CN104302780B

CN104302780B - 纤维变性易感性il22ra2基因及其用途

Info

Publication number: CN104302780B
Application number: CN201280047401.1A
Authority: CN
Inventors: 阿莱恩·德赛因; 马蒂厄·塞尔托里奥; 劳伦特·阿尔吉罗
Original assignee: France National Medical Association Of Health And Research; Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Current assignee: France National Medical Association Of Health And Research; Aix Marseille Universite
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: US20140295427A1; BR112014002347B1; WO2013020904A1; CN107217092A; JP2014524236A; CN104302780A; KR102003835B1; US10150989B2; JP6141275B2; CA2843949C; KR20140058611A; DK2739748T3; JP2017176186A; EP2739748A1; CA2843949A1; US20190323060A1; EP2739748B1; BR112014002347A2

Abstract

本发明公开了纤维变性易感性基因座IL22RA2基因座的鉴定，所述基因座可用于纤维变性的易感性检测、诊断和预后以及治疗活性药物的筛选。本发明还提供了用于确定患有病毒感染的患者对使用抗病毒剂和/或干扰素的治疗做出响应的可能性的方法，所述方法包括确定所述患者的生物样品中IL22RA2基因座中、或IL22RA2表达或IL22RA2蛋白活性中的变化。

Description

纤维变性易感性IL22RA2基因及其用途

技术领域

本发明总的来说涉及遗传学和医学领域。具体来说，本发明公开了人类易感性基因的鉴定，所述基因可用于对组织中可能引起纤维变性的细胞外基质蛋白（ECMP）的异常沉积进行诊断或预后，或用于检测在肝脏疾病、肝硬化、皮肤瘢痕瘤、肥胖症和任何纤维变性疾病以及在其他组织例如心、血管或脑的疾病中发生的这种异常ECMP沉积或纤维变性的易感性。更具体来说，本发明公开了6号染色体上IL22RA2基因的某些等位基因，其与纤维变性的易感性相关并代表了用于筛选治疗活性药物的新靶点。更具体来说，本发明涉及IL22RA2基因和表达产物中的特定突变，以及基于这些突变的诊断工具和试剂盒。

背景技术

组织中细胞外基质蛋白的积累可能具有有害效应。组织中ECMP的异常沉积可能引起组织纤维变性。

纤维变性是器官、其任何部分或组织中，例如肝脏、其任何部分或组织中纤维状结缔组织的过度生长，特别是对损伤做出响应的过度生长。

异常纤维变性发生在各种病因的慢性肝脏炎症中，例如在肝炎病毒和血吸虫感染中。以前显示，被血吸虫感染的某些对象是慢性纤维变性患者，而其他对象是快速纤维变性患者，并且这部分取决于位于Chr6q22-q23上的主要基因（Dessein等，1999；Mohamed-Ali等，1999）。国际专利申请WO2010/094740将CTGF（CCN2）鉴定为该区域中的纤维变性易感性基因。

血吸虫病由在宿主的血管系统中发育并产卵的蠕虫引起，某些卵被运载到肝脏，在那里它们在门静脉周围间隙中引发炎症。由于蠕虫在它们的人类宿主中生活多年，因此在受感染对象中伴有大量组织破坏的慢性肝炎是常见的。组织修复需要在受损组织中沉积ECMP，其在随后被更新并被正常肝细胞替代。在某些患者中ECMP积累在门静脉周围间隙中，形成纤维变性沉积物，其减少血液流动，造成静脉曲张、腹水。在慢性或重复损伤数月或数年后，纤维变性变得永久且不可逆。对象死于纤维变性的结果。

在南方国家，据估计3亿5千万受感染对象中的5至10%可能发生严重肝纤维变性。没有良好的标志物允许在血吸虫感染的对象中预测并追踪肝纤维变性的进展。

肝纤维变性的诊断大多数基于肝脏活检、弹性测量法和超声分析。

取决于临床情况，活检样品通过经皮、经颈静脉的放射照相引导的细针或腹腔镜途径来获得。组织病理学检查能够使临床医生对炎症坏死的严重性分级并对纤维变性的程度分期。Metavir评分系统使用如下所述的1-4的量表为纤维变性的阶段指派分值：F0=无纤维变性，F1=门静脉纤维变性而没有隔膜，F2=门静脉纤维变性和少数隔膜，F3=大量隔膜而没有肝硬化，F4=肝硬化（Bedossa等，1996）。肝脏活检是侵入性和昂贵的程序，并且仅对肝脏的少部分取样。因此，它不能提供肝纤维变性的全面评估，并且易受取样变差和观察者间和观察者内误差的影响。此外，肝脏活检伴有3%的显著发病率和0.03%的死亡率。潜在的并发症包括与活检相关的局部血肿、感染和疼痛。

