CN104313028A

CN104313028A - 抗类风湿关节炎的小肽基因及其生产方法

Info

Publication number: CN104313028A
Application number: CN201410521516.0A
Authority: CN
Inventors: 李相鲁; 张严冬; 孟建军; 梁庄严
Original assignee: BEIJING SHENGKE DONGFANG TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING SHENGKE DONGFANG TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2015-01-28

Abstract

本发明公开了一种抗类风湿关节炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明利用基因重组的方法来生产DNAJP1的衍生物M-DNAJP1，人工构建dnaJP1的基因，并通过首尾相连中间添加蛋氨酸的方法进行串联形成如下方式：M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1，将其克隆到质粒pet31b(+)中，然后转化进大肠杆菌中进行表达得到DNAJP1修饰后的多肽：M-DNAJP1的重复序列如SEQIDNO：2所示。通过发酵制备该小肽，然后利用溴化氰裂解的方法来得到游离多肽，裂解后的溴化氰通过高温高压处理，生成氨水和甲酸钠，减少对环境的污染，整个过程成本低，产量高，纯化简单，利于产业化。

Description

抗类风湿关节炎的小肽基因及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种抗类风湿关节炎的小肽的重组发酵生产，以及纯化方法。

背景技术

类风湿性关节炎是一种慢性反复发作的以全身关节炎症改变为主的疼痛性疾病，英文名称Rheumatoid arthritis，简写RA，是一种常见病、多发病。发病时间可以持续几天、几周或几个月，并带有不同程度的活动性，严重者病人生活不能自理，往往累及终生，形成长期病痛，极大地危害着人类的生命和健康，人们期望能研发和生产出更多高效优质的药物在临床应用。

现在应用的RA治疗药物有抗炎药，如阿司匹林、皮质类固醇和通过抑制或消灭机体免疫反应而减轻疾病症状的药物，这些药物虽可改善症状，但不能去除风湿的基本病理改变，而且还存在减弱机体的抗病能力的危害。

DNAJP1是一个通过计算机辅助设计技术开发的新药多肽，它起源于热休克蛋白dnaJ.，在该蛋白的基础上通过合成法得到的。热休克蛋白细胞在经受诸如发炎、自身免疫性疾病如类风湿性关节炎的情况下会产生热休克蛋白。dnaJP1的作用机制在于通过调节T细胞的功能来减少发炎、增强调控免疫系统，使得由类风湿性关节炎引起的炎症反应受到抑制，美国160例二期临床实验表明，口服该多肽可以降低炎症反应，取得了良好的效果。

抗类风湿关节炎的小肽dnaJP1与传统的治疗类风湿关节炎物相比，具有无可比拟的优势。该药物不会对患者的免疫系统产生抑制，通过口服应用dnaJP1，因为肠内的粘膜免疫系统可以对患者的免疫系统进行重新驯化，从而有效改善免疫系统。通过模拟反应，帮助患者免疫系统重新识别自身物质和外源抗原，保护原来深受破坏的病灶得以恢复，症状得到缓解，通过使得患者的免疫系统耐受dnaJ而起到治疗作用，具有安全性高、作用直接迅速、易被人体吸收、特异性高、持续时间长、可口服等优点，具有极为诱人的广阔前景。

现有的抗类风湿关节炎的小肽dnaJP1的纯化方法为化学合成法。美国发明专利US5773570A，该技术利用聚合链式反应（PCR）从业和重组的噬菌体质粒包含dnaK和dnaJ中扩增了含有dnaJ基因的片段，然后将该片段亚克隆到PCG808fX的Xba1位点，作为麦芽糖结合融合蛋白进行表达，然后用含有针对该融合蛋白的兔抗血清将用pUC19质粒进行表达的rdnaJ进行纯化，最后，用固定化的蛋白A，将IgG-MBL-DnaJ进行纯化，然后用pH2.5的甘氨酸缓冲液进行洗脱出来，SDS电泳结果表明只有一条带，融合蛋白符合预期，分子量在41KD。该专利采用了融合蛋白和目的多肽融合生产的方法，融合标签本身的分子量为40KD，而目的多肽的分子量仅有1.76KD，相差20多倍，也就是说即使产生大量的融合蛋白，其实含有目的蛋白的产量很低(占总蛋白含量的4%)，造成不必要的浪费，不利于大规模生产。另外他纯化出来的是融合蛋白（41KD），而不是真正的dnaJP1多肽(1.76KD)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：抗类风湿关节炎的小肽dnaJP1是由几个氨基酸组成的短肽，而要实现短肽直接在宿主菌中的表达并分离出来非常困难，而采取融合表达方式也因采用较大的融合标签和较低的抗炎基因拷贝导致表达量很低。本发明构建具有合适高拷贝数的基因，通过将其基因进行6个重复串联的方法来增加产量，并采用较小的融合标签来融合表达该基因已增加在表达产物中的相对比重，对实现抗类风湿关节炎小肽的高效表达，相对比重约为50%，由于生成的融合蛋白是包涵体，所以非常容易纯化，纯化后的包涵体蛋白，采用溴化氰裂解，专一性强，成本低，本发明采用高压裂解的方法清除溴化氰，成本低，污染小，操作简单，易于产业化。

