CN104411834A - 子宫内膜异位的判定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p和hsa-miR-518d-3p中的1种以上的miRNA的浓度的、以上述miRNA的扩增引物为主要成分的子宫内膜异位诊断药。本发明还提供包括测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p和hsa-miR-518d-3p中的1种以上的miRNA的浓度的工序的子宫内膜异位的检测方法。本发明的子宫内膜异位诊断药及使用其的诊断方法简便、侵袭性低、且灵敏度和特异性高。

Description

子宫内膜异位的判定方法

交叉申请

本申请基于日本专利申请2012-124595(2012年5月31日申请)主张优先权，其内容作为参照组合入本说明书中。

技术领域

本发明涉及新型的子宫内膜异位诊断标记物及利用该标记物的子宫内膜异位的诊断。

背景技术

子宫内膜异位目前通过经阴道超声波造影及磁共振造影法诊断，其确诊通过腹腔镜检查进行。另外，作为子宫内膜异位诊断标记物，已知有CA125等血中蛋白标记物。

除CA125以外，还研究了作为血清CA19-9的诊断标记物的有用性(FERTILITY AND STERILITY 78(2002)733-739：非专利文献1)。另外，也提出了将各种炎症标记物与CA-125(均为蛋白标记物)组合的诊断方法(FERTILITY AND STERILITY 89(2008)1073-1081：非专利文献2)。

另外，报告了子宫内膜异位患者的子宫内膜中的miRNA表达解析(MolEndocrinol 25(2011)821-832：非专利文献3)。在该文献中，在患者的子宫内膜组织中，显示10种miRNA表达增强、12种miRNA表达减少。但是，对于这些miRNA在血中的表达没有任何提及。

miRNA(Micro RNA，微RNA)是指在机体中内源性存在的、19～23个碱基的单链RNA分子。目前为止鉴定了700种以上的人类miRNA，已知靶标基因的mRNA(信使RNA)依赖于序列发挥作用，具有控制基因表达的功能，但其详细的作用机理及其生理学的作用尚未很好地解明。

本说明书中引用的参考文献如下。这些文献所记载的内容全部组合入本说明书中作为参照。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：FERTILITY AND STERILITY 78(2002)733-739

非专利文献2：FERTILITY AND STERILITY 89(2008)1073-1081

非专利文献3：Mol Endocrinol 25(2011)821-832

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供比现有的方法更简便、侵袭性低、且灵敏度及特异性高的来自血液的试样中的子宫内膜异位诊断标记物。另外，本发明的目的在于提供容易组合多种标记物进行测定的来自血液的试样中的子宫内膜异位诊断标记物、以及使用其的诊断方法。

解决问题的方法

本发明人等在研究来自子宫内膜异位患者血液的试样中的约600种miRNA的表达时发现：hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p的3种miRNA的表达增强。基于该表达，本发明人等进一步反复研究，完成了本发明。

即本发明提供：

[1]一种子宫内膜异位诊断药，其用于测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA的浓度，且以该miRNA的扩增引物为主要成分；

[2]包含[1]的诊断药的子宫内膜异位诊断试剂盒；

[3]根据[1]所述的子宫内膜异位诊断药，其中，miRNA为hsa-miR-708；

[4]根据[1]所述的子宫内膜异位诊断药，其中，miRNA为hsa-miR-127-3p；

[5]根据[1]所述的子宫内膜异位诊断药，其中，miRNA为hsa-miR-518d-3p；

[6]根据[1]和[3]至[5]中任一项所述的子宫内膜异位诊断药，其中，来自血液的试样为血浆；

[7]一种子宫内膜异位的检测方法，其包括：测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA的浓度的工序；

[8]根据[7]所述的方法，其包括：将上述miRNA的浓度与正常对照中的上述miRNA的浓度比较，确定上述miRNA的浓度是否为高值的工序；

[9]根据[7]或[8]中任一项所述的方法，其包括：确定上述miRNA的浓度是否为临界(cut off)值以上的工序；

[10]根据[7]至[9]中任一项所述的方法，其中，miRNA为hsa-miR-708；

[11]根据[7]至[9]中任一项所述的方法，其中，miRNA为hsa-miR-127-3p；

[12]根据[7]至[9]中任一项所述的方法，其中，miRNA为hsa-miR-518d-3p；

[13]根据[7]至[12]中任一项所述的方法，其中，来自血液的试样为血浆；

[14]一种诊断受检者的子宫内膜异位的方法，其包括：测定来自受检者的血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA的浓度的工序；

