CN104316618B - 一种hplc法测定l-半胱氨酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑半胱氨酸胶囊中L‑半胱氨酸含量的测定方法，用高效液相色谱法，采用正相硅胶键合二醇色谱柱，以混合溶剂为流动相的色谱法进行测定，用该方法可快速的测定样品中L‑半胱氨酸的含量。
Description
技术领域
本发明属涉及一种高效液相色谱法，尤其是一种分析L-半胱氨酸胶囊中L-半胱氨酸含量的高效液相色谱法。
背景技术
L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸，分子式为C3H7NO2S，分子量为121.16，化学名为L-2-氨基-3-巯基丙酸，结构式为
L-半胱氨酸因具有广泛的生理功能，目前已在医药、食品添加剂和化妆品中得到广泛应用。传统的L-半胱氨酸测定采用紫外分光光度法进行，但因存在辅料干扰等问题，不能准确、快速测定L-半胱氨酸含量，无法实时监测产品质量。因此，研究一种准确、快速且易于操作的L-半胱氨酸测定方法对控制产品质量，保证广大患者用药的安全性具有重大意义。
HPLC法测定L-半胱氨酸虽有文献报道，但因产品中存在特殊辅料干扰的问题，故发明了一种用HPLC法测定L-半胱氨酸胶囊中L-半胱氨酸含量的方法，经检索，未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分析L-半胱氨酸胶囊中L-半胱氨酸含量的高效液相色谱法，从而实现L-半胱氨酸含量的精确测定。
本发明所研究对象为L-半胱氨酸胶囊，辅料成分为：磷酸氢钙、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠、聚维酮K30和硬脂酸镁。
经研究发现，原测定方法(Validation plan for a UV spectrophotometricassay of Acetium(L‐Cysteine)capsules[J].Pharmaceutical Sciences Laboratory,2014,01,03)紫外分光光度法因胶囊中空白辅料在213nm处存在较大吸收，所以将原方法的测定方法变为高效液相色谱法。首先我们对L-半胱氨酸对照品和空白辅料分别在200-400nm进行全波长扫描，发现L-半胱氨酸在200nm存在较大的末端吸收而空白辅料吸收较小，因此我们选用200nm为高效液相色谱法的测定波长。其次，我们参考精氨酸测定条件，在此条件下进行优化，研究流动相的配比，先后采用pH2.0、pH5.3等不同pH值对L-半胱氨酸含量测定的影响，发现碱性条件不利于L-半胱氨酸的测定，在流动相pH为5.3时，色谱图没有明显的主峰，且酸性越强峰型越好，综合色谱柱的使用条件我们将流动相的pH订为2.0，同时我们考察了不同溶剂下L-半胱氨酸的稳定性，发现L-半胱氨酸在酸性条件下可以稳定存在，在中性和碱性条件下稳定性较差，综合对溶出情况考察的要求，我们将L-半胱氨酸含量测定的溶剂定为pH为1.2的盐酸缓冲液，并对稳定性进行的研究发现在0-8h内稳定性良好。最后我们经过大量的实验，对色谱柱进行了研究，发现普通的C18柱和C8柱不能满足测定的要求，综合文献报告我们选用了硅胶键合二醇类色谱柱，发现在实验条件下可以获得很好的峰形效果。对该方法进行方法学验证得出该方法准确可靠。
综上所述，正相硅胶键合二醇色谱柱，以混合溶剂为流动相，在200nm处测定L-半胱氨酸的峰面积与含量呈正比，通过外标法，从而可以准确测定L-半胱氨酸的含量，监测L-半胱氨酸胶囊的质量。本发明的方法能简单、快速、准确地分析L-半胱氨酸的含量。
本发明所述的分析方法，可按照以下方法实现：
(1)取L-半胱氨酸对照品适量，用pH为1.2的缓冲溶液溶解样品，得到1ml含L-半胱氨酸0.01～0.50mg的溶液。
(2)设置水相pH值为1.8～7.0，检验波长为200nm，色谱柱柱温箱为25～40℃，色谱柱柱温的最佳温度为30℃。
(3)取L-半胱氨酸胶囊样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取相当于L-半胱氨酸20mg的细粉，精密称定，置量瓶中，加入适量溶剂，在快速混匀器上震荡15min后，稀释至对照液的浓度，摇匀。用0.45μm的滤膜过滤，弃去初滤液后，取续滤液作为供试品溶液。
(4)取相同浓度的对照品溶液和供试品20μl注入液相色谱仪，采用外标法计算L-半胱氨酸的含量。
其中：
色谱柱：正向硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(1.15g磷酸二氢铵加去离子水80ml使溶解，用磷酸调pH值至2.0，再用去离子水稀释至1000ml，作为缓冲溶液)(80:20)；
柱温：30℃；
检测波长：200nm；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl。
本发明采用硅胶键合二醇类色谱柱，能够快速有效的测定L-半胱氨酸的含量；选择pH为1.2的缓冲溶液溶解样品，确保了溶液的稳定性；选择进样体积20μl，柱温为30℃，提高了色谱峰的对称性。本发明解决了L-半胱氨酸胶囊中L-半胱氨酸含量的测定，从而确保了L-半胱氨酸的质量可控。
附图说明
图1：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(75:25)，柱温30℃的HPLC图；
图2：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(80:20)，柱温30℃的HPLC图；
