBNA1。
[15] [12]或[13]的方法，其中前述含有编码EBNA-1的核酸的质粒载体是pCXB-EBNA1。
[16] [1]-[15]中任一项的方法，其中前述体细胞选自人成纤维细胞(HDF)和血细胞。
[17] [16]的方法，其中前述血细胞是外周血单核细胞(PMNC)。
[18] [17]的方法，其中前述外周血单核细胞(PMNC)是T细胞。
[19] 改进iPS细胞建立效率的方法，其包括将含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体引入体细胞的步骤，其中将含有编码EBNA-1的核酸的不同的附加型载体与所述载体一起引入体细胞。
[20] [19]的方法，其进一步包括引入以附加型载体形式的编码p53功能的抑制剂的核酸。
[21] [20]的方法，其中前述p53功能的抑制剂是p53 shRNA或p53的显性失活突变体。
[22] [21]的方法，其中前述p53的显性失活突变体是p53DD。
[23] 用于改进iPS细胞建立效率的试剂，其包含含有编码EBNA-1的核酸的附加型载体。
[24] 用于产生iPS细胞的试剂盒，其包含以下(1)和(2)：
(1) 含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体；和
(2) 不同于(1)的含有编码EBNA-1的核酸的附加型载体。
[25] [24]的试剂盒，其进一步包含以附加型载体形式的编码p53功能A的抑制剂的核酸。
[26] [25]的试剂盒，其中前述p53功能的抑制剂是p53 shRNA或p53的显性失活突变体。
[27] [26]的试剂盒，其中前述p53的显性失活突变体是p53DD。
[28] [24]的试剂盒，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCEB-hSK-O和pCEB-hUL-G。
[29] [24]的试剂盒，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL。
[30] [25]的试剂盒，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL。
[31] [25]的试剂盒，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSK和pCE-hUL。
[32] [25]的试剂盒，其中前述含有编码核重编程因子的核酸的附加型质粒载体是pCE-hOCT3/4、pCE-hSK和pCE-hUL，且前述含有编码p53功能的抑制剂的核酸的附加型载体是pCE-mp53DD。
[33] [28] - [30]中任一项的试剂盒，其中前述含有编码EBNA-1的核酸的质粒载体是pCXWB-EBNA1。
[34] [31]或[32]的试剂盒，其中前述含有编码EBNA-1的核酸的质粒载体是pCXB-EBNA1。
[35] 产生体细胞的方法，其包括使通过[1] - [18]中任一项的方法获得的iPS细胞进行分化处理，以允许分化为体细胞。
发明效果
在体细胞的核重编程步骤中使用额外的EBNA-1载体显著增强了iPS细胞的建立效率，并且能够更有效地提供人iPS细胞。此外，使用额外的EBNA-1载体能够从血细胞有效建立iPS细胞，这通过常规方法是极其困难的，这进而能够以非侵入性形式获得体细胞来源。因此，本发明对于将人iPS细胞用于再生医学中是非常有用的。
附图简述
[图1] 图1A显示pCEB-hSK-O的结构，且图1B显示pCEB-hUL-G的结构。
[图2] 图2A – E显示各种附加型质粒(pCE-hOCT3/4、pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSK、pCE-hUL和pCE-mp53DD)的结构。
[图3] 图3A显示额外EBNA-1载体质粒(pCXWB-EBNA-1)的结构。图3B显示额外EBNA-1载体质粒(pCXB-EBNA-1)的结构。
[图4] 图4显示从人成纤维细胞(HDF1419)建立iPS细胞。iPS细胞通过使用为质粒组合的2种载体(2 vec.)(pCEB-hSK-O和pCEB-hUL-G)和其与pCXWB-EBNA1的组合从人成纤维细胞(HDF1419)建立。作为饲养细胞，使用丝裂霉素C处理的MEF或丝裂霉素C处理的SNL。
[图5] 图5显示从人成纤维细胞(HDF1388)建立iPS细胞。iPS细胞通过使用为质粒组合的Y4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL)和其与pCXWB-EBNA1的组合从人成纤维细胞(HDF13889)建立。作为饲养细胞，使用丝裂霉素C处理的MEF或丝裂霉素C处理的SNL。
[图6] 图6显示从人外周血单核细胞(PMNC)建立iPS细胞。(A) 显示使用质粒从PMNC诱导iPS细胞的方案。(B)和(C)是使用质粒组合Y4 (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL)建立的iPS细胞集落的照片。(D) 显示在TRB基因座的Southern印迹分析的结果。V(D)J重组(reknitting)在源自两个供体(#1和#3)的iPS细胞克隆(585A1、585B1、604A1和604B1)的TRB基因座中发现。(E) - (G)显示来自iPS细胞的畸胎瘤形成。
[图7] 图7显示额外EBNA-1载体质粒的iPS细胞建立促进效果。(A)和(B)显示使用质粒组合Y4 (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL)和其与pCXWB-EBNA1的组合从PMNC建立的iPS细胞的结果。作为培养基，T细胞培养基(A)或非T细胞培养基(B)。(C)显示在建立的iPS细胞中保留的附加型载体的拷贝数。
[实施方案的描述]
[发明详述]
本发明提供了iPS细胞的产生方法，其包括将以下引入体细胞的步骤，(1) 含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体；和(2) 不同于(1)的含有EBNA-1的附加型载体，和进一步，当期望时，含有编码p53功能的抑制剂的核酸的附加型载体(在附加型载体中，编码p53功能的抑制剂的核酸可以单独地包含在或与编码核重编程因子的核酸一起包含在任何上述(1)的附加型载体中)。本发明还提供了用于改进iPS细胞建立效率的试剂，其包含含有编码EBNA-1的核酸的附加型载体，等。
(A)体细胞的来源
除了哺乳动物起源(例如人、小鼠、猴、猪、大鼠等)的生殖细胞以外的任何细胞都可以用作用于产生iPS细胞的起始材料。实例包括角质化上皮细胞(例如角质化的表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如舌浅层的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如肾上腺髓质细胞)、用于代谢或贮存的细胞(例如肝细胞)、构成界面的内膜上皮细胞(例如I型肺泡细胞)、闭膜管的内膜上皮细胞(例如血管内皮细胞)、具有转运能力的具有纤毛的细胞(例如气道上皮细胞)、用于细胞外基质分泌的细胞(例如成纤维细胞)、收缩细胞(例如平滑肌细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞)、感觉相关细胞(例如杆状细胞)、自主神经系统神经元(例如胆碱能神经元)、感觉器官和外周神经元的支持细胞(例如卫星细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如星形胶质细胞)、色素细胞(例如视网膜色素上皮细胞)、其祖细胞(组织祖细胞)等。不存在关于细胞分化程度，从其中收集细胞的动物年龄等的限制；甚至未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞可以类似地用作本发明中的体细胞来源。未分化的祖细胞的实例包括组织干细胞(成体干细胞)诸如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞。具体地，由于血细胞(外周血单核细胞(包括T细胞和非T细胞(包括CD34阳性细胞和祖干细胞))，外周血淋巴细胞，脐带血细胞等)很容易得到，并且不伴随侵入，所以期望利用其作为iPS细胞库的体细胞来源。此外，由于牙髓干细胞可以通过从智齿、由于牙周疾病拔出的牙齿等分离而制备，所以它们是容易获得的，并且期望利用其作为iPS细胞库的体细胞来源。
当外周血单核细胞被用作体细胞时，T细胞受体(TCR)基因座可以含有或可以不含V(D)J重组。外周血单核细胞的优选实例包括，但不限于，T细胞，其中T细胞受体(TCR)基因座含有V(D)J重组。
作为体细胞来源的哺乳动物个体的选择并无特别限制；然而，当获得的iPS细胞待用于人中的再生医学时，从预防移植物排斥的观点来看，从患者或具有与患者的HLA类型相同或基本上相同的HLA类型的另一个人中收集体细胞是优选的。如本文使用的，“基本上相同的HLA类型”意指，当它们移植到使用免疫抑制剂等的患者时，供体的HLA类型与患者的HLA类型匹配至移植细胞(其已通过诱导衍生自供体的体细胞的iPS细胞分化获得)可以移入的程度。例如，它包括其中主要HLAs(例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的三个主要基因座，进一步包括HLA-Cw的4个基因座)是等同的(下文将应用相同含义)等的HLA类型。当获得的iPS细胞不施用于(移植到)人，但用作例如用于筛选评估患者的药物敏感性或不良反应的细胞来源时，同样期望从患者或具有与药物敏感性或不良反应关联的相同遗传多态性的另一个人中收集体细胞。
当作为体细胞来源的哺乳动物个体是人时，他/她的年龄通常为20岁 - 60岁，优选地，20岁– 40岁，但不限于此。
在实施核重编程步骤前，从哺乳动物中分离的体细胞可以根据细胞的选择使用本身已知适合于其培养的培养基进行预培养。此类培养基的实例包括但不限于，含有约5 -20%胎牛血清(FCS)的最小必需培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。例如，当牙髓干细胞用作体细胞时，优选使用用于间质干细胞(例如间质干细胞基础培养基(Lonza))等的培养基。当使用血细胞时，可以将IL-2、抗CD3抗体和抗CD28抗体添加至培养基中，因为T细胞在浓缩后使用。类似地，可以将IL-3、IL-6、G-CSF和GM-CSF添加至培养基中，因为非T细胞在浓缩后使用。细胞可以在引入上述(1)和(2)的本发明的附加型载体(有时含有编码p53功能的抑制剂的核酸的额外附加型载体；下文也被称为“本发明的载体集合”)之前或之后浓缩。当使用本发明的载体集合，例如，转移试剂诸如阳离子脂质体用于使体细胞与iPS细胞建立效率改进剂接触时（如果期望），有时优选培养基已代替为无血清培养基，以防止转移效率降低。
