CN104357440A - 一对靶向斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen识别序列及其mRNA制备方法 - Google Patents
一对靶向斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen识别序列及其mRNA制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一对靶向斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen识别序列及用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA的制备方法。所述Talen识别序列对的基因序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述mRNA的制备方法包括以下步骤a)组装并合成权利要求1所述的Talen识别序列对；b)根据a)的所述的Talen识别序列对，构建靶向Forkhead box n1基因的基因敲除效应蛋白Talen的表达载体；c)将步骤b)获得的载体通过脂质体转染，在293T细胞内检测蛋白表达情况；d)将步骤b)获得的载体通过过体外转录，获得所述的用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA。本发明方法获得的mRNA，可以用于敲除斑马鱼Forkhead box n1基因，制备斑马鱼胸腺发育研究模型。与现有技术相比，成本低，设计简单，成功率高，具有明显的效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及利用基因打靶技术敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的方法。
背景技术
胸腺是T细胞发育成熟的关键中枢器官，可分泌多种胸腺激素及激素类物质。Forkhead Box(Fox)转录因子家族是一组组翼状螺旋/叉头型转录因子家族，在人类中共发现20多种Forkhead基因，该转录因子在胚胎发育中，特别是内胚层发育器官中发挥着关键调控作用Forkhead box n1在哺乳动物中参与了胸腺的形成、发育、成熟和退化各个阶段，人类和小鼠Foxn1基因突变或缺失可以引起胸腺发育严重障碍或缺失(李红然与张连军等,2010)。而对斑马鱼胸腺发育研究中发现，在Foxn1抑制的胚胎中，胸腺原基减少，T细胞的发育受损，揭示Foxn1在斑马鱼胸腺形成的遗传调控网络中的中心作用(Ma and Wang et al.,2012)。
因此构建Foxn1基因敲除的斑马鱼对进一步阐明胸腺发育、维持机制具有重要意义。
传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低(低于10-6)，增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。
利用RNA干扰引起的基因敲除：RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是RNA依赖的基因沉默现象，是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默，dsRNA在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21～22nt的siRNA(small interferenceRNA)，siRNA分子核酸酶以及螺旋酶等结合形 成RNA诱导沉默复合物(RNA－induced silencing complex，RISC)，RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，利用RISC内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，从而导致目的基因的沉默，因此，通过将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其同源的mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除，但RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型，并存在位置效应，临时性和不完全敲除的弊端。因此，RNAi不能完全取代传统的基因敲除技术。
锌指核酸酶基因打靶技术(Zincfinger nucleases，ZFNs)：该方法的核心设计思想是将2个有特定功能的结构域，即特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白。单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3～6个Cys2－His2锌指蛋白重复单位、能特异性识别1个三联体碱基与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶、以及来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当2个识别位点相距6～8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，并在此特异位点产生1个DNA双链切口(Doublestrands breaks，DSB)，然后利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复。