图3：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(85:15)，柱温30℃的HPLC图；
图4：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(80:20)，柱温35℃的HPLC图；
图5：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH 1.8)(80:20)，柱温30℃的HPLC图；
图6：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.6)(80:20)，柱温30℃的HPLC图；
图7：L-半胱氨酸峰面积与浓度的线性关系图。
具体实施方式：
实施例1
仪器与条件
色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(75:25)；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
检测波长：200nm；
实验步骤
取L-半胱氨酸对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用pH值1.2的缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取细粉80mg(相当于L-半胱氨酸20mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50ml pH值1.2的缓冲溶液，在快速混匀器上震荡15min，用pH值1.2的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，弃去5ml初滤液，取续滤液作为供试品溶液，立即进样，记录色谱图，按外标法计算L-半胱氨酸含量。
结果见附图1，图中1号峰为L-半胱氨酸的峰，可以看出在该条件下，L-半胱氨酸在11.1min出峰，峰形良好，峰高较图2峰高低，L-半胱氨酸峰与溶剂峰完全分开。
实施例2
仪器与条件
色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(80:20)；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
检测波长：200nm；
实验步骤
取L-半胱氨酸对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用pH值1.2的缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取细粉80mg(相当于L-半胱氨酸20mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50ml pH值1.2的缓冲溶液，在快速混匀器上震荡15min，用pH值1.2的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，弃去5ml初滤液，取续滤液作为供试品溶液，立即进样，记录色谱图，按外标法计算L-半胱氨酸含量。
结果见附图2，图中1号峰为L-半胱氨酸的峰，可以看出在该条件下，L-半胱氨酸在8.1min出峰，峰形良好，L-半胱氨酸峰与溶剂峰能完全分开。
实施例3
仪器与条件
色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(85:15)；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
检测波长：200nm；
实验步骤
取L-半胱氨酸对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用pH值1.2的缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取细粉80mg(相当于L-半胱氨酸20mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50ml pH值1.2的缓冲溶液，在快速混匀器上震荡15min，用pH值1.2的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，弃去5ml初滤液，取续滤液作为供试品溶液，立即进样，记录色谱图，按外标法计算L-半胱氨酸含量。
结果见附图3，图中1号峰为L-半胱氨酸的峰，可以看出在该条件下，L-半胱氨酸在6.0min出峰，峰形良好，L-半胱氨酸峰与溶剂峰距离较图2近，能完全分开。
实施例4
仪器与条件
色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(pH2.0)(80:20)；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
检测波长：200nm；
实验步骤
取L-半胱氨酸对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用pH值1.2的缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取细粉80mg(相当于L-半胱氨酸20mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50ml pH值1.2的缓冲溶液，在快速混匀器上震荡15min，用pH值1.2的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，弃去5ml初滤液，取续滤液作为供试品溶液，立即进样，记录色谱图，按外标法计算L-半胱氨酸含量。