为了获得适合于人临床应用的完全无外来物(xeno-free)人iPS细胞，不含源自非人动物的组分诸如FCS等的培养基是更期望的。通过将适合于培养体细胞的各种人衍生的组分(具体地，重组人蛋白诸如生长因子等)、非必需氨基酸、维生素等添加至基础培养基中而获得的培养基是可商购的，并且本领域普通技术人员可以选择用于体细胞来源的适当的无外来物的培养基。在无外来物的培养基中预培养的体细胞通过使用合适的无外来物细胞脱离溶液与培养容器脱离，回收，并使其与本发明的载体集合接触。
(B) 核重编程因子(也简称为“重编程因子”)
本发明的“核重编程因子”意指能够从体细胞诱导iPS细胞的蛋白因子(组)。待用于本发明中的核重编程因子可以是任何蛋白因子(组)，只要其可以通过将编码其的核酸引入体细胞而诱导iPS细胞。例如，它可以是选自Oct家族、Klf家族、Sox家族、Myc家族、Lin家族和Glis家族的成员的一种或多种蛋白因子。优选地，待用于本发明中的核重编程因子至少含有Oct3/4、Klf4和Sox2(Klf4和/或Sox2可以替代为经报道能够替代其功能的其它因子)，并且当p53功能的抑制剂没有组合使用时，L-Myc和Lin28或Lin28b优选进一步组合为核重编程因子。待用于本发明中的核重编程因子特征性地不含Nanog。具体地，以下组合可以列举作为核重编程因子。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 285000DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
上文中，还可以使用Lin28b代替Lin28。当使用Esrrb或Esrrg(上述(12)和(23))时，Klf4可以组合使用。
不落入上文(1)至(23)中但包含(1)至(22)中任一项的所有组成成分且进一步包含任选选择的其它物质的任何组合也可以包括在本发明的“核重编程因子”的范围中。如果经历核重编程的体细胞内源以足以引起核重编程的水平表达上文(1)至(23)中任一项的一种或多种组成成分，则不含有所述一种或多种组成成分的仅其余组成成分的组合也可以包括在本发明的“核重编程因子”的范围中。
在这些组合中，Oct3/4 (有时缩写为“O”)、Sox2 (有时缩写为“S”)、Klf4 (有时缩写为“K”)、Lin28 (有时缩写为“L”)和L-Myc (有时缩写为“U”)的5种因子以及Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28、L-Myc和Glis1 (有时缩写为“G”)的6种因子是优选的实例。
关于上述核重编程因子的小鼠和人cDNA序列的信息可参考WO 2007/069666中提及的NCBI登录号获得(在该公开中，Nanog描述为ECAT4。关于Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg、L-Myc 和Glis1的小鼠和人cDNA序列的信息可以分别通过参考以下NCBI登录号获得)；本领域技术人员可容易地能够分离这些cDNA。
Figure 160331DEST_PATH_IMAGE004
(c) p38功能的抑制剂
在本发明中，更优选的是，除了上述核重编程因子以外，将p53功能的抑制剂与体细胞接触。如本文提及的，“p53功能的抑制剂”可以是任何物质，只要它能够抑制(a)p53蛋白的功能或(b)p53基因的表达。即，不仅直接作用于p53蛋白以抑制其功能的物质和直接作用于p53基因以抑制其表达的物质，而且作用于参与p53信号转导的因子以导致p53蛋白的功能或p53基因的表达抑制的物质，也包括在如本文提及的“p53功能的抑制剂”的范围中。
抑制p53蛋白功能的物质的实例包括，但不限于，p53的化学抑制剂、p53的显性失活突变体、抗p53拮抗剂抗体、含有p53应答元件的共有序列的诱饵核酸、p53通路抑制剂等。优选的是p53的化学抑制物质、p53的显性失活突变体和p53通路抑制物质，并且更优选的是p53的显性失活突变体。另一方面，作为抑制p53基因表达的优选物质，可以提及针对p53的siRNA和shRNA。
p53功能的抑制剂的具体实例、获得它们的方法、以及使其与体细胞接触的方法详细描述于WO 2009/157593。
在本发明的优选实施方案中，将作为p53功能的抑制剂的p53 shRNA或p53的显性失活突变体以含有编码其的核酸的附加型载体的形式引入体细胞以实现与体细胞的接触。
本发明中特别优选的p53的显性失活突变体是p53DD，其中小鼠p53的第14-301(对应于人p53的第11-304)氨基酸已经缺失(Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835(1996))。
编码p53的显性失活突变体的核酸可以，例如，通过以下方法获得。首先，基于小鼠或人p53 cDNA序列信息合成合适的寡核苷酸作为探针或引物，并且使用杂交方法或(RT-)PCR方法，从衍生自小鼠或人细胞或组织的mRNA、cDNA或cDNA文库克隆小鼠或人p53 cDNA，并且亚克隆到适当的质粒内。在缺失变体诸如p53DD的情况下，在待缺失的位点之外上设计引物，使用所述引物，使用插入有p53 cDNA的质粒作为模板进行反向PCR，由此获得编码目标显性失活突变体的cDNA。
将分离的cDNA以与上述编码核重编程因子的核酸相同的方式插入下述附加型载体，并且可以将其引入体细胞。
根据例如由Elbashir等人(Genes Dev., 15, 188-200 (2001))提出的规则，针对p53的siRNA可以基于小鼠或人p53 cDNA序列信息进行设计。检查基于上述规则选择的目标序列候选物与除了目标以外的mRNA中连续16-17个碱基的序列的同源性，其使用同源性检索软件程序诸如BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，以便证实所选目标序列的特异性。对于其特异性已被证实的目标序列，由19-21个碱基的有义链和与其互补的反义链组成的双链RNA经由能够形成环结构(例如，约8-25个碱基)的任何接头序列连接，由此可以设计siRNA。
具体而言，具有序列
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 877752DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
下划线部分是p53的目标序列，大写字母显示形成dsRNA的部分)的针对人p53的shRNA等可以被用作本发明中特别优选的shRNA。
对于表达编码shRNA的DNA的载体，尽管pol II启动子(例如CMV的立即早期启动子)可以用作启动子，但通常实践是使用pol III启动子，以便允许短RNA的准确转录。作为pol III启动子，可以提及小鼠和人U6-snRNA启动子、人H1-RNase P RNA启动子、人缬氨酸-tRNA启动子等。作为转录终止信号，使用连续4个或更多T残基的序列。
将因此构建的shRNA表达盒以与上述编码核重编程因子的核酸相同的方式插入下述附加型载体，并且可以将其引入体细胞。
(D) 表达盒
上述编码核重编程因子的核酸(和编码p53功能的抑制剂的核酸)可以单独或以任何组合构成表达盒，并且这些表达盒可以以任何组合包含在附加型载体中。例如，当Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28 和L-Myc用作重编程因子时，编码这些重编程因子的五种核酸被包含作为附加型载体中的以下3个表达盒。
(a) 含有编码Oct3/4的核酸(O)的表达盒；
(b) 表达盒，其中编码Sox2的核酸(S)和编码Klf4的核酸(K)以该顺序(S-K)以5’至3’方向经由使得双顺反子表达的间隔序列(interlying sequence)连接；和
(c) 表达盒，其中编码L-Myc的核酸(U)和编码Lin28的核酸(L)以该顺序(U-L)以5’至3’方向经由使得双顺反子表达的间隔序列连接。
在本发明的优选实施方案中，除了上述5种重编程因子以外，还使用Glis1作为重编程因子。在这种情况下，在附加型载体中含有编码6种重编程因子的核酸作为上述3个表达盒(a) - (c)和
(d) 含有编码Glis1的核酸(G)的表达盒的4个表达盒。
在另一个实施方案中，将Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28 和L-Myc的5种重编程因子与p53 shRNA或p53DD组合。在这种情况下，编码5种重编程因子和p53 shRNA或p53DD的6种核酸被包含作为附加型载体中的以下4个表达盒。
(a) 含有编码Oct3/4的核酸(O)的表达盒；
(b) 表达盒，其中编码Sox2的核酸(S)和编码Klf4的核酸(K)以该顺序(S-K)以5’至3’方向经由使得双顺反子表达的间隔序列连接；
(c) 表达盒，其中编码L-Myc的核酸(U)和编码Lin28的核酸(L)以该顺序(U-L)以5’至3’方向经由使得双顺反子表达的间隔序列连接；和
(d’) 含有编码p53 shRNA的核酸的表达盒或(d”)含有编码p53DD的核酸的表达盒。
作为“使得双顺反子表达的间隔序列”，可以使用口蹄疫病毒的2A序列(PLoS ONE3，e2532，2008，Stem Cells 25，1707，2007)、IRES序列(美国专利号4,937,190)等，优选2A序列。“表达盒”含有重编程因子和/或编码p53功能的抑制剂的核酸(O、S-K、U-L、G等)，以及与该核酸可操作连接的至少一个启动子。用于重编程因子或编码p53的显性失活突变体的核酸的启动子的实例包括EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等，其中优选为EF1α启动子、CAG启动子、MoMuLVLTR、CMV启动子、SRα启动子等。此外，除了基本启动子序列以外，表达盒可以含有用于增强重编程因子的表达的增强子序列(例如，CMV早期立即增强子等)。在编码p53 shRNA的核酸的情况下，pol III启动子诸如U6启动子等优选用作如上所述的启动子。
