CN104422761A - 成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用 - Google Patents
成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂如试剂盒、细胞芯片中的应用。证实了RA患者血清中存在能与成纤维样滑膜细胞结合的特异性抗体。建立了以成纤维样滑膜细胞为底物抗原的间接免疫荧光方法和细胞芯片检测方法，对RA的诊断具有较高的敏感性和特异性，为RA的诊断提供了新的诊断试剂和方法。
Description
技术领域
本发明涉及类风湿关节炎诊断试剂技术，具体地说，是成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用，属于医学领域。
背景技术
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种系统性自身免疫性疾病，主要累及周围关节，表现为慢性、对称性、进行性关节炎。RA的病理改变最初表现为关节滑膜增生，并逐渐向软骨、骨及周围肌腱侵犯，最终导致关节破坏、关节畸形及功能丧失。RA多发于中年女性，患病率在我国为0.32%～0.36%，在欧美国家则高达1%。RA的病因目前尚不清楚，主要与感染因素、遗传因素及激素水平改变有关，其临床表现主要以关节症状为主，表现为晨僵、关节痛、关节肿胀及关节畸形。关节外表现主要包括类风湿结节、类风湿血管炎及肺损坏、肾脏损坏和心脏损坏。RA的诊断主要依据美国风湿病学会1987年RA分类标准：（1）晨僵持续1小时，病程至少6周；（2）有3个或3个以上的关节肿，至少6周；（3）腕、掌指、近端关节肿，至少6周；（4）对称性关节肿，至少6周；（5）有皮下结节；（6）手X线改变；（7）血清类风湿因子（RF）升高；满足4条或4条以上并排除其他关节炎即可诊断为RA。2012年最新的美国风湿病学会RA分类标准中添加了抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）作为RA诊断的检测指标。从上述RA诊断标准看，该疾病的诊断主要依靠临床表现结合放射性检查及实验室检测指标。在已知的RA相关的自身抗体当中，类风湿因子敏感性为60%～70%，特异性为86%；抗角蛋白抗体（AKA）敏感性为44%～73%，特异性为90%；抗核周因子抗体（APF）敏感性为48%～66%，特异性为92%；抗聚角蛋白微丝蛋白抗体（AFA）敏感性为47%～69%，特异性为93%；抗CCP抗体敏感性为47%～82%，特异性为96%。虽然这些RA实验室检测指标已经达到相当高的敏感性和特异性，但据统计，在RA当中仍有20%左右患者呈RF和CCP双阴性，所以，寻求敏感性和特异性更高的RA检测指标及方法，仍是该疾病临床研究的重点课题。
上述的自身抗体检测都是以特定蛋白或多肽为抗原底物，通过抗原抗体反应的原理设计检测血清中针对该蛋白或多肽的抗体。这些抗原底物的来源主要通过分离提纯、重组表达或体外化学合成（多肽）获得，通过上述方法获得的抗原底物与体内天然存在的抗原在理化性质、生物活性或空间构象上存在一定差异，应用这样得到的抗原底物对其血清抗体进行检测会不可避免的造成误差。为避免上述问题，研究者采用间接免疫荧光的方法对疾病进行定性诊断。该方法是将某种特定细胞为底物抗原固定在固相载体上，如载玻片，将待测血清与其反应，再通过带荧光的抗人IgG二抗与血清中能和细胞反应的抗体结合，从而在荧光显微镜下观察荧光强度来判断血清中含抗该细胞抗体多少，与标准阳性血清或阴性血清比较，从而判断待测血清的阴阳性。因为该方法操作简便，判断直观，在临床上得到广泛应用。
抗细胞抗体在临床上应用较多的有如下检测：（1）抗内皮细胞抗体检测是以人脐静脉内皮细胞为底物抗原，用于白色病（BD）的辅助诊断；其在BD中的敏感性为54.8%，特异性为87.2%；而在系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化症（SSc）及RA中阳性率分别为8%、9%及10%；（2）抗巨核细胞抗体检测是以人巨核细胞为底物抗原，主要用于SLE的辅助诊断；（3）抗人肾脏集合管细胞抗体检测主要用于肾脏疾病的辅助诊断；（4）抗壁细胞抗体检测主要用于恶性贫血的辅助诊断。