本发明的技术方案为：一种抗类风湿关节炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的抗类风湿关节炎的小肽基因，核苷酸序列所编码的多肽如SEQ ID NO：2所示。

所述的表达抗类风湿关节炎的小肽基因的多肽串联生产方法，利用大肠杆菌的pET31b(+)表达体系，将SEQ ID NO：1基因序列亚克隆到质粒pET31b(+)融合标签KSI的基因序列的后面，限制性内切酶为AwnI，然后将亚克隆得到的转化进大肠杆菌BL21（DE3）plysS中进行表达，并进行发酵生产，得到的菌体通过低温高压裂解得到包涵体，洗涤后的包涵体利用溴化氰(CNBr)或者蛋氨酸裂解酶进行裂解成单个多肽，裂解完毕后加碱水猝灭反应，采用高温高压水解法，除去溴化氰等杂质，通过纳滤除盐，得到纯品。

所述的表达抗类风湿关节炎的小肽基因的多肽串联生产方法，所述高温高压水解法的条件为，103.4kPa，1.05kg/cm2，在温度121.3°C的条件下处理15~20分钟。

本发明的有益效果是：本发明利用基因重组的方法来生产DNAJP1的衍生物M-DNAJP1，人工构建dnaJP1的基因，并通过首尾相连中间添加蛋氨酸的方法进行串联形成如下方式：M-dnajp1- M-dnajp1- M-dnajp1- M-dnajp1- M-dnajp1- M-dnajp1，将其克隆到质粒pet31b(+)中，然后转化进大肠杆菌中进行表达得到DNAJP1修饰后的多肽：M-DNAJP1的重复序列如SEQ ID NO：2 所示。通过发酵制备该小肽，然后利用溴化氰裂解的方法来得到游离多肽，裂解后的溴化氰通过高温高压处理，生成氨水和甲酸钠，减少对环境的污染，整个过程成本低，产量高，纯化简单，利于产业化。

本发明利用pet-31(b+)上较小的His标签片段融合表达串联6次目的小肽，增加了表达出来的重组蛋白中目的多肽所占的比例（～50%），形成融合蛋白包涵体，以减少表达蛋白的细胞毒性，大大增加了表达效率和减小了小肽的分离难度。

附图说明

图1为工程菌发酵表达中5升小试实验结果；

图2为中试50升发酵过程中生长曲线；

图3为发酵SDS-PAGE；

图4为菌体经过低温高压破碎后的样品电泳图；

图5为包涵体洗涤后产物电泳图；

图6为小肽溴化氰裂解电泳图；

图7为小肽MALDI-TOF/TOF质谱联机检测图。

具体实施方式

工程菌的构建：

内容包括根据密码子偏爱性设计序列、合成全基因序列、利用Alwn I 酶切质粒，导入目的序列，构建了以以pet-31(b+)为表达载体的、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS为宿主菌的MDNAJP1融合表达系统。6个重复的MDNAJP1的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性。确定基因序列如SEQ ID NO：1所示。

基因序列由本实验室自己合成。将质粒用AlwnI内切酶切开，将目的基因片段进行亚克隆，连接到质粒中去，然后转化到大肠杆菌中，宿主菌和表达载体均购自Novagen公司。工程菌构建完成后，经表达质粒酶切鉴定、目的片段DNA测序鉴定，结果表明工程菌构建正确。

工程菌发酵表达

构建了工程菌株后，基因重组大肠杆菌BL21(DE3) pLysS划线接种于含氨苄青霉素（80ug/ml）的LB固体平板上，首先进行小试表达：摇瓶培养，然后进行了5升发酵罐培养。以便对种子培养基、接种浓度进行摸索。

5升小试实验结果如图1所示。从左至右点样顺序为：二级种、0hr、3 hr、5 hr（诱导0hr）、MARK、8 hr（诱导3hr）、11 hr（诱导6hr）、17 hr（诱导12hr）、20 h（诱导15hr）最终确定工艺步骤如下：

一级、二级种子培养基为LB，发酵培养基为TB（修改版），接种前Amp浓度为100μg/mL

本项目碳源为甘油，因为其做碳源产生更少的杂质蛋白。

中试50升发酵过程：

一发酵过程

（1）将基因重组大肠杆菌BL21(DE3) pLysS划线接种于含氨苄青霉素（80ug/ml）的LB固体平板上，置37℃恒温箱倒置培养12h；

（2）挑取平板上的大肠杆菌BL21(DE3) pLysS

接种到20ml含氨苄青霉素（80ug/ml）的LB培养基中，37℃下200rpm.min－1振荡培养8h至对数生长期，将上述培养液20ml接种于200ml含氨苄青霉素（80ug/ml）的LB培养基中，37℃下220rpm.min－1振荡培养4h，得到发酵种子液；

