CN104367600B - 牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞或治疗与Th17细胞调节相关之疾病的药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞或治疗与Th17细胞调节相关之疾病的药物的用途。本发明提供一种牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞的药物的用途，其中该牛樟芝萃取物具有调节Th17细胞的功效。

Description

牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞或治疗与Th17细胞调节 相关之疾病的药物的用途

技术领域

本发明系关于一种牛樟芝萃取物的用途，且特别关于一种牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞的药物的用途。

背景技术

Th17细胞是一群独特的CD4⁺T细胞，起初被视为会产生IL-17及IL-17F的T细胞(Harrington et al.,2005;Park et al.,2005；Langrish et al.,2005)。有别于Th1与Th2细胞，Th17细胞的发展受TGF-β及其他发炎性细胞激素如IL-6、IL-21、IL-1β及IL-23所调控(Bi and Yang,2012)。除了IL-17A与IL-17F外，Th17细胞还可分泌其他指标性的细胞激素如IL-21、IL-22、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-9、IL-26、CXCL8与CCL20等(Marwaha et al.,2012)，因而可作用于其他细胞如纤维母细胞、角质细胞、内皮细胞、嗜中性白血球及记忆性T细胞等(Gaffen,2011;Ghoreschi et al.,2011;Wilke et al.,2011)。目前发现Th17细胞及其作用分子如IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSF及CCL20等与自体免疫疾病及发炎性疾病的病理发生有关，例如：全身性红斑性狼疮、干癣、类风湿性关节炎、多发性硬化症、发炎性肠症、过敏、气喘等(Maddur et al.,2012)。

牛樟芝(学名为Antrodia cinnamomea,Antrodia camphorata或Taiwanofunguscamphoratus)是传统的中草药，为台湾特有的真菌，仅寄生于牛樟树(Cinnamomumkanehirae Hayata(Lauraceae))之实木内或潮湿的表面上(Ao et al.2009;Lu etal.2009)。现今已将牛樟芝用于治疗肝炎、癌症、腹痛、腹泻、高血压或是护肝、解毒等用途上，然而，目前仍不清楚牛樟芝是否具备调节Th17细胞的功效。

发明内容

本发明提供一种用于调节Th17细胞的医药组合物，包括：牛樟芝萃取物为有效成分，其中该牛樟芝萃取物具有调节Th17细胞的功效。

本发明还提供一种牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞的药物的用途，其中该牛樟芝萃取物具有调节Th17细胞的功效。

本发明更提供一种牛樟芝萃取物用于制备治疗与Th17细胞调节相关之疾病的药物的用途，其中该牛樟芝萃取物具有抑制Th17细胞分化的功效。

附图说明

图1显示牛樟芝萃取物ACFB03对Th17细胞分化的影响，**：p<0.01，***：p<0.001。

图2显示牛樟芝萃取物ACFB06对Th17细胞分化的影响，*：p<0.05，**：p<0.01。

图3显示牛樟芝萃取物ACFB12对Th17细胞分化的影响，*：p<0.05。

图4显示牛樟芝萃取物AC06-EA对Th17细胞分化的影响，*：p<0.05。

图5显示牛樟芝萃取物AC06-A对Th17细胞分化的影响，**：p<0.01。

图6显示牛樟芝萃取物ACFB12对全身性红斑性狼疮病人的Th17细胞活性的影响，***：p<0.001。

图7显示牛樟芝萃取物ACFB12对葛瑞夫氏病(Graves’disease)人的Th17细胞活性的影响，***：p<0.001。

图8显示牛樟芝萃取物ACFB12对咪喹莫特诱发的干癣动物模式的Th17细胞活性的影响，***：p<0.001。

具体实施方式

在本发明一实施方式中，本发明可提供一种用于调节Th17细胞的医药组合物。本发明的用于调节Th17细胞的医药组合物可包括牛樟芝萃取物为有效成分，但不限于此。

于本发明用于调节Th17细胞的医药组合物中，牛樟芝萃取物可具有调节Th17细胞的功效。上述调节Th17细胞的功效可包括，例如，抑制或促进Th17细胞分化、增生等，但不限于此。在一实施例中，上述调节Th17细胞的功效包括抑制Th17细胞分化。

