CN104383531A - 预防儿童脑膜炎的联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种预防儿童脑膜炎的联合疫苗及其制备方法，其中所述疫苗含有脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌多糖蛋白质结合物，用于免疫6周龄以上儿童，用于预防脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌引起的儿童脑膜炎，同时预防这些病原菌引起的其他感染性疾病。

Description

预防儿童脑膜炎的联合疫苗及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种联合疫苗及其制备方法，主要用于预防儿童脑膜炎，同时也预防相关病原菌引起的其他感染性疾病。本发明的联合疫苗特别涉及预防脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌引起的儿童脑膜炎，同时预防这些病原菌引起的其他感染性疾病。

背景技术：

急性细菌性脑膜炎是儿童死亡的主要病因之一，全球每年有17万死亡病例(Meenakshi R.,et al.Sequelae due to bacterial meningitis among African children:asystematic literature review.BMC Medicine 2009,7:47)，在幸存者中，还伴随有高比例的神经系统后遗症，严重危害人体健康。导致细菌性脑膜炎的主要病原菌包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)和脑膜炎双球菌(Neisseria meningitides,Nm)，其中，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌还是引起儿童肺炎、败血症、中耳炎等感染性疾病的最主要病原菌。

国际上已有针对以上病原菌的上市疫苗，如针对肺炎链球菌的“23价肺炎球菌多糖疫苗”、“13价肺炎球菌结合疫苗”、“10价肺炎球菌结合疫苗”等，针对流感嗜血杆菌的“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”，针对脑膜炎双球菌的“ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗”、“ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌结合疫苗”、“AC群脑膜炎球菌多糖疫苗”、“AC群脑膜炎球菌结合疫苗”“A群脑膜炎球菌多糖疫苗”等，也有针对两种病原菌的联合疫苗，如“AC群脑膜炎球菌(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗”、“CY群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌结合疫苗”等，但还没有同时针对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌三种病原菌的联合疫苗。国外有采用三种疫苗同时接种的报道(Lagos R.,et al.Immunology of combiningCRM(197)conjugates for Streptococcus pneumoniae,Neisseria meningitis andHaemophilus influenzae in Chilean infants.Vaccine.2009,17:2299)，采用“9价肺炎球菌结合疫苗”、“C群流脑结合疫苗”和“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”混合后接种，观察到有些细菌型别抗体降低的情况，但各种抗体阳转率并无明显变化，还有将“7价肺炎球菌结合疫苗”、“C群流脑结合疫苗”和“百白破/IPV/b型流感嗜血杆菌五联苗”同时在不同部位接种的报道(Moss SJ.,et al.Immunogenicity of aHeptavalent Conjugate Pneumococcal VaccineAdministered Concurrently with a Combination Diphtheria,Tetanus,Five-ComponentAcellular Pertussis,Inactivated Polio,and Haemophilus influenzae Type b Vaccineand a Meningococcal Group C Conjugate Vaccine at 2,3,and 4Months of Age.Clin.Vaccine Immunol.2010,17:311)，也发现类似情况，证明针对疫苗的联合免疫，可以诱导有保护效果的免疫应答。

本发明意外的发现，将脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌制备成结合疫苗可以预防儿童脑膜炎，同时发现三者结合具有协同增效作用。

发明内容：

本发明提供了一种预防儿童脑膜炎的联合疫苗制剂，所述疫苗制剂含有的活性成分为：脑膜炎双球菌结合物、肺炎球菌结合物和流感嗜血杆菌结合物。

其中，脑膜炎双球菌结合物选自：脑膜炎双球菌A群、C群、Y群、W135群中的一种或多种不同血清型的组合。

肺炎球菌结合物选自：肺炎球菌1型、2型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、8型、9N、9V、10A、11A、12F、14型、15B、17F、18C、19A、19F、20型、22F、23F和33F型一种或多种不同血清型的组合。

流感嗜血杆菌结合物选自：流感嗜血杆菌a型和b型的一种或2种血清型组合。

本发明联合疫苗制剂中，每型结合物的含量0.5－20μg/剂(以多糖含量计)，优选1－10μg/剂，更优选2－5μg/剂。联合制剂中，各型结合物含量可相同，也可不同。