TALEN(TranscriptionActivator-like(TAL)Effector Nuclease)基因打靶技术:该方法的设计和构建是基于植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种转录激活子样效应因子(Transcriptionactivator-like effector，TALE)可以识别DNA序列的原理。TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，重复17～18次，34个氨基酸中的第12和13个氨基酸为重复可变残基(Repeat Variant Diresidue，RVD)对应识别1个目标碱基利用TAL的序列模块，可组装成特异 结合任意DNA序列的模块蛋白。TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行DNA操作。
与ZFNs相比，TALENs成功解决了常规的ZFNs方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有与ZFNs相等或更好的活性，无基因序列细胞物种限制，试验设计简单准确，成本低，成功率几乎可达100％，毒性低，脱靶情况少，使基因操作变得更加简单方便。因此是构建基因敲除动物模型的首选。
参考文献
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发明内容
本发明要解决的技术问题是利用现有的基因敲除方法建立Foxn1基因缺失斑马鱼，以最经济、最快捷的方法提供胸腺发育缺陷的动物模型。
本发明公开了一对靶向斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen识别序列，其基因序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的内容还包括一对用于合成靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的 Talen蛋白的表达载体对，所述表达载体含有上述识别序列。
进一步，所述载体为pCS2-Foxn1-FOK1-L和pCS2-Foxn1-FOK1-R，分别对应所述靶标序列两段的识别序列。
本发明还包括一种用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA制备方法，包括以下步骤:
a)组装并合成上述的Talen识别序列对；
b)根据a)的所述的Talen识别序列对，构建靶向Forkhead box n1基因的基因敲除效应蛋白Talen的表达载体对pCS2-Foxn1-FOK1-L和pCS2-Foxn1-FOK1-R；
c)将步骤b)获得的载体通过脂质体转染，在293T细胞内检测蛋白表达情况；
d)将步骤b)获得的载体通过过体外转录，获得所述的用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA。
进一步的，本发明还包括上述方法获得的mRNA，在敲除斑马鱼Forkhead box n1基因中的应用。
进一步的，本发明还包括上述方法获得的mRNA，在斑马鱼胸腺发育研究模型的应用。
本发明首次利用TALENs基因打靶技术，制备了靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA，用于敲除斑马鱼Forkhead box n1基因，进而获得该基因敲除的斑马鱼动物模型。相对现有技术，TALENs基因打靶技术成功解决了常规基因敲除方法不能识别任意目标基因序列，无基因序列细胞物种限制，试验设计简单准确，成本低，成功率几乎可达100％，毒性低，脱靶情况少，使基因操作变得更加简单方便。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1：A：含Tale识别单模块载体pMD-18结构示意图，
图2：pMD-Tale结构示意图
图3：Talen表达载体pCS2-Fok1结构图
图4：pCS2-Foxn1-FOK1-L、pCS2-Foxn1-FOK1-R蛋白表达的Western-Blot检测结果；
图5：pCS2-Foxn1-FOK1-L、pCS2-Foxn1-FOK1-R酶切线性化和体外转录产物进行电泳分析结果，其中：
A：表达载体酶切线性化产物电泳结果；B：体外转录成mRNA电泳结果；
图6：Foxn1-Tal-Fok1注射胚胎基因组序列酶切突变分析
图7：突变处基因组DNA序列测序结果
图8：原位杂交检测ccl25a表达量，其中A为野生型，B为Foxhead box n1基因敲除的斑马鱼系。
具体实施方式
实施例1：用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA的制备
本发明中，使用材料pMD-18(NI/HD/NN/HD)、pCS2-Foxn1均来源于北京大学张博实验室构建，293T细胞来源于ACTT细胞系库，mRNA合成试剂盒(mMESSAGESP6 Kit)购自ambion，Tu系斑马鱼饲养于中山大学生命科学院大学院斑马鱼房。