又，于本发明用于调节Th17细胞的医药组合物中，上述牛樟芝萃取物可包括牛樟芝子实体的萃取物或牛樟芝菌丝体的萃取物。

上述牛樟芝萃取物可通过对牛樟芝子实体或菌丝体进行萃取工艺而获得，但不限于此。上述萃取工艺可使用至少一萃取溶剂。

在一实施例中，上述牛樟芝萃取物为牛樟芝子实体的萃取物。于此实施例中，牛樟芝子实体的萃取物可通过对牛樟芝子实体进行萃取工艺而获得，但不限于此。上述萃取工艺可使用至少一萃取溶剂。

而于此实施例中，上述至少一萃取溶剂可包括，但不限于，醇类及/或水等。上述醇类的例子可包括甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等，但不限于此。在一实施例中，上述醇类为乙醇，又上述乙醇可包括10-95%的乙醇水溶液，但不限于此。此外，在一特定实施例中，上述乙醇可为25%、50%或95%的乙醇水溶液。

再者，上述用以获得牛樟芝子实体的萃取物的萃取工艺可包括下列步骤，但不限于此。

首先，将牛樟芝子实体与上述至少一萃取溶剂形成混合物后再加热回流。在一实施例中，加热回流之时间可为约0.5-8小时。在一特定实施例中，加热回流之时间可为约1小时。

然后，将上述混合物过滤以获得滤液与滤渣，其中所获得的滤液即为牛樟芝子实体萃取物。

在另一实施例中，上述牛樟芝萃取物为牛樟芝菌丝体的萃取物。于此实施例中，牛樟芝菌丝体的萃取物可通过对牛樟芝菌丝体进行萃取工艺而获得，但不限于此。上述萃取工艺可使用至少一萃取溶剂。

又于此实施例中，上述至少一萃取溶剂可包括，但不限于，乙酸乙酯或丙酮等，但不限于此。在一实施例中，至少一萃取溶剂为乙酸乙酯，而在另一实施例中，至少一萃取溶剂为丙酮。

此外，上述用以获得牛樟芝菌丝体的萃取物的萃取工艺可包括下列步骤，但不限于此。

首先，将牛樟芝菌丝体与上述至少一萃取溶剂形成混合物后再加热回流。在一实施例中，加热回流之时间可为约0.5-8小时。在一特定实施例中，加热回流之时间可为约1小时。

然后，将上述混合物过滤以获得滤液与滤渣，其中所获得之滤液即为牛樟芝子菌丝萃取物。

另外，在一实施例中，上述本发明用于调节Th17细胞的医药组合物可更包括药学上可接受之载体或盐类。

于本发明用于调节Th17细胞的医药组成物中，上述药学上可接受之载体可包括，但不限于溶剂、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌与抗真菌试剂与一等渗透压与吸收延迟(absorption delaying)试剂等与药学投予相容者。对于不同的给药方式，可利用一般方法将药学组合物配制成剂型(dosage form)。

又，上述药学上可接受之盐类可包括，但不限于盐类包括无机阳离子，例如，碱金属盐类，如钠、钾或胺盐，碱土金族盐类，如镁、钙盐，含二价或四价阳离子之盐类，如锌、铝或锆盐。此外，也可是为有机盐类，如二环己胺盐类、甲基-D-葡糖胺，胺基酸盐类，如精胺酸、赖氨酸(lysine)、组氨酸、谷氨酰胺。

本发明所制备出药物给药可以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalation spray)或通过植入贮存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)、静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉(intraarterial)、滑囊（腔）内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内(intralesional)注射以及灌注技术。