本发明联合疫苗制剂，所述结合物的结合蛋白，选自破伤风类毒素、破伤风毒素C片段、白喉类毒素、交叉反应物质(如CRM197)、百日咳毒素及其类似物、重组绿脓杆菌外毒素A及其类似物、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、不可分型流感嗜血杆菌P蛋白、肺炎球菌外膜蛋白等。

本发明联合疫苗制剂，其中除上述活性成分外，还可含有佐剂，优选铝佐剂，加入量为0.1－1.5mg铝含量/剂，铝佐剂可为氢氧化铝、硫酸铝、磷酸铝的一种或不同配比的混合物。

本发明联合疫苗制剂优选注射剂，可为冻干或液体制剂，供皮下或肌肉注射。

本发明的联合疫苗制剂可通过以下工艺制备：

多糖的制备：选用脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的菌种，经发酵培养后，纯化出各型荚膜多糖。荚膜多糖纯化方法可选用有机溶剂分离和/或层析纯化，属于本行业通用技术。纯化荚膜多糖残余核酸和蛋白质含量不高于10％，优选不高于5％，更优选不高于2％。

载体蛋白质的制备：选用相应菌种发酵培养后，纯化目标蛋白质而成，其中类毒素类产品需经脱毒，脱毒剂可选用甲醛、戊二醛的一种或混合。目标蛋白质的纯化方法包括盐析、层析、超滤等，属于本行业通用技术。目标蛋白质含量不低于90％，优选不低于95％。

结合物制备：采用胺还原法或氰基活化法制备，属于本行业通用技术。多糖与蛋白质可以直接连接，也可以通过桥连剂(如ADH)连接。制备的结合物游离多糖含量不高于30％，优选不高于20％，更优选不高于10％。

联合疫苗制备：将不同的结合物，以一定比例混合，用缓冲盐水或盐水稀释至一定浓度分装而成。可添加佐剂制备成吸附剂型，也可添加赋形剂分装冻干后，制备为冻干剂型。赋形剂可以是糖类、蛋白质类或氨基酸类，优选糖类，最优选乳糖。

本发明联合疫苗制剂采用脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌制备的结合物，所选血清型中，脑膜炎双球菌选择A群、C群、Y群、W135群，优选A群、C群，最优选A群；肺炎链球菌选择1型、2型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、8型、9N、9V、10A、11A、12F、14型、15B、17F、18C、19A、19F、20型、22F、23F和33F型，优选1型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、9V、14型、18C、19A、19F和23F，最优选4型、6B、9V、14型、18C、19F和23F；流感嗜血杆菌选择a型和b型，优选b型。

因此，本发明的联合疫苗制剂，优选的是含有A、C群流脑(结合)13价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)的联合疫苗。最优选的是含有A、C群流脑(结合)7价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)的联合疫苗。其中13价为：1型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、9V、14型、18C、19A、19F和23F，7价为：4型、6B、9V、14型、18C、19F和23F；

本发明的联合疫苗制剂，优选的配方，各组分的配比如下：

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml

4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为3-5μg/ml

6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9μg/ml

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml。

或，

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml

1型、3型、4型、5型、6A、7F、9V、14型、18C、19A、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为3-5μg/ml

6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9μg/ml

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml。

本发明的联合疫苗制剂，最优选的配方，各组分的配比如下：

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml

4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为4μg/ml

6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为8μg/ml

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml。

或，

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml

1型、3型、4型、5型、6A、7F、9V、14型、18C、19A、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为4μg/ml

6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为8μg/ml

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml。

本发明联合疫苗制剂的小鼠免疫原性观察发现，各型抗原都可以诱导良好的免疫应答，各抗原间没观察到明显的免疫抑制现象。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：

实验1，流脑肺炎流感嗜血杆菌联合疫苗制剂的小鼠免疫原性

选用实施例9,10,11的联合疫苗分别免疫NIH小鼠各10只，免疫3针，间隔2周，免疫剂量为0.1ml/针，最后一次免疫后2周经眼眶采血，离心收集血清。另设10只小鼠为对照，用生理氯化钠免疫。

