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CN104311830A - 一种树枝状基因药物载体及制备和应用 - Google Patents

一种树枝状基因药物载体及制备和应用 Download PDF

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CN104311830A
CN104311830A CN201410501370.3A CN201410501370A CN104311830A CN 104311830 A CN104311830 A CN 104311830A CN 201410501370 A CN201410501370 A CN 201410501370A CN 104311830 A CN104311830 A CN 104311830A
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Abstract

本发明提供一类可生物降解的高效低毒性的树枝状聚阳离子材料，本发明利用二硫键将毒性很低的低代数树枝状阳离子聚合物链接在生物相容性很好的水溶性内核上，形成了一个高分子量的聚合物，不仅有很好的基因和药物递送效率，而且可以在细胞内降解，有效缓解了树枝状阳离子聚合物递送效率与毒性之间的矛盾。本发明选取了简单易得的多分支水溶性聚合物和低代数的树枝状阳离子聚合物作为原料，成本比较低廉；而且合成方法简易，大多是常温反应，不需要无水无氧等苛刻的反应条件，后处理一般采用萃取或透析的分离方法，操作简单。本发明结构式：

Description

一种树枝状基因药物载体及制备和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一类高效低毒性的可生物降解的树枝状基因药物载体，具体涉及一类树枝状聚阳离子材料及其制备方法和应用。
背景技术
基因药物疗法是近二十年来兴起的治疗癌症的方法，其基本策略是将外源基因或抗癌药物通过载体运输的方式导入目的细胞并发挥其作用，从而达到治疗癌症的目的。基因药物疗法中，基因和药物的运输是十分重要的部分，对于运输的载体来说，将一定量的目的基因和药物高效得运输到靶细胞中，使其安全、有效、稳定得发挥作用是最基本的要求。目前应用于基因药物疗法的载体主要分成两大类:病毒性载体和非病毒性载体。
病毒性载体因其天然的嗜性，能够自然感染细胞，所以具有很高的运输效率，目前基因疗法中有很多常用的病毒载体，并已进入临床试验阶段。现使用的病毒有逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒等。近年来在病毒载体方面的研究取得了重大进展，但由于病毒性载体仍然存在着生物安全性不足、靶向特异性不够、对某些细胞转导不完全和易诱导宿主免疫反应等缺陷，限制了病毒性载体进一步的发展（Thomas C.E., Ehrhardt A., Kay M.A. Nat Rev Genet. 2003, 4:346-358）。非病毒基因载体在基因和药物的递送效率上没有病毒性载体高，但它们具有独特的优势，如低毒性、低免疫原性、无传染、合成制备简便、结构灵活可控等（AL-Dosari M.S.,GAO X. Aaps J, 2009, 11(4):671-681），因此得到了研究者的广泛应用，而其中的聚阳离子材料是最主要且研究最广泛的非病毒性载体之一。
聚阳离子材料由于结构中带有正电荷，很容易通过静电作用与带有负电荷的核酸( DNA，RNA，PNA) 形成复合物，使核酸被压缩，从而避免了被酶降解。由于复合物在通常情况下带有正的净电荷，有助于附着在细胞表面和随后的内吞及溶酶体逃逸的过程。本课题组曾发表过关于聚阳离子材料的专题论述（TANG G.P., LU X. Journal of Zhejiang University: Medical Sciences. 2009, 38(1):1-6），近年来对聚阳离子材料的研究又有了许多突破性进展。目前常用的聚阳离子材料包括壳聚糖(chitosan)、 聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、 树枝状聚合物(dendrimer) 等（Morille M., Passirani C., Vonarbourg A., etal. Biomaterials, 2008, 29(24-25):3477-3496）。
树枝状聚合物作为一种特殊的聚合物，它拥有精确排布的分支结构，表面存在着大量的阳离子集团，可以用于基因的运输，同时由于它内部对称排列的分支单元，使整个分子呈现一种严格的三维立体结构，这就形成了很多超分子空腔，用于携带药物（Menjoge A.R., Kannan R.M., Tomalia D.A. Drug Discov. Today. 2010, 15:171–185）。但是树枝状聚合物在运输效率和自身毒性上存在着一定的矛盾，高代数的树枝状分子具有很好的运输效率，但是由于降解性差而表现明显的细胞毒性。同时高代数树枝状分子的合成方面也十分困难（Cheng Y.Y., Zhao L.B., Li Y.W., Xu T.W. Chem. Soc. Rev. 2011, 40:2673−2703；Kukowska-latallo J.F., Bielinska A.U., Johnson J., Spindler R., Tomalia D.A., Baker J.R., Jr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93:4897−4902）。
本研究通过可降解的化学键将一类大小可控的水溶性聚合物与一些低代数的树枝状阳离子聚合物连接起来，从而得到了一系列新型的可生物降解的高效低毒性的树枝状聚阳离子材料。通过研究，我们发现这类材料对基因和药物有很好的携带和递送能力，而且效率高，毒性小，生物降解性好，是一类很有潜力的基因药物载体。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种树枝状基因药物载体，即一类可生物降解的高效低毒性的树枝状聚阳离子化合物(Dendritic cationic polymer)，具有如下结构式：
其中：
R为二代AB3型树枝状阳离子聚合物（AB3-Dendeimer G2），结构式为：
n为八分支聚乙二醇每个支链中的重复单元的个数；
m为直链聚乙二醇中的重复单元的个数。
本发明的第二个目的是提供这一类新型树枝状聚阳离子化合物的制备方法，通过以下步骤实现（以8armPEG-SS-PEG-Dendrimer G2为例）：
