CN104391068B - 一种测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，所述常用杀菌剂为霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵，包括以下步骤：提取烟草中的目标物、N-丙基乙二胺纯化、标准储备液和标准工作液的配制、超高效液相色谱-串联质谱测定。本发明针对烟草中常施用的6种杀菌剂，利用超高效液相色谱-串联质谱仪，同位素内标定量法，建立UPLC–MS/MS同时快速分析烟草中6种杀菌剂残留的方法，与标准方法相比，合并了两个标准方法的检测指标，并加入了霜霉威，提高了方法的灵敏度，缩短了分析时间和检测成本。
Description
技术领域
本发明属于农药残留检测领域，涉及烟草中农药残留量检测技术，特别涉及烟草中常用杀菌剂残留量的测定方法，具体是检测烟草中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的残留量。
背景技术
霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵都为是烟草生产上常用的杀菌剂，能防治烟草叶、茎、根多种真菌病害，具有对高效、低毒，兼有保护和治疗作用等特点。除多菌灵外，其它5个指标均被列入《中国烟叶公司2013年度烟草上推荐使用农药名单》，在各个烟区都有施用。由于施用广泛，杀菌剂在烟叶中较大残留量会对吸烟者产生健康风险，因此，这6个指标均被列入国际烟草科学研究合作中心（CooperationCentreforScientificResearchRelativetoTobacco，CORESTA）2008年提出对烟草中的118种农药指导性残留限量名单。鉴于这些杀菌剂的施用广泛性和潜在影响烟叶的安全性，快速、准确的对其定量分析显得较为重要。
烟草常施用低毒类农药有可能会超出指导限量，因此监测烟草常施用农药的残留量尤为重要。烟叶农药残留量的分析方法主要有气相色谱法（GC）、气相色谱-串联质谱法（GC–MS/MS）和液相色谱–质谱法（LC–MS/MS）。2012年，杨飞等利用LC-MS/MS同时检测了烟草及烟草制品中6种杀菌剂，此方法选取基质分散固相萃取处理样样品。陈晓水等利用GC-MS/MS同时测定了烟草中的氟节胺等132种农药残留，此方法适合于有机磷、有机氯和菊酯类农药的检测。2011年，烟草行业制定一系列多农残检测标准，而这6种常用农药分列于两个检测标准，三种不同的检测方法，这使得检测过程较为复杂、繁琐。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种快速、准确的烟草中常用杀菌剂残留量的测定方法，该方法可同时测定烟草中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的残留量。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，所述常用杀菌剂为霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵，包括以下步骤：
（1）提取烟草中的目标物：
称取烘干磨好的烟叶样品，加入纯水浸润，依次加入氘代内标和乙腈，涡漩混合振荡；放入冰箱冷冻后取出，依次加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，涡旋振荡后离心；
（2）N-丙基乙二胺（PSA）纯化：
移取上清液于新的离心管中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，于漩涡振荡混合，然后高速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用超纯水稀释后待测；
（3）标准储备液和标准工作液的配制：
用乙腈配制霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得5μg/mL混合标准储备液；
用乙腈准确配制多菌灵-d4和甲基硫菌灵-d6氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得10μg/mL混合内标标准储备液；所有的储备液于-20℃保存，使用前将其恢复到室温；
用空白烟叶的萃取基质配制不同浓度的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准工作溶液；
（4）超高效液相色谱-串联质谱测定：
吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准工作溶液，注入串联质谱检测器，按内标法以峰面积计算出样品待测液中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵含量；
选取90%流动相A和10%流动相B为初始流动相体系，分析时间为12min，进样量为10μL；所述流动相A是体积分数为0.1%的甲酸水，流动相B是体积分数为0.1%的甲酸甲醇；
前述串联质谱检测器采用UPLC-MS/MS系统，选取的色谱柱为UPLC色谱柱：UPLCHSST3，规格为100mm×2.1mm、1.8μm，柱温35°C，进样量10μL；串联质谱检测的条件为：电喷雾离子源，喷雾电压（IS）：2.6kV；离子化温度350℃；雾化气流量：1000L/Hr;锥孔气流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集。
优选地，步骤（1）中，提取过程依次加入的超纯水、10μg/mL的氘代内标，乙腈的体积分别为10mL、20μL、10mL。
优选地，步骤（1）中，速率涡旋振荡时长1min，振荡的速率为2000rpm。
优选地，步骤（1）中，离心管在-10℃条件下保持10min。
优选地，步骤（1）中，依次加入的无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g、1g、1g和0.5g。
优选地，步骤（1）中，漩涡混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，离心10min、离心速率为4000rpm。
优选地，步骤（2）中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。
优选地，步骤（2）中，移取滤液体积为200μL，加入超纯水定容到1mL。
优选地，步骤（4）中，色谱柱采用梯度洗脱，条件为：0~2min，90%A~50%A；2~2.4min，50%A~30%A；2.4~4.0min，30%A~20%A；4.0~6.0min，20%A~5%A，6.0~9.8min，5%A~5%A；9.8~10.0min，5%A~90%A，10.0~12.0min，90%A~90%A；流动相流速为0.3mL/min。
优选地，所述步骤（4）中，测定烟草中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵含量的具体操作为：吸取标准空白烟草和配制好的不同浓度的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，绘制霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