血清特异性抗体测定采用间接ELISA法，包被抗原为相应多糖与牛血清白蛋白的偶联物。在已包被的酶标板中加入1:200稀释的血清并做倍比稀释，洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体，洗板后，加入底物显色，OD405nm读数。以对照小鼠1：200的平均OD值+3SD为cutoff值，判定并计算各型别小鼠的抗体几何平均滴度。

联合疫苗免疫后小鼠特异性抗体滴度(1:)

实验2，流脑肺炎流感嗜血杆菌联合疫苗制剂的小鼠免疫原性

选用实施例6,7,8的联合疫苗分别免疫NIH小鼠各10只，免疫3针，间隔2周，免疫剂量为0.1ml/针，最后一次免疫后2周经眼眶采血，离心收集血清。另设10只小鼠为对照，用生理氯化钠免疫。

血清特异性抗体测定采用间接ELISA法，包被抗原为相应多糖与牛血清白蛋白的偶联物。在已包被的酶标板中加入1:200稀释的血清并做倍比稀释，洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体，洗板后，加入底物显色，OD405nm读数。以对照小鼠1：200的平均OD值+3SD为cutoff值，判定并计算各型别小鼠的抗体几何平均滴度。

联合疫苗免疫后小鼠特异性抗体滴度(1:)

实验3，三种结合物协同作用的实验

选用A、C群脑膜炎球菌结合物、7价肺炎球菌(4型、6B、9V、14型、18C、19F、23F)结合物、13价肺炎球菌(1型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、9V、14型、18C、19A、19F、23F)、b型流感嗜血杆菌结合物以及实施例6,9的联合疫苗分别免疫NIH小鼠各10只，免疫3针，间隔2周，免疫剂量为0.1ml/针，最后一次免疫后2周经眼眶采血，离心收集血清。另设10只小鼠为对照，用生理氯化钠免疫。

血清特异性抗体测定采用间接ELISA法，包被抗原为相应多糖与牛血清白蛋白的偶联物。在已包被的酶标板中加入1:200稀释的血清并做倍比稀释，洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体，洗板后，加入底物显色，OD405nm读数。以对照小鼠1：200的平均OD值+3SD为cutoff值，判定并计算各型别小鼠的抗体几何平均滴度。

联合疫苗免疫后小鼠特异性抗体滴度(1:)

本发明联合疫苗制剂可用于免疫6周龄以上儿童，用于预防脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌引起的儿童脑膜炎，同时预防这些病原菌引起的其他感染性疾病。它的特点是多联多价，减少免疫针次，从而减轻儿童的痛苦和家长的负担。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。本实施例只是一种举例，是本发明的解决方案之一，并非将本发明局限于实施例。

实施例一荚膜多糖的制备

细菌发酵后，离心收集上清液，100Kd超滤浓缩，收集截留液，加入乙醇至25％，离心收集上清，加乙醇至75％，离心收集沉淀，注射用水复溶后，羟基磷灰石层析，收集流穿液，100KD超滤浓缩，离心澄清，冻干制备荚膜多糖。

实施例二胺还原法制备结合物(直接连接)

多糖溶解为5～10mg/ml，加入高碘酸钠至2.5～10mmol/L，避光氧化，甘油终止反应，30KD超滤浓缩后，按1：0.5～2比例加入蛋白质，同时加入硼氰化钠至2mg/ml，室温反应3～7天，后经分子筛层析纯化，收集V₀附近的洗脱峰获得结合物。

实施例三胺还原法制备结合物(桥连剂连接)

多糖溶解为5～10mg/ml，加入高碘酸钠至2.5～10mmol/L，避光氧化，甘油终止反应，30KD超滤浓缩后，加己二酰二肼(ADH)和硼氰化钠至终浓度40mg/ml和2mg/ml，室温反应3天，制备衍生物。

衍生多糖和载体蛋白质按质量比1：0.5～2混合，加入碳二亚胺(EDAC)至终浓度0.02mol/L，维持pH值5.6反应150分钟以上，制备的结合物经分子筛层析纯化，收集V₀附近洗脱峰，获得结合物原液。

实施例四氰基活化法制备结合物(直接连接)