优选地，除了启动子以外，本发明的表达盒含有在编码重编程因子或p53的显性失活突变体的核酸的3’下游的polyA添加信号。在编码p53 shRNA的核酸的情况下，4个或更多个连续T残基的序列优选被包含作为核酸的3'下游的转录终止信号。而且，在本发明的表达盒中，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列可以被插入在，例如，重编程因子和显性失活突变体的编码区和polyA添加信号之间，以试图改进重编程因子和p53的显性失活突变体的mRNA的稳定性。
(E) 附加型载体
待用于本发明中的附加型载体的实例包括包含对于哺乳动物细胞中自主复制必需的衍生自EBV、SV40等的序列作为载体组分的载体。对于哺乳动物细胞中自主复制必需的载体组分通过哺乳动物细胞中有功能的复制起点和编码结合复制起点以控制复制的蛋白的基因具体例举。其实例包括用于EBV的复制起点oriP和EBNA-1基因、和用于SV40的复制起点ori和SV40大T抗原基因。更优选地，使用oriP和EBNA-1基因。
当期望时，附加型载体可以进一步含有细菌或酵母的复制起点(例如，pUC ori、ColE1 ori、2μ ori等)，选择标记基因(例如，氨苄青霉素抗性基因、营养缺陷型互补基因)等，以实现细菌和酵母诸如大肠杆菌等中的大量扩增。此外，当期望时，例如，二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因等可以进一步被包含作为哺乳动物细胞中的选择标记基因。此外，附加型载体可以含有多克隆位点，以便于插入编码重编程因子的核酸的表达盒。在一个实施方案中，上述表达盒中的启动子、增强子、polyA添加信号、WPRE序列等被预先包含在附加型载体上，且附加型载体也可以经设计以通过将编码重编程因子的核酸插入启动子和polyA添加信号(当载体含有WPRE序列时为WPRE序列)之间而构建转基因载体。在此类情况下，附加型载体优选含有启动子和polyA添加信号(当载体含有WPRE序列时为WPRE序列)之间的多克隆位点。
本发明的载体集合可以通过在多个(优选为2、3或4个)附加型载体中每个中包括上述表达盒(a) - (c)、或(a) - (d)、(d’) 或(d”)中的1或2个而构建。在这方面，本发明人先前公开了多个表达盒的组合和其在附加型载体上的顺序显著影响iPS细胞建立效率(美国临时专利申请号61/521,153)。
在本发明中，额外EBNA-1载体的组合使用显著改进iPS细胞建立效率。因此，本发明的载体集合可以以任何组合和任何位置处的任何顺序在2、3或4个附加型载体上含有上述表达盒(a) - (c)、或(a) - (d)、(d’)或(d”)中的1或2个。
然而，在一个优选实施方案中，本发明的载体集合通过根据以下规则(美国临时专利申请号61/521,153)将上述表达盒(a) - (d)中的两个置于两个附加型载体上而构建。
当表达盒以5’至3’方向以[表达盒A]-[表达盒B]的顺序与编码蛋白(例如，EBNA-1、SV40大T抗原等，优选EBNA-1)(其结合哺乳动物细胞中的功能复制起点并调节载体在哺乳动物细胞中的复制)的基因(有义链)的3’-侧设置为起点(此后，附加型载体上表达盒的位置总是通过使用该起点显示)时，
1) 上述(a)的表达盒(包括编码Oct3/4的核酸(O))被布置在表达盒B的位置；优选地，
2) 上述(b)的表达盒（其中编码Sox2的核酸(S)和编码Klf4的核酸(K)以该顺序(S-K)以5’至3’方向经由使得双顺反子表达的间隔序列连接）被布置在表达盒A的位置。
此处，上述表达盒(a)和上述表达盒(b)可以被设置在(ⅰ)相同附加型载体上(以(b)-(a)的顺序被布置在第一附加型载体上)，或者被设置在(ii)不同附加型载体上(以(c)或(d)-(a)的顺序被布置在第一附加型载体上，且以(b)-(d)或(c)的顺序被布置在第二附加型载体上)。上述(i)包括两种组合： (ia) 第一附加型载体:(b)-(a) (重编程因子SK-O的顺序)和第二表达载体:(c)-(d) (重编程因子UL-G的顺序)的组合,和(ib) 第一附加型载体: (b)-(a) (重编程因子SK-O的顺序)和第二表达载体: (d)-(c) (重编程因子G-UL的顺序)的组合。上述(ii)包括两种组合： (iia) 第一附加型载体: (c)-(a) (重编程因子UL-O的顺序)和第二表达载体: (b)-(d) (重编程因子SK-G的顺序)的组合,和(iib) 第一附加型载体: (d)-(a) (重编程因子G-O的顺序)和第二表达载体: (b)-(c) (重编程因子SK-UL的顺序)的组合。
在这些中，特别优选的组合是上述组合(ia)，即，第一附加型载体: (b)-(a) (重编程因子SK-O的顺序)和第二表达载体:(c)-(d) (重编程因子UL-G的顺序)的组合。更具体地，可以提及下述实施例和图1中显示的pCEB-hSK-O和pCEB-hUL-G的组合。
在上面提及的表达盒的顺序中，每个表达盒的转录的方向没有特别限定，且两个表达盒可以被插入，从而使得它们以相同方向(头至尾)转录，或者可以被插入，从而使得它们以相反方向(头至头或尾至尾)转录。每个表达盒的转录方向可以与编码结合哺乳动物细胞中的功能复制起点并调节载体在哺乳动物细胞中的复制的蛋白的基因的转录方向相同或相反。在一个优选的实施方案中，将所有表达盒置于载体上，从而使得它们以与基因的方向相同的方向转录。
在另一个优选的实施方案中，本发明的载体集合包含分别置于3种附加型载体上的上述表达盒(a) - (c)。更具体地，3种附加型载体的实例包括如下述实施例和图2中显示的
Figure 210644DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
当载体集合进一步含有p53功能的抑制剂的表达盒(即，上述(d’)或(d”)的表达盒)时，该表达盒可以单独地置于分开的附加型载体上(总共4种附加型载体)。具体实例包括下述实施例和图2中显示的pCE-mp53DD等。
或者，p53功能的抑制剂的表达盒可以一起置于含有上述表达盒(a) - (c)的3种附加型载体中的任一种上。优选地，其可以，但不限于，与上述表达盒(a)一起置于附加型载体上。当将其与编码重编程因子的核酸一起置于附加型载体上时，其顺序没有特别限定。例如，它们可以以p53功能的抑制剂的表达盒－重编程因子的表达盒的顺序进行设置。具体实例包括下述实施例和图2中显示的
Figure 962699DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE011
(也称为
Figure 722845DEST_PATH_IMAGE012
, 参见
Figure DEST_PATH_IMAGE013
)和
Figure 927561DEST_PATH_IMAGE014
(也称为
Figure DEST_PATH_IMAGE015
)。
本发明中的附加型载体可以含有或可以不含对于载体在哺乳动物细胞中的复制必需的载体组分的5’-侧和3’-侧上的loxP序列。优选地，可以使用具有相同方向的载体组分的5’-侧和3’-侧上的loxP序列的附加型载体。由于附加型载体能够在染色体之外自主复制，甚至当它没有被引入基因组中时，也可以提供宿主细胞中的稳定表达。一旦建立iPS细胞，则期望快速去除载体。通过放置由两个loxP序列(其允许Cre重组酶在其上发挥作用并切割出载体组分)侧接的对于附加型载体在哺乳动物细胞中的复制所需的载体组分可以使得附加型载体的自主复制能力消失，并且可以使得载体从早期iPS细胞脱落。
除了噬菌体P1衍生的野生型loxP序列以外，可用于本发明中的loxP序列包括，当以相同方向置于侧接对于附加型载体在哺乳动物细胞中的复制必需的载体组分的位置时，能够通过重组缺失loxP序列侧接的序列的任选选择的突变体loxP序列。此类突变体loxP序列的实例包括在5'重复中突变的lox71、在3'重复中突变的lox66、以及在间隔序列部分中突变的lox2272和lox511。尽管置于载体组分的5’和3’侧上的两个loxP序列可以是相同或不相同的，但在间隔序列部分中突变的两个突变体loxP序列必须是相同的(例如一对lox2272序列、一对lox511序列)。优选给予在5'重复中突变的突变体loxP序列(例如lox71)、和在3'重复中突变的突变体loxP序列(例如lox66)的组合。在这种情况下，由于重组，在染色体上剩余的loxP序列具有在5'侧和3'侧上在重复中的双重突变，并且因此不太可能由Cre重组酶识别，从而减少由于不需要的重组引起染色体中的缺失突变的风险。当突变体loxP序列lox71和lox66组合使用时，各自可以置于上述载体组分的5'和3'侧的任何上，但突变体loxP序列以这样的方向插入，从而使得突变位点将位于各自loxP序列的外部末端是必需的。尽管本发明中的优选附加型载体是甚至在没有Cre重组酶作用的情况下从早期iPS细胞脱落的早期消失载体，但由于对于从细胞脱落可能需要格外长时间，因此可优选设计loxP序列来处理由于用Cre重组酶处理导致的不必要重组风险等。
两个loxP序列各自以相同方向置于对于附加型载体在哺乳动物细胞中的复制必需的载体组成成分(即在哺乳动物细胞中有功能的复制起点(例如，EBV oriP、SV40 ori等，优选oriP)或编码结合复制起点以控制复制的蛋白的基因序列(例如，EBNA-1、SV40大T抗原等，优选EBNA-1))的5'和3'侧上。loxP序列侧接的载体组成成分可以是复制起点、或编码结合复制起点以控制复制的蛋白的基因序列、或两者。
本发明中使用的附加型载体不仅提供附加型载体的固有效果(即，当引入体细胞时，无论loxP序列是否存在，构成载体的外源核酸因子(包括重编程因子或编码p53功能的抑制剂的核酸)没有被引入细胞基因组中，即使是瞬时地)，而且提供意料之外的效果(即，作为附加体存在的载体从早期iPS细胞脱落，甚至在不应用Cre重组酶处理的情况下)。即，本发明还提供了自消失的附加型载体，其提供足以建立iPS细胞的重编程因子和p53功能的抑制剂的表达，此后其从早期细胞脱落。如本文中所使用，“脱落”意指通过WO 2011/016588A1中实施例6或10所述的PCR分析或实施例11中所述的RT-PCR分析没有检测到(低于检测限值)载体的存在或置于载体上的重编程因子或p53功能的抑制剂的表达。此类载体的特征在于其在通过引入载体建立的iPS细胞克隆中的50％或更多、优选60％或更多、更优选70％或更多中在10代之前从iPS细胞脱落。或者，自消失的附加型载体的特征在于其在细胞中是不稳定的，其程度为，在引入后的一周内，每1x104个细胞的拷贝数为大约106，而当建立iPS细胞时(例如，从引入载体起约4周)，每1x104个细胞的拷贝数为100或更少，优选50或更少，更优选30或更少。
具体而言，本发明的早期自消失载体具有以下(i) - (vii)中至少一种、优选2种或更多种、更优选3种或更多种、特别优选4种或更多种结构特征。