本发明克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样本优化了提取、净化条件，选择了UPLC-MS/MS，并对UPLC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
1、本发明针对烟草中常施用的6种杀菌剂，利用超高效液相色谱-串联质谱仪，同位素内标定量法，建立UPLC–MS/MS同时快速分析烟草中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵等农药残留的方法，与标准方法相比，合并了两个标准方法的检测指标，并加入了霜霉威，提高了方法的灵敏度，缩短了分析时间和检测成本。与报道的LC-MS/MS方法相比，应用氘代内标定量，有效降低基质效应，提高了检测准确性；应用了小粒径UPLC色谱柱，提高分离能力，节省分析时间。
2、与传统的气相色谱比较，采用基质分散固相萃取法来检测霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵。简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。
3、由于选取了超高效液相色谱柱，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩短。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的杀菌剂残留的测定。
4、选取了2个化合物的氘代标准品对霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵进行定量，使得方法的准确性更高，有效消除基质干扰和前处理过程中引起的误差。
5、本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
附图说明
图1为霜霉威的选择离子流色谱图。
图2为多菌灵的选择离子流色谱图。
图3为多菌灵氘代内标的选择离子流色谱图。
图4为恶霜灵的选择离子流色谱图。
图5为甲霜灵的选择离子流色谱图。
图6为稻瘟灵的选择离子流色谱图。
图7为甲基硫菌灵的选择离子流色谱图。
图8为甲基硫菌灵氘代内标的选择离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合一个具体实施例进行说明。
本发明依次采用超纯水浸润样品，乙腈萃取分析物，N-丙基乙二胺（PSA）净化样品，超高效液相色谱-串联质谱仪等步骤进行测定，可快速、准确、同时检测出烟草中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的残留含量。
实验例1
1．仪器与试剂：WatersXevoTQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配备电喷雾电离源（ESI）；VtexMixer230VeU振荡器（美国Labnet公司）；Sigma3K15离心机(德国Sigma公司)。
甲酸为HPLC级(浓度为49-51%，德国Sigma公司)；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国Thermo-Fisher公司）；霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准品来自于LaborDr.Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度：98.5%，Augsburg，德国），内标多菌灵-d4来自于加拿大TRC（化学纯度：98%，同位素纯度：98.9%和99.2%，多伦多，加拿大），甲基硫菌灵-d6购自CDNIsotopesInc.（化学纯度：98%，同位素纯度：99.9%，QuebecCanada）。试剂包和N-丙基乙二胺（PSA）购自安捷伦公司（美国），水为超纯水。N-丙基乙二胺（PSA）吸附剂、末尾封端碳18（C18E）吸附剂，水为超纯水。
2．提取烟草中的分析物
准确称取2.00g样品于50mL具盖离心管中，加入10mL水，振荡直至样品被水充分浸润。冷冻10min后移取10mL乙腈至离心管中，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡1min。将离心管置于0℃条件下保持10min，然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min，然后以4000rpm速率离心10min。
3.PSA纯化
移取上清液1.0mL于1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁及25mgPSA吸附剂，于漩涡混合振荡仪上以2000rpm速率振荡2min，以6000rpm速率离心2min。吸取上清液经0.22μm有机相滤膜过滤，移取200μL，用超纯水稀释至1.0mL，待测。
4液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定
（1）UPLC-MS/MS条件：
色谱条件：AtiantisUPLCHSST3(100mm×2.1mm，1.8μm，美国Waters公司)；流动相A：0.1%甲酸水溶液（体积分数），流动相B：0.1%甲酸甲醇溶液（体积分数）；流速0.3mL/min；柱温35°C；进样量10μL。梯度洗脱条件：0~2min，90%A~50%A；2~2.4min，50%A~30%A；2.4~4.0min，30%A~20%A；4.0~6.0min，20%A~5%A；6.0~9.8min，5%A~5%A；9.8~10.0min，5%A~90%A；10.0~12.0min，90%A~90%A。
质谱条件；电喷雾离子源，喷雾电压（IS）：2.6kV；离子化温度350℃；雾化气流量：1000L/Hr;锥孔气(cone)流量50L/Hr;碰撞气流量为0.15ml/min;碰撞气为氩气，其余气体为氮气;驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量（CE）见表1。图1至图8是各杀菌剂的离子流色谱图。
表1多反应监测模式下6种杀菌剂及其氘代内标的部分质谱参数
注：①黑体字为定量离子对，非黑体字为辅助定性离子对。
（2）标准储备液的配制：
用乙腈准确配置混合标准储备液（5μg/mL）储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。
用乙腈准确配置多菌灵-d4（0.099mg/mL）和甲基硫菌灵-d6（0.099mg/mL）氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液（10μg/mL）。所有的储备液于冰箱-20℃，使用前将其恢复到室温。
（3）霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵含量的测定：
吸取配制好的不同浓度的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的混合标准工作溶液各10μL，注入UPLC-MS/MS；霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的线性回归方程和相关系数见表2，其中y代表分析物与内标峰面积的比值，x表示烟草中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的含量。