多糖溶解为5～20mg/ml，调整pH值至9.0，按质量比1:0.75加入1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)，维持pH值9.00-10.00，反应5分钟，加入2％三乙胺溶液调整pH值到10.00-11.00，反应5分钟，调整pH值为8.60左右，按多糖蛋白质量比1:0.5～2.0加入蛋白，维持pH值8.6附近反应120分钟以上，甘氨酸终止反应，经超滤后，分子筛层析纯化，收集V0附近洗脱峰，获得结合物原液。

实施例五氰基活化法制备结合物(桥连剂连接)

多糖溶解为5～20mg/ml，调整pH值至10.8左右，按质量比1:1加入溴化氰(CNBr)，维持pH值10.8反应6分钟，加入相同体积的0.5mol/L己二酰二肼(ADH)溶液，维持pH值8.6反应2小时以上，30KD超滤洗涤后，获得多糖衍生物。

多糖衍生物与载体蛋白质按1：0.5～2.0的比例混合，调整pH值至5.6，加入碳二亚胺(EDAC)至终浓度0.02mol/L，维持pH值5.6反应150分钟以上，制备的结合物经分子筛层析纯化，收集V₀附近洗脱峰，获得结合物原液。

实施例六A、C群流脑(结合)7价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗制备

选取A、C群脑膜炎球菌、4型、6B、9V、14型、18C、19F、23F肺炎球菌和b型流感嗜血杆菌的结合物，以脑膜炎球菌结合物各型和b型流感嗜血杆菌结合物终浓度20μg/ml、6B肺炎球菌结合物终浓度8μg/ml、4型、9V、14型、18C、19F、23F肺炎球菌结合物4μg/ml混合，补以生理氯化钠溶液，调整pH值至6.0±0.5，配制为半成品，以每瓶0.6ml分装，制备为联合疫苗成品。

实施例七吸附A、C群流脑(结合)7价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗制备

选取A、C群脑膜炎球菌、4型、6B、9V、14型、18C、19F、23F肺炎球菌和b型流感嗜血杆菌的结合物，以脑膜炎球菌结合物各型和b型流感嗜血杆菌结合物终浓度10μg/ml、6B肺炎球菌结合物终浓度8μg/ml、4型、9V、14型、18C、19F、23F肺炎球菌结合物终浓度4μg/ml、磷酸铝佐剂至铝含量0.25mg/ml混合，补以氯化钠溶液，调整pH值至6.0±0.5，配制为半成品，以每瓶0.6ml分装，制备为吸附联合疫苗成品。

实施例八冻干A、C群流脑(结合)7价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗制备

选取A、C群脑膜炎球菌、4型、6B、9V、14型、18C、19F、23F肺炎球菌和b型流感嗜血杆菌的结合物，以脑膜炎球菌结合物各型和b型流感嗜血杆菌结合物终浓度20μg/ml、6B肺炎球菌结合物终浓度8μg/ml、4型、9V、14型、18C、19F、23F肺炎球菌结合物终浓度4μg/ml、乳糖终浓度5～6mg/ml混合，补以氯化钠溶液，调整pH值至6.0±0.5，配制为半成品，以每瓶0.6ml分装冻干后，制备为冻干联合疫苗成品。

实施例九A、C群流脑(结合)13价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗制备

选取A、C群脑膜炎球菌、1型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、9V、14型、18C、19A、19F、23F肺炎球菌和b型流感嗜血杆菌的结合物，以脑膜炎球菌结合物各型和b型流感嗜血杆菌结合物终浓度20μg/ml、6B肺炎球菌结合物终浓度8μg/ml、其余各型肺炎球菌结合物4μg/ml混合，补以生理氯化钠溶液，调整pH值至6.0±0.5，配制为半成品，以每瓶0.6ml分装，制备为联合疫苗成品。实施例十吸附A、C群流脑(结合)13价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗制备