1、二代树枝状分子（化合物4）的制备：称取一定量的化合物1溶解于质量体积比20-40倍的二氯甲烷中，向其中加入用量为化合物1物质的量的3-5倍的活化剂1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAt）并加入HOAt物质的量2-4倍量的催化剂三乙胺，常温搅拌5-20分钟后，加入用量为化合物1物质的量的5-10倍的N-叔丁氧羰基乙二胺，然后在0-5摄氏度的条件下缓缓，加入用量为HOAt物质的量的2-4倍的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），加完后保持0-5摄氏度反应0.5-2小时，再常温反应3-5小时。反应完毕后，向反应液中加入一定体积的乙酸乙酯，有机相用0.1-0.5摩尔/升的盐酸洗2-4次，用一定体积的饱和碳酸氢钠溶液洗2-4次，用一定体积的饱和氯化钠溶液洗1-2次，再用一定量的无水硫酸钠干燥，旋蒸。
然后将所得中间产物溶解于质量体积比10-20倍的甲醇中，向其中加入化合物2物质的量的1-2倍的六水合氯化镍，然后在0-5摄氏度的条件下缓慢加入化合物2物质的量的3-10倍的硼氢化钠。加完后，在0-5摄氏度反应0.3-0.5小时，然后室温反应3-5小时。反应完毕后，用0.5-2摩尔/升的盐酸溶液将pH值调节至酸性，然后再用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调节至碱性。将溶液中的甲醇旋蒸掉，再用乙酸乙酯萃取2-4次，有机相用饱和氯化钠溶液洗1-2次，用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用柱层析分离的方法得到化合物2。
称取一定量的化合物2、化合物2物质的量的0.05-0.08倍的化合物3和化合物2物质的量的1.5-3倍的HOAt溶解于质量体积比20-40倍的二氯甲烷中，加入HOAt物质的量2-4倍量的催化剂三乙胺，然后在0-5摄氏度的条件下加入HOAt物质的量2-4倍量的EDCI，加完后控制0-5摄氏度反应1-3小时，之后常温反应30-50小时。反应完毕后，向反应液中加入一定体积乙酸乙酯，有机相用一定体积的0.1-0.5摩尔/升的盐酸洗2-4次，用一定体积的饱和碳酸氢钠溶液洗2-4次，用一定体积的饱和氯化钠溶液洗1-2次，再用一定量的无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸，剩余残渣用柱层析分离的方法得到中间产物。
然后将所得中间产物于0-5摄氏度条件下溶解在质量体积比30-50倍三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中，常温搅拌10-20小时，之后用一定截留分子量的透析袋在水中透析20-40小时，冷冻干燥后得到二代树枝状分子（化合物4）。
2、含有双硫键的水溶性内核分子（化合物6）的制备：将一定量多分支水溶性内核化合物5溶解于质量体积比3-5倍的二甲基亚砜中，然后称取活化羟基的连接剂，用量为多分支化合物物质的量的10-30倍，将连接剂溶解于质量体积比1-5倍的二甲基亚砜中，并加入连接剂物质的量比为1-2倍的三乙胺，在氮气保护下避光将多分支化合物的溶液滴加至连接剂的溶液中，之后继续搅拌反应3-5小时。之后将反应液加入至体积比20-50倍的乙醚：四氢呋喃=3:1-5:1体积比的混合溶液中，0-5摄氏度条件下静置1-3小时，过滤得到沉淀即中间产物。
然后将过滤得到的中间产物溶解于质量体积比5-10倍的二甲基亚砜中，再称取胱胺二盐酸盐，用量为该中间产物物质的量的15-30倍，将其溶解于质量体积比3-10倍的二甲基亚砜中，并加入称取胱胺二盐酸盐物质的量的3-5倍的三乙胺，搅拌片刻至完全溶解。之后将该中间产物的溶液缓慢滴加至胱胺的溶液中，滴加3-5小时，之后继续反应3-5小时，反应完毕后，溶液在透析袋中透析24-48小时，然后冰冻干燥得到中间产物。
再将所得中间产物溶解于质量体积比5-10倍的二甲基亚砜中，再称取单侧活化的直链聚乙二醇，用量为该中间产物物质的量的5-10倍，将其溶解于质量体积比5-10倍的二甲基亚砜中，将该中间产物的溶液滴加入直链聚乙二醇的溶液中，搅拌反应2-5小时，之后将反应液加入至体积比20-50倍的乙醚：四氢呋喃=3:1-5:1体积比的混合溶液中，0-5摄氏度条件下静置1-3小时，之后过滤得到白色粉末即为含有双硫键的水溶性内核分子，即化合物6。
3、最终产物树枝状聚阳离子化合物（化合物7）的制备：将含有双硫键的水溶性内核分子化合物6溶解于质量体积比5-10倍的二甲基亚砜中，然后称取活化羟基的连接剂，用量为化合物6物质的量的15-30倍，将连接剂溶解于质量体积比5-10倍的二甲基亚砜中，并加入连接剂物质的量比为1-2倍的三乙胺，在氮气保护下避光将两种溶液混合，之后搅拌反应4-8小时。之后将反应液加入至体积比10-50倍的乙醚：四氢呋喃=3:1-5:1体积比的混合溶液中，0-5摄氏度条件下静置1-2小时，过滤得到沉淀即中间产物。
然后将过滤得到的中间产物溶解于质量体积比10-20倍的二甲基亚砜中，再称取一定量的化合物4，用量为该中间产物物质的量的5-10倍，将其溶解于质量体积比10-20倍的二甲基亚砜中。之后将该中间产物的溶液缓慢滴加至化合物4的溶液中了，滴加2-4小时，之后继续反应12-18小时，反应完毕后，溶液在透析袋中透析24-48小时，然后冰冻干燥，得到粉末状物质，即最终产物树枝状聚阳离子材料（化合物7）。
反应式如下：
反应式中，化合物1是已知化合物（Newkome G.R. Journal of Organic Chemistry,1988, V53(23): P5552-5554； Leonard N.J. Journal of the American Chemical Society, 1949, V71: P1762-1764）；化合物2是化合物1和N-叔丁氧羰基乙二胺缩合后的还原产物；化合物3是已知化合物（Newkome G.R., Young J.K., Baker G.R., Potter R, Audoly L.P., Cooper D., and Weis C.D. Macromolecules, 1993, 26:2394-2396； Huang Q.R. Langmuir, 2005, V21(7):P2737-2742）；化合物4是化合物2和化合物3缩合后的水解产物，即二代AB3型树枝状阳离子聚合物（AB3-Dendeimer G2）；化合物5是八分支聚乙二醇；化合物6是含有双硫键的水溶性内核分子，用二硫键链接着直链聚乙二醇的八分支聚乙二醇（8arm-PEG-SS-PEG）；化合物7是化合物4和化合物6的缩合产物，即最终产物树枝状聚阳离子材料（8arm-PEG-SS-PEG-Dendrimer G2，简称PSPG2s）。
此外，反应式中的n为八分支聚乙二醇每个支链中的重复单元的个数，m为直链聚乙二醇中的重复单元的个数，n和m由聚乙二醇原料的分子量而定。反应条件中的HOAT表示1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑，EDCI表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，TFA表示三氟乙酸，CDI表示N,N'-羰基二咪唑，化合物7中的R基团表示化合物4基团(Dendrimer G2)。