口服成分的形式可包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)与溶液。

再者，在一实施例中，本发明用于调节Th17细胞的医药组合物系可用于与Th17细胞调节相关之疾病的治疗，但不限于此。上述与Th17细胞调节相关之疾病的例子，可包括，但不限于，全身性红斑性狼疮、葛瑞夫氏病、干癣、类风湿性关节炎、1型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、帕金森氏症、炎症性肠病、过敏性疾病、艾滋病、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌炎、扩张性心肌病变与癌症等。

在另一实施例中，本发明用于调节Th17细胞的医药组合物系可用于全身性红斑性狼疮、葛瑞夫氏病或干癣的治疗。上述全身性红斑性狼疮可包括活动型全身性红斑性狼疮(active systemic lupus erythematosus)，但不限于此。

在本发明另一实施方式中，本发明可提供一种牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞的药物的用途，其中上述牛樟芝萃取物可具有调节Th17细胞的功效。上述调节Th17细胞的功效可包括，但不限于，抑制或促进Th17细胞分化、增生等。在一实施例中，上述调节Th17细胞的功效包括抑制Th17细胞分化。

于本发明牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞的药物的用途中，牛樟芝萃取物可包括牛樟芝子实体的萃取物或牛樟芝菌丝体的萃取物。

上述牛樟芝萃取物可通过对牛樟芝子实体或菌丝体进行萃取工艺而获得，但不限于此。上述萃取工艺可使用至少一萃取溶剂。

在一实施例中，上述牛樟芝萃取物为牛樟芝子实体的萃取物。于此实施例中，牛樟芝子实体的萃取物可通过对牛樟芝子实体进行萃取工艺而获得，但不限于此。上述萃取工艺可使用至少一萃取溶剂。

上述至少一萃取溶剂可包括，醇类及/或水等，但不限于此。适合之醇类可包括，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等，但不限于此。在一实施例中，醇类为乙醇，又乙醇可包括10-95%的乙醇水溶液，但不限于此。此外，在一特定实施例中，上述乙醇可为25%、50%或95%的乙醇水溶液。

上述用以获得牛樟芝子实体的萃取物的萃取工艺可包括下列步骤，但不限于此。

首先，将牛樟芝子实体与上述至少一萃取溶剂形成混合物后再加热回流。在一实施例中，加热回流之时间可为约0.5-8小时。在一特定实施例中，加热回流之时间可为约1小时。

接着，将上述混合物过滤以获得滤液与滤渣，其中所获得之滤液即为牛樟芝子实体萃取物。

在另一实施例中，上述牛樟芝萃取物则为牛樟芝菌丝体的萃取物。于此实施例中，牛樟芝菌丝体的萃取物可通过对牛樟芝菌丝体进行萃取工艺而获得，但不限于此。上述萃取工艺可使用至少一萃取溶剂。

又于此实施例中，上述至少一萃取溶剂可包括，但不限于，乙酸乙酯或丙酮等，但不限于此。在一实施例中，至少一萃取溶剂为乙酸乙酯，而在另一实施例中，至少一萃取溶剂为丙酮。

此外，上述用以获得牛樟芝菌丝体的萃取物的萃取工艺可包括下列步骤，但不限于此。

首先，将牛樟芝菌丝体与上述至少一萃取溶剂形成混合物后再加热回流。在一实施例中，加热回流之时间可为约0.5-8小时。在一特定实施例中，加热回流之时间可为约1小时。

然后，将上述混合物过滤以获得滤液与滤渣，其中所获得之滤液即为牛樟芝子菌丝萃取物。

又，在一实施例中，于本发明牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞的药物的用途中，上述调节Th17细胞的药物系可用于与Th17细胞调节相关之疾病的治疗，但不限于此。

与Th17细胞调节相关之疾病可包括全身性红斑性狼疮、葛瑞夫氏病、干癣、类风湿性关节炎、1型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、帕金森氏症、炎症性肠病、过敏性疾病、艾滋病、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌炎、扩张性心肌病变或癌症等，但不限于此。

