CN104318131A - 电子fish的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物信息学领域，具体涉及电子FISH的方法。所述方法包括步骤：)以探针序列作为检索序列，以靶序列作为数据库序列，进行序列比对；用Perl脚本blast_parser.pl修饰比对结果；删除比对结果中片段偏短、一致性偏差的结果；以探针序列及检索序列靶序列上的位置为纵坐标，以比对次数为横坐标做散点图。该方法操作简单方便，且用真实FISH验证其结果，证明其结果可靠精确，节约了时间和成本，且靶DNA可以是基因组、单染色体、特定序列片段等，分辨率高且针对性较强。

Description

电子FISH的方法

技术领域

本发明属于生物信息学领域，具体涉及电子FISH的方法。

背景技术

荧光原位杂交技术诞生于20世纪60年代末，其原理是利用碱基互补配对原则把探针DNA物理定位到染色体、间期细胞核和DNA纤维等靶DNA上。目前，荧光原位杂交技术广泛应用在基因物理定位、染色体识别、物理图谱的构建、亲缘关系研究和转基因检测等方面，在现代分子细胞遗传学领域有着不可取代的地位。

然而荧光原位杂交实验，往往对实验人员的实验技术要求较高，实验过程中稍有差错便会导致实验失败，结果不理想，且实验还需要消耗大量的实验材料。随着大量物种基因组序列的获得，生物信息学得到了快速的发展，利用生物信息学进行电子荧光原位杂交，可快速准确的获得探针DNA在靶DNA上的物理位置和重复次数，结果可靠精确，且靶DNA可以是基因组、单染色体、特定的染色体片段等，针对性强。

发明内容

本发明的目的是提供一种电子FISH的方法。

根据本发明的具体实施方式，所述的方法包括以下步骤：

(1)用NCBI的BLASTN软件进行序列比对：以探针序列作为检索序列，以靶序列作为数据库序列，进行序列比对，数据库序列可是某条染色体的序列、基因组序列及某染色体片段序列等；

(2)用Perl脚本blast_parser.pl修饰比对结果，该脚本可以把比对结果转换成表格形式，方便统计分析；

(3)删除比对结果中片段偏短、一致性偏差的结果。

(4)以探针序列在靶序列上的位置为纵坐标，以比对次数为横坐标做散点图。

荧光原位杂交技术如今在染色体鉴定、物理图谱构建、基因组比较研究等方面起着重要的作用，该方法利用BLASTN软件从碱基水平进行序列比对分析，来探究探针序列和靶序列的同源关系，故可准确直观的展现出探针序列在靶序列上的位置及重复次数，操作简单方便，且用真实FISH验证其结果，证明其结果可靠精确，节约了时间和成本，且靶DNA可以是基因组、单染色体、特定序列片段等，分辨率高且针对性较强。

附图说明

图1显示实施例1电子FISH和常规FISH的结果，其中，

A以棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以雷蒙德氏棉13号染色体序列为靶DNA，进行电子FISH，横坐标是探针DNA在雷蒙德氏棉13号染色体上的重复次数，纵坐标是探针DNA在雷蒙德氏棉1号染色体上的物理位置；

B以为棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以雷蒙德氏棉有丝分裂中期染色体序列为靶DNA，进行FISH，绿色为BAC克隆299N22的杂交信号，红色为用来识别雷蒙德氏棉13号染色体的特异BAC的杂交信号，标尺＝5μm；

C以棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以亚洲棉2号染色体序列为靶DNA，进行电子FISH，横坐标是探针DNA在亚洲棉2号染色体上的重复次数，纵坐标是探针DNA在亚洲棉2号染色体上的物理位置；

D以为棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以亚洲棉有丝分裂中期染色体序列为靶DNA，进行FISH。绿色为BAC克隆299N22的杂交信号，标尺＝5μm。

具体实施方式

实施例1 以棉花BAC 299N22克隆为探针，分别以雷蒙德氏棉(D₅)、亚洲棉(A₁)基因组为靶DNA，进行电子FISH。随后以雷蒙德氏棉(D₅)、亚洲棉(A₁)有丝分裂中期染色体为靶DNA，进行FISH验证。

1材料和方法

1.1实验材料

实验材料是亚洲棉中亚1号、雷蒙德氏棉，均来自于中国农业科学院棉花研究所。所用的BAC克隆为299N22，来自于海岛棉pi-ma 90海岛棉文库。

1.2实验方法

1.2.1电子FISH步骤

1)用棉花BAC克隆299N22的序列，通过Blastn软件比对亚洲棉基因组和雷蒙德氏棉基因组(Li et al.,2014；Wang et al.,2012)。

2)通过Perl脚本blast_parser.pl编辑比对结果。

脚本内容

3)随后把比对结果拷贝到Excel中，去除片段偏短，一致性较差的结果。

4)以在染色体上的位置为纵坐标，以比对次数为横坐标做散点图。

1.2.2FISH步骤

1)取材及预处理：取雷蒙德氏棉和亚洲棉的种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗1次，用95％乙醇：冰乙酸(3:1)固定液固定4h以上；

2)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗1次，在37℃下用4％纤维素酶+2％果胶酶混合液处理根尖45min；随后用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃下保存4h以上，然后在-80℃下揭掉盖片，迅速置于80℃烤干，在60℃烘箱中烘干10h，最后放在4℃保存备用；

3)标记探针：BAC克隆(299N22)的质粒和用于鉴别染色体的特异BAC克隆(Wang K et al.,2007)分别采用Roche公司的Bio-Nick Translation Mix、Dig-NickTranslation Mix系统标记。

4)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法。地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示为红色。生物素标记在荧光显微镜下观察显示为绿色。染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。

5)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。采用Photoshop作图软件处理图片。

2实验结果

以棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以雷蒙德氏棉基因组序列为靶DNA，进行电子FISH，只有在13号染色体有较好的比对结果，比对结果大都分布在13号染色体的偏中部(图1A)。以棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以雷蒙德氏棉有丝分裂中期染色体为靶DNA，进行真实FISH，在13号染色体偏中部位置有一对杂交信号。绿色为BAC克隆299N22的杂交信号，位于染色体的偏中部位置，红色为用来识别雷蒙德氏棉13号染色体的特异BAC(图1B)。结果显示电子FISH与真实FISH的结果一致。

以棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以亚洲棉基因组序列为靶DNA，进行电子FISH，在13条染色体上均有较好的比对结果，且比对次数巨大，弥散的分布在13条染色体上(图1C为当2号染色体为靶DNA时的结果，其他染色体情况类似)。以棉花BAC克隆299N22为探针DNA，以亚洲棉有丝分裂中期染色体为靶DNA，进行FISH，在13条染色体上均有杂交信号，且信号分布弥散。绿色为BAC克隆299N22的杂交信号(图1D)。结果显示电子FISH与真实FISH的结果一致。

Claims (1)

1.一种电子FISH的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)以探针序列作为检索序列，以靶序列作为数据库序列，进行序列比对；

(2)用Perl脚本blast_parser.pl修饰比对结果，该脚本可以把比对结果转换成表格形式，方便统计分析；

(3)删除比对结果中片段偏短、一致性偏差的结果；

(4)以探针序列在靶序列上的位置为纵坐标，以比对次数为横坐标做散点图。