本发明所述的树枝状聚阳离子化合物，即化合物7为：AB3型聚酰胺-胺型树枝状大分子-G2(Dendrimer G2)，AB2型聚酰胺-胺型树枝状大分子-G2、G3、G4(PAMAM G2、G3、G4)。
本发明所述的水溶性树枝状内核（化合物5）为：多分支聚乙二醇（3arm，4arm，8arm），分子量为10000Da-40000Da。
本发明所述的单侧N-羟基丁二酰亚胺活化的直链聚乙二醇分子量为MW 2000Da-5000Da。
本发明所述的连接剂为：N,N'-羰基二咪唑（CDI）、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）、N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯、9-芴基甲基1-苯并三唑基碳酸酯（FMOC-OBT）中任一种。
本发明所述的连接剂用量与对应水溶性树枝状内核的物质的量比为10-30倍量。
本发明所述的水溶性树枝状内核用量与二甲基亚砜的质量体积比为3-5倍量。
本发明所述的连接剂用量与二甲基亚砜的质量体积比为1-5倍量。
本发明所述的催化剂为三乙胺，用量与活化剂HOAT物质的量比为2-4倍量，与连接剂物质的量比为1-2倍量；与胱胺二盐酸盐物质的量比为3-5倍量。
本发明所述的胱胺二盐酸盐用量与对应水溶性树枝状内核的物质的量比为15-30倍量。
本发明所述的直链水溶性树枝状内核（直链聚乙二醇）用量（NHS-PEG-OH）与对应化合物5的物质的量比为5-10倍量。
本发明所述的树枝状小分子化合物（化合物4）用量与对应PEG（化合物6）的物质的量比为5-10倍量。
本发明的第三个目的是提供所述该类新型树枝状聚阳离子材料在作为基因药物载体中的应用，其中所述的药物是具有疏水性质的药物。
本发明材料作为非病毒基因药物载体，该载体由一类多分支的水溶性聚合物（如聚乙二醇）为内核，通过可降解的二硫键，在末端链接多个低代数（G2-G4）树枝状阳离子聚合物（如本发明中合成的AB3型PAMAM和商品化的AB2型PAMAM），形成了一系列新型的树枝状聚阳离子材料(Dendritic cationic polymer)。这类材料不仅可以高效的运输基因和药物，同时具有低毒性和可降解性，而且合成方法简单，成本较低，是一类有良好应用前景的材料。
本发明化合物在制备方面，选取了简单易得的多分支水溶性聚合物和低代数的树枝状阳离子聚合物作为原料，成本比较低廉；而且合成方法简易，大多是常温反应，不需要无水无氧等苛刻的反应条件，后处理一般采用萃取或透析的分离方法，操作简单。
本发明巧妙地运用了水溶性内核与树枝状阳离子聚合物各自的特点，通过简单的连接，达到了很好的效果。首先，由于树枝状阳离子聚合物表面带有大量的正电荷，彼此间相互排斥，所以整个载体材料在水中呈现放射状形态，球状的树枝状阳离子聚合物分散在水溶性内核周围，同时利用树枝状阳离子聚合物自身内部特有的疏水性空腔，可以轻松携带脂溶性药物；其次，树枝状阳离子聚合物外层的正电荷可以有效地与带有负电荷的基因（DNA或RNA）相结合，当正电荷被中和，由于水溶性的不足，会被水溶性更好的内核结构包裹起来，形成接近电中性且尺寸适宜细胞吞噬的纳米微粒。第三，由于水溶性内核分子与树枝状阳离子聚合物间用二硫键链接，而二硫键在细胞内易于被还原降解，从而释放出包裹在内的基因和药物，使其发挥作用。
本发明是利用本身结构的特点及化合物各部分的亲疏水性不同，通过化合物内外层结构的翻转换位，达到有效地携带基因（DNA或RNA）和药物的功能，同时形成性质稳定、尺寸200nm左右的纳米微粒。该纳米微粒在细胞中具有很高的基因递送效率，药物也可以在细胞中稳定持续地缓释，提高了基因和药物的生物利用度。此外，传统的低代数树枝状阳离子聚合物递送基因和药物的效率很低，而高代数树枝状阳离子聚合物虽然有一定的递送效率，但是由于自身分子量很高，而且无法在体内降解，细胞毒性很大，本发明利用二硫键将毒性很低的低代数树枝状阳离子聚合物链接在生物相容性很好的水溶性内核上，形成了一个高分子量的聚合物，不仅有很好的基因和药物递送效率，而且可以在细胞内降解，有效缓解了树枝状阳离子聚合物递送效率与毒性之间的矛盾。
附图说明
图1是新型的树枝状聚阳离子化合物的立体结构示意图。
图2是AB3-Dendrimer G2的核磁氢谱表征图。
图3是AB3-Dendrimer G2的高分辨质谱表征图。
图4是8armPEG-SS-PEG-Dendrimer G2及合成过程产物的核磁氢谱表征。
图5是四种不同比例的PSPG2s的核磁氢谱表征。
图6是材料携带DNA和RNA的琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。
图7是PSPG2s-6和PSPG2s-6/Dox/DNA的衰减全反射傅里叶红外光谱。
图8是PSPG2s-6和PSPG2s-6/Dox/DNA的表面X射线光电子能谱图。
图9是PSPG2s-6/DOX/DNA的电镜图，其中（a）是透射电镜图，（b）是扫描电镜图。
图10（a-h）是PSPG2s-6、Dendrimer G2及其载药和基因之后的粒径和电位图，其中图a是Dendrimer G2和4种不同比例PSPG2s的粒径和电位，图b是Dendrimer G2和PSPG2s-6携带不同比例阿霉素的粒径和电位，图c和图d分别是Dendrimer G2和4种不同比例PSPG2s结合DNA后在不同N/P比下的粒径和电位，图e和图f分别是Dendrimer G2和PSPG2s-6携带阿霉素后在不同N/P比下结合DNA的粒径和电位，图g和图h分别是Dendrimer G2、2种不同比例PSPG2s和PSPG2s-6携带2中不同比例阿霉素后在不同N/P比下结合siRNA的粒径和电位。
图11是Dendrimer G2和PSPG2s-6结合DNA或结合阿霉素和DNA之后的肝素干扰实验。
图12是PSPG2s-6在PH=7.4、6.5和5.0的PBS溶液中的降解实验。
图13是6种材料在4小时不同浓度条件下的细胞毒性。
图14是6种材料在24小时不同浓度条件下的细胞毒性。
图15是4种不同比例PSPG2s和2种不同比例PPG2s携带荧光素酶蛋白质粒基因（Luciferase）在Hek293细胞上的转染结果。
图16是4种不同比例PSPG2s和2种不同比例PPG2s携带绿色荧光蛋白干扰RNA（GFP-siRNA），在表达绿色荧光蛋白的人肾上皮细胞（293T-GFP）上24小时内的绿色荧光蛋白沉默实验结果。
图17是PSPG2s-6/Dox9%在PH=5.0、7.4的PBS中的阿霉素释放结果。
图18是PSPG2s-6/Dox9%在PH=5.0的酸性条件下0h和12h时的TEM图片，以及PSPG2s-6/Dox9%在PH=5.0、7.4的条件下0h和12h的白光照片。
图19中是Dox、siRNA和PSPG2s/Dox9%/siRNA在裸鼠肿瘤部位代谢的不同时间点的活体荧光图。
图20是图19中红绿荧光的相对强度变化曲线。