又，于本发明牛樟芝萃取物用于制备调节Th17细胞的药物的用途中，上述调节Th17细胞的药物系可用于全身性红斑性狼疮、葛瑞夫氏病或干癣的治疗，但不限于此。上述全身性红斑性狼疮可包括，例如活动型全身性红斑性狼疮。

在本发明又另一实施方式中，本发明可提供一种牛樟芝萃取物用于制备治疗与Th17细胞调节相关之疾病的药物的用途，其中上述牛樟芝萃取物具有抑制Th17细胞分化的功效。在一实施例中，牛樟芝萃取物为前述之牛樟芝萃取物。

与Th17细胞调节相关之疾病的例子，可包括，限于全身性红斑性狼疮、葛瑞夫氏病、干癣、类风湿性关节炎、1型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、帕金森氏症、炎症性肠病、过敏性疾病、艾滋病、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌炎、扩张性心肌病变与癌症等。

在一实施例中，上述与Th17细胞调节相关之疾病为全身性红斑性狼疮、葛瑞夫氏病或干癣。又，上述全身性红斑性狼疮可包括，例如活动型全身性红斑性狼疮。

实施例

实施例1：牛樟芝萃取物的制备

1.牛樟芝子实体萃取物ACFB03的制备

ACFB03样品的制备方法描述如下：

(1)将10g牛樟芝子实体粉体，加入100ml的95%乙醇水溶液以形成混合物，且之后将混合物加热回流1小时。

(2)将混合物利用离心方式去除于其中的杂质（6000rpm；20分钟）以收集上清液，之后以减压浓缩去除于上清液中的溶剂以获得干燥的萃取物。

(3)加入20ml纯水，且以超声波震荡，以回溶上述萃取物并形成悬浮液。

(4)将悬浮液进行冷冻干燥，以去除水分。

(5)收集冷冻干燥的样品共1.67g。代号ACFB03。

2.牛樟芝子实体萃取物ACFB06的制备

ACFB06样品的制备方法描述如下：

(1)将10g牛樟芝子实体粉体，加入100ml的25%乙醇水溶液以形成混合物，且之后将混合物加热回流1小时。

(2)将混合物利用离心方式去除于其中的杂质（6000rpm；20分钟）以收集上清液，之后以减压浓缩去除于上清液中的溶剂以获得干燥的萃取物。

(3)加入20ml纯水，且以超声波震荡，以回溶上述萃取物并形成悬浮液。

(4)将悬浮液进行冷冻干燥，以去除水分。

(5)收集冷冻干燥的样品共0.59g。代号ACFB06。

3.牛樟芝子实体萃取物ACFB12的制备

ACFB12样品的制备方法描述如下：

(1)将80g牛樟芝子实体粉体，加入800ml的50%乙醇水溶液以形成混合物，且之后将混合物加热回流1小时。

(2)趁热将混合物以滤纸(Toyo,N0.2)减压过滤，以收集滤液并获得牛樟芝子实体残留物（滤渣）。持续减压抽滤30分钟以抽干牛樟芝子实体残留物。

(3)回收上述牛樟芝子实体残留物，并将1600ml的纯水加入其中以形成混合物，之后将混合物加热回流1小时。

(4)趁热将混合物以利用滤纸(Toyo,N0.2)减压过滤，收集滤液。

(5)收集两次的滤液进行减压浓缩，先浓缩步骤2的滤液，且于浓缩步骤2的滤液之步骤期间再合并步骤4所得滤液进行减压浓缩，浓缩至合适浓度后进行冷冻干燥，以去除水分。

(6)收集冷冻干燥的样品共20.34g。代号ACFB12。

4.牛樟芝菌丝体萃取物AC06-EA（乙酸乙酯萃取物）的制备

AC06-EA样品的制备方法描述如下：

(1)将2g牛樟芝菌丝体，加入30ml的乙酸乙酯混合以形成混合物，且之后将混合物加热回流1小时。

(2)将混合物利用离心方式去除混合物中的杂质（6000rpm；10分钟），再经滤纸(Toyo,N0.2)过滤以收集滤液，之后以减压浓缩去除于滤液中的溶剂以获得萃取物。