结果见附图4，图中1号峰为L-半胱氨酸的峰，可以看出在该条件下，L-半胱氨酸在8.2min出峰，峰形良好，出峰时间与图2大致相同，L-半胱氨酸峰与溶剂峰能完全分开。
实施例5
仪器与条件
色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(1.15g磷酸二氢铵加去离子水80ml使溶解，用磷酸调pH值至1.8，再用水稀释至1000ml，作为缓冲溶液)(80:20)；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
检测波长：200nm；
实验步骤
取L-半胱氨酸对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用pH值1.2的缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取细粉80mg(相当于L-半胱氨酸20mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50ml pH值1.2的缓冲溶液，在快速混匀器上震荡15min，用pH值1.2的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，弃去5ml初滤液，取续滤液作为供试品溶液，立即进样，记录色谱图，按外标法计算L-半胱氨酸含量。
结果见附图5，图中1号峰为L-半胱氨酸的峰，可以看出在该条件下，L-半胱氨酸在8.6min出峰，峰形略有拖尾，对称因子为1.15，峰高较图2略低，L-半胱氨酸峰与溶剂峰能完全分开。
实施例6
仪器与条件
色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(1.15g磷酸二氢铵加去离子水80ml使溶解，用磷酸调pH值至2.5，再用去离子水稀释至1000ml，作为缓冲溶液)(80:20)；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
检测波长：200nm；
实验步骤
取L-半胱氨酸对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用pH值1.2的缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取细粉80mg(相当于L-半胱氨酸20mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50ml pH值1.2的缓冲溶液，在快速混匀器上震荡15min，用pH值1.2的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，弃去5ml初滤液，取续滤液作为供试品溶液，立即进样，记录色谱图，按外标法计算L-半胱氨酸含量。
结果见附图6，图中1号峰为L-半胱氨酸的峰，可以看出在该条件下，L-半胱氨酸在9.8min出峰，峰形略有拖尾，对称因子为1.28，峰高较图2无变化，峰面积略高，L-半胱氨酸峰与溶剂峰能完全分开。
实施例7
仪器与条件
色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱；
流动相：乙腈-磷酸二氢铵的水溶液(80:20)；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
检测波长：200nm；
实验步骤
精确称取L-半胱氨酸对照品，用pH为1.2盐酸缓冲液稀释至浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、0.20mg/ml、0.25mg/ml、0.30mg/ml、0.40mg/ml、0.50mg/ml的溶液。精密量取20μl进样，记录色谱图，以浓度对峰面积作图。
结果见附图7，图中横坐标为L-半胱氨酸浓度，纵坐标为L-半胱氨酸液相色谱图峰面积，可以看出L-半胱氨酸在浓度0.01～0.50mg/ml范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系。
Claims (1)
1.一种高效液相色谱法测定样品中L-半胱氨酸含量的测定方法，其特征在于采用正相硅胶键合二醇色谱柱，以混合溶剂为流动相的色谱法进行测定，所述的混合溶剂为乙腈和缓冲盐溶液的混合溶液，所述的乙腈和缓冲盐溶液的体积比例为75:25～85:15；
分析L-半胱氨酸胶囊中L-半胱氨酸含量的方法包括以下步骤：
(1)取L-半胱氨酸对照品适量，精密称定，用pH为1.2的缓冲溶液溶解样品，得到1ml含L-半胱氨酸0.20mg的溶液，作为对照品溶液；所述缓冲溶液由3.728gKCl和7mlHCl溶解于1000ml水中制得；
(2)设置溶剂pH值为1.8～7.0，检验波长为200nm，色谱柱柱温箱为25～40℃；
(3)取L-半胱氨酸胶囊样品20粒，除去胶囊壳，得到内容物，用研钵研细，取相当于L-半胱氨酸20mg的细粉，精密称定，置量瓶中，加入适量溶剂，在快速混匀器上震荡15min后，稀释至对照液的浓度，摇匀；用0.45μm的滤膜过滤，弃去初滤液后，取续滤液作为供试品溶液；
(4)取对照品溶液和供试品20μl注入液相色谱仪，采用外标法计算L-半胱氨酸的含量。
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