图21是Dox和PSPG2s-6/Dox9%/siRNA在裸鼠肿瘤部位代谢24h后的肿瘤切片图。
图22是2种接入比的PSPP3s/DNA（PSPP3s-4/6分别表示树枝状聚阳离子化合物PSPG2s中8arm-PEG和PAMAM G3的物质的量比为4/6）在不同N/P比下的携带DNA的琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。
图23是PAMAM G3、PEI25KD、PSPP3s-6在最佳N/P比下，在血清浓度分别为0%、10%、25%、50%的条件下的荧光素酶报告基因Luciferase的转染实验结果。
图24是不同材料溶酶体逃逸能力的检测实验结果。
图25是不同载药率对转染的影响实验结果。
图26是2种接入比的4PSPP4s/DNA（4PSPP4s-2/4分别表示树枝状聚阳离子化合物4PSPP4s中4arm-PEG和PAMAM G4的物质的量比为2/4）在不同N/P比下的携带DNA的琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。
图27是4PSPP4s（a）和4PSPP4s/Gef/DNA（b）的原子力显微镜（AFM）图。
图28是丁硫氨酸硫酸亚胺（BSO）对材料细胞毒性的影响实验。
图29是丁硫氨酸硫酸亚胺（BSO）对材料细胞转染的影响实验。
图30是PAMAM G4、4PSPP4s-4和4PPP4s-4在结合吉非替尼和DNA之后，在肝素（heparin）解离实验中的电位变化。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但不限于实施例所公开的内容。
实施例 1：载体材料8armPEG-SS-PEG-Dendrimer G2（PSPG2s）的制备及携带药物和基因。(树枝状聚合物为AB3-Dendrimer G2，8armPEG为15000Da，NHS-PEG-OH为2000Da，连接剂为CDI，药物为阿霉素，基因为空白报告基因DNA)
（1）AB3-Dendeimer G2的合成
称取445.6毫克化合物1溶解于15毫升二氯甲烷中，向其中加入871毫克1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAt）和3毫升三乙胺，常温搅拌10分钟后，加入2.1克N-叔丁氧羰基乙二胺，然后在0摄氏度的条件下缓缓加入4.05克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），加完后保持0摄氏度反应1小时，再常温反应4小时。反应完毕后，向反应液中加入30毫升乙酸乙酯，有机相20毫升用0.4 摩尔/升的盐酸洗三次，用20毫升饱和碳酸氢钠溶液洗三次，用20毫升饱和氯化钠溶液洗一次，再用少量无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸，得到白色固体。
称取703.8毫克该白色固体溶解于10毫升甲醇中，向其中加入356.7毫克的六水合氯化镍，然后在0摄氏度的条件下缓慢加入189.4毫克的硼氢化钠。加完后，在0摄氏度反应0.3小时，然后室温反应4小时。反应完毕后，用1摩尔/升的盐酸溶液将pH值调节至5，然后再用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调节至9。将溶液中的甲醇旋蒸掉，再用乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗一次，用无水硫酸钠干燥，过滤然后浓缩，用柱层析分离的方法（正己烷/乙酸乙酯=1/1）得到无色油状物质，即化合物2。
称取337毫克化合物2、47毫克化合物3和136毫克HOAt溶解于10毫升二氯甲烷中，加入0.5毫升三乙胺，然后在0摄氏度的条件下慢慢加入575毫克EDCI，加完后控制0摄氏度反应2小时，之后常温反应36小时。反应完毕后，向反应液中加入75毫升乙酸乙酯，有机相用50毫升0.4摩尔/升的盐酸洗两次，用50毫升饱和碳酸氢钠溶液洗两次，用50毫升饱和氯化钠溶液洗一次，再用无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸，剩余残渣用柱层析分离的方法（甲醇/乙酸乙酯=1/4）得到白色固体。
称取该白色固体460毫克，于0摄氏度溶解在10毫升三氟乙酸和10毫升二氯甲烷的混合溶剂中，常温搅拌12小时，之后用分子量2000的透析袋在水中透析24小时，冷冻干燥后得到白色粉末，即二代树枝状分子4（AB3-Dendeimer G2）。
（2）8armPEG-SS-PEG的合成
称取6克15000Da的8armPEG溶解于18毫升二甲基亚砜中，称取19克N,N'-羰基二咪唑（CDI），溶解于20毫升二甲基亚砜中，并加入催化剂三乙胺1.6毫升，在氮气保护下避光将8armPEG的溶液滴加至CDI的溶液中，之后继续搅拌反应3小时。之后将反应液加入至体积为2升的乙醚：四氢呋喃=4:1体积比的混合溶液中，0摄氏度条件下静置1小时，之后过滤得到白色粉末。
然后称取3克该白色粉末溶解于15毫升二甲基亚砜中，称取1.35克胱胺二盐酸盐溶解于5毫升二甲基亚砜中，并加入2.5毫升三乙胺，搅拌片刻至完全溶解。之后将PEG的溶液缓慢滴加至胱胺的溶液中，滴加3小时，之后继续反应3小时，反应完毕后，溶液在MW14000透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末。
然后称取1.75克该白色粉末溶解于10毫升二甲基亚砜中，再称取2克2000Da的单侧N-羟基丁二酰亚胺活化的直链聚乙二醇（NHS-PEG-OH）溶解于10毫升二甲基亚砜中，将白色粉末的溶液滴加入NHS-PEG-OH的溶液中，搅拌反应2小时，之后将反应液加入到400毫升的乙醚：四氢呋喃=4:1体积比的混合溶液中，0摄氏度条件下静置1小时，之后过滤得到白色粉末即为8armPEG-SS-PEG。
（3）8armPEG-SS-PEG-Dendrimer G2（PSPG2s）的合成
将3.4克8armPEG-SS-PEG溶解于35毫升二甲基亚砜中，然后称取500毫克N,N'-羰基二咪唑（CDI）溶解于5毫升二甲基亚砜中，并加入催化剂三乙胺400微升，在氮气保护下避光将两种溶液混合，之后搅拌反应6小时。之后将反应液加入至400毫升的乙醚：四氢呋喃=4:1体积比的混合溶液中，0摄氏度条件下静置2小时，之后过滤得到白色粉末。
然后称取1克该白色粉末溶解于10毫升二甲基亚砜中，再称取1.5克AB3-Dendrimer G2树枝状聚合物溶解于15毫升二甲基亚砜中，之后将白色粉末的溶液缓慢滴加至树枝状聚合物的溶液中了，滴加3小时，之后继续反应12小时，反应完毕后，溶液在MW14000的透析袋中透析36小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即最终产物树枝状聚阳离子材料PSPG2s。
反应式同前，化合物7是最终产物树枝状聚阳离子化合物的结构式，其中R基团是化合物4，而化合物7的立体结构参见图1。