蛋白芯片具有高通量、平行检测、自动化等优点，为简便、快速、同时检测多种自身抗体问题的解决带来了希望，在临床疾病诊断等领域中发挥了重要的作用。既往的蛋白芯片在制备过程中所点的样都是特定的抗原（用其来检测特异性抗体），其来源大多数为通过基因工程方法重组表达而成。重组表达的蛋白抗原，无论是原核或真核表达，其蛋白产物在理化性质、生物学活性或免疫学性质上与天然存在的蛋白之间多少存在差异，这样会导致用该蛋白检测人体特异性抗体的时候产生误差。直接用原代培养的细胞作为底物，由于细胞中表达的蛋白与体内细胞比较相差最小，在针对检测该细胞蛋白抗体时比重组表达的蛋白更具优势。现有技术中尚无采用一定数量的成纤维样滑膜细胞点样来检测血清中相应抗体含量从而对RA进行实验室诊断的报道。
RA发病机制至今尚不明确，据研究报道可能参与RA疾病发生的细胞多达十余种。其中，目前得到公认的是CD4+T细胞，尤其是Th17细胞被认为在RA发病中起主要作用。而其他效应细胞，如成纤维样滑膜细胞、软骨细胞、肥大细胞、巨噬细胞等在RA发病机制中也扮演不同角色。然而就RA而言，现有技术中未公开哪种细胞蛋白能作为抗原底物通过检测患者血清中抗体达到辅助诊断的目的，且很多细胞参与RA疾病发生并非通过抗体发挥作用。已知的人体内细胞的种类不计其数，在RA中如何寻找一种细胞，针对其蛋白底物进行自身抗体检测以建立具有高度敏感性和特异性的辅助诊断方法仍是本领域的难点。
正常滑膜衬里层细胞包括巨噬细胞样滑膜细胞、成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synovial cells，简称FLS）和树突状滑膜细胞。在RA发病机制中，一致认为成纤维样滑膜细胞的过度增生和对软骨的破坏是造成关节病理改变的根本原因，它是参与RA滑膜炎症反应的效应细胞，但就成纤维样滑膜细胞在制备RA诊断试剂中的应用却未见报道，对于本领域技术人员来说，成纤维样滑膜细胞能用于诊断RA也是非显而易见的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。
本发明的再一的目的是，提供一种成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂盒中的应用。
本发明的另一的目的是，提供一种成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断细胞芯片中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。
所述的成纤维样滑膜细胞是体外培养的人成纤维样滑膜细胞。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂盒中的应用。
所述的诊断试剂盒中包括体外培养的人成纤维样滑膜细胞及间接免疫荧光检测法所用的其他试剂。
所述的间接免疫荧光检测法的步骤为：
（1）将体外培养的人成纤维样滑膜细胞固定；
（2）用含BSA的PBS封闭液封闭；
（3）取待测血清孵育固定的成纤维样滑膜细胞；
（4）Cy3标记的羊抗人IgG二抗孵育；
（5）DAPI溶液染核；
（6）荧光显微镜观察，类风湿关节炎患者血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均匀着色，其他患者及正常人血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均不着色。
所述的荧光显微镜观察条件为：使用铬滤光片，激发波长554nm，发射波长570nm。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断细胞芯片中的应用。
所述的细胞芯片中固定有体外培养的人成纤维样滑膜细胞。
所述的细胞芯片的制备方法为：
（1）应用点样仪软件设计矩阵，确定点间距、点样顺序、点样坐标，每个样本设置3个复孔；