本发明用到的实验方法除非特别提及均为常规实验方法。
1.靶向Forkhead box n1基因的talen表达载体构建
从NCBI网站的基因组数据库中检测斑马鱼的基因组序列(GenBank:Gene ID:266748)，其分析其外显子使用情况，基于Talen基因敲除原理，选取合适的 目标序列Talen识别靶序列如下：T CCCTACAGCCAGAAGA gtgcggagcg ctttc GTAGACACAGTGTAGATGGAA，其中，大写字母表示的序列为识别的序列，小写字母表示的序列为剪切的序列。
根据靶标序列和Talen蛋白靶向识别DNA序列的原理，设计靶向Forkhead box n1基因的基因敲除效应蛋白Talen序列,其识别所述靶标序列的重复可变残基序列为：
左臂：Foxn1-TAL1RVD：HD HD HD NG NI HD NI NN HD HD NI NN NI NINN NI
右臂：Foxn1-TAL2RVD：NG HD HD NI NG NI HD NI HD NG NN NG NN NG HD NG NI HD；
其中，NI、HD、NN、NG分别代表靶向识别A、C、G、T的Tale模块，NI、HD、NN、NG为不同模块中的重复变异双残基(RVD)。
通过基因组PCR，确定靶位点的基因组序列与NCBI数据库相同。
使用四种包含不同Tale识别单模块的载体质粒pMD-18(NI/HD/NN/HD)(Huang and Xiao etal.,2014)其结构见图1，通过HindⅢ、Nhe Ⅰ内切酶酶切，获得前识别模块NI/HD/NN/HD，建立后件模块库，通过HindⅢ、Spe Ⅰ内切酶酶切，获得后识别模块NI/HD/NN/HD，建立后件模块库，各模块识别碱基和对应的Tale蛋白见表1所示，其具体DNA序列见序列表SEQ ID NO.3～6。
表1Tale识别前、后件模块库模块识别碱基和对应的Tale蛋白
从Tale蛋白模块库中，根据设计好的Tale蛋白序列，编码Tale蛋白序列的碱基序列为识别区序列。按顺序前件和后件分别组装，通过多步酶切最终连接成完整含有完整的识别区序列的Tale蛋白基因载体pMD-Tale，如图2所示。根据Foxn1的设计，此处构建了pMD-Tale-Foxn1-L与pMD-Tale-Foxn1-R两特异识别Foxn1基因的识别区序列，序列见序列表SEQ ID No.1&SEQ ID No.2。
使用Spe Ⅰ、Nhe Ⅰ内切酶将完整的编码Tale蛋白的识别区序列从pMD-Tale-Foxn1-L与pMD-Tale-Foxn1-R中切割下来，分别连接至Nhe Ⅰ内切酶酶切线性化的含有Fok1酶序列的pCS2-Fok1-L载体与pCS2-Fok1-R载体中。pCS2-Fok1-L载体与pCS2-Fok1-R载体骨架为pCS2-Fok1，载体结构见图3，Talen识别序列的上游含有SP6启动子、CMW启动子及3×HA或FLAG标签，下游还有Fok1基因。pCS2-Fok1-L与pCS2-Fok1-R载体基本骨架相同，部分碱基序列有差异，详细序列见序列表SEQ ID NO.4。连接后，通过测序鉴定出正确连接的TALEN载体，最终组装成pCS2-Foxn1-Fok1-L、pCS2-Foxn1-FOK1-R表达载体对。
2.Foxn1-Tal-Fok1蛋白表达鉴定
将去内毒提取的pCS2-Foxn1-Fok1-L、pCS2-Foxn1-Fok1-R表达载体质粒对用脂质体包裹转染至感受态293T细胞内，48小时后收取细胞，通过Western-Blot 检测Foxn1-Tal-Fok1-R、Foxn1-Tal-Fok1-L蛋白的表达。使用表达载体上带有的HA或FLAG标签检测其对应的表达蛋白的大小。图4为Western-Blot结果，表明两重组质粒均表达了目的蛋白。
3.Foxn1-Tal-Fok1 mRNA合成
左右臂表达载体PCS-Foxn1-Fok1-R、PCS-Foxn1-Fok1-L用NotI内切酶酶切线性化后，作为体外转录的DNA模板，使用基于SP6启动子的mRNA合成试剂盒合成质粒pCS2-Foxn1-Fok1-L、pCS2-Foxn1-Fok1-R编码的左右臂mRNA。对酶切线性化产物和体外转录产物进行电泳分析，结果如图5A、B显示，线性化后的左右臂质粒长度约为8kb，符合预期。
实施例2：利用Foxn1-Tal-Fok1 mRNA靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因
1.Foxn1-Tal-Fok1 mRNA的注射
将适量的左右臂mRNA混合后，该组合mRNA下称为Foxn1-Tal-Fok1mRNA，用RNAase-free的ddH2O稀释至终浓度为100ng/ul，并加入1/10体积的phenored混匀后，通过显微注射，导入Tu系斑马鱼胚胎中。
2.注射Foxn1-Tal-Fok1的胚胎基因变异分析
随机收集注射foxn1-Tal-Fok1 mRNA，3dpf Tu系斑马鱼胚胎20枚，使用提取基因组DNA。PCR扩增出Foxn1靶位点的DNA条带，其中使用的引物为：
TalenFoxn1JD-F0:5'-AAGGCACTATTCAAGGACACCAGACCCTGG-3'，
TalenFoxn1JD-R1:5'-TCCACATCAGTGCCTAATGTAGTCCAAGAG-3'
使用Afe1酶切分析扩增产物，如图6所示，注射Foxn1-Tal-Fok1 mRNA的胚胎DNA产物使用酶切后，会有一条含量很高的未切开条带，说明Foxn1基因的基因组序列发生变异，原有的Afe1酶切位点不复存在。
3.突变鱼系筛选与建立
选择含有目标突变的F0代成熟鱼与野生型侧交得F1代，雌雄F1代相同突变类型的成熟鱼进行自交后，在其后代中，通过尾鳍组织基因组检测筛选出纯合突变的斑马鱼F2。通过PCR，将突变处基因组DNA序列扩增后测序结果，见图7，显示该处出现非三倍数的碱基缺失，基因发生读码框移位，造成基因的失活。证实Foxn1-Tal-Fok1 mRNA表达基因敲除效应蛋白Talen，造成Forkhead box n1基因被敲除。
同突变类型的纯合突变的雌雄斑马鱼保存并交配繁殖，得Forkhead box n1基因敲除斑马鱼系。
4.Forkhead box n1敲除斑马鱼系Forkhead box n1表达水平检测及胸腺发育相关基因ccl25a表达变化检测
通过胚胎整体原位杂交试验，用淋巴细胞标记基因的反义RNA探针检测Forkhead box n1基因敲除斑马鱼中胸腺内的ccl25a的表达，用于评估胸腺内淋巴细胞发育受损情况：
斑马鱼胚胎经过水化恢复处理后，使用含有蛋白酶K(终浓度10μg/ml)的PBST溶液常温消化8min-15min，PBST漂洗后使用4％多聚甲醛(PFA)预洗2-3min，将胚胎按杂交的探针分组置于胚胎管中，加入新鲜的4％多聚甲醛固定20min后，PBST洗两次，每次10min。加入预热66℃杂交液HYB，66℃预漂洗10min，换新鲜已预热66℃HYB，66℃预杂交2-3hr。3ng/μlRNA探针溶于预热HYB，并于杂交炉66℃预热。弃去胚胎中的预杂交HYB，加入含有RNA探针的HYB,66℃温育振荡12hr-16hr。弃去探针杂交液后，用洗液(50％甲酰胺，2×SSCT)洗两次，每次20min，再用2×SSCT液洗3次，每次10min，最后使用洗液(1×MABT)洗涤10min，两次。使用阻断溶液(热失活羔羊血清：10％BM： MABT＝1:2:7)，室温封闭阻断1hr。按1:2000体积浓度配制地高辛抗体(一抗)：阻断溶液的一抗溶液。弃阻断溶液，加入含有一抗溶液，4℃过夜。洗涤溶液(10％热失活羔羊血清：MABT＝1:9)加入胚胎管中后室温摇动孵育20min，弃洗液，换MABT液洗20min，重复3次。加入检测缓冲液(100mM NaCl，50mM MgCl2,100mMTris-HCl pH9.5)洗2次，每次10min。将胚胎转移至24孔板中，加入300μ了减刑磷酸酶底物染色缓冲液(1ml检测缓冲液，4.5μlNBT，3.5μlBCIP)，锡纸避光包裹，室温染色，待孔板中目标胚胎着色出现后，使用PBS洗涤5min、2次，以终止染色。使用4％多聚甲醛溶液常温固定1hr-2hr，用30％，50％，70％Me(OH)的PBS溶液梯度过度适应处理后转移至纯Me(OH)中4℃过夜。拍照前将胚胎用30％，50％，70％甘油的PBS溶液处理后转移至甘油，照相后梯度转移回Me(OH)或70％甘油的PBST中。
请参照图8，原位杂交结果显示Forkhead box n1基因敲除斑马鱼中趋化信号ccl25a在胸腺内的表达剧烈减弱，说明Forkhead box n1基因的敲除使胸腺上皮细胞分泌的趋化因子减少，胸腺内的T细胞发育受到损伤。至此，Forkhead box n1敲除斑马鱼系提供胸腺发育缺陷的动物模型。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一对靶向斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen识别序列，其特征在于，所述识别序列对的基因序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.一对用于合成靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen蛋白的表达载体对，所述表达载体含有权利要求1所述的识别序列。
3.根据权利要求2所述的表达载体对，其特征在于，所述载体为pCS2-Foxn1-FOK1-L和pCS2-Foxn1-FOK1-R，分别对应所述靶标序列两段的识别序列。
4.一种用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
a)组装并合成权利要求1所述的Talen识别序列对；
b)根据a)的所述的Talen识别序列对，构建靶向Forkhead box n1基因的基因敲除效应蛋白Talen的表达载体对pCS2-Foxn1-FOK1-L和pCS2-Foxn1-FOK1-R；
c)将步骤b)获得的载体通过脂质体转染，在293T细胞内检测蛋白表达情况；
d)将步骤b)获得的载体通过过体外转录，获得所述的用于靶向敲除斑马鱼Forkheadboxn1基因的mRNA。
5.权利要求4所述的用于靶向敲除斑马鱼Forkheadboxn1基因的mRNA制备方法获得的mRNA，在敲除斑马鱼Forkhead box n1基因中的应用。
6.权利要求4所述的用于靶向敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的mRNA制备方法，在斑马鱼胸腺发育研究模型的应用。
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