（4）纳米粒PSPG2s-6/Dox的制备
4毫克阿霉素（Doxorubicin，Dox）溶解在1毫升 CH2Cl2 中，加入3微升三乙胺，36毫克PSPG2s-6溶解在10毫升 DMSO中，再将两者混合，室温敞口搅拌过夜。然后溶液用分子量14000的透析袋透析4h，冷冻干燥，得到PSPG2s-6/Dox。
（5）纳米粒PSPG2s-6/DNA、PSPG2s-6/Dox/DNA的制备
将空白基因DNA用水溶解配成0.1微克/微升的溶液，取10微升该溶液，再将10微克/微升的PSPG2s-6或含有10微克/微升PSPG2s-6的PSPG2s-6/Dox水溶液等体积加入到DNA溶液中，室温静止30分钟，即形成纳米粒PSPG2s-6/DNA或PSPG2s-6/Dox/DNA，可供后续使用。
实施例 2：材料的表征
（1）AB3-Dendrimer G2的表征
图2为AB3-Dendrimer G2的核磁氢谱和碳谱的谱图，图3为AB3-Dendrimer G2的高分辨质谱（MALDI-TOF MS）的谱图，与理论分子量5604基本吻合，说明AB3-Dendrimer G2的制备方法是可行的。
（2）8armPEG-SS-PEG-Dendrimer G2的合成表征
图4是八分支聚乙二醇（8arm-PEG）、用二硫键链接直链聚乙二醇的八分支聚乙二醇（8arm-PEG-SS-PEG）、二代AB3型树枝状聚合物（AB3-Dendrimer G2）、最终产物树枝状聚阳离子材料（8armPEG-SS-PEG-Dendrimer G2，PSPG2s）的核磁共振氢谱图，图中各非活性氢原子位移如图所示，最终产物PSPG2s的核磁共振氢谱表明聚乙二醇和树枝状聚合物是一个整体，充分证明了提供的制备方法的可行性。图5是四种不同比例的PSPG2s的核磁共振氢谱图，其中内核8armPEG-SS-PEG和Dendrimer G2的比例分别是近似1:2、1:4、1:6、1:8，说明该合成方法可以控制合成不同比例的产物。
实施例 3：化合物携带基因的能力
图6（a）是Dendrimer G2/DNA和4种接入比的PSPG2s/DNA（PSPG2s-2/4/6/8分别表示树枝状聚阳离子化合物PSPG2s中8arm-PEG和Dendrimer G2的物质的量比为2/4/6/8）在不同N/P比下的携带DNA的琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。图中所示说明PSPG2s这类化合物可以有效的携带DNA，而且效率比单独存在的Dendrimer G2的携带效率要高。而图（b）是PSPG2s-2/4/6/8在不同N/P比下的携带RNA的琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。图中所示说明PSPG2s这类化合物也可以有效的携带RNA。
实施例 4：化合物携带基因和药物的结构表征
（1）PSPG2s-6和PSPG2s-6/Dox/DNA的衰减全反射傅里叶红外实验
图7是PSPG2s-6和PSPG2s-6/Dox/DNA的衰减全反射傅里叶红外光谱（PSPG2s-6表示8arm-PEG-SS-PEG-Dendrimer G2-6，即平均每个8armPEG接入6个Dendrimer G2）。图中两条谱带所示，PSPG2s-6材料在携带了DOX和DNA之后，谱带中Dendrimer G2的峰面积大幅度降低，说明在携带DOX和DNA的时候发生了结构的翻转，原本暴露在外圈的阳离子Dendrimer结合了负电荷的DNA，被PEG包裹在了纳米微球内部，而PEG则在外面形成了一层保护层。
（2）PSPG2s-6和PSPG2s-6/Dox/DNA的表面X射线光电子能谱实验
图8是PSPG2s-6和PSPG2s-6/Dox/DNA的C1s（a，b）和O1s（c，d）的高分辨X射线光电子能谱图，图下为各峰的归属说明。图中对应C1s的分峰结果中，a图和b图的对比表明PSPG2s-6在携带了DOX和DNA后，原本表面属于Dendrimer G2的C=O的峰基本不见了；而对应O1s的分峰结果中，c图中绝大部分是属于Dendrimer G2的C=O的峰，而d图中几乎完全是PEG中的C-O的峰。上述依据均说明，PSPG2s-6在携带了DOX和DNA后，其表面基本呈现PEG的性质，而Dendrimer G2连同携带的DOX和DNA被包裹在纳米微球内部。
实施例 5：材料携带基因和药物的电镜实验
图9是PSPG2s-6/DOX/DNA的透射电镜图（a）和扫描电镜图（b）。二种电镜的图均说明了纳米微球的粒径为200nm左右，属于适合细胞吞噬的范围，有利于其发挥基因药物载体的功效。
实施例 6：化合物及携带基因和药物后的粒径点位表征
图10中，图a是Dendrimer G2和4种不同比例PSPG2s的粒径和电位。图b是Dendrimer G2和PSPG2s-6携带不同比例阿霉素的粒径和电位。图c和图d分别是Dendrimer G2和4种不同比例PSPG2s结合DNA后在不同N/P比下的粒径和电位。图e和图f分别是Dendrimer G2和PSPG2s-6携带阿霉素后在不同N/P比下结合DNA的粒径和电位。图g和图h分别是Dendrimer G2、2种不同比例PSPG2s和PSPG2s-6携带2中不同比例阿霉素后在不同N/P比下结合siRNA的粒径和电位。综合上述结果可以得出以下结论：PSPG2s和PSPG2s/DOX在结合DNA或者siRNA之后粒径稳定在200nm左右，同时表面电荷发生了很大变化，由明显的正电性变为接近中性，这一点与单独的Dendrimer G2和Dendrimer G2/DOX在结合DNA或者siRNA之后的电位变化相比，这再次证明材料本身在结构上发生了内外层的翻转，正电荷的Dendrimer被包裹在纳米微球内部，而表面是PEG构成的外壳结构。
实施例 7：化合物的肝素干扰试验
图11是Dendrimer G2和PSPG2s-6结合DNA或结合阿霉素和DNA之后，在肝素解离实验中的粒径变化，其中DTT的作用是降解二硫键，即断开PEG与Dendrimer之间的链接。图中的结果说明在携带基因形成纳米微球由于PEG的保护，可以有效的避免外界电荷的干扰，而失去PEG的保护其结构则不再稳定。
实施例 8：材料的降解实验
图12是PSPG2s-6在PH=7.4、6.5和5.0的PBS溶液中的降解实验。结果表明化合物PSPG2s-6可以在酸性条件下降解，这样可以降低其在使用时的细胞毒性。
实施例 9：化合物的细胞毒性实验
图13和图14是4种不同比例PSPG2s和2种不同比例PPG2s（8arm-PEG-PEG -Dendrimer G2，表示用1,4-丁二胺代替胱胺二盐酸盐合成得到的没有二硫键的树枝状聚阳离子化合物）在Hek293细胞上4小时和24小时的细胞毒性。结果表明，PSPG2s在24小时内几乎没有细胞毒性，而没有二硫键的化合物则会表现出一定的毒性。由于二硫键可以在细胞内被还原，导致化合物被分解成几乎没有细胞毒性的小分子，所以整体毒性低，而没有二硫键的PPG2s则毒性较大，说明二硫键的使用有利于降低化合物的细胞毒性。