(3)收集萃取物样品共0.32g。代号AC06-EA。

5.牛樟芝菌丝体萃取物AC06-A（丙酮萃取物）的制备

AC06-A样品的制备方法描述如下：

(1)将2g牛樟芝菌丝体，加入30ml的丙酮混合以形成混合物，且之后将混合物加热回流1小时。

(2)将混合物利用离心方式去除混合物中的杂质（6000rpm；10分钟），再经滤纸(Toyo,N0.2)过滤以收集滤液，之后以减压浓缩去除于滤液中的溶剂以获得萃取物。

(3)收集萃取物样品共0.30g。代号AC06-A。

实施例2：牛樟芝子实体萃取物对于抑制Th17细胞分化能力的评估

于本实施例中，透过小鼠脾脏细胞建构的Th17细胞分化系统，评估实施例1所得的牛樟芝子实体萃取物（ACFB12、ACFB03、ACFB06）与牛樟芝菌丝体萃取物（AC06-EA与AC06-A）对于Th17细胞分化的影响。

1.牛樟芝子实体萃取物ACFB03对于抑制Th17细胞分化能力的评估将C57BL/6小鼠（6～8周龄）的脾脏取出并利用筛网磨碎，收集细胞悬浮液即为初级脾脏细胞。接着利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分离出CD4⁺T细胞，取将细胞以5×10⁵细胞/孔的密度加入24孔细胞培养盘中，并将细胞分成控制组、负对照组、实验组A、实验组B、实验组C五组，而各组的详细处理如表1所示。

表1、各组别的详细处理

参见表1。控制组系为未加入任何处理试剂的CD4⁺T细胞；负对照组为Th17分化组，给予细胞激素与中和性抗体处理，促使CD4⁺T细胞分化为Th17细胞；实验组A、实验组B与实验组C，为分别同时加入不同浓度的牛樟芝子实体萃取物(ACFB03)，以观察其对于Th17细胞分化的影响。将上述细胞于37℃且含5％CO₂培养箱中培养。经过三天培养后，分别于每个孔洞中加入10μl PMA(0.05mg/ml)(Sigma)与1μl brefeldin A(eBioscience)刺激4小时，之后分别收取细胞与上清液体。细胞部分通过Fixation&Permeabilization Buffers(eBioscience)进行固定与穿透，接着加入抗-小鼠IL-17FITC抗体(0.25μg/test)(eBioscience)进行染色，且透过流式细胞仪(Partec)分析Th17细胞的百分比，其结果如图1所示。

图1显示，实验组中给予牛樟芝子实体萃取物（ACFB03）处理后能抑制Th17细胞的分化，且在10μg/ml与20μg/ml的浓度处理下，皆有良好的抑制效果，几乎可完全抑制Th17细胞的分化。

2.牛樟芝子实体萃取物ACFB06对于抑制Th17细胞分化能力的评估将C57BL/6小鼠（6～8周龄）的脾脏取出并利用筛网磨碎，收集细胞悬浮液即为初级脾脏细胞。接着利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分离出CD4⁺T细胞，将细胞以5×10⁵细胞/孔的密度加入24孔细胞培养盘中，并将细胞分成控制组、负对照组、实验组D、实验组E、实验组F五组，而各组的详细处理如表1所示。