（2）选择经预处理的玻片作为基片，将浓度为1×103/mL的成纤维样滑膜细胞悬液应用点样仪加到基片中，干燥过夜；
（3）将点样后的基片放置到湿盒中，37℃恒温水浴固定2小时；
（4）封闭并洗涤基片，置于4℃保存备用。
所述的细胞芯片的使用方法为：取待测血清加入细胞芯片矩阵反应，经过洗涤，然后与Cy3标记的抗人IgG二抗反应，再次洗涤后，用激光共聚焦扫描仪进行扫描荧光强度，最后根据标准曲线用Quant Anlysis分析待测血清中抗成纤维样滑膜细胞抗体浓度，再与cutoff值比较，判断待测血清是否为阳性。
本发明优点在于：
本发明提供了成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂如试剂盒、细胞芯片中的应用；证实了RA患者血清中存在能特异性与成纤维样滑膜细胞结合的抗体；建立了以成纤维样滑膜细胞为底物抗原的间接免疫荧光方法和细胞芯片检测方法，具备高通量、自动化操作的特点，对RA的诊断具有较高的敏感性和特异性，为RA的诊断提供了新的诊断试剂和方法。
附图说明
附图1是用特异性标记CD55鉴定原代培养的成纤维样滑膜细胞，图A为CD55染色，表现为细胞浆着色；图B为DAPI染色显示细胞核；图C为A+B叠加后的图片，同时显示细胞核和CD55显色。
附图2是不同患者及正常人血清与成纤维样滑膜细胞蛋白Western-Blot图，分别是RA患者血清（RA1-RA8）、SLE患者血清（SLE1-SLE2）、OA患者血清（OA1-OA2）及正常人血清（NC1-NC4）。
附图3是RA患者、SLE患者、OA患者及正常人血清孵育成纤维样滑膜细胞间接免疫荧光图。
附图4是人IgG标准品浓度与荧光强度之间的线性关系。
附图5是用特异性标记CII鉴定原代培养的软骨细胞，图A为CII染色，表现为细胞胞浆着色；图B为DAPI染色显示细胞核；图C为A+B叠加后的图片，同时显示细胞核和CII显色。
附图6是RA患者及正常人血清与软骨细胞蛋白的Western-Blot图，A图表示RA患者血清，B图表示正常人血清。
附图7是RA患者血清和正常人血清孵育的软骨细胞胞浆着色情况，A图表示RA患者血清，B图表示正常人血清。
附图8是RA患者及正常人血清与Th17细胞蛋白的Western-Blot图，A图表示RA患者血清，B图表示正常人血清。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、人成纤维样滑膜细胞的分离鉴定及原代培养
1、滑膜来源
滑膜取自膝关节置换或滑膜切除术的RA患者，患者诊断符合1987年美国风湿病学会分类标准。
2、滑膜细胞分离培养
将术中取得的滑膜组织用无菌剪剪碎，用1.0 mg/mLⅠ型胶原酶（GIBCO）在37℃下消化4h，离心收集细胞，加入含有20%胎牛血清的DMEM培养液（GIBCO），置于37℃、5%CO2孵箱中贴壁生长。细胞生长到80%培养瓶底部时，用0.25%胰酶（Sigma）进行消化，小牛血清终止，0.01M PBS洗涤离心，收集细胞，传代培养。经传代以后滑膜细胞迅速增殖，1代以后成纤维样滑膜细胞比例逐渐增加，至第3代可占视野内细胞95%以上（张鹏，石关桐.膝骨关节炎滑膜细胞体外培养及生物学特性观察.中国骨伤，2006，19（11）：656-658）。本实验均采用第3代成纤维样滑膜细胞。
3、成纤维样滑膜细胞的鉴定
培养皿吸去上清，用甲醇在－20℃下固定10分钟。用0.01M PBS洗涤3次，羊血清封闭30分钟，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。用成纤维样滑膜细胞特异性标记CD55（M D Smith, E Barg, H Weedon. Microarchitecture and protective mechanisms in synovial tissue from clinically and arthroscopically normal knee joints. Ann Rheum Dis 2003, 62: 303-307）单克隆抗体（Abcam）按照1:1000稀释后室温孵育1小时，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。用Cy3标记的抗小鼠IgG二抗按照1:2000稀释，室温孵育30分钟，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。最后用1:10000稀释的DAPI染细胞核，洗涤完成后加入防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察。结果见图1，结果证实从滑膜分离培养后获得的细胞为成纤维样滑膜细胞。
二、证实人血清中存在抗成纤维样滑膜细胞抗体
1、成纤维样滑膜细胞蛋白提取
（1）倒掉培养液，培养瓶倾斜放置1～2分钟，残余培养液用移液管吸走。
（2）每瓶细胞加3mL 4℃预冷的0.01M PBS。平放轻轻摇动1分钟以洗涤细胞，然后弃去洗液。共洗细胞三次，将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）每瓶细胞中加入200uL Pierce裂解液（预先加入蛋白酶抑制剂PMSF），静置20分钟；在10000g、4℃下离心20分钟，保留上清。将离心后的上清测定浓度后，分装，放于－80℃保存。
2、上样及电泳
（1）在成纤维样滑膜细胞蛋白样品中加入2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后100℃沸水浴加热35分钟，使蛋白充分变性。
（2）变性后的蛋白冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，使用Bio-Rad的电泳装置，恒压设置100V，溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。
3、转膜
采用PVDF膜，将PVDF膜分别浸于甲醇15秒、纯水3分钟、转移缓冲液15分钟预处理；凝胶浸泡于电泳缓冲液5分钟；在Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300mA，转膜时间为60分钟。转完膜后，用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，同时通过其显示条带将每份蛋白样品剪开，以便于孵育不同血清。
4、封闭
转膜完毕后，用洗涤液将膜洗3次，每次3分钟；洗涤完成后将膜加入脱脂奶粉配成的封闭液中，4℃封闭过夜。
5、血清孵育
RA患者、骨关节炎（osteoarthritis，简称OA）患者、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，简称SLE）患者及正常人（NC）的血清按照1:200浓度稀释后加入到湿转后的PVDF膜，室温，在水平摇床上轻微震荡孵育1小时。孵育结束后，用洗涤液洗涤6次，每次10分钟，以减轻背景。
6、二抗孵育
采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG二抗，按照1:10000浓度稀释后，室温，在水平摇床上轻微震荡孵育30分钟。孵育结束后，用洗涤液洗涤6次，每次10分钟，以减轻背景。
7、化学发光及X片显影
在PVDF膜上加入化学发光底物（Thermo）后在暗盒中进行曝光，在自行配制的显影液和定影液进行手工洗片。结果见图2，与RA患者血清孵育的PVDF膜上能显示多条反应条带，而与SLE、OA及正常人（NC）血清孵育的PVDF膜上在相同条件下不能显示相应条带，该结果说明RA患者血清中存在能特异性与成纤维样滑膜细胞蛋白反应的抗体。
三、抗成纤维样滑膜细胞抗体检测方法的建立——间接免疫荧光法
1、成纤维样滑膜细胞的固定
将获得的第3代成纤维样滑膜细胞在胰酶消化后，制得单细胞悬液，铺于96孔板上，每孔100uL，37℃培养过夜，吸去培养液，经过PBS洗涤3次后，每孔加入95%乙醇（或甲醇、5%冰醋酸）200uL，4℃固定20分钟。固定后的细胞去掉固定液后再经PBS洗涤3次后，拍干，置于－20℃保存备用。
2、封闭
每孔用含3% BSA的0.01M PBS封闭液100uL在室温下，封闭1小时。完成后，弃去封闭液，洗涤液漂洗3次，每次5分钟。
3、血清孵育
分别取RA患者、SLE患者、OA患者及正常人血清按照1:100倍稀释，在固定了成纤维样滑膜细胞的96孔板中，每孔加入上述稀释后血清100uL，室温孵育1小时。孵育完成后，吸去血清，拍干，洗涤液洗涤6次，每次3分钟。
4、Cy3标记的羊抗人IgG二抗孵育
每孔加入100uL，1:1000稀释浓度的Cy3标记的羊抗人IgG，室温孵育30分钟。完成后，弃去封闭液，洗涤液漂洗6次，每次5分钟。
5、染核
将1:10000稀释的DAPI溶液100uL加入各孔中，常温反应30分钟。反应结束后用洗涤液漂洗3次，每次5分钟。加盖盖玻片封片后荧光显微镜下观察。
6、荧光显微镜观察
使用铬滤光片，激发波长554nm、发射波长570nm条件下观察Cy3荧光强度。结果见图3，用RA患者血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均匀着色（红色），而用SLE患者、OA患者及正常人血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均不着色。
四、抗成纤维样滑膜细胞抗体细胞芯片检测方法的建立
1、细胞芯片的制备
（1）矩阵设计：
应用点样仪ProSys 5510软件设计矩阵，确定点间距，点样顺序，点样坐标等指标，每个样本设置3个复孔。
（2）点样：
选择经预处理的玻片作为基片，将浓度为1×103/mL的成纤维样滑膜细胞悬液应用点样仪加到基片中，干燥过夜。
（3）固定：
将点样后的基片放置到湿盒中，37℃恒温水浴固定2小时。
（4）封闭：
采用1%BSA溶液，每矩阵加入50uL，放置到湿盒中，37℃恒温水浴封闭半小时；0.1%TBST洗涤3次，每次15分钟；封闭洗涤后的基片置于4℃保存备用。
2、标准曲线的建立
（1）标准品点样：按照50ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL五个浓度梯度的纯化人IgG加入到矩阵相应位置；37℃反应30分钟；
（2）洗涤：PBST洗涤3次，每次10分钟；
（3）荧光二抗：选择浓度为0.2ng/mL Cy3标记的抗人IgG二抗，37℃反应30分钟；
（4）洗涤：PBST洗涤3次，每次10分钟；
（5）扫描及绘制标准曲线：应用美国 Innopsys公司Innoscan 710 激光共聚焦扫描仪进行扫描，将扫描后得到的结果经Quant Anlysis分析各个标准品荧光强度，输入Excel软件，进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见图4，线性方程为y=1.692x+11.804，R2=0.9925。
3、待测血清抗成纤维样滑膜细胞抗体浓度检测
（1）待测血清用1:200稀释后，每份血清50uL加入矩阵，37℃反应30分钟；
（2）洗涤：PBST洗涤3次，每次10分钟；
（3）荧光二抗：选择浓度为0.2ng/mL Cy3标记的抗人IgG二抗，37℃反应30分钟；
（4）洗涤：PBST洗涤3次，每次10分钟；
（5）扫描及根据标准曲线计算待测样本抗体含量：应用美国 Innopsys公司Innoscan 710激光共聚焦扫描仪进行扫描，将扫描后得到的结果经Quant Anlysis分析各个待测血清样本荧光强度，根据标准曲线计算待测血清样本中抗体的含量。24例RA患者（RA1-RA24）及24例正常人（NC1-NC24）血清荧光强度检测结果见表1，按照图4得到的标准曲线公式进行计算，定量得到待测血清抗成纤维样滑膜细胞抗体浓度，结果见表2。
表1 RA患者及正常人血清荧光强度
表2 血清样本中抗成纤维样滑膜细胞抗体浓度
五、抗成纤维样滑膜细胞抗体检测在RA诊断中的价值评价
1、应用间接免疫荧光检测抗成纤维样滑膜细胞抗体对RA进行定性诊断
（1）基本原理：采用阳性血清与阴性血清与待测血清共同孵育的方法，待测血清荧光强度与二者进行比较，大于或等于阳性血清的即为阳性，小于或等于阴性血清的即为阴性。
（2）阳性血清及阴性血清的界定：在固定好成纤维样滑膜细胞的96孔板中，应用48个诊断明确的RA患者（RA1-RA48）血清及48个正常人（NC1-NC48）血清，按照间接免疫荧光法，与固定在96孔板中的成纤维样滑膜细胞反应，结果在荧光显微镜下观察，每个孔所得到的荧光强度结果如表3所示。通过受试者工作曲线（ROC）确定血清荧光强度cutoff值，如表4所示，在此基础上，选择荧光强度稍高于cutoff值血清为阳性血清，即21号RA血清（荧光强度4.9），即待测血清荧光强度高于该血清荧光强度则为阳性；选择荧光强度稍低于cutoff值血清为阴性血清，即14号NC血清（荧光强度4.88），即待测血清荧光强度低于该血清荧光强度则为阴性。
表3 RA患者及正常人血清荧光强度
表4 间接免疫荧光检测荧光强度ROC曲线分析
（3）定性方法在RA诊断中的敏感性及特异性：
根据表4的结果，通过荧光强度的区别，敏感性为79.17%，特异性为97.92%，其敏感性和特异性均高于RF（文献报道RF敏感性、特异性分别为70%及86%左右），而特异性高于CCP（文献报道CCP为96%左右），敏感性与CCP相当（文献报道CCP为80%左右）。
2、应用细胞芯片检测抗成纤维样滑膜细胞抗体对RA进行定量诊断
（1）基本原理：按照前述细胞芯片检测方法，通过抗人IgG标准品得到的标准曲线、待测血清荧光强度，经过计算获得血清中抗体浓度，从而实现待测血清中抗体浓度的定量检测。同时经过ROC曲线分析，获得cutoff值，从而实现对RA的定量诊断，即待测血清抗体浓度高于cutoff值视为阳性，低于cutoff值视为阴性。
（2）阳性判断Cutoff值的设定：将表2的结果应用ROC曲线进行分析，将获得敏感性%+特异性%之和最大时的抗体浓度设定为阳性cutoff值，结果见表5。
表5 细胞芯片检测抗体浓度ROC曲线分析
（3）定量方法在RA诊断中的敏感性及特异性：
根据表5的结果，抗成纤维样滑膜细胞抗体检测敏感性为87.5%，特异性为95.83%，其敏感性和特异性均高于RF及CCP（文献报道RF敏感性特异性分别为70%及86%左右，CCP敏感性、特异性分别为80%及95%左右）。
综上所述，成纤维样滑膜细胞能作为类风湿关节炎的诊断试剂，在RA的诊断中具有较高的敏感性和特异性。
实施例2 应用软骨细胞作为抗原底物不适合用于RA临床辅助诊断
1、RA软骨细胞的分离培养
（1）取材：取行膝关节置换术的RA患者关节软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中；
（2）将软骨组织剪碎成0.5～0.8mm的细块，用含有青霉素和链霉素的PBS溶液冲洗；
（3）0.25%胰蛋白酶在37℃消化2小时后终止；
（4）0.02%II型胶原酶在37℃消化过夜；
（5）在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化；
（6）将细胞团吹打成单个细胞后用200目滤网过滤，收集滤液，1500r/min离心5min；
（7）弃上清，加入培养液重悬细胞，0.2%台盼蓝染色，活细胞率大于90%，CO2培养箱孵育。
2、软骨细胞鉴定
采用软骨细胞标志物II型胶原（CII）抗体对原代培养的软骨细胞进行染色以确定细胞种类。
培养皿吸去上清，用甲醇在－20℃下固定10分钟。用0.01M PBS洗涤3次，羊血清封闭30分钟，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。用软骨细胞特异性标记CII单克隆抗体（Abcam）按照1:1000稀释后室温孵育1小时，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。用Cy3标记的羊抗小鼠IgG二抗按照1:2000稀释，室温孵育30分钟，0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。最后用1:10000稀释的DAPI染细胞核，洗涤完成后加入防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察，CII主要分布在软骨细胞胞浆，证实原代培养的细胞为软骨细胞，结果见图5。