实施例 10：
图15是4种不同比例PSPG2s和2种不同比例PPG2s携带荧光素酶蛋白质粒基因（Luciferase）在Hek293细胞上的转染结果。结果表明二硫键在化合物进入细胞后释放基因使其发挥作用的过程中具有至关重要的作用，PSPG2s这类化合物具有很好的递送基因的能力。
实施例 11：
图16：4种不同比例PSPG2s和2种不同比例PPG2s携带绿色荧光蛋白干扰RNA（GFP-siRNA），在表达绿色荧光蛋白的人肾上皮细胞（293T-GFP）上24小时内的绿色荧光蛋白沉默实验结果。结果表明二硫键在化合物进入细胞后释放基因使其发挥作用的过程中具有至关重要的作用，PSPG2s这类化合物还可以有效的携带siRNA进入细胞发挥作用。
实施例12：
图17是PSPG2s-6/Dox9%在PH=5.0、7.4的PBS中的阿霉素释放结果。结果表明，化合物可以有效的携带和释放药物，在酸性条件下的释放效率比中性条件下要高很多，这有利于化合物在肿瘤部分的酸性环境下释放药物，达到疗效。图18是PSPG2s-6/Dox9%在PH=5.0的酸性条件下0h和12h时的TEM图片，以及PSPG2s-6/Dox9%在PH=5.0、7.4的条件下0h和12h的白光照片，上述结果表明，PSPG2s-6/Dox9%在酸性条件下纳米微球的结构会散开，药物会释放出来，而在中性条件下药物释放会受到抑制。这是因为在酸性条件下纳米微球内部的化合物和药物的溶解性会提高，结果会变松散，从而加速药物的释放。
实施例 13：
图19是Dox、siRNA和PSPG2s/Dox9%/siRNA在裸鼠肿瘤部位代谢的不同时间点的活体荧光图；图20是图19中红绿荧光的相对强度变化曲线；图21是Dox和PSPG2s-6/Dox9%/siRNA在裸鼠肿瘤部位代谢24h后的肿瘤切片图。结果表明，材料可以有效的同时在体内携带和释放基因和药物，同时在肿瘤部位有很好的缓释效果。
实施例 14：
载体材料8armPEG-SS-PEG-PAMAM G3（PSPP3s）的制备及携带药物和基因。(树枝状聚合物为PAMAM G3，8armPEG为20000Da，NHS-PEG-OH为3500Da，连接剂为DSC，药物为紫杉醇（Paclitaxel，Taxol），基因为荧光素酶报告基因Luciferase)
（1）8armPEG-SS-PEG的合成
称取8克20000Da的8armPEG溶解于40毫升二甲基亚砜中，称取2克N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC），溶解于6毫升二甲基亚砜中，并加入催化剂三乙胺2.2毫升，在氮气保护下避光将8armPEG的溶液滴加至DSC的溶液中，之后继续搅拌反应5小时。之后将反应液加入至体积为1升的乙醚：四氢呋喃=5:1体积比的混合溶液中，5摄氏度条件下静置3小时，之后过滤得到白色粉末。
然后称取4克该白色粉末溶解于40毫升二甲基亚砜中，称取1克胱胺二盐酸盐溶解于10毫升二甲基亚砜中，并加入2.7毫升三乙胺，搅拌片刻至完全溶解。之后将PEG的溶液缓慢滴加至胱胺的溶液中，滴加5小时，之后继续反应5小时，反应完毕后，溶液在MW14000透析袋中透析48小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末。
然后称取2.25克该白色粉末溶解于20毫升二甲基亚砜中，再称取2.8克3500Da的单侧N-羟基丁二酰亚胺活化的直链聚乙二醇（NHS-PEG-OH）溶解于20毫升二甲基亚砜中，将白色粉末的溶液滴加入NHS-PEG-OH的溶液中，搅拌反应5小时，之后将反应液加入到2升的乙醚：四氢呋喃=3:1体积比的混合溶液中，5摄氏度条件下静置3小时，之后过滤得到白色粉末即为8armPEG-SS-PEG。
（2）8armPEG-SS-PEG- PAMAM G3（PSPP3s）的合成
将4.5克8armPEG-SS-PEG溶解于25毫升二甲基亚砜中，然后称取650毫克N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）溶解于4毫升二甲基亚砜中，并加入催化剂三乙胺650微升，在氮气保护下避光将两种溶液混合，之后搅拌反应8小时。之后将反应液加入至1.2升的乙醚：四氢呋喃=3:1体积比的混合溶液中，5摄氏度条件下静置1.5小时，之后过滤得到白色粉末。
然后称取1.3克该白色粉末溶解于25毫升二甲基亚砜中，再称取1.7克PAMAM G3树枝状聚合物溶解于35毫升二甲基亚砜中，之后将白色粉末的溶液缓慢滴加至树枝状聚合物的溶液中了，滴加4小时，之后继续反应18小时，反应完毕后，溶液在MW14000的透析袋中透析48小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即最终产物树枝状聚阳离子化合物PSPP3s。
（3）纳米粒PSPP3s-6/Taxol的制备
4毫克紫杉醇（Paclitaxel，Taxol）溶解在1毫升 CH2Cl2 中，加入3微升三乙胺，36毫克PSPP3s-6溶解在10毫升 DMSO中，再将两者混合，室温敞口搅拌过夜。然后溶液用分子量14000的透析袋透析4h，冷冻干燥，得到PSPP3s-6/Taxol。
（4）纳米粒PSPP3s-6/DNA、PSPP3s-6/Taxol/DNA的制备
将荧光素酶报告基因Luciferase用水溶解配成0.1微克/微升的溶液，取10微升该溶液，再将10微克/微升的PSPP3s-6或含有10微克/微升PSPP3s-6的PSPP3s-6/Taxol水溶液等体积加入到DNA溶液中，室温静止30分钟，即形成纳米粒PSPP3s-6/DNA或PSPP3s-6/Taxol/DNA，可供后续使用。
实施例 15：化合物携带基因的能力
图22是2种接入比的PSPP3s/DNA（PSPP3s-4/6分别表示树枝状聚阳离子化合物PSPG2s中8arm-PEG和PAMAM G3的物质的量比为4/6）在不同N/P比下的携带DNA的琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。图中所示说明PSPP3s这类化合物可以有效的携带DNA。
实施例 16：血清浓度对转染的影响
图23是PAMAM G3、PEI25KD、PSPP3s-6在最佳N/P比下，在血清浓度分别为0%、10%、25%、50%的条件下的荧光素酶报告基因Luciferase的转染实验结果。图中所示，PAMAM G3和PEI25KD的转染效率随着血清浓度的升高都呈现出大幅度的下降趋势，而PSPP3s-6则几乎不受影响。这是因为血清中的蛋白等物质会影响纳米微球的稳定性，而PSPP3s-6/DNA形成的纳米微球表面是PEG的中性材料，几乎不会受到蛋白的影响，提高了微球的稳定性，从而使转染效率不受明显影响。同时值得一提的是PAMAM G3为分支的化合物的转染效率与PEI25KD基本相同，而我们自主合成的Dendrimer G2为分支的PSPG2s-6的转染效率为PEI25KD的1.13倍（实施例10），具有更好的递送能力。