[15]根据[14]所述的方法，其包括：将上述miRNA的浓度与正常对照中的上述miRNA的浓度比较，确定上述miRNA的浓度是否为高值的工序；

[16]根据[14]或[15]所述的方法，其包括：确定上述miRNA的浓度是否为临界值以上的工序。

发明的效果

本发明的子宫内膜异位诊断药及诊断方法比现有的方法(经阴道超声波造影、磁共振造影法、腹腔镜、血中蛋白标记物等)更为简便，侵袭性低，灵敏度及特异性高。另外，本发明的子宫内膜异位诊断药及诊断方法中，容易组合多种标记物进行测定，通过组合多种标记物，能够灵敏度良好、特异性地诊断子宫内膜异位。

附图说明

图1表示患者及对照的2组间的hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p的三种miRNA的表达分布。

图2表示通过ROC解析进行的单独miRNA的子宫内膜异位检测能力的评价。各纵轴表示灵敏度，横轴表示假阳性率(1-Specificity(1-特异性))。

图3表示使用利用多种miRNA的预测模型时的检测能力的评价。

发明的具体实施方式

本发明提供，用于测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA(本说明书中，有时称为“本发明的miRNA”)的浓度，且以上述miRNA的扩增引物为主要成分的子宫内膜异位诊断药(本说明书中，有时称为“本发明的诊断药”)。

本说明书中，受检者是指患有或者疑似患有子宫内膜异位的人。在来自受检者的血液的试样中包含全血、血清及血浆。该试样优选为血清或血浆，更加优选为血浆。此外，通常认为血清miRNA浓度与血浆miRNA浓度相关(例如、参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105(2008)10513-10518)。

本发明中，在来自子宫内膜异位患者的血液的试样中被发现表达增强的miRNA为hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p的3种。这些miRNA的碱基序列如下所述，也可以参照miRBase(http://www.mirbase.org/index.shtml)。

hsa-miR-708(aaggagcuuacaaucuagcuggg)序列编号1

hsa-miR-127-3p(ucggauccgucugagcuuggcu)序列编号2

hsa-miR-518d-3p(caaagcgcuucccuuuggagc)序列编号3

本发明的子宫内膜异位诊断药以能够扩增这3种miRNA中的1种或其以上的miRNA的引物(本说明书中，有时称为“本发明的扩增引物”。)作为主要成分。使用这些扩增引物，将本发明的miRNA以聚合酶链式反应(PCR)等进行扩增，由此能够测定来自血液的试样中的本发明的miRNA的浓度，能够进行子宫内膜异位的简便且迅速的检查。

本发明的扩增引物为单链的寡核苷酸，优选为DNA。扩增引物有正向引物和反向引物，将这两种组合使用。典型而言，正向引物具有与miRNA序列的中间核酸的5’侧的6～10个碱基相同的序列(其中，在引物为DNA时，代替U而具有T)，反向引物具有与miRNA序列的中间核酸的3’侧的6～10个碱基的序列互补的序列。

任意地，引物在与其伸长方向的相反侧，也可以具有对于扩增产物的识别、纯化、亚克隆等有用的添加的序列(例如编码His-tag的序列或限制酶识别部位)。这样的添加的序列优选为1～15碱基的长度。各扩增引物的序列选定为各引物的特异性高，在分子内不形成二级结构，引物彼此不杂交。各扩增引物的长度优选为12～30个核苷酸，更优选为15～25个核苷酸。

进而，为了使PCR产物的定量容易，优选正向引物及反向引物的一方或两方被荧光标识。作为荧光标识，可以列举荧光色素、消光物质、供体色素、受体色素。

本发明的扩增引物能够使用通用的DNA合成装置(例如、AppliedBiosystems公司制Model 394)化学地合成，但也可以使用在该技术领域中所公知的其他方法合成。

在另一个观点中，本发明提供子宫内膜异位诊断试剂盒。试剂盒除本发明的诊断药之外，还可以包括用于对试样进行前处理的试剂、PCR用的试剂及酶、缓冲液、容器以及使用的指南等。