选取A、C群脑膜炎球菌、1型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、9V、14型、18C、19A、19F、23F肺炎球菌和b型流感嗜血杆菌的结合物，以脑膜炎球菌结合物各型和b型流感嗜血杆菌结合物终浓度10μg/ml、6B肺炎球菌结合物终浓度8μg/ml、其余各型肺炎球菌结合物终浓度4μg/ml、磷酸铝佐剂至铝含量0.25mg/ml混合，补以氯化钠溶液，调整pH值至6.0±0.5，配制为半成品，以每瓶0.6ml分装，制备为吸附联合疫苗成品。

实施例十一冻干A、C群流脑(结合)13价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗制备

选取A、C群脑膜炎球菌、1型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、9V、14型、18C、19A、19F、23F肺炎球菌和b型流感嗜血杆菌的结合物，以脑膜炎球菌结合物各型和b型流感嗜血杆菌结合物终浓度20μg/ml、6B肺炎球菌结合物终浓度8μg/ml、1型、3型、4型、5型、6A、7F、9V、14型、18C、19A、19F、23F肺炎球菌结合物终浓度4μg/ml、乳糖终浓度5～6mg/ml混合，补以氯化钠溶液，调整pH值至6.0±0.5，配制为半成品，以每瓶0.6ml分装冻干后，制备为冻干联合疫苗成品。

Claims (10)

1.一种预防儿童脑膜炎的联合疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂含有的活性成分为：脑膜炎双球菌结合物、肺炎球菌结合物和流感嗜血杆菌结合物；其中，脑膜炎双球菌结合物选自：脑膜炎双球菌A群、C群、Y群、W135群中的一种或多种不同血清型的组合；肺炎球菌结合物选自：肺炎球菌1型、2型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、8型、9N、9V、10A、11A、12F、14型、15B、17F、18C、19A、19F、20型、22F、23F和33F型一种或多种不同血清型的组合；流感嗜血杆菌结合物选自：流感嗜血杆菌a型和b型的一种或2种血清型组合。

2.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，其中，脑膜炎双球菌结合物、肺炎球菌结合物和流感嗜血杆菌结合物的含量以多糖含量计为0.5－20μg/剂。

3.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，其中，脑膜炎双球菌结合物、肺炎球菌结合物和流感嗜血杆菌结合物的含量以多糖含量计为1－10μg/剂。

4.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，为注射剂。

5.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，为冻干或液体制剂，供皮下或肌肉注射。

6.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，是含有A、C群流脑(结合)13价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)的联合疫苗，其中13价为：1型、3型、4型、5型、6A、6B、7F、9V、14型、18C、19A、19F和23F。

7.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，是含有A、C群流脑(结合)7价肺炎(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)的联合疫苗，其中7价为：4型、6B、9V、14型、18C、19F和23F。

8.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，各组分的配比如下：

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml；

4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为3-5μg/ml6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9μg/ml；

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml；

或，

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml；

1型、3型、4型、5型、6A、7F、9V、14型、18C、19A、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为3-5μg/ml；

6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9μg/ml；

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-20μg/ml。

9.根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，各组分的配比如下：

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml；

4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为4μg/ml6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为8μg/ml；

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml；

或，

A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml；

1型、3型、4型、5型、6A、7F、9V、14型、18C、19A、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为4μg/ml；

6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为8μg/ml；

b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20μg/ml。

10.权利要求1的联合疫苗制剂的制备方法，其特征在于，所述结合物的结合蛋白，选自破伤风类毒素、破伤风毒素C片段、白喉类毒素、交叉反应物质、百日咳毒素及其类似物、重组绿脓杆菌外毒素A及其类似物、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、不可分型流感嗜血杆菌P蛋白、肺炎球菌外膜蛋白；

其中，多糖的制备：选用脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的菌种，经发酵培养后，纯化出各型荚膜多糖；

载体蛋白质的制备：选用相应菌种发酵培养后，纯化目标蛋白质而成，其中类毒素类产品需经脱毒；

结合物制备：采用胺还原法或氰基活化法制备，多糖与蛋白质可以直接连接，也可以通过桥连剂连接，制备的结合物游离多糖含量不高于30％；

联合疫苗制备：将不同的结合物，按比例混合，用缓冲盐水或盐水稀释至确定的浓度分装而成，可添加佐剂制备成吸附剂型，也可添加赋形剂分装冻干后，制备为冻干剂型。