(i) 将loxP序列以相同方向布置在对于附加型载体在哺乳动物细胞中的复制所需的载体组分(例如，EBNA-1基因、SV40大T抗原基因，优选EBNA-1基因)的5’-侧和3’-侧上。
(ii) 编码重编程因子的核酸在CAG启动子的调控下。
(iii) 编码重编程因子或p53的显性失活突变体的核酸在CMV早期立即增强子的调控下。
(iv) 编码重编程因子或p53的显性失活突变体的核酸在兔β珠蛋白polyA添加信号的调控下。
(v) 将WPRE序列包含在编码重编程因子或p53的显性失活突变体的核酸和polyA添加信号之间。
(vi) 编码p53 shRNA的核酸在U6启动子的调控下。
(vii) 含有在细菌中有功能的复制起点(例如pUC ori，ColE1 ori，优选pUC ori)和能够在细菌中选择的标记基因(例如，氨苄青霉素抗性基因)。
(viii) 置于载体上的对于附加型载体在哺乳动物细胞中的复制所需的载体组分(例如，EBNA-1基因、SV40大T抗原基因，优选EBNA-1基因)和编码各重编程因子或p53功能的抑制剂的核酸以相同方向转录。
如美国临时专利申请号61/521,153的实施例6中所示，可以建立iPS细胞，甚至当在一个附加型载体上含有4个表达盒的转基因载体被引入体细胞时。建立效率可以通过研究也在这种情况下表达盒的顺序来进一步改进。
(F) 额外EBNA-1载体质粒
EBV(Epstein-Barr病毒)对细胞的潜伏感染中，EBNA-1 (Epstein-Barr病毒核抗原1)蛋白在其附加体的复制和维持以及病毒基因组的转录表达中发挥极端重要的作用，并且已知当所述蛋白结合EBV基因组DNA的OriP区域时，此类功能得以实现(Frappier, L.,和O’Donnell, M. (1991) J. Biol. Chem. 266, 7819-7826)。本发明中的额外EBNA-1载体质粒利用EBNA-1的此类功能，使得具有OriP区域的附加型载体能够自主复制。本发明中的额外EBNA-1载体质粒携带编码EBNA-1蛋白的基因，并且可以在哺乳动物细胞中瞬时或组成型表达EBNA-1蛋白。
本发明中的任何额外EBNA-1载体质粒也涵盖在本发明的范围内，只要它是以下质粒，所述质粒具有含有在启动子调控下的插入的EBNA-1编码区的结构，且具有使得EBNA-1编码区表达的结构。例如，除了启动子以外，本发明中的额外EBNA-1载体质粒可以含有，当期望时，增强子、polyA添加信号、选择标记基因等。选择标记基因的实例包括氨苄青霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。作为调控EBNA-1编码区的启动子，使用EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等。在这些中，CAG启动子、CMV启动子等是优选的。本发明中的额外EBNA-1载体质粒可以，例如，使用pCX-EGFP (FEBS Letters, 407, 313-319,1997)和通过以下步骤来产生。
･将WPRE序列插入pCX-EGFP的pA序列的5'侧，并且将SV40ori通过用限制性内切酶BamHI处理而进一步去除。
･然后，载体的EGFP部分通过EcoRI去除，并且将EBNA-1编码区插入代替。
因此获得的额外EBNA-1载体质粒在本说明书中也称为“pCXWB-EBNA-1”。
在另一个实施方案中，本发明中的额外EBNA-1载体质粒可以，例如，使用pCX-EGFP(FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)和通过以下步骤来产生。
･ pCX-EGFP用限制性内切酶BamHI处理，以允许自连接(pCXB-EGFP)。
･然后，载体用限制性内切酶EcoRI处理，并且插入pCXWB-EBNA1的EcoRI片段(EBNA-1编码区)。
因此获得的额外EBNA-1载体质粒在本说明书中也称为“pCXB-EBNA1”。
作为额外EBNA-1载体质粒的用途实施方案，例如，它可以在iPS细胞建立步骤中与细胞接触，同时与携带核重编程因子的附加型载体接触。在另一个实施方案中，额外EBNA-1载体质粒可以在携带核重编程因子的附加型载体与细胞接触之前或之后与细胞接触。前者实施方案更优选用于实施本发明。
作为额外EBNA-1载体质粒的iPS细胞建立效率改进效果的机制，例如，可以认为通过常规的方法的EBNA-1结合oriP的量是不足的，这进而阻止携带核重编程因子的附加型载体的充分复制，并且引起核重编程因子的表达水平不足；然而，额外EBNA-1载体质粒可以补偿不足量的EBNA-1。显然，本发明完全不受影响，即使iPS细胞建立效率的确受到一些其它机制的改进。
在以下本说明书中，使用附加型载体建立的iPS细胞有时缩写为“epi-iPS细胞”或“epi-iPSCs”。当本发明中转基因的组合被缩写为“
Figure 64145DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE017
”时，这些组合如下表1中显示。
表 1
Figure 670706DEST_PATH_IMAGE018
(G) 将载体集合引入体细胞的方法
上述附加型载体的组合构成的载体集合可以被引入体细胞中，例如，通过使用脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、颗粒枪法等。具体地，例如，可以使用在Science, 324: 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1, NatureMethods, 8(5), 409-412 (2011)等中描述的方法。
对于附加型载体在哺乳动物细胞中的复制必需的载体组分是否已经从iPS细胞中去除可以通过以下来证实：进行通过使用核酸(所述核酸含有载体组分中的碱基序列和/或当使用loxP序列时loxP序列附近的碱基序列)作为探针或引物和从iPS细胞分离的附加体级分作为模板的Southern印迹分析或PCR分析，并且检查条带的存在或不存在或检测条带的长度(参见WO 2011/016588 A1, Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011))。附加体级分可以通过本领域众所周知的方法来制备，并且例如，可以使用Science, 324:797-801(2009), WO 2011/016588 A1, Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等中描述的方法。
(H) iPS细胞建立效率改进物质
预期iPS细胞的建立效率通过使已知iPS细胞建立效率改进物质与体细胞接触而得到进一步改进。iPS细胞建立效率改进物质的实例包括，但不限于，组蛋白去乙酰基酶(HDAC)抑制剂[例如，丙戊酸(VPA) (Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))，低分子量抑制剂诸如曲古抑菌素A、丁酸钠、MC 1293和M344，基于核酸的表达抑制剂诸如针对HDAC的siRNAs和shRNAs(例如HDAC1 siRNA Smartpool® (Millipore)、针对HDAC1的HuSH29聚体shRNA构建体(OriGene)等)等]，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如，核酸表达抑制剂诸如低分子量抑制剂诸如BIX-01294(Cell Stem Cell，2: 525-528(2008))等，针对G9a的siRNA和shRNA(例如G9a siRNA(人)(Santa Cruz Biotechnology)等)等]，L-钙通道激动剂(例如Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))，UTF1 (Cell Stem Cell, 3,475-479 (2008))，细胞内信号转导调节剂[例如，Wnt信号传导激活剂(例如可溶性Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))，TGF-β抑制剂，MEK抑制剂，2i/LIF [2i是丝裂原活化蛋白激酶信号传导和糖原合酶激酶-3的抑制剂，PloS Biology, 6(10), 2237-2247(2008))]，其它天然或合成的低分子量化合物(例如，5’-氮杂胞苷、thiazovivin、维生素C等)，ES细胞特异性miRNA(例如miR-302-367簇(Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08, WO 2009/075119)，miR-302(RNA (2008) 14: 1-10)，miR-291-3p, miR-294和miR-295 (其中所有都在Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009)))等。如上所述，基于核酸的表达抑制剂可以是具有编码siRNA或shRNA的DNA的表达载体的形式。
对于(a)当物质是蛋白因子时，(b)当物质是编码蛋白因子的核酸或(c)低分子量化合物时中每种情况，这些iPS细胞建立效率改进剂可以通过与关于本发明的建立效率改进因子的常规已知方法类似的方法与体细胞接触。
iPS细胞建立效率改进剂可以和本发明的载体集合一起与体细胞同时接触，并且任何一种可以预先接触，只要来自体细胞的iPS细胞建立效率与不存在所述改进剂的情况下获得的效率比较得到显著改进。
(I) 通过培养条件改进建立效率
iPS细胞建立效率可以进一步通过在低氧条件下在用于体细胞的核重编程过程中培养细胞得到改进。如本文提及的，术语“低氧条件”意指在细胞培养时的环境氧浓度显著低于大气中的浓度。具体地，可以提及涉及比在5-10% CO2/95-90%空气气氛(其通常用于普通细胞培养)中的环境氧浓度更低的氧浓度的条件；实例包括涉及18%或更低的环境氧浓度的条件。优选地，环境氧浓度是15%或更低 (例如14%或更低、13%或更低、12%或更低、11%或更低等)、10%或更低 (例如9%或更低、8%或更低、7%或更低、6%或更低等)、或5%或更低 (例如4%或更低、3%或更低、2%或更低等)。环境氧浓度优选是0.1%或更高 (例如0.2%或更高、0.3%或更高、0.4%或更高等)、0.5%或更高 (例如0.6%或更高、0.7%或更高、0.8%或更高、0.95%或更高等)、或1%或更高 (例如1.1%或更高、1.2%或更高、1.3%或更高、1.4%或更高等)。