表2、各组别的详细处理

参见表2。控制组系为未加入任何处理试剂的CD4⁺T细胞；负对照组为Th17分化组，给予细胞激素与中和性抗体处理，促使CD4⁺T细胞分化为Th17细胞；实验组D、实验组E与实验组F，为分别同时加入不同浓度的牛樟芝子实体萃取物ACFB06，以观察其对于Th17细胞分化的影响。将上述细胞于37℃且含5％CO₂培养箱中培养。经过三天培养后，分别于每个孔洞中加入10μl PMA(0.05mg/ml)(Sigma)与1μl brefeldin A(eBioscience)刺激4小时，之后分别收取细胞与上清液体。细胞部分通过Fixation&Permeabilization Buffers(eBioscience)进行固定与穿透，接着加入抗-小鼠IL-17FITC抗体(0.25μg/test)(eBioscience)进行染色，且透过流式细胞仪(Partec)分析Th17细胞的百分比，其结果如图2所示。

图2显示，实验组中给予牛樟芝子实体萃取物ACFB06处理后，亦可抑制Th17细胞的分化。

3.牛樟芝子实体萃取物ACFB12对于抑制Th17细胞分化能力的评估将C57BL/6小鼠（6～8周龄）的脾脏取出并利用筛网磨碎，收集细胞悬浮液即为初级脾脏细胞。接着利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分离出CD4⁺T细胞，将细胞以5×10⁵细胞/孔的密度加入24孔细胞培养盘中，并将细胞分成控制组、负对照组、实验组G、实验组H、实验组I五组，而各组的详细处理如表3所示。

表3、各组别的详细处理

参见表3。控制组系为未加入任何处理试剂之CD4⁺T细胞；负对照组为Th17分化组，给予细胞激素与中和性抗体处理，促使CD4⁺T细胞分化为Th17细胞；实验组G、实验组H与实验组I，为分别同时加入不同浓度的牛樟芝子实体萃取物ACFB12，以观察其对于Th17细胞分化的影响。将上述细胞于37℃且含5％CO₂培养箱中培养。经过三天培养后，分别于每个孔洞中加入10μl PMA(0.05mg/ml)(Sigma)与1μl brefeldin A(eBioscience)刺激4小时，之后分别收取细胞与上清液体。细胞部分通过Fixation&Permeabilization Buffers(eBioscience)进行固定与穿透，接着加入抗-小鼠IL-17FITC抗体(0.25μg/test)(eBioscience)进行染色，且透过流式细胞仪(Partec)分析Th17细胞的百分比，其结果如图3所示。

图3显示，实验组中给予牛樟芝子实体萃取物ACFB12处理后能抑制Th17细胞的分化，其抑制效果随着剂量增加有相对增强之趋势，尤其在10μg/ml与20μg/ml的浓度下之抑制效果更为显著。

根据图1-3所示之结果可知，牛樟芝子实体萃取物ACFB06对Th17细胞的分化的抑制效果相对于牛樟芝子实体萃取物ACFB12及ACFB03则减弱许多。

实施例3：牛樟芝菌丝体萃取物对于抑制Th17细胞分化能力的评估

于本实施例中，透过小鼠脾脏细胞建构的Th17细胞分化系统，评估实施例1所得的牛樟芝菌丝体萃取物（AC06-EA与AC06-A）对于Th17细胞分化的影响。

1.牛樟芝菌丝体萃取物AC06-EA对于抑制Th17细胞分化能力的评估

将C57BL/6小鼠（6～8周龄）的脾脏取出并利用筛网磨碎，收集细胞悬浮液即为初级脾脏细胞。接着利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分离出CD4⁺T细胞，将细胞以5×10⁵细胞/孔的密度加入24孔细胞培养盘中，并将细胞分成控制组、负对照组、实验组J、实验组K、实验组L五组，而各组的详细处理如表4所示。

表4、各组别的详细处理

参见表4。控制组系为未加入任何处理试剂的CD4⁺T细胞；负对照组为Th17分化组，给予细胞激素与中和性抗体处理，促使CD4⁺T细胞分化为Th17细胞；实验组J、实验组K与实验组L，为分别同时加入不同浓度的牛樟芝菌丝体萃取物AC06-EA，以观察其对于Th17细胞分化的影响。将上述细胞于37℃且含5％CO₂培养箱中培养。经过三天培养后，分别于每个孔洞中加入10μl PMA(0.05mg/ml)(Sigma)与1μl brefeldin A(eBioscience)刺激4小时，之后分别收取细胞与上清液体。细胞部分通过Fixation&Permeabilization Buffers(eBioscience)进行固定与穿透，接着加入抗-小鼠IL-17FITC抗体(0.25μg/test)(eBioscience)进行染色，且透过流式细胞仪(Partec)分析Th17细胞的百分比，其结果如图4所示。

图4显示，实验组中给予牛樟芝菌丝体萃取物AC06-EA处理后能抑制Th17细胞的分化，其抑制效果随着剂量增加有相对增强之趋势，尤其在20μg/ml的浓度下，有较显著的抑制效果。

2.牛樟芝菌丝体萃取物AC06-A对于抑制Th17细胞分化能力的评估

将C57BL/6小鼠（6～8周龄）的脾脏取出并利用筛网磨碎，收集细胞悬浮液即为初级脾脏细胞。接着利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分离出CD4⁺T细胞，将细胞以5×10⁵细胞/孔的密度加入24孔细胞培养盘中，并将细胞分成控制组、负对照组、实验组M、实验组N、实验组O五组，而各组的详细处理如表5所示。

表5、各组别的详细处理

参见表5。控制组系为未加入任何处理试剂的CD4⁺T细胞；负对照组为Th17分化组，给予细胞激素与中和性抗体处理，促使CD4⁺T细胞分化为Th17细胞；实验组M、实验组N与实验组O，为分别同时加入不同浓度的牛樟芝菌丝体萃取物AC06-A，以观察其对于Th17细胞分化的影响。将上述细胞于37℃且含5％CO₂培养箱中培养。经过三天培养后，分别于每个孔洞中加入10μl PMA(0.05mg/ml)(Sigma)与1μl brefeldin A(eBioscience)刺激4小时，之后分别收取细胞与上清液体。细胞部分通过Fixation&Permeabilization Buffers(eBioscience)进行固定与穿透，接着加入抗-小鼠IL-17FITC抗体(0.25μg/test)(eBioscience)进行染色，且透过流式细胞仪(Partec)分析Th17细胞的百分比，其结果如图5所示。

图5显示，实验组中给予牛樟芝菌丝体萃取物AC06-A处理后，亦可抑制Th17细胞的分化且其抑制效果与AC06-EA相似。

实施例4：牛樟芝子实体萃取物ACFB12对于全身性红斑性狼疮病人的Th17细胞的影响

于本实验中，透过全身性红斑性狼疮病人外周血单核细胞，来评估牛樟芝子实体萃取物ACFB12对于Th17细胞活性的影响。其实施步骤如下所述：

将21位活动型全身性红斑性狼疮病人及20位健康者的外周血以ACFB12(20ng/ml)（实验组）或是DMSO（对照组）处理6小时后，分离其单核细胞。之后再以IL-17抗体进行细胞内染色，最后利用流式细胞仪分析Th17细胞的百分比。实验结果如图6所示。

图6实验结果显示，牛樟芝子实体萃取物ACFB12于20ng/ml下即可有效降低全身性红斑性狼疮病人的Th17细胞（平均值：0.95%vs.0.48%；p<0.001），但ACFB12对于健康者的Th17细胞则无影响。

实施例5：牛樟芝子实体萃取物ACFB12对于葛瑞夫氏病人的Th17细胞的影响

本实施例中，透过葛瑞夫氏病人外周血单核细胞来评估牛樟芝子实体萃取物ACFB12对于Th17细胞的影响。其实施步骤如下：

收集5位葛瑞夫氏病人与3位健康者的外周血，接着分离出外周血单核细胞，分别给予ACFB12(20μg/ml)（实验组）与DMSO(对照组)处理72小时后，再以IL-17抗体进行细胞内染色，最后利用流式细胞仪分析Th17细胞的百分比。实验结果如图7所示。