（4）该方法的线性范围和检出限：
分别移取混合标准储备液0μL，10μL，20μL，50μL，100μL1μg/mL混合标液和20μL，50μL及100μL10μg/mL混合标液到8个10mL容量瓶中，每个容量瓶移入20uL混合氘代内标工作液（1μg/mL），加入200μL空白烟叶样品萃取液，用纯水定容至1mL。各标准工作溶液的浓度分别为0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL。分别对这些标准溶液进行UPLC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见表2。结果表明，各种化合物线性关系良好(相关系数r≥0.99)，可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限，详见表2。
表26种杀菌剂的线性范围、相关系数、检测限、保留时间及标准方法的检出限
a:YC-T405.1-2011方法涉及指标的检出限，b:YC-T405.3-2011方法涉及指标的检出限。
（5）本发明方法的重复性和加标回收率：
在空白的烤烟样品中添加一定量的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本实验选用高、中、低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，计算5次结果的平均值为83.9%~113.7%。方法的精密度以回收率的相对标准偏差(RSD)来评价，对同一样品平行测定5次，6种杀菌剂回收率的RSD范围为3.5%~13.8%，结果见表3。
表3烟草中6中杀菌剂的回收率和精密度(n＝5)
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，所述常用杀菌剂为霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取烟草中的目标物：
称取烘干磨好的烟叶样品于离心管中，加入超纯水浸润，依次加入氘代内标和乙腈，涡漩混合振荡；放入冰箱冷冻后取出，依次加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，涡旋振荡后离心；
(2)N-丙基乙二胺纯化：
移取上清液于新的离心管中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，于漩涡振荡混合，然后高速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用超纯水稀释后待测；
(3)标准储备液和标准工作液的配制：
用乙腈配制霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得5μg/mL混合标准储备液；
用乙腈准确配制多菌灵-d4和甲基硫菌灵-d6氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得10μg/mL混合内标标准储备液；所有的储备液于-20℃保持，使用前将其恢复到室温；
用空白烟叶的萃取基质配制不同浓度的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准工作溶液；
(4)超高效液相色谱-串联质谱测定：
吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准工作溶液，注入串联质谱检测器，按内标法以峰面积计算出样品待测液中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵含量；
选取90％流动相A和10％流动相B为初始流动相体系，分析时间为12min，进样量为10μL；所述流动相A是体积分数为0.1％的甲酸水，流动相B是体积分数为0.1％的甲酸甲醇；
前述串联质谱检测器采用UPLC-MS/MS系统，选取的色谱柱为UPLC色谱柱：UPLCHSST3，规格为100mm×2.1mm、1.8μm，柱温35℃，进样量10μL；串联质谱检测的条件为：电喷雾离子源，喷雾电压(IS)：2.6kV；离子化温度350℃；雾化气流量：1000L/Hr；锥孔气流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集；
色谱柱采用梯度洗脱，条件为：0～2min，90％A～50％A；2～2.4min，50％A～30％A；2.4～4.0min，30％A～20％A；4.0～6.0min，20％A～5％A，6.0～9.8min，5％A～5％A；9.8～10.0min，5％A～90％A，10.0～12.0min，90％A～90％A；流动相流速为0.3mL/min。
2.根据权利要求1所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，步骤(1)中，提取过程依次加入的超纯水、10μg/mL的氘代内标，乙腈的体积分别为10mL、20μL、10mL。
3.根据权利要求2所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，步骤(1)中，涡旋振荡时长1min，振荡的速率为2000rpm。
4.根据权利要求3所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，步骤(1)中，离心管在-10℃条件下保持10min。
5.根据权利要求4所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，步骤(1)中，依次加入的无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g、1g、1g和0.5g。
6.根据权利要求5所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，步骤(1)中，涡漩混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，离心10min、离心速率为4000rpm。
7.根据权利要求1所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，步骤(2)中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量分别为150mg和25mg。
8.根据权利要求7所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，步骤(2)中，移取滤液体积为200μL，加入超纯水定容到1mL。
9.根据权利要求1所述的测定烟草中常用杀菌剂残留量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，测定烟草中霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵含量的具体操作为：吸取标准空白烟草和配制好的不同浓度的霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，绘制霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
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