尽管可以使用在细胞环境中产生低氧状态的任何方法，但最容易的方法是在允许调整氧浓度的CO2培养箱中培养细胞，并且这代表合适情况。允许调整氧浓度的CO2培养箱是从多个制造商商购的(例如由Thermo scientific，Ikemoto Scientific Technology，JujiField，Wakenyaku制造的用于低氧培养的CO2培养箱等)。。
在低氧条件下起始细胞培养的时间并无具体限制，只要与正常氧浓度(20％)相比，iPS细胞建立效率的改进未被阻止。尽管培养可以在体细胞与本发明的载体集合接触前、或与接触同时、或在接触后起始，但优选例如在低氧条件下的培养仅在体细胞与载体集合接触后，或在接触后的给定时间间隔时[例如1 - 10(例如2、3、4、5、6、7、8或9)天]起始。
在低氧条件下细胞培养的持续时间并无特别限制，只要与正常氧浓度(20%)相比，iPS细胞建立效率得到改进未被阻止；实例包括，但不限于，3天或更多、5天或更多、7天或更多或10天或更多、和50天或更少、40天或更少、35天或更少或30天或更少等的期间。优选的在低氧条件下的培养持续时间根据环境氧浓度而改变；本领域技术人员可以根据使用的氧浓度适当地调整培养的持续时间。在本发明的一个实施方案中，如果iPS细胞候选集落用药物抗性作为指数进行选择，则优选在开始药物选择前从低氧条件恢复正常氧浓度。
此外，对于在低氧条件下的细胞培养的优选起始时间和培养的优选持续时间也取决于在正常氧浓度下的iPS细胞建立效率等而改变。
在与本发明的载体集合(当需要时，进一步iPS细胞建立效率改进剂)接触后，细胞可以例如在适合于培养ES细胞的条件下进行培养。通常，在小鼠细胞的情况下，用作为分化抑制因子的白血病抑制因子(LIF)添加至普通培养基来实施培养。同时，在人细胞的情况下，期望添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或干细胞因子(SCF)来代替LIF。细胞可以在作为饲养细胞、用放射或抗生素处理以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞共同存在的情况下培养，或者可以在用细胞外基质代替这些饲养细胞包被的培养皿中培养。通常，作为小鼠胚胎衍生的成纤维细胞，经常使用STO细胞系(ATCC CRL-1503)等作为饲养细胞。为了诱导iPS细胞，经常使用通过在STO细胞(SNL76/7 STO细胞；ECACC 07032801)中稳定引入新霉素抗性基因和LIF基因而获得的SNL细胞(McMahon, A. P. 和 Bradley, A. Cell 62,1073-1085 (1990))等。此外，也可以使用小鼠胚胎衍生的原代成纤维细胞(MEF)。丝裂霉素C处理的MEF商购自Millipore和ReproCELL Incorporated。与这些饲养细胞的共培养可以在与本发明的载体集合接触之前，接触之时，或接触之后(例如，1-10天后)开始。
培养基可以含有Rho激酶(ROCK)抑制剂。具体地，当培养步骤包括以单细胞分散人iPS细胞的步骤时，优选的是，培养基应当含有ROCK抑制剂。当MEF细胞和SNL细胞被用作饲养细胞时，对其使用的培养基可以含有或可以不含ROCK抑制剂，优选其不存在。作为ROCK抑制剂，可以使用Y-27632，但ROCK抑制剂不限于此。
使用本发明的载体集合，人iPS细胞可以在不使用非人动物衍生的组分(即，在完全无外来物的条件下)的情况下通过培养，从将所述载体集合引入体细胞以建立iPS细胞并且进一步以维持为iPS细胞来产生。当在无外来物条件下诱导人iPS细胞时，接触本发明的载体集合(进一步，必要时，iPS细胞建立效率改进物质)，并且将细胞在无FCS和其它非人动物衍生的组分的培养基中培养。作为待添加至培养基中作为分化抑制剂的物质(例如，bFGF、SCF等)，使用人衍生的纯化蛋白，优选重组蛋白。作为饲养细胞，可以使用任何人衍生的体细胞。例如，可以优选使用人皮肤成纤维细胞(HDF)、人牙髓干细胞等。也可诱导人iPS细胞，而不使用饲养细胞。在这种情况下，细胞外基质也可以被用作细胞容器的包被剂。细胞外基质是细胞之外存在的超分子结构，其可以是天然衍生的或人工产物(重组体)。其实例包括物质诸如胶原蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白、透明质酸、生腱蛋白、内功素、弹性蛋白、原纤蛋白和层粘连蛋白及其片段。这些细胞外基质可以组合使用，并且可以，例如，从细胞制备，诸如BD基质胶(TM)等。这些之外，可以使用市售无外来物包被剂。市售无外来物包被剂的实例包括，但不限于，CellStart、Coat1、VTN-N、Synthemax2、和Retronectin。
通过使用附加型载体从外周血单核细胞(T细胞和非T细胞(包括CD34阳性细胞和干细胞，祖细胞)建立iPS细胞的方法详细描述于，例如，Kyoto University iPS细胞培养方案(http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)。
iPS细胞的候选集落可以以两种方式进行选择：用药物抗性和报道分子活性作为指示剂的方法，以及基于形态学的肉眼检查的方法。作为前者的实例，使用重组细胞选择对于药物抗性和/或报道分子活性为阳性的集落，其中药物抗性基因和/或报道基因被靶向至在多能细胞中特异性高度表达的基因的基因座(例如Fbx15、Nanog、Oct3/4等，优选Nanog或Oct3/4)。此类重组细胞的实例，包括衍生自具有敲入Fbx15基因座中的βgeo(其编码β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合蛋白)基因的小鼠的MEF [Takahashi和Yamanaka,Cell, 126, 663-676 (2006)]和衍生自具有整合到Nanog基因座中的绿色荧光蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因的转基因小鼠的MEF [Okita等人, Nature, 448, 313-317(2007)]。同时，通过形态学的肉眼检查选择候选集落的方法包括例如由Takahashi等人在Cell, 131, 861-872 (2007)中描述的方法。尽管使用报道细胞的方法是方便和有效的，但当iPS细胞制备用于人治疗的目的时，通过肉眼检查的集落选择从安全性观点来看是期望的。
所选集落的细胞作为iPS细胞的身份可以如上所述通过对于Nanog(或Oct3/4)报道分子的阳性应答(嘌呤霉素抗性、GFP阳性等)，以及通过ES细胞样集落的可见形成得到证实；然而，为了确保更高的准确度，可以进行测试诸如碱性磷酸酶染色，分析多种ES细胞特异性基因的表达，和将所选细胞移植至小鼠且证实畸胎瘤形成。
因此建立的iPS细胞可以用于多种目的。例如，通过利用报道的关于ES细胞的分化诱导方法，可以诱导从iPS细胞分化成多种细胞(例如心肌细胞、血细胞、神经细胞、血管内皮细胞、胰岛素分泌细胞等)。因此，使用从患者或具有相同或基本上相同的HLA类型的另一个人中收集的体细胞诱导iPS细胞，将使得通过自体或同种异体移植的干细胞治疗成为可能，其中移植至患者的iPS细胞分化成期望细胞(即，患者的受影响器官的细胞，对疾病具有治疗作用的细胞等)。此外，因为由iPS细胞分化的功能细胞(例如肝细胞)被认为比相应现有细胞系更好地反映功能细胞在体内的实际状态，所以它们还可以合适地用于对药物候选化合物的有效性和毒性的体外筛选等。
本发明在下文借助于以下实施例进一步详细描述，然而，本发明的范围不限于以下实施例。
实施例
实施例1：待用于重编程的各种附加型质粒的制备
使用的四种质粒(pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL 和pCXLE-hOCT3/4-shp53-F)是以前产生的质粒(Okita等人, Nature Methods, 8(5), 409-412(2011), WO2011/016588)。各质粒的构建概述如下。
1)
Figure DEST_PATH_IMAGE019
:
质粒，其中将具有人Oct3/4的翻译区的表达盒以5’至3’方向以从作为起点的EBNA-1基因(有义链)的3'侧的该顺序配置(以下相同)，所述人Oct3/4的翻译区被配置为在CAG启动子(在翻译区的下游含有WPRE序列与兔β珠蛋白polyA添加信号，以下相同)的调节下。
2)
Figure 598824DEST_PATH_IMAGE020
:
质粒，其中将具有构建体的表达盒（其中人Sox2和人Klf4的各翻译区经由口蹄疫病毒(FMV) 2A序列连接(PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007)）以5’至3’方向以从作为起点的EBNA-1基因(有义链)的3'侧的该顺序配置，所述表达盒布置在CAG启动子的调节下。
3)
Figure DEST_PATH_IMAGE021
:
质粒，其中将具有构建体的表达盒（其中人L-Myc和人Lin28的各翻译区经由口蹄疫病毒(FMV) 2A序列连接）以5’至3’方向以从作为起点的EBNA-1基因(有义链)的3'侧的该顺序配置，所述表达盒布置在CAG启动子的调节下。
4)
Figure 290836DEST_PATH_IMAGE022
:
质粒，其中将具有编码p53shRNA和人Oct3/4的翻译区(分别被布置在U6启动子和CAG启动子的调节下)的核酸区的表达盒以5’至3’方向以该顺序配置。
和
Figure DEST_PATH_IMAGE025
如下产生。
1)
Figure 488916DEST_PATH_IMAGE026
:
将WPRE序列插入pCX-EGFP (由Dr. Masaru OKABE, Osaka University, FEBSLetters, 407, 313-319, 1997提供)的pA序列的5'侧，并且进一步，SV40ori通过用限制性内切酶BamHI处理而去除。该载体为pCXWB。该载体的EGFP位点用EcoRI去除，并且将以相同方式用EcoRI从pCXLE-hOCT3/4切出的人基因的翻译区插入代替。其被命名为pCXWB-hOCT3/4。该载体用SalI处理，并且将以相同方式用SalI 处理的pCXLE-hSK插入其中，以产生pCEB-hSK-O(图1A)。
2)
Figure DEST_PATH_IMAGE027
:
pMXs-hGLIS1的hGLIS1位点通过PCR扩增，并插入pCR2.1。然后，hGLIS1片段通过用限制性内切酶EcoRI处理而切出，并将其插入用限制性内切酶EcoRI处理的pCXLE-EGFP中。
3)
Figure 856444DEST_PATH_IMAGE028
:
pCXWB的EGFP位点用EcoRI去除，并且将以相同方式用EcoRI从pCXLE-hGLIS1切出的人基因的翻译区插入代替。其被命名为pCXWB-hGLIS1。该载体用SalI处理，并且将以相同方式用SalI 处理的pCXLE-hUL插入其中，以产生pCEB-hUL-G (图1B)。
4)
Figure DEST_PATH_IMAGE029
:
pBluescriptII KS-用限制性内切酶BamHI/XhoI处理，并且将接头插入其中，以产生pBS-XhoBam。然后，pBS-XhoBam用限制性内切酶SalI/MfeI处理，并且将pCEP4的SalI/EcoRI片段插入其中，以产生pBS-CEP盒。然后，pCX-EGFP用限制性内切酶BamHI处理，并且将pBS-CEP盒的BamHI/BglII片段插入其中，以产生pCE-EGFP。
5)
Figure 35752DEST_PATH_IMAGE030
(图2A):
上述pCE-EGFP用限制性内切酶EcoRI处理，并且将pCXLE-hOCT3/4的EcoRI片段插入其中。
6)
Figure DEST_PATH_IMAGE031
(图2B):
上述pCE-hOCT3/4用限制性内切酶BamHI处理，并且将pCXLE-hOCT3/4-shp53-F的BamHI片段插入其中。
7)
Figure 248559DEST_PATH_IMAGE032
(图2C):
上述pCE-EGFP用限制性内切酶EcoRI处理，并且将pCXLE-hSK的EcoRI片段插入其中。
8)
Figure DEST_PATH_IMAGE033
(图2D):
上述pCE-EGFP用限制性内切酶EcoRI处理，并且将pCXLE-hUL的EcoRI片段插入其中。
9)
Figure 829713DEST_PATH_IMAGE034
(图2E):
pENTR-p53DD的mp53DD位点通过PCR扩增，并插入pCR2.1以产生pTopo-mp53DD。然后，pCXLE-EGFP用限制性内切酶EcoRI处理，并且将pTopo-mp53DD的EcoRI片段插入其中，以产生pCXLE-mp53DD。然后，上述pCE-EGFP用限制性内切酶EcoRI处理，并且将pCXLE-mp53DD的EcoRI片段插入其中，以产生pCE-mp53DD。
实施例2：额外EBNA-1载体质粒的产生
为了有效表达转基因，将WPRE序列插入pCX-EGFP (由Dr. Masaru OKABE, OsakaUniversity, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997提供)的pA序列的5'侧，并且进一步，SV40ori通过用限制性内切酶BamHI处理而去除。该载体为pCXWB。然后，pCXWB的EGFP位点用EcoRI去除，并且将通过PCR从pCEP4 (Invitrogen)扩增的EBNA-1-编码区插入代替。该载体被命名为“pCXWB-EBNA1”，并且用于以下实验中(图3A)。
pCXB-EBNA1，是其它额外EBNA-1载体质粒，如下所示产生。首先，pCX-EGFP用限制性内切酶BamHI处理，以允许自连接。该载体为pCXB-EGFP。然后，pCXB-EGFP用限制性内切酶EcoRI处理，并且将pCXWB-EBNA1的EcoRI片段(EBNA-1编码区)插入，以得到pCXB-EBNA1(图3B)。
实施例3：人成纤维细胞(HDF1419)-衍生的iPS细胞的建立
使用质粒组合(pCEB-hSK-O和pCEB-hUL-G)和其与pCXWB-EBNA1的组合，从人成纤维细胞(HDF1419)建立iPS细胞。
人成纤维细胞(HDF1419)购自Cell Applications, Inc。将成纤维细胞在100 mm培养皿中的培养基(补充10%胎牛血清(FCS, Invitrogen)的DMEM (Nacalai Tesque,Japan))中在37℃, 5% CO2下培养和维持。为了引入质粒，去除培养基并添加PBS (5 mL)以洗涤细胞。去除PBS，添加0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA (Invitrogen)，并将混合物在37℃反应约5 min。当细胞漂浮时，添加DMEM/10% FCS以悬浮细胞，并将6x105个细胞收集在15 mL离心管中。将细胞以800 rpm离心5 min以去除上清液。将每种质粒(1.5 μg，pCXLE-hSK-O和pCEB-hUL-G)通过微孔器(ARBROWN CO., LTD.)引入细胞。引入条件为100 μL芯片，1650 V，10 ms和三次脉冲。将引入后的细胞转移至先前添加DMEM/10% FCS (3 mL)的6孔培养板(Falcon)中，并在37℃, 5% CO2的条件下培养6天。其后，去除培养基，并将细胞用PBS (2mL)洗涤。去除PBS后，添加0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA (Invitrogen)，并将混合物在37℃反应约5 min。当细胞漂浮时，添加DMEM/10% FCS以悬浮细胞，并将1x105个细胞铺板在先前用饲养细胞铺板的100 mm皿上。作为饲养细胞，使用丝裂霉素C处理的MEF或丝裂霉素C处理的SNL76/7。第二天，将培养基更换为添加bFGF (Wako)至4 ng/mL的用于灵长类ES细胞(ReproCELL Incorporated)的培养基，并且此后，每2天继续培养基更换。在质粒引入的第24天，将ES样集落和非ES样集落的数目进行计数，并且结果显示在图4中。
据阐明，pCEB-hSK-O和pCEB-hUL-G与pCXWB-EBNA1的组合使用增加iPS细胞建立效率。
实施例4：人成纤维细胞(HDF1388)-衍生的iPS细胞的建立
通过与实施例3中的方法类似的方法且使用质粒组合Y4 (
Figure DEST_PATH_IMAGE035
和
Figure 102563DEST_PATH_IMAGE036
)和其与pCXWB-EBNA1的组合，从人成纤维细胞(HDF1388)建立iPS细胞。
作为结果，据阐明，使用Y4与pCXWB-EBNA1的组合增加iPS细胞建立效率(图5)。
实施例5：人外周血单核细胞(PMNC)-衍生的iPS细胞的建立
使用质粒组合T2 (
Figure DEST_PATH_IMAGE037
和
Figure 766238DEST_PATH_IMAGE038
)、Y3 (
Figure DEST_PATH_IMAGE039
和
Figure 845052DEST_PATH_IMAGE040
) 和Y4(
Figure DEST_PATH_IMAGE041
和
Figure 280713DEST_PATH_IMAGE042
)和其与pCXWB-EBNA1的组合，从人外周血单核细胞(PMNC)建立iPS细胞。
基于机构审查委员会的准则，从给予知情同意的健康供体收集血液。使用Ficoll-paque Plus (GE Healthcare)或BD Vacutainer CPT (BD)且通过密度梯度离心法从该血液回收PMNC。使用NucleofectorII (Lonza)，将3 μg表达质粒混合物引入3-5 × 106个PMNC。为了引入，使用Amaxa(R)人T细胞Nucleofector(R)试剂盒。将引入后的细胞转移至先前用MEF饲养细胞(丝裂霉素C处理)铺板的6孔培养板(Falcon)中，并在37℃, 5% CO2的条件下培养。作为培养基，使用添加30 U/ml IL-2 (PeproTech)和5 μl/孔Dynabeads人T活化剂CD3/CD28的X-vivo10培养基 (Lonza) (用于从T细胞诱导)、或添加10% FCS、10 ng/mlIL-3、10 ng/ml IL-6、10 ng/ml G-CSF 和10 ng/ml GM-CSF、或StemSpan H3000(StemCell Technologies)的αMEM培养基(用于从非T细胞诱导)。从质粒引入的第2天，在没有更换培养基的情况下，将等量添加4 ng/mL bFGF和10 μM Y27632的用于灵长类ES细胞(ReproCELL Incorporated)的培养基添加至每个孔中。然后，在质粒引入的第4天，将培养基更换为添加4 ng/mL bFGF和10 μM Y27632的用于灵长类ES细胞(ReproCELLIncorporated)的培养基。在质粒引入的第20 - 25天，计数ES样集落(iPS细胞集落)。
作为结果，据阐明，使用Y3和Y4与pCXWB-EBNA1的组合增加iPS细胞建立效率(图6和7，表2A和B)。类似地，据阐明，使用Y5 (
Figure DEST_PATH_IMAGE043
和
Figure 990043DEST_PATH_IMAGE044
)、Y6 (
Figure DEST_PATH_IMAGE045
Figure 878364DEST_PATH_IMAGE046
和
Figure DEST_PATH_IMAGE047
)、和pCXB-EBNA1的组合成功地从PMNC建立iPS细胞(表2B)，且使用Y5和Y6与pCXB-EBNA1的组合增加iPS细胞建立效率。此外，据证实，当使用Y6和pCXB-EBNA1的组合时，也可以通过使用用20 μg/ml RetroNectin(Takara)代替MEF饲养细胞包被的培养皿以相同方式建立iPS细胞。
表2
Figure 698553DEST_PATH_IMAGE048
由于本发明可以显著增加iPS细胞的建立效率，所以人iPS细胞可以更有效地提供。而且，根据本发明，由于iPS细胞可以有效地从血细胞建立，这通过常规方法是极端困难的，因此本发明非常可用于将人iPS细胞应用于再生医学。
尽管本发明已着重于优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是优选实施方案可以进行改变。本发明预期本发明可以通过除了本说明书中详细描述那些以外的方法进行实施。因此，本发明涵盖在附加“权利要求”的要点和范围中涵盖的所有改变。
在本文引用的任何出版物包括专利和专利申请中描述的内容在此以其整体通过引用并入本文，至它们已在本文中公开的程度。
本申请基于美国临时专利申请号61/650,694 (申请日：2012年5月23日，其内容完全涵盖在本文中。
Figure IDA0000613464040000011

Claims (15)

1.产生iPS细胞的方法，其包括将以下(1)和(2)引入体细胞的步骤：
(1) 含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体；和