实施例 17：溶酶体逃逸能力的检测实验
图24为PAMAM G3、PEI25KD、PSPP3s-6在最佳N/P比的条件下，分别在有无氯喹和巴佛洛霉素A1存在下的荧光素酶报告基因Luciferase的转染实验结果。氯喹的作用是促进内吞材料的溶酶体逃逸，而巴佛洛霉素A1的作用是通过抑制离子泵的正常工作从而抑制溶酶体逃逸。实验结果表明，PSPP3s-6具有很好的溶酶体逃逸的能力，在相同条件下氯喹对其的促进作用并不明显，而PAMAM G3单体则逃逸能力较差，在氯喹的条件下有明显的提升；另一方面，说明PSPP3s-6的溶酶体逃逸是由于自身的质子海绵效应，抑制了离子泵的功能，就会大幅度的抑制其的逃逸能力。
实施例 18：
图25为PSPP3s-6载不同比例的紫杉醇（Taxol）的荧光素酶报告基因Luciferase的转染实验结果，载药率分别为0%、9%、20%、30%。结果表明，随着载药率的增大，转染效率会有一定程度的降低，这是因为药物本身对细胞有一定的杀伤性，使得细胞正常功能受到一定的抑制，间接导致转染效率下降。
实施例 19：载体材料4armPEG-SS-PEG-PAMAM G4（4PSPP4s）的制备及携带药物和基因。(树枝状聚合物为PAMAM G4，8armPEG为40000Da，NHS-PEG-OH为5000Da，连接剂为FMOC-OBT，药物为吉非替尼（Gefitinib，Gef），基因为荧光素酶报告基因Luciferase)
（1）4armPEG-SS-PEG的合成
称取10克40000Da的4armPEG溶解于40毫升二甲基亚砜中，称取0.9克9-芴基甲基1-苯并三唑基碳酸酯（FMOC-OBT），溶解于5毫升二甲基亚砜中，并加入催化剂三乙胺0.5毫升，在氮气保护下避光将8armPEG的溶液滴加至FMOC-OBT的溶液中，之后继续搅拌反应4小时。之后将反应液加入至体积为2升的乙醚：四氢呋喃=3:1体积比的混合溶液中，0摄氏度条件下静置2小时，之后过滤得到粉末状固体。
然后称取8克该粉末溶解于60毫升二甲基亚砜中，称取0.7克胱胺二盐酸盐溶解于5毫升二甲基亚砜中，并加入1.6毫升三乙胺，搅拌片刻至完全溶解。之后将PEG的溶液缓慢滴加至胱胺的溶液中，滴加4小时，之后继续反应4小时，反应完毕后，溶液在MW14000透析袋中透析36小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末。
然后称取4克该白色粉末溶解于30毫升二甲基亚砜中，再称取2.5克5000Da的单侧N-羟基丁二酰亚胺活化的直链聚乙二醇（NHS-PEG-OH）溶解于25毫升二甲基亚砜中，将白色粉末的溶液滴加入NHS-PEG-OH的溶液中，搅拌反应3.5小时，之后将反应液加入到2升的乙醚：四氢呋喃=5:1体积比的混合溶液中，0摄氏度条件下静置2小时，之后过滤得到白色粉末即为4armPEG-SS-PEG。
（2）4armPEG-SS-PEG-PAMAM G4（4PSPP4s）的合成
将3克8armPEG-SS-PEG溶解于25毫升二甲基亚砜中，然后称取270毫克9-芴基甲基1-苯并三唑基碳酸酯（FMOC-OBT）溶解于2毫升二甲基亚砜中，并加入催化剂三乙胺100微升，在氮气保护下避光将两种溶液混合，之后搅拌反应4小时。之后将反应液加入至1升的乙醚：四氢呋喃=5:1体积比的混合溶液中，0摄氏度条件下静置1小时，之后过滤得到白色粉末。
然后称取1.8克该白色粉末溶解于25毫升二甲基亚砜中，再称取2.7克PAMAM G4树枝状聚合物溶解于40毫升二甲基亚砜中，之后将白色粉末的溶液缓慢滴加至树枝状聚合物的溶液中了，滴加2小时，之后继续反应15小时，反应完毕后，溶液在MW50000的透析袋中透析24小时，然后冰冻干燥，得到白色粉末状物质，即最终产物树枝状聚阳离子化合物4PSPP4s。
（3）纳米粒4PSPP4s-4/Gef的制备
4毫克吉非替尼（Gefitinib，Gef）溶解在1毫升 CH2Cl2 中，加入3微升三乙胺，36毫克4PSPP4s-4溶解在10毫升DMSO中，再将两者混合，室温敞口搅拌过夜。然后溶液用分子量14000的透析袋透析4h，冷冻干燥，得到4PSPP4s-4/Gef。
（4）纳米粒4PSPP4s-4/DNA、4PSPP4s-4/Gef/DNA的制备
将基因为荧光素酶报告基因Luciferase用水溶解配成0.1微克/微升的溶液，取10微升该溶液，再将10微克/微升的4PSPP4s-4或含有10微克/微升4PSPP4s-4的4PSPP4s-4/Gef水溶液等体积加入到DNA溶液中，室温静止30分钟，即形成纳米粒4PSPP4s-4/DNA或4PSPP4s-4/Gef/DNA，可供后续使用。
实施例 20：材料携带基因的能力
图26是2种接入比的4PSPP4s/DNA（4PSPP4s-2/4分别表示树枝状聚阳离子化合物4PSPP4s中4arm-PEG和PAMAM G4的物质的量比为2/4）在不同N/P比下的携带DNA的琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。图中所示说明4PSPP4s这类材料可以有效的携带DNA。
实施例 21：
图27是4PSPP4s（a）和4PSPP4s/Gef/DNA（b）的原子力显微镜（AFM）图。图中显示，4PSPP4s在携带了基因和药物之后可以形成粒径为200nm左右的纳米微球，属于适合细胞吞噬的范围，有利于其发挥基因药物载体的功效。
实施例 22：二硫键对材料细胞毒性的影响
图28为二硫键对化合物细胞毒性影响的研究，具体为4PSPP4s-4和4PPP4s-4（4arm-PEG-PEG-PAMAM G4，表示用1,4-丁二胺代替胱胺二盐酸盐合成得到的没有二硫键的树枝状聚阳离子化合物）在有无丁硫氨酸硫酸亚胺（BSO）存在的条件下的细胞毒性实验。丁硫氨酸硫酸亚胺是细胞氧化-还原态的调控应用特异性谷胱甘肽(GSH)的合成抑制剂，它可以通过抑制GSH的合成来抑制化合物中二硫键的降解。实验结果表明，二硫键的降解在化合物的低毒性方面起到了至关重要的作用，没有BSO存在的4PSPP4s-4在细胞中几乎没有毒性表现，而有BSO存在的条件下，4PSPP4s-4的细胞毒性与没有二硫键的4PPP4s-4相似。
实施例 23：二硫键对化合物细胞转染的影响
图29为二硫键对化合物细胞转染影响的研究，具体为4PSPP4s-4和4PPP4s-4在有无丁硫氨酸硫酸亚胺（BSO）存在的条件下的荧光素酶报告基因Luciferase转染实验。丁硫氨酸硫酸亚胺是细胞氧化-还原态的调控应用特异性谷胱甘肽(GSH)的合成抑制剂，它可以通过抑制GSH的合成来抑制化合物中二硫键的降解。实验结果表明，二硫键的降解在化合物的转染方面起到了至关重要的作用，这是因为二硫键的降解促进了DNA的释放，从而有效的提高的转染效率。
实施例 24：化合物的肝素干扰试验