从又一个观点中，本发明提供包括测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA的浓度的工序的子宫内膜异位的检测方法(本说明书中，有时称为“本发明的方法”。)。

为了测定试样中的miRNA的浓度，从试样中提取RNA制备模板cDNA，将其作为模板使用本发明的扩增引物进行PCR，由此使试样中所含的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA扩增。

从试样中提取RNA的方法在该技术领域中是熟知的，例如可以使用胍-异硫氰酸酯及苯酚-氯仿提取。或者也可以使用市售的RNA提取试剂。然后，可以将所得到的总RNA进行尺寸分级，得到miRNA。例如，能够使用TrizolLS reagent(Life Technologies Inc.)从试样中提取RNA，使用mirVana miRNAisolation kit(Life Technologies Inc.)的过滤管(Filter cartridge)，分离制备RNA组分。

以RNA作为模板合成cDNA的方法在该技术领域也是熟知的。作为引物，能够使用市售的随机引物或茎环逆转录引物(Stem-loop reversetranscription primers)，在dNTPs的存在下使用逆转录酶合成cDNA。

接着，将这样制备的DNA或cDNA作为模板，使用本发明的扩增引物进行PCR。优选使用实时PCR扩增法，对miRNA进行定量。特别地，在优选方式中，能够利用使用TaqMan(商品名)探针的定量RT-PCR，测定来自血液的试样中的miRNA的浓度。

在miRNA的浓度的测定中，为了校正测定值的偏差，优选包含适当的内部标准。作为内部标准，可以列举例如已知表达量没有变动的miRNA、snRNA或mRNA，具体而言，可以列举β-肌动蛋白、甘油醛β-磷酸脱氢酶、及核糖体蛋白质P1。另外在同时测定大量(例如200以上)的miRNA的情况下，能够使用这些全部的表达量的中间值作为内部标准。

本发明的miRNA的浓度可以使用将具有与hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p或hsa-miR-518d-3p的一部分相同或互补的序列的探针固定化得到的微阵列，利用杂交法进行测定。此外，也可以使用新一代测序法(next-generation sequencing)，直接测定miRNA的浓度。

将这样得到的来自受检者的血液的试样中的本发明的miRNA的浓度，与正常对照中的本发明的miRNA的浓度比较，确定是否为高值。在受检者的上述试样中的本发明的miRNA的浓度与正常对照比较为高值的情况下，判定该受检者患有子宫内膜异位或者疑似患有子宫内膜异位。“正常对照”是指来自被诊断为没有患子宫内膜异位的人的血液的试样。优选预先测定多个正常对照中的各miRNA的浓度，预先求出对照组平均表达量。

在优选方式中，本发明的方法包括确定使用来自受检者血液的试样中的miRNA的浓度构建的预测模型函数是否为临界值以上的工序。临界值是指以判定、诊断疾病为目的设定的值，本发明中的临界值是指，为了知道是否疑似患有子宫内膜异位而设定的、使用来自受检者的血液的试样中的本发明的miRNA的浓度构建的预测模型函数的值。受检者的上述试样中的本发明的miRNA的浓度为临界值以上的情况下，受检者就被判定为患有子宫内膜异位或者疑似患有子宫内膜异位。关于该临界值的设定方法虽然没有特别规定，但能够使用逻辑(Logistic)回归分析构建取0到1之间的值的预测模型函数，通过进行关于规定的受检者组和对照组的集团的ROC曲线分析而求得。

在特定的方式中，作为临界值能够使用如下的值：

作为上述试样中的miRNA使用has-miR-708、has-miR-127-3p和has-miR-518d-3p三种miRNA的情况下，作为其临界值，能够使用0.1以上且0.9以下、优选0.31以上且0.68以下、更优选0.40以上且0.59以下的值。

作为上述试样中的miRNA使用has-miR-708和has-miR-518d-3p两种miRNA的情况下，作为其临界值，能够使用0.1以上且0.9以下、优选0.34以上且0.66以下、更优选0.38以上且0.54以下的值。

作为上述试样中的miRNA使用has-miR-708的情况下，作为其临界值，能够使用0.1以上且0.9以下、优选0.42以上且0.60以下、更优选0.46以上且0.58以下的值。