(2) 含有编码EBNA-1的核酸并且不含有编码核重编程因子的核酸的质粒载体，
其中所述(1)的附加型载体包含oriP和编码EBNA-1的核酸，并且其中所述(2)的质粒载体不具有在哺乳动物细胞中有功能的复制起点，
其中所述方法进一步包括引入以附加型载体形式的编码p53功能的抑制剂的核酸，
其中所述核重编程因子包括Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc和Lin28，和
其中所述体细胞/iPS细胞是人细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所述p53功能的抑制剂是p53 shRNA或p53的显性失活突变体。
3.根据权利要求2的方法，其中所述p53的显性失活突变体是p53DD。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中将所述编码核重编程因子的核酸分开并包含在2或3个附加型载体中。
5.根据权利要求4的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCEB-hSK-O和pCEB-hUL-G。
6.根据权利要求4的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL。
7.根据权利要求4的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL。
8.根据权利要求4的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSK和pCE-hUL。
9.根据权利要求4的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型质粒载体是pCE-hOCT3/4、pCE-hSK和pCE-hUL，且所述含有编码p53功能的抑制剂的核酸的附加型载体是pCE-mp53DD。
10.根据权利要求1-3和5-9中任一项的方法，其中所述含有编码EBNA-1的核酸的质粒载体是pCXWB-EBNA1。
11.根据权利要求1-3和5-9中任一项的方法，其中所述含有编码EBNA-1的核酸的质粒载体是pCXB-EBNA1。
12.根据权利要求1-3和5-9中任一项的方法，其中所述体细胞选自人成纤维细胞和血细胞。
13.根据权利要求12的方法，其中所述血细胞是外周血单核细胞。
14.改进iPS细胞建立效率的方法，其包括将以下(1)和(2)引入体细胞的步骤：(1)含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体，和(2)含有编码EBNA-1的核酸的质粒载体，其中所述(1)的附加型载体包含oriP和编码EBNA-1的核酸，并且其中所述(2)的质粒载体不具有在哺乳动物细胞中有功能的复制起点，
其中所述方法进一步包括引入以附加型载体形式的编码p53功能的抑制剂的核酸，
其中所述核重编程因子包括Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc和Lin28，和
其中所述体细胞/iPS细胞是人细胞。
15.用于产生iPS细胞的试剂盒，其包含以下(1)和(2)：
(1) 含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体；和
(2) 含有编码EBNA-1的核酸并且不含有编码核重编程因子的核酸的质粒载体，
其中所述(1)的附加型载体包含oriP和EBNA-1，并且其中所述(2)的质粒载体不具有在哺乳动物细胞中有功能的复制起点，
其中所述试剂盒进一步包括含有编码p53功能的抑制剂的核酸的附加型载体，
其中所述核重编程因子包括Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc和Lin28，和
其中所述iPS细胞是人细胞。
CN201380026797.6A 2012-05-23 2013-05-23 用于建立诱导性多能干细胞的高效方法 Active CN104471060B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261650694P 2012-05-23 2012-05-23
US61/650694 2012-05-23
PCT/JP2013/064409 WO2013176233A1 (ja) 2012-05-23 2013-05-23 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104471060A CN104471060A (zh) 2015-03-25
CN104471060B true CN104471060B (zh) 2021-11-05

Family

ID=49623914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380026797.6A Active CN104471060B (zh) 2012-05-23 2013-05-23 用于建立诱导性多能干细胞的高效方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10519425B2 (zh)
EP (1) EP2853592B1 (zh)
JP (1) JP6381442B2 (zh)
KR (1) KR102066761B1 (zh)
CN (1) CN104471060B (zh)
AU (1) AU2013264708B2 (zh)
CA (1) CA2874259C (zh)
ES (1) ES2725827T3 (zh)
HK (1) HK1208492A1 (zh)
SG (1) SG11201407917PA (zh)
WO (1) WO2013176233A1 (zh)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201608797WA (en) 2009-08-07 2016-12-29 Univ Kyoto Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
EP2853592B1 (en) 2012-05-23 2019-02-20 Kyoto University Highly efficient method for establishing artificial pluripotent stem cell
US10738323B2 (en) 2013-07-12 2020-08-11 Cedars-Sinai Medical Center Generation of induced pluripotent stem cells from normal human mammary epithelial cells
CN103923920B (zh) * 2014-04-04 2016-09-21 清华大学 一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法
WO2016008982A1 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Methods for generating induced pluripotent stem cells
CN108778299A (zh) * 2016-01-12 2018-11-09 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 生成无载体诱导多能干细胞的载体和方法
SG11201809279YA (en) 2016-04-22 2018-11-29 Univ Kyoto Method for producing dopamine-producing neural precursor cells
CN105861447B (zh) * 2016-06-13 2017-12-19 广州市搏克生物技术有限公司 一种非病毒iPSCs诱导组合物及其试剂盒
CN106086071B (zh) * 2016-06-13 2019-08-09 广州市搏克生物技术有限公司 一种非病毒iPSCs诱导方法及其诱导组合物、试剂盒及其获得的iPSCs
US11572545B2 (en) 2016-06-16 2023-02-07 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
US10221395B2 (en) 2016-06-16 2019-03-05 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
CN106244558B (zh) * 2016-08-31 2020-01-21 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种人单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的方法
JP2018082639A (ja) * 2016-11-21 2018-05-31 学校法人千葉工業大学 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法及び人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地
AU2018333503B2 (en) * 2017-09-13 2025-03-27 BioNTech SE RNA replicon for reprogramming somatic cells
BR112020007228A2 (pt) 2017-10-11 2020-10-13 Fate Therapeutics, Inc. reprogramação celular usando sistema de expressão de vetor plasmídeo temporal e transitório
EP3810638A1 (en) 2018-06-25 2021-04-28 Ospedale San Raffaele S.r.l. Gene therapy
EP3818158A1 (en) * 2018-07-02 2021-05-12 Shi-Lung Lin In-vitro induction of adult stem cell expansion and derivation