（3）发酵罐空消后，校正pH电极、溶氧电极，倒入溶解好的TB培养基，按发酵罐灭菌操作进行灭菌（121℃，30min），待料液温度降至37℃时，加入准备好的氨苄青霉素（80ug/ml）和葡萄糖（3%），按10%比例接进种子液，控制温度37℃、溶氧30%以上，用氨水调节pH7.0，搅拌速率和通气量调节由溶氧浓度决定。当发酵液中菌密度达到OD600值为15时加入诱导剂IPTG达0.2mM，继续培养10－16h左右，最终OD约42。

表1 发酵记录

发酵结果

1. 消耗补料2000mL，（补料速度一开始1/分钟，后来调成2/分钟，平均流速，3毫升/分钟）得到菌体湿重1000g；

2. 生长曲线如图2所示，发酵SDS-PAGE如图3所示；

3、目的蛋白的纯化工艺，研究内容包括融合蛋白的制备、溴化氰切割融合蛋白、小肽裂解混合物的纯化。本发明纯化工艺简化了流程，节省时间、试剂耗材，易于放大。具体步骤如下：（1）发酵结束，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2～3遍后，加入发酵液体积十分之一的缓冲液A 重悬细胞。在冰浴条件下利用低温高压细胞破碎细胞至不粘稠为止，离心弃上清，沉淀用包涵体洗涤液洗涤四次得到包涵体蛋白。

表2 实验步骤

实验步骤	实验时间	时长	相关参数	称重
					1、第一次高压匀浆	15:00~16:10	70min	压力：680~720 Bar	——
2、第二次高压匀浆	16:50~17:40	50min	压力：680~750 Bar	——
					3、破碎液离心	18:50~19:40	50min	——	2.170 kg
4、第一次洗涤包涵体	9:50~10:40	50min	20L包涵体洗涤液	1.906 kg
					5、第二次洗涤包涵体	12:00~13:40	100min	15L包涵体洗涤液	1.270 kg
6、第三次洗涤包涵体	14:40~16：20	100min	15L纯水	1.085 kg
					7、第四次洗涤包涵体	17:00~17~50	50min	15L纯水	1.065 kg

发酵后生产的发酵液，离心，收集菌体，用蒸馏水洗涤2～3遍后，菌体用发酵液体积十分之一的缓冲液A 重悬菌体。在冰浴条件下利用低温高压细胞破碎细胞至不粘稠为止，离心弃上清，沉淀用包涵体洗涤液洗涤一次，离心（5000转/分钟，15min），将菌体破壁，洗涤，离心等步骤得到的各个样品进行电泳分析，结果如图4所示，将包涵体洗涤液洗涤过的包涵体样品再进行3次洗涤，离心（5000转/分钟，15min），除去细胞壁，核酸等杂质，得到的样品进行电泳分析，结果如图5所示。

（2）将包涵体蛋白称重后，按1：10的质量体积比加入融合蛋白溶解液（8M尿素），置于冰箱4℃过夜溶解包涵体蛋白，离心弃沉淀保留上清，得到包涵体溶解液。称取适量溴化氰溶于乙腈（200mg/ml）配置成溴化氰工作液。取等体积溴化氰工作液加入以上包涵体溶解液，密封，避光于摇床裂解24h。裂解完毕后于通风厨中向裂解反应液中加入过量碱水终止溴化氰反应，然后用高压高温裂解清除溴化氰，待冷却至室温，高速离心，收集裂解液上清，4℃保存。

（3）取小肽裂解液样品进行Tricine–SDS-PAGE电泳分析，同时做高效液相色谱和MALDI-TOF/TOF质谱联机检测，质谱鉴定后得到的谱图，利用生物信息软件进行标注和提取肽段的荷质比数据，通过检索蛋白数据库，鉴定出裂解液中小肽为M-DNAJP1。溴化氰裂解物电泳进行电泳分析，电泳图如图6所示。

Claims

1.一种抗类风湿关节炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的抗类风湿关节炎的小肽基因，核苷酸序列所编码的多肽如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求2所述的表达抗类风湿关节炎的小肽基因的多肽串联生产方法，其特征在于：利用大肠杆菌的pET31b(+)表达体系，将SEQ ID NO：1基因序列亚克隆到质粒pET31b(+)融合标签KSI的基因序列的后面，限制性内切酶为AwnI，然后将亚克隆得到的转化进大肠杆菌BL21（DE3）plysS中进行表达，并进行发酵生产，得到的菌体通过低温高压裂解得到包涵体，洗涤后的包涵体利用溴化氰(CNBr)或者蛋氨酸裂解酶进行裂解成单个多肽，裂解完毕后加碱水猝灭反应，采用高温高压水解法，除去溴化氰等杂质，通过纳滤除盐，得到纯品。

4.如权利要求3所述的表达抗类风湿关节炎的小肽基因的多肽串联生产方法，其特征在于：所述高温高压水解法的条件为，103.4kPa，1.05kg/cm²，在温度121.3°C的条件下处理15~20分钟。