作为上述试样中的miRNA使用has-miR-127-3p的情况下，作为其临界值，能够使用0.1以上且0.9以下、优选0.44以上且0.55以下、更优选0.49以上且0.55以下的值。

作为上述试样中的miRNA使用has-miR-518d-3p的情况下，作为其临界值，能够使用0.1以上且0.9以下、优选0.44以上且0.56以下、更优选0.47以上且0.53以下的值。

另外，本发明的方法也能够通过测定来自从1位受检者在某一时刻仅1次分离的血液的试样中的本发明的miRNA的浓度而进行，但由于本发明的miRNA的浓度伴随从子宫内膜异位发病的时间的增长而增大，所以也能够通过测定从1位受检者经时地采集的试样中的本发明的miRNA的浓度而进行。此时，由于不与正常对照的miRNA的浓度比较而能够进行子宫内膜异位的检测，所以优选。此时，试样的采集例如在从初诊开始两周到完全治愈为止的期间、以1周1次左右的间隔进行。即，本发明的诊断方法也包括疾病发展的监控方法以及治疗经过的监控方法。

本说明书中明示引用的全部专利及参考文献的内容都作为参照组合入本说明书中。在本说明书中使用的情况下，由“包含/包括(comprising)…”的表达所表示的方式包括由“本质上由…构成(essentially consisting of)”的表达所表示的方式、以及由“由…构成(consisting of)”的表达所表示的方式。

以下利用实施例更加详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。

实施例

(来自患者以及对照受检者的血清试样)

由经阴道子宫镜诊断的子宫内膜异位患者(20例)及与患者组的年龄相配的对照受检者(20例(其中9例为子宫内膜异位以外的良性妇科疾病患者，11例为健康人))的血清试样由Cureline Inc.(South San Francisco,美国卡利福尼亚州)购入。血清试样在使用之前保存于-80℃。各受检者的临床信息记载于表1。

[表1]

受检者的监床信息

(从血清试样的RNA提取)

使用Trizol LS reagent和mirVana miRNA isolation kit(均为LifeTechnologies Inc.)从血清试样提取RNA。具体的程序如下所述。在血清1mL中添加1mL灭菌水后，再添加6mL的Trizol LS reagent进行混合。将混合后的溶液在室温静置5分钟后，添加1.6mL的氯仿，用手剧烈搅拌。将搅拌后的溶液在室温静置10分钟后，利用离心操作(4℃、12,000xg、10分钟)分离有机溶剂层和水层。从所得到的水层中，分取4mL，在分取的水层中添加5mL的99.5％乙醇进行均匀搅拌。将搅拌后的溶液添加至mirVana miRNAisolation kit的过滤管，按照该kit中附带的操作方案分离提取RNA组分。将分离提取的RNA组分冻结干燥后，用10μL的灭菌水进行再悬浮得到RNA浓缩溶液。所得到的RNA浓缩溶液所含的miRNA浓度，作为该RNA浓缩溶液所含的相当于10～40碱基长度的RNA浓度，使用Agilent 2100bioanalyzer和Small RNA kit(Agilent Technologies)测定。

(miRNA定量解析)

从上述RNA浓缩溶液中，使用Megaplex RT primers(pool A或B v.2.0)以及TaqMan^TM MicroRNA Reverse Transcription Kit得到含有cDNA的溶液后，使用Megaplex PreAmp primers(pool A或B v.2.0)以及TaqMan^TM PreAmpMaster Mix扩增所得到的溶液所含的cDNA。将混合扩增后的cDNA和TaqMan Universal PCR Master Mix(No AmpErase UNG)得到的试样装填于TaqMan^TM Human MicroRNA Array v2.0，使用7900HT Fast Real-Time PCR系统进行定量PCR解析。此外，本项中的各操作按照制品所附带的操作方案进行。

(数据解析)

数据解析使用RQ Manager 1.2software(Life Technologies)。从扩增曲线的C_T(Threshold cycle)值的算出按照由Liang等报告的方法(Liang,Y.et al.,BMC Genomics,8,166-,2007)，将阈值设定为0.2。关于全部40个检体中的80％以上没有观察到扩增的miRNA，从以下的解析中排除。对每个各检体算出剩余的总miRNA的C_T值的中间值，算出从各个C_T值中减去该中间值后的值(ΔC_T值)，将检体间的表达差标准化。为了鉴定在患者组与对照组之间表达量显著不同的miRNA，而实施Welch’s t-test。进行通过使用逻辑回归解析鉴定的多个miRNA的组合的诊断模型的构建和评价。另外，使用ROC(Receiver operating characteristic)解析，评价利用miRNA各自的或者组合的诊断力。这些解析中使用MATLAB software(The Mathworks Inc.)。