CN109913494A (zh) * 2019-02-12 2019-06-21 北京呈诺医学科技有限公司 一种新的ips细胞的诱导方法
WO2020213725A1 (ja) 2019-04-17 2020-10-22 学校法人慶應義塾 誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット
WO2020230138A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Aleph Farms Ltd. Pluripotent cell aggregates and use thereof
AU2021388074A1 (en) 2020-11-24 2023-06-22 Monash University Methods and cellular structures
CN114645023B (zh) * 2022-05-18 2022-09-20 上海爱萨尔生物科技有限公司 将外周血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的系统和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011032166A2 (en) * 2009-09-14 2011-03-17 The Johns Hopkins University Reprogramming blood cells to pluripotent and multipotent stem cells
WO2011119942A1 (en) * 2010-03-25 2011-09-29 Vistagen Therapeutics, Inc. Induction of ips cells using transient episomal vectors

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
EP2206778B1 (en) 2005-12-13 2018-08-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007080590A2 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Human embryonic stem cell-derived connective tissue progenitors for tissue engineering
EP3399025A1 (en) 2007-03-23 2018-11-07 Wisconsin Alumini Research Foundation Somatic cell reprogramming
US7972849B2 (en) 2007-05-17 2011-07-05 Oregon Health & Science University Primate pluripotent stem cells produced by somatic cell nuclear transfer
AU2008297024B2 (en) 2007-10-31 2014-08-28 Kyoto University Nuclear reprogramming method
WO2009075119A1 (ja) 2007-12-10 2009-06-18 Kyoto University 効率的な核初期化方法
WO2009115295A1 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Vectors and methods for generating vector-free induced pluripotent stem (ips) cells using site-specific recombination
CN101550406B (zh) 2008-04-03 2016-02-10 北京大学 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途
EP2297307B1 (en) * 2008-06-04 2016-06-01 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of ips cells using non-viral approach
SG10201402428WA (en) 2008-06-27 2014-07-30 Univ Kyoto Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
KR101685209B1 (ko) 2008-07-30 2016-12-09 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법
WO2010147612A1 (en) * 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
US20110003365A1 (en) 2009-05-29 2011-01-06 Kyoto University Method of preparing induced pluripotent stem cells deprived of reprogramming gene
SG10201608797WA (en) 2009-08-07 2016-12-29 Univ Kyoto Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US9719146B2 (en) * 2009-09-09 2017-08-01 General Electric Company Composition and method for imaging stem cells
SG183315A1 (en) * 2010-02-16 2012-09-27 Univ Kyoto Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
EP2601289B1 (en) * 2010-08-04 2017-07-12 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming immortalized b cells
WO2013022022A1 (ja) * 2011-08-08 2013-02-14 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
EP2853592B1 (en) 2012-05-23 2019-02-20 Kyoto University Highly efficient method for establishing artificial pluripotent stem cell

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011032166A2 (en) * 2009-09-14 2011-03-17 The Johns Hopkins University Reprogramming blood cells to pluripotent and multipotent stem cells
WO2011119942A1 (en) * 2010-03-25 2011-09-29 Vistagen Therapeutics, Inc. Induction of ips cells using transient episomal vectors

Also Published As

Publication number Publication date
US20150175973A1 (en) 2015-06-25
US10519425B2 (en) 2019-12-31
AU2013264708B2 (en) 2019-03-07
AU2013264708A1 (en) 2015-01-15
CA2874259C (en) 2021-02-09
EP2853592A1 (en) 2015-04-01
JPWO2013176233A1 (ja) 2016-01-14
EP2853592A4 (en) 2016-01-13
WO2013176233A1 (ja) 2013-11-28
CA2874259A1 (en) 2013-11-28
ES2725827T3 (es) 2019-09-27
EP2853592B1 (en) 2019-02-20
CN104471060A (zh) 2015-03-25
SG11201407917PA (en) 2015-01-29
HK1208492A1 (zh) 2016-03-04
KR102066761B1 (ko) 2020-01-15
KR20150014512A (ko) 2015-02-06
JP6381442B2 (ja) 2018-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104471060B (zh) 用于建立诱导性多能干细胞的高效方法
JP5827220B2 (ja) 人工多能性幹細胞の樹立効率改善方法
CN102782122B (zh) 有效建立经诱导的多能干细胞的方法
JP5346925B2 (ja) 核初期化方法
US9637732B2 (en) Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
JP5794588B2 (ja) 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
JP2011525793A (ja) 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
US9506039B2 (en) Efficient method for establishing induced pluripotent stem cells
JP5995237B2 (ja) 多能性幹細胞からの好酸球の製造方法
WO2013022022A1 (ja) 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
JP6385340B2 (ja) 巨核球の成熟化促進物質

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant