CN104359883A - 人源沉默信息调节因子6的活性荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，本发明利用含有荧光基团与淬灭基团（FRET效应）、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物，将荧光强度与Sirtuin6的酶活性关联起来，FRET效应可以使底物长链脂肪酰化赖氨酸这一Sirtuin6识别位点位于底物的中部，这样一来，使得底物多肽更接近于Sirtuin6的天然底物，结合更紧密 ；同时，可以给予更多选择的荧光基团，最终，可以得到更可靠的筛选结果。这样的方法可应用于Sirtuin6调节剂的筛选，或是生物样本中的Sirtuin6活性检测，具有微型化、自动化、快速可靠等特点，适用于高通量的应用，也可应用于新型Sirtuin6活性检测试剂盒的开发和开展Sirtuin6调节剂的筛选服务。

Description

人源沉默信息调节因子6的活性荧光检测方法

技术领域

本发明涉及药学领域，尤其是一种人源沉默信息调节因子6（Sirtuin 6或SIRT6）的活性荧光检测方法。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶是一类催化各种底物蛋白赖氨酸残基侧链的乙酰基水解的蛋白酶家族。目前发现的人源的组蛋白去乙酰化酶包括4个亚类共 18个亚种。按催化机理的不同，它们分为经典的I类、II类和IV类以锌为辅酶的组蛋白去乙酰化酶(HDAC，有11种分别是HDAC1到HDAC11)[ A. J. de Ruijter, et al. Biochem. J. 2003, 370, 737]；另外，比较特殊的III类以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）为辅酶的组蛋白去乙酰化酶，也叫做沉默信息调节因子(Sirtuin，有7种分别是SIRT1到SIRT7) 。根据蛋白序列的相似性以及进化分类，所有物种的Sirtuin又被分成四大类：SIRT1, SIRT2, SIRT3属于I类；SIRT4属于II类；SIRT5属于III类；SIRT6和SIRT7属于IV类[A. A. Sauve, et al. Annu. Rev. Biochem. 2006, 75, 435]。

研究表明，HDAC抑制剂可以抑制肿瘤细胞的生长、促进其分化及凋亡，而对正常细胞几乎没影响。因此，它们已成为新一代明星靶向抗癌药物，目前多种HDAC抑制剂正处于临床前期和临床试验中[G. Giannini, et al. Future Med. Chem. 2012, 4, 1439; S. Minucci, et al. Nature Reviews Cancer 2006, 6, 38] 。Vorinostat和FK228（图10）已被美国FDA分别于2006年和2009年批准用于治疗难治性的皮肤Ｔ细胞淋巴瘤[M. Duvic, et al. Blood 2007, 109, 31; R. L. Piekarz, et al. J. Clin. Oncol. 2009, 27, 5410]。已上市的这两个药物都是机理型的HADC抑制剂，但它们都不是选择性地只抑制某一个HDAC。这有可能导致这两个药物在治疗过程中会带来的一些副作用，如疲劳、恶心、腹泻、肺栓塞和血小板减少等，甚至极个别的心脏毒性[G. Giannini, et al. Future Med. Chem. 2012, 4, 1439; S. Minucci, et al. Nature Reviews Cancer 2006, 6, 38]。

相对于HDAC抑制剂， Sirtuin抑制剂的抗肿瘤研究相对滞后，报道的不多[S. Sanchez-Fidalgo, et al. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2414]。目前只有一个针对Sirtuin的非特异性抑制剂（EX-527）在欧洲进入一期临床研究 [Y. Zhang, et al. Oncogene 2009, 28, 445]。

Sirtuin抑制剂开发相对滞后的主要原因在于，在这四大类的Sirtuin当中，仅有I类Sirtuin（即SIRT1,SIRT2和SIRT3）具有显著的去乙酰化酶活；而其他的II、III、IV类Sirtuin（SIRT4、 SIRT5、SIRT6和SIRT7）的去乙酰化酶活则是非常微弱[E. Michishita, et al. Mol. Biol. Cell 2005, 16, 4623; G. Liszt, et al. J. Biol. Chem. 2005, 280, 21323; M. C. Haigis, et al. Cell 2006, 126, 941; A. Schuetz, et al. Structure, 2007, 15, 277; E. Michishita et al. Nature, 2008, 452, 292]。对于这些仅具有微弱去乙酰化活性的Sirtuin来说，我们很难开发出可靠的Sirtuin活性筛选方法去开发它们的调节剂。

近期的最新研究成果表明，IV类Sirtuin中的一员SIRT6是NAD依赖的去长链脂肪酰化酶（NAD-dependent defatty-aclyase）

根据SIRT6去长链脂肪酰化酶活性的这一最新研究结果，已开发出香豆素偶联多肽的荧光底物并建立了相关的SIRT6的活性筛选方法[CN103403553A; J. Hu, et al. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 5213]。然而，这些方法依赖的香豆素只能连接在多肽的C端，使得底物长链脂肪酰化赖氨酸这一SIRT6识别位点只能位于C端，从而导致了底物多肽与SIRT6的亲和力下降，另一方面，香豆素基团还可能给后续的药物筛选带来一些误导[K. T. Howitz, et al. Nature 2003, 425, 191 ; M. Kaeberlein, et al. J. Biol. Chem. 2005, 280, 17038; M.T. Borra, et al. J. Biol. Chem. 2005, 280, 17187; D. Beher, et al. Chem. Biol. Drug Des. 2009, 74, 619; M, Pacholec, et al. J. Biol. Chem. 2010, 285, 8340]。

因此，SIRT6的新型活性筛选方法亟待研究和开发。

发明内容

本发明的目的是：提供一种人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，它的筛选效果更准确，且简单易行，成本低廉，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物， 1）将所述底物与人源沉默信息调节因子6孵育，脱去底物的赖氨酸残基上的长链脂肪酰化修饰，得到无修饰的赖氨酸多肽；2）将所述的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液孵育，从赖氨酸的C端裂解肽键；使荧光强度与上述的无修饰的赖氨酸多肽关联起来，该检测得到荧光强度与人源沉默信息调节因子6的酶活性具有相关性。

所述的以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物具有如下结构式：

式中，R1及R2均表示3个以上氨基酸；所述的多肽为通过肽键相连的3个以上的氨基酸；在该氨基酸序列中没有无修饰的赖氨酸或者精氨酸，且长链脂肪酰化赖氨酸残基不能位于多肽的两端。

所述的配对的荧光基团和荧光淬灭基团包括Edans/Dabcyl、Trp/Dansyl、Trp/DNP、MCA/DNP, Abz/DNP或Abz/Tyr(NO₂)。

所述的蛋白水解酶裂解液为蛋白质裂解液其有效成分为胰蛋白酶、羧肽酶或gluc-C。

所述底物与人源沉默信息调节因子5的体积比为10:1，孵育时间为30分钟；所得的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液的体积比为10：1，孵育时间为1小时；上述的孵育温度为25-37℃。

本发明作为底物的多肽所含的两个基团，属于荧光供体-荧光淬灭受体的关系。根据荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理，当荧光供体-荧光淬灭受体的这两个基团通过共价键（肽键）连接保持一定的距离内，荧光基团发出的荧光会被荧光淬灭基团吸收，导致底物的荧光强度非常弱，当蛋白水解酶裂解液处理后，多肽的肽键断裂，荧光基团和荧光淬灭基团失去了FRET的有效距离，荧光基团的荧光强度大大增强，荧光强度和所述无修饰的赖氨酸多肽关联起来，而所述无修饰的赖氨酸多肽又和人源沉默信息调节因子6（以下简称Sirtuin6或SIRT6）的活性相关，因此，FRET信号降低，荧光信号增强，与Sirtuin6活性具有相关性。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明利用含有荧光基团与荧光淬灭基团（FRET效应）、且带有长链脂肪酰化修饰基团的多肽为底物，将荧光强度与Sirtuin6的酶活性关联起来，FRET效应可以使底物长链脂肪酰化赖氨酸这一Sirtuin6识别位点位于底物的中部，这样一来，使得底物多肽更接近于Sirtuin6的天然底物，结合更紧密 ；同时，可以给予更多选择的荧光基团，最终，可以得到更可靠的筛选结果。这样的方法可应用于Sirtuin6调节剂的筛选，或是生物样本中的Sirtuin6活性检测，具有微型化、自动化、快速可靠等特点，适用于高通量的应用，也可应用于新型SIRT6活性检测试剂盒的开发和开展Sirtuin6调节剂的筛选服务。且本发明的筛选效果准确，简单易行，成本低廉。

附图说明

图1：使用含Dabcyl、Edans及长链脂肪酰化赖氨酸的多肽作为Sirtuin6活性检测的底物；

图2：(Dabcyl)ISGASEKDIVHSE(Edans)G多肽的FRET效应；

图3：Fmoc保护的长链脂肪酰化赖氨酸及FRET多肽的合成；

图4：(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)DIVHSE(Edans)G是Sirtuin6的底物；

图5：测定(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)KDIVHSE(Edans)G多肽在SIRT6催化下的动力学曲线；动力学参数分别是Km为10.8uM、Kcat为0.0030S^-1和Kcat/Km为277S^-1 M^-1；

图6：测定(Dabcyl)ISGASEK(Acetyl)KDIVHSE(Edans)G多肽在SIRT6催化下的动力学曲线；动力学参数分别是Km为178.5uM、Kcat为0.0024S^-1和Kcat/Km为14S^-1 M^-1；

图7：使用(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)DIVHSE(Edans)G筛选SIRT6的抑制剂；

附图8使用(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)DIVHSE(Edans)G测定SIRT6抑制剂的IC50。

具体实施方式

本发明的实施例1：人源沉默信息调节因子6的活性荧光检测方法：

试剂和仪器

所有试剂均从Aldrich 或Acros公司购买分析纯级别，未做进一步处理；VARIAN INOVA 400M Hz核磁共振仪；液质配置为岛津-LC20A和Thermo LCQ FLEET质谱，分析柱为Sprite TARGA C18 column (40 × 2.1 mm, 5 μm, Higgins Analytical, Inc.)，检测波长为215和280纳米，采用0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸乙腈溶液的二元梯度洗脱方式；BIO-TEK® Synergy H4多功能酶标仪 (激发波长336 nm ，发射波长490 nm)。

多肽的合成与纯化

合成路线如图3所示，长链脂肪酰化多肽及其他多肽均是通过Fmoc-Wang树脂，采用标准的Fmoc/tBu多肽合成通法合成的（Du et al., Biochemistry 48: 2878-2890, 2009）。含长链脂肪酰化修饰的氨基酸，及其他Fmoc保护的氨基酸，按照设计序列顺序依次连接。最后，通过含有苯酚（5%），茴香硫醚（5%），乙二硫醇（2.5%）和水（5%）的三氟醋酸溶液与氨基酸连接完成的树脂孵育2~4小时，从树脂上切下来，得到无保护的多肽粗品。经过反相HPLC纯化，冻干机冻干，得到白色固体的目标多肽。(Dabcyl)ISGASEKDIVHSE(Edans)G 多肽（SEQ ID NO:1），分子式C₈₆H₁₂₂N₂₂O₂₇S，LC-MS(ESI) 计算值[M+H⁺]=1927.9，实测值[M+H⁺]=1928.3。(Dabcyl)ISGASEK(Acetyl)DIVHSE(Edans)G 多肽（SEQ ID NO:2），分子式C₈₈H₁₂₄N₂₂O₂₈S，LC-MS(ESI) 计算值[M+H⁺]=1969.9，实测值[M+H⁺]=1970.1。(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)DIVHSE(Edans)G 多肽（SEQ ID NO:3），分子式C₁₀₀H₁₄₈N₂₂O₂₈S，LC-MS(ESI) 计算值[M+H⁺]=2138.1，实测值[M+H⁺]=2138.7。

(Dabcyl)ISGASEKDIVHSE(Edans)G 多肽（SEQ ID NO:1）的结构式如下：

(Dabcyl)ISGASEK(Acetyl)DIVHSE(Edans)G 多肽（SEQ ID NO:2）的结构式如下：

(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)DIVHSE(Edans)G 多肽（SEQ ID NO:3）的结构式如下：

人源 NAD 依赖的去乙酰化酶 (Sirtuin) 的克隆、表达和纯化

人源NAD依赖的去乙酰化酶(Sirtuin)的SIRT6如文献所述进行克隆、表达和纯化（J. Hu, et al. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 5213）。使用TOPO和GATEWAY克隆技术（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）克隆到pDEST-F1表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。得到的蛋白裂解液通过HisTrap^TM HP色谱柱（GE Healthacare, US）进行纯化。得到的蛋白溶液通过Bradford试剂测定其蛋白浓度。

多肽在 SIRT6 催化下的动力学参数

通过HPLC检测酰化与去酰化FRET多肽的检测，来计算SIRT6的动力学参数。纯化的SIRT6（对于长链脂肪酰化多肽采用0.2 uM；对于乙酰化多肽采用1uM）与1mM NAD、1mM DTT、20mM Tris-HCl 缓冲液（PH 7.4）和FRET多肽(对于长链脂肪酰化多肽采用2-256uM；对于乙酰化多肽采用10-500uM)组成的反应液，在37^oC下孵育60分钟。所述反应液用100mM盐酸和160mM乙酸中止反应。通过HPLC的梯度洗脱，分离酰化与去酰化FRET多肽，反应收率按照336nm下的吸收峰面积计算，假定这两种多肽在该波长下摩尔吸光系数一样。Kcat和Km值是通过使用KaleidaGraph曲线拟合Vinitial/[E]比[S]得到。所述测试均重复一次进行。实验结果如图5和图6所示。

多肽的 FRET 效应

将10uM所述无修饰的FRET多肽（SEQ ID NO:1）、20mM Tris-HCl缓冲液（PH 7.4）和6.25U胰蛋白酶（Trypsin）组成的反应液（同时设一组不加胰蛋白酶（Trypsin）的作为对照组），在37^oC下孵育1小时后，加入等体积的100mM盐酸和160mM乙酸中止反应。利用BIO-TEK® Synergy H4多功能酶标仪 (激发波长336 nm ，发射波长490 nm)，检测各个样品的荧光信号强度。实验结果如图2所示。

多肽在 SIRT6 催化下的荧光实验

将10uM所述含长链脂肪酰化修饰的FRET多肽（SEQ ID NO:3）、20mM Tris-HCl缓冲液（PH 7.4）、1mM NAD、1mM DTT分别和不同浓度SIRT6（0.2，0.5, 1，2uM）组成的反应液，在37^oC下孵育1小时后，加入6.25U胰蛋白酶（Trypsin）和2mM烟酰胺继续在37^oC下孵育1小时。加入等体积的100mM盐酸和160mM乙酸中止反应。利用BIO-TEK® Synergy H4多功能酶标仪 (激发波长336 nm ，发射波长490 nm)，检测各个样品的荧光信号强度。实验原理如图1所示。实验结果如图4所示。

根据图1得知，使用含Dabcyl、Edans及长链脂肪酰化赖氨酸的多肽作为SIRT6活性检测的底物。

根据图2得知，上述多肽(Dabcyl)ISGASEKDIVHSE(Edans)G能够产生FRET效应。有或没有胰蛋白酶（Trypsin）下，上述多肽孵育1小时。与没有Trypsin的对照相比，Trypsin（6.25U）孵育后的荧光强度增强了15倍。

根据图3得知，Fmoc保护的长链脂肪酰化赖氨酸、FRET多肽的合成途径。

根据图4得知，在SIRT6存在或者不存在下，与(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)DIVHSE(Edans)G多肽孵育1小时，然后，加入6.25U的胰蛋白酶（Trypsin）孵育1小时，与SIRT6不存在的阴性对照相比，0.2, 0.5, 1, 2uM SIRT6存在下的荧光强度均增加10倍以上。

根据图5得知，SIRT6的去长链脂肪酰化活性，酶动力学参数分别是Km为10.8uM、Kcat为0.0030S^-1和Kcat/Km为277S^-1 M^-1。

根据图6得知，SIRT6的去乙酰化活性，酶动力学参数分别是Km为178.5uM、Kcat为0.0024S^-1和Kcat/Km为14S^-1 M^-1。

本发明的实施例2：Sirtuin 6调节剂的筛选方法：

(Dabcyl)ISGASEK(Myristoyl)DIVHSE(Edans)G 筛选 SIRT6 的抑制剂

这里步骤和上所述步骤（(Dabcyl)ISGASEK(Succinyl)DIVHSE(Edans)G多肽在SIRT6催化下的荧光实验）相同，除了反应中加入不同待测化合物（浓度均为30uM），在第一步反应中，最后添加SIRT6来启动反应。实验结果如图7所示。

测定 SIRT6 抑制剂的 IC50

这里步骤和上所述步骤（(Dabcyl)ISGASEK(Succinyl)DIVHSE(Edans)G筛选SIRT6的抑制剂）相同，除了反应中加入不同浓度的Nicotinamide（浓度分别为50, 100, 200, 500, 1000, 2000uM）。实验结果如图8所示。

根据图7得知，使用无SIRT6和只加SIRT6作为对照组。所有小分子的浓度为300uM。Nicotinamide表现出显著的SIRT6抑制活性。

根据图8得知，使用无SIRT6和只加SIRT6作为对照组。其余各组分别加入不同浓度的，Nicotinamide的浓度分别为50, 100, 200, 500, 1000, 2000uM。通过荧光强度，计算出Nicotinamide对SIRT6的IC50值约为235uM。

结论：

本发明成功设计和开发了含有荧光基团与荧光淬灭基团、且带有长链脂肪酰化修饰基团的多肽为底物，利用FRET荧光效应，将荧光强度与Sirtuin 6的酶活性关联起来，荧光强度为背景荧光的十倍以上，建立了 Sirtuin 6活性检测方法。

长链脂肪酰化赖氨酸这一SIRT6识别位点位于底物的中部，使得底物多肽更接近于SIRT6的天然底物，动力学常数Kcat/Km达到277S^-1 M^-1。

本发明的检测方法可应用于生物样本中的Sirtuin6活性检测，或者应用于Sirtuin6调节剂的初步筛选及IC50的测定。

本发明对Sirtuin 6的活性检测及其调节剂的筛选效果准确，简单易行，成本低廉。

序列表

<110> 贵阳医学院

<120> 人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法

<130> nm:

<160> 3

<170> PatentIn version

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lys 7无修饰，且含有荧光基团和荧光淬灭基团的多肽，用于考查该多肽序列能否产生FRET效应

<400> 1

Ile Ser Gly Ala Ser Glu Lys Asp Ile Val His Ser Glu Gly

1 7 14

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lys 7乙酰化修饰，且含有荧光基团和荧光淬灭基团的多肽，用于考查Sirtuin6活性

<400> 2

Ile Ser Gly Ala Ser Glu Lys Asp Ile Val His Ser Glu Gly

1 7 14

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lys 7长链脂肪酰化修饰，且含有荧光基团和荧光淬灭基团的多肽，用于考查Sirtuin6活性

<400> 3

Ile Ser Gly Ala Ser Glu Lys Asp Ile Val His Ser Glu Gly

1 7 14

Claims (5)

1.一种人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物， 1）将所述底物与人源沉默信息调节因子6孵育，脱去底物的赖氨酸残基上的长链脂肪酰化修饰，得到无修饰的赖氨酸多肽；2）将所述的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液孵育，从赖氨酸的C端裂解肽键；使荧光强度与上述的无修饰的赖氨酸多肽关联起来，该检测得到荧光强度与人源沉默信息调节因子6的酶活性具有相关性。

2.根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述的以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物具有如下结构式：

式中，R1及R2均表示3个以上氨基酸；所述的多肽为通过肽键相连的3个以上的氨基酸；在该氨基酸序列中没有无修饰的赖氨酸或者精氨酸，且长链脂肪酰化赖氨酸残基不能位于多肽的两端。

3.根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述的配对的荧光基团和荧光淬灭基团包括Edans/Dabcyl、Trp/Dansyl、Trp/DNP、MCA/DNP, Abz/DNP或Abz/Tyr(NO₂)。

4.根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述的蛋白水解酶裂解液为蛋白质裂解液其有效成分为胰蛋白酶、羧肽酶或gluc-C。

5.根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述底物与人源沉默信息调节因子5的体积比为10:1，孵育时间为30分钟；所得的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液的体积比为10：1，孵育时间为1小时；上述的孵育温度为25-37℃。