(结果)

图1表示患者及对照的2组间中的3种miRNA的表达分布。纵轴表示各miRNA的相对的表达量，底作为2的对数表示。以蓝点表示各受检者的表达量，以红线表示各组的表达量的中间值。箱的上限和下限分别表示25及75百分数(Percentile)，须(whisker)的两端表示除去偏离值后的上限值和下限值，红十字表示偏离值。将Welch’s t-test的结果得到的P值和两组的表达量(底为2的对数)的平均值的差表示在各图的miRNA名称下。

对20例子宫内膜异位患者组和20例对照受检者组的血清中的miRNA表达谱进行比较解析的结果，得知hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-518d-3p的3种miRNA的表达量在患者组中显著增加(图1)。由此，可知通过测定血清中的这3种miRNA的表达量，能够良好地检测出患者组。

表2中表示了这些miRNA的序列，并且记载了从两组的表达量(底为2的对数)的平均值算出的、相比于对照组，患者组的这些miRNA的表达量增加倍数(Fold Change)。

[表2]

由ROC解析，评价了将这些上调节的3种miRNA用于子宫内膜异位的检测时的检测能力。

首先，利用分别单独使用hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-518d-3p三种miRNA时的ROC曲线的曲线下面积(AUC)比较检测能力。此外，鉴定在ROC曲线上能够最好判别两组的点，将与该点对应的临界值(阈值，threshold)表示为来自对照组平均表达量的上调节倍数(Fold Change)。接着，算出使用该临界值时的有病正诊率(真阳性率)(灵敏度：Sensitivity)和无病正诊率(真负率)(特异性：Specificity)。将这些图示在图2中。

此外，使用逻辑回归分析，构建组合多种miRNA的预测模型，与上述同样地通过ROC解析评价模型的检测能力。图3表示使用从hsa-miR-708和hsa-miR-518d-3p(左)或hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-518d-3p的全部(右)构建的预测模型时的ROC曲线。利用其曲线下面积(AUC)评价检测能力。

其结果表明，利用组合2种或3种miRNA的模型的情况，与1种的情况(图2)相比，ROC曲线的曲线下面积增大，能够以更高的精度进行患者的检测。

工业实用性

本发明对于子宫内膜异位的诊断有用。

Claims (16)

1.一种子宫内膜异位诊断药，其用于测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA的浓度，且以所述miRNA的扩增引物为主要成分。

2.一种子宫内膜异位诊断试剂盒，其包含权利要求1所述的诊断药。

3.根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中，

miRNA为hsa-miR-708。

4.根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中，

miRNA为hsa-miR-127-3p。

5.根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中，

miRNA为hsa-miR-518d-3p。

6.根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中，

来自血液的试样为血浆。

7.一种子宫内膜异位的检测方法，其包括：

测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA的浓度的工序。

8.根据权利要求7所述的方法，其包括：

将所述miRNA的浓度与正常对照中的所述miRNA的浓度比较，确定所述miRNA的浓度是否为高值的工序。

9.根据权利要求7所述的方法，其包括：

确定所述miRNA的浓度是否在临界值以上的工序。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，

miRNA为hsa-miR-708。

11.根据权利要求7所述的方法，其中，

miRNA为hsa-miR-127-3p。

12.根据权利要求7所述的方法，其中，

miRNA为hsa-miR-518d-3p。

13.根据权利要求7所述的方法，其中，

来自血液的试样为血浆。

14.诊断受检者的子宫内膜异位的方法，其包括：

测定来自受检者的血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA的浓度的工序。

15.根据权利要求14所述的方法，其包括：

将所述miRNA的浓度与正常对照中的所述miRNA的浓度比较，确定所述miRNA的浓度是否为高值的工序。

16.根据权利要求14所述的方法，其包括：

确定所述miRNA的浓度是否在临界值以上的工序。