图7实验结果显示，牛樟芝子实体萃取物ACFB12于20μg/ml浓度处理下，可降低葛瑞夫氏病人的Th17细胞（平均值：0.25%vs.0.13%；p<0.001），但ACFB12对于健康者的Th17细胞则无显著影响（平均值：0.06%vs.0.04%；p=0.161）。

实施例6：牛樟芝子实体萃取物ACFB12对于咪喹莫特(imiquimod,IMQ)诱导的干癣动物模式Th17细胞的影响

本实施例中，透过咪喹莫特(imiquimod,IMQ)诱导的干癣动物模式来评估牛樟芝子实体萃取物ACFB12对于Th17细胞的影响。其实施步骤如下：首先将Balb/c小鼠（6～8周龄）背部毛发剃除，并将小鼠分成控制组、对照组、实验组三组，控制组中未给予小鼠任何处理；对照组将62.5mg咪喹莫特乳膏(Aldara；3M Pharmaceuticals)涂抹于小鼠背部，每天给予一次咪喹莫特乳膏，连续给予十天，以诱导小鼠皮肤干癣症状产生；而实验组则将62.5mg咪喹莫特乳膏涂抹于小鼠背部，接着透过腹腔注射给予牛樟芝子实体萃取物ACFB12(10mg/kg)，每天给予一次咪喹莫特乳膏与牛樟芝子实体萃取物ACFB12(10mg/kg)，连续给予十天。之后牺牲小鼠并且将其脾脏取出，并将脾脏通过70-μm格状铁网以取得单颗细胞悬浮液。利用红血球细胞裂解液(Red blood cell lysis buffer)剔除于上述单颗细胞悬浮液中的红血球，然后将其以经由PBS清洗两次后，即获得初级脾脏淋巴球细胞。进一步将脾脏淋巴球细胞(2×10⁶)植入已涂覆抗-CD3单株抗体(1μg/ml)(BD Pharmingen)的24孔细胞培养盘中，刺激细胞24小时后，取出细胞溶于0.2%BSA/PBS，利用抗-小鼠CD4PE抗体染色30分钟，接着将细胞利用PBS清洗三次。进一步利用2%多聚甲醛(paraformaldehyde)与0.5%皂素(saponin)进行固定与穿透，接着加入抗-小鼠IL-17FITC抗体进行细胞内部的染色。最后利用流式细胞仪(FACSCalibur;BD Biosciences)及CellQuest软体(BD Biosciences)分析CD4⁺/IL-17⁺双阳性细胞之百分比。

图8显示，对照组相对于控制组在给予咪喹莫特后，可明显增强小鼠脾脏的CD4⁺/IL-17⁺双阳性细胞，然而在实验组中同时给予咪喹莫特与牛樟芝子实体萃取物ACFB12后,则可降低CD4⁺/IL-17⁺双阳性细胞（平均值：9.3%vs.3.6%；p<0.001）。

Claims (5)

1.一种牛樟芝萃取物用于制备治疗葛瑞夫氏病或干癣的药物的用途，其中该牛樟芝萃取物具有抑制Th17细胞分化的功效。

2.如权利要求1所述的牛樟芝萃取物用于制备治疗葛瑞夫氏病或干癣的药物的用途，其中该牛樟芝萃取物包括牛樟芝子实体的萃取物或牛樟芝菌丝体的萃取物。

3.如权利要求2所述的牛樟芝萃取物用于制备治疗葛瑞夫氏病或干癣的药物的用途，其中该萃取物为以水、醇类、酯类、烷类或卤烷溶剂萃取而得。

4.如权利要求3所述的牛樟芝萃取物用于制备治疗葛瑞夫氏病或干癣的药物的用途，其中该醇类包括甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇。

5.如权利要求4所述的牛樟芝萃取物用于制备治疗葛瑞夫氏病或干癣的药物的用途，其中该乙醇包括10-95％的乙醇水溶液。