3、Western-blot的方法检测RA患者及正常人血清中抗软骨细胞抗体
（1）软骨细胞蛋白提取：
A、倒掉培养液，培养瓶倾斜放置1～2分钟，残余培养液用移液管吸走。
B、每瓶细胞加3mL 4℃预冷的0.01M PBS；平放轻轻摇动1分钟以洗涤细胞，然后弃去洗液；共洗细胞三次，将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
C、每瓶细胞中加入200uL Pierce裂解液（预先加入蛋白酶抑制剂PMSF），静置20分钟；在10000g、4℃下离心20分钟，保留上清；将离心后的上清测定浓度后，分装，放于－80℃保存。
（2）上样及电泳：
A、在软骨细胞蛋白样品中加入2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后100℃沸水浴加热35分钟，使蛋白充分变性。
B、变性后的蛋白冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，使用Bio-Rad的电泳装置，恒压设置100V，溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。
（3）转膜：
采用PVDF膜，将PVDF膜分别浸于甲醇15秒、纯水3分钟、转移缓冲液15分钟预处理；凝胶浸泡于电泳缓冲液5分钟；在Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300mA，转膜时间为60分钟。转完膜后，用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，同时通过其显示条带将每份蛋白样品剪开，以便于孵育不同血清。
（4）封闭：
转膜完毕后，用洗涤液将膜洗3次，每次3分钟；洗涤完成后将膜加入脱脂奶粉配成的封闭液中，4℃封闭过夜。
（5）血清孵育：
RA患者及正常人血清按照1:200浓度稀释后加入到湿转后的PVDF膜，室温，在水平摇床上轻微震荡孵育1小时。孵育结束后，用洗涤液洗涤6次，每次10分钟，以减轻背景。
（6）二抗孵育：
采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG二抗，按照1:10000浓度稀释后，室温，在水平摇床上轻微震荡孵育30分钟；孵育结束后，用洗涤液洗涤6次，每次10分钟，以减轻背景。
（7）化学发光及X片显影：
在PVDF膜上加入化学发光底物（Thermo）后在暗盒中进行曝光，在自行配制的显影液和定影液进行手工洗片。结果见图6，与RA患者及正常人血清孵育的PVDF膜上均能显示多条反应条带，该结果说明除RA患者血清外，正常人血清中也存在能同软骨细胞蛋白反应的抗体，所以抗软骨细胞抗体不是特异性地存在于RA患者血清中。
4、间接免疫荧光的方法检测RA患者及正常人血清中抗软骨细胞抗体
（1）软骨细胞的固定：
将获得的软骨细胞在胰酶消化后，制得单细胞悬液，铺于96孔板上，每孔100uL，37℃培养过夜，吸去培养液，经过PBS洗涤3次后，每孔加入95%乙醇（或甲醇、5%冰醋酸）200uL，4℃固定20分钟。固定后的细胞去掉固定液后再经PBS洗涤3次后，拍干，置于－20℃保存备用。
（2）封闭：
每孔用含3% BSA的0.01M PBS封闭液100uL在室温下，封闭1小时。完成后，弃去封闭液，洗涤液漂洗3次，每次5分钟。
（3）血清孵育：
分别取RA患者及正常人血清按照1:100倍稀释，在固定了软骨细胞的96孔板中，每孔加入上述稀释后血清100uL，室温孵育1小时。孵育完成后，吸去血清，拍干，洗涤液洗涤6次，每次3分钟。
（4）Cy3标记的羊抗人IgG二抗孵育：
每孔加入100uL，1:1000稀释浓度的Cy3标记的羊抗人IgG，室温孵育30分钟。完成后，弃去封闭液，洗涤液漂洗6次，每次5分钟。
（5）染核：
含1:10000稀释的DAPI溶液100uL加入各孔中，常温反应30分钟。反应结束后用洗涤液漂洗3次，每次5分钟。加盖盖玻片封片后荧光显微镜下观察。