图30是PAMAM G4、4PSPP4s-4和4PPP4s-4在结合吉非替尼和DNA之后，在肝素（heparin）解离实验中的电位变化，其中二硫苏糖醇（DTT）的作用是降解二硫键，即断开4arm-PEG与PAMAM G4之间的链接。图中的结果显示，PAMAM G4的电位会受到肝素的影响，4PSPP4s-4和4PPP4s-4在PEG的保护下，基本不受肝素的影响，而4PSPP4s-4在DTT作用下二硫键降解，PEG离去之后，也会受到肝素的影响。这说明在4PSPP4s-4携带基因和药物形成纳米微球只有，会由于自身PEG的保护，可以有效的避免外界电荷的干扰，而失去PEG的保护其结构则不再稳定。

Claims (10)

1.一类树枝状聚阳离子化合物，其特征在于，结构式如下：
其中：
R为二代AB3型树枝状阳离子聚合物，结构式为：
n为八分支聚乙二醇每个支链中的重复单元的个数；
m为直链聚乙二醇中的重复单元的个数。
2.根据权利要求1所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现，以8armPEG-SS-PEG-Dendrimer G2为例：
（1）化合物4的制备：化合物1溶解于二氯甲烷中，向其中加入活化剂1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑并加入催化剂三乙胺，常温搅拌，之后加入N-叔丁氧羰基乙二胺，然后缓缓加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，加完后继续反应，反应完毕后，向反应液中加入乙酸乙酯，有机相依次用盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到中间产物，将中间产物溶解于甲醇中，向其中加入六水合氯化镍，然后缓慢加入硼氢化钠，加完后继续反应，反应完毕后，用盐酸溶液将pH值调节至酸性，再用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调节至碱性，将溶液中的甲醇旋蒸掉，再用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用柱层析分离的方法得到化合物2；
将化合物2、化合物3和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑溶解于二氯甲烷中，加入催化剂三乙胺，然后加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，加完后继续反应，反应完毕后，向反应液中加入乙酸乙酯，有机相依次用盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸，剩余残渣用柱层析分离的方法得到中间产物，然后将所得中间产物溶解于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中，常温搅拌，之后用水透析，冷冻干燥后得到化合物4；
（2）化合物6的制备方法：将化合物5溶解于二甲基亚砜中，然后将连接剂溶解于二甲基亚砜中，并加入三乙胺，在氮气保护下避光将化合物5的溶液滴加至连接剂的溶液中，继续反应，之后将反应液加入乙醚和四氢呋喃混合溶液中，静置，过滤得到沉淀即中间产物，将中间产物溶解于二甲基亚砜中，再将胱胺二盐酸盐溶解于二甲基亚砜中，并加入三乙胺，搅拌至完全溶解，将该中间产物的溶液缓慢滴加至胱胺的溶液中，继续反应，反应完毕后，溶液用水透析，冰冻干燥得到中间产物，再将该中间产物溶解于二甲基亚砜中，再将单侧活化的直链聚乙二醇溶解于二甲基亚砜中，将该中间产物的溶液滴加入聚乙二醇的溶液中，搅拌反应，之后将反应液加入至乙醚和四氢呋喃的混合溶液中，静置，过滤得到白色粉末即为化合物6；
（3）最终产物化合物7的制备：将化合物6溶解于二甲基亚砜中，然后将连接剂溶解于二甲基亚砜中，并加入三乙胺，在氮气保护下避光将两种溶液混合，搅拌反应，将反应液加入乙醚和四氢呋喃的混合溶液中，静置，过滤得到沉淀即中间产物，然后将该中间产物和化合物4分别溶解于二甲基亚砜中，将中间产物的溶液缓慢滴加至化合物4的溶液中，之后继续反应，反应完毕后，溶液用水透析，然后冰冻干燥，得到粉末状物质，即最终产物化合物7；反应式如下：
反应式中n为八分支聚乙二醇每个支链中的重复单元的个数，m为直链聚乙二醇中的重复单元的个数，n和m由聚乙二醇原料的分子量而定；反应条件中的HOAT表示1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑，EDCI表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，TFA表示三氟乙酸，CDI表示N,N'-羰基二咪唑，化合物7中的R基团表示化合物4。
3.根据权利要求2所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，所述的树枝状聚阳离子化合物，即化合物7为：AB3型聚酰胺-胺型树枝状大分子-G2，AB2型聚酰胺-胺型树枝状大分子-G2、G3、G4。
4.根据权利要求2所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，所述的化合物5为：3arm，4arm，8arm多分支聚乙二醇，分子量为10000Da-40000Da；所述的直链聚乙二醇分子量为MW 2000Da-5000Da。
5.根据权利要求2所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，所述的连接剂为：N,N'-羰基二咪唑、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯、9-芴基甲基1-苯并三唑基碳酸酯中任一种。
6.根据权利要求2所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，所述的连接剂用量与对应的化合物5的物质的量比为10-30倍量，所述的化合物5用量与二甲基亚砜的质量体积比为3-5倍量。
7.根据权利要求2所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，所述的连接剂用量与二甲基亚砜的质量体积比为1-5倍量。
8.根据权利要求2所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，所述的催化剂为三乙胺，用量与活化剂HOAT物质的量比为2-4倍量，与连接剂物质的量比为1-2倍量，与胱胺二盐酸盐物质的量比为3-5倍量。
9.根据权利要求2所述的一类树枝状聚阳离子化合物的制备方法，其特征在于，所述的胱胺二盐酸盐用量与对应化合物5的物质的量比为15-30倍量；直链聚乙二醇用量与对应化合物5的物质的量比为5-10倍量；化合物4用量与对应化合物6的物质的量比为5-10倍量。
10.根据权利要求1所述的一类树枝状聚阳离子化合物在作为基因药物载体中的应用，其中所述的药物是具有疏水性质的药物。
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