（6）荧光显微镜观察：
使用铬滤光片，激发波长554nm，发射波长570nm条件下观察Cy3荧光强度，结果见图7。实验结果表明，分别有约40%、30%的RA患者血清和正常人血清孵育的软骨细胞胞浆均匀着色（绿色），约60%及70%的RA患者血清及正常人血清不与软骨细胞反应（软骨细胞胞浆不着色）。该结果进一步证实抗软骨细胞抗体不是特异性地存在于RA患者血清中，因而软骨细胞不适合作为细胞底物用于RA的辅助诊断。
实施例3 应用Th17阳性细胞作为抗原底物不适合用于RA临床辅助诊断
1、RA患者外周血中Th17细胞的磁珠分选
（1）采用梯度离心的方法从RA外周血中分离得到单个核细胞（PBMC）。
（2）选用德国美天妮的Th17细胞阳性分选柱按照说明书对RA外周血中的PBMC进行分选，得到Th17阳性细胞。
2、Th17细胞蛋白总蛋白提取
加入防蛋白降解的蛋白酶抑制剂，通过超声裂解的方法破碎细胞，得到细胞总蛋白。
3、Western-blot的方法检测RA患者及正常人血清中抗Th17细胞抗体
该部分方法与实施例2中用Western-blot方法检测血清中抗软骨细胞抗体相同。经过上述实验，在RA患者及正常人血清孵育的PVDF膜上均未发现反应条带，请参见图8，该结果说明无论是正常人血清或RA患者血清中均不存在抗Th17细胞蛋白的抗体，所以Th17细胞不适合用于RA的辅助诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的成纤维样滑膜细胞是体外培养的人成纤维样滑膜细胞。
3.成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂盒中包括体外培养的人成纤维样滑膜细胞及间接免疫荧光检测法所用的其他试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的间接免疫荧光检测法的步骤为：
（1）将体外培养的人成纤维样滑膜细胞固定；
（2）用含BSA的PBS封闭液封闭；
（3）取待测血清孵育固定的成纤维样滑膜细胞；
（4）Cy3标记的羊抗人IgG二抗孵育；
（5）DAPI溶液染核；
（6）荧光显微镜观察，类风湿关节炎患者血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均匀着色，其他患者及正常人血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均不着色。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的荧光显微镜观察条件为：使用铬滤光片，激发波长554nm，发射波长570nm。
7.成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断细胞芯片中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的细胞芯片中固定有体外培养的人成纤维样滑膜细胞。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的细胞芯片的制备方法为：
（1）应用点样仪软件设计矩阵，确定点间距、点样顺序、点样坐标，每个样本设置3个复孔；
（2）选择经预处理的玻片作为基片，将浓度为1×103/mL的成纤维样滑膜细胞悬液应用点样仪加到基片中，干燥过夜；
（3）将点样后的基片放置到湿盒中，37℃恒温水浴固定2小时；
（4）封闭并洗涤基片，置于4℃保存备用。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的细胞芯片的使用方法为：取待测血清加入细胞芯片矩阵反应，经过洗涤，然后与Cy3标记的抗人IgG二抗反应，再次洗涤后，用激光共聚焦扫描仪进行扫描荧光强度，最后根据标准曲线用Quant Anlysis分析待测血清中抗成纤维样滑膜细胞抗体浓度，再与cutoff值比较，判断待测血清是否为阳性。
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