非侵入性测试（即血清学标志物、弹性测量法、超声分析）也被使用，但是尚未准备好用于常规临床使用。

血液标志物评估组已被测试，主要是在患有慢性丙型肝炎或由病毒性丙型肝炎造成的肝硬化的患者中。这些研究揭示，血清标志物可以在约35%的患者中判断出或排除纤维变性（Sebastiani等，2006）。然而，当单个地看待患者时，这些标志物不能可靠地区分纤维变性的各个阶段。更近的研究合并了三个血清标志物评估组来设计提高诊断准确性的算法（Parkes等，2006）。所评估的3个评估组是APRI（天冬氨酸转氨酶与血小板比率指数）、Forns指数（血小板、γ-谷氨酰基转肽酶、胆固醇）和Fibrotest（GGT、结合珠蛋白、胆红素、载脂蛋白A、α-2-巨球蛋白）。由APRI和随后的Fibrotest构成的算法将纤维变性的诊断准确性提高到高于90%。该研究组估计，使用这种算法能够避免高达50%的肝脏活检需要。然而，使用这种算法不能辨别纤维变性的各个阶段。这些血清标志物的限制是当存在高活性肝脏炎症时假阳性的可能性。

Fibroscan是对肝纤维变性进行分期的另一种方法，其基于为肝组织平均刚度提供快速测量的弹性成像术（Ziol等，2005）。使用探针将低频低振幅的振动传送到肝脏中。这种振动波触发弹性剪切波，其通过肝脏的速度与以千帕（kPa）为单位度量的组织刚度成正比。与肝脏活检相比，Fibroscan技术的灵敏度在79至95%的范围内，特异性在78至95%的范围内。然而，这种技术的限制与弹性波在流体或脂肪组织中的衰减相关，所述衰减损害患者中纤维变性的评估。此外，Fibroscan是极为昂贵的仪器。

对于从肝脏根除HCV来说，目前的护理标准（SOC）由PEG化的I型干扰素（PegIFN）和合成核苷利巴韦林（RBV）疗法构成（Fried MW等，N Engl J Med.2002;347(13):975-82；“EASL临床实践指南：丙肝病毒感染的管理”（EASL Clinical Practice Guideline:Management of Hepatitis C virus infection,J Hepatol），2011;55:245-264）。然而，这种标准疗法具有有限和不可预测的效能、常常导致治疗中断的广泛的毒性分布情况，并且非常昂贵。少于一半的基因型1和4的慢性HCV感染个体对标准疗法（PegIFN/RBV）的长期治疗（48周）有响应（Testino G等，Hepatogastroenterology2011;58(106):536-8）。

因此，为了优化治疗、避免对非响应者的副作用和降低治疗费用，对选择具有更好的机会对治疗做出响应的患者的方法，存在着需求。

总而言之，对于预测纤维变性的进展和治疗效率的有效方法，仍存在需求。

发明概述

本发明的目的是提供用于纤维变性预后和治疗的新的遗传学方法。现在，本发明公开了另一个人类纤维变性易感性基因座IL22RA2基因座的鉴定，所述基因座可用于异常ECMP沉积、特别是纤维变性、尤其是肝纤维变性的易感性检测、诊断和预后，以及用于治疗活性药物的筛选。具体来说，本发明涉及一种方法，所述方法包括检测来自于所述对象的样品中IL22RA2基因座的变化的存在，所述变化的存在是异常ECMP沉积或纤维变性的存在或易感性的指示。

本发明的具体目的在于对象中发生异常ECMP沉积或纤维变性的易感性检测或诊断和/或预后的体外方法，所述方法包括检测来自于所述对象的样品中IL22RA2基因或多肽的变化的存在，所述变化的存在是异常ECMP沉积或纤维变性的存在的指示、或对异常ECMP沉积或纤维变性的易感性的指示。本发明的具体目的在于用于评估（预测）异常ECMP沉积或纤维变性的进展的方法。

在优选实施方式中，所述变化位于IL22RA2基因的起始密码子上游的500kb之内，优选地100kb之内，优选地20kb之内，并位于IL22RA2基因的3’UTR下游的500kb之内，优选地100kb之内，优选地20kb之内。优选地，所述变化位于IL22RA2基因的起始密码子上游10kb区域和非翻译区（3’UTR）下游10kb区域的周围序列中。

在另一个优选实施方式中，所述变化是一个或多个碱基的突变、插入或缺失。在更优选的实施方式中，所述变化是与纤维变性相关的一个或数个单核苷酸多态性SNP或SNP的单倍体型。优选地，所述单核苷酸多态性是IL22RA2基因侧翼的SNP，其是位置接近IL22RA2基因的等位基因变体。

本发明的方法允许对人类纤维变性疾病中发生的纤维变性进行检测和预后，所述纤维变性疾病选自肝脏疾病纤维变性、肝硬化、皮肤瘢痕瘤、增生性瘢痕和肥胖症、酗酒或药物性肝中毒。特别是，所述肝纤维变性可能由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒（HCV）、日本血吸虫（S.japonicum）或曼森氏血吸虫（S.mansoni）感染引起。

在特定实施方式中，所述方法包括对对象、优选地被肝炎病毒或寄生虫感染的对象的生物样品中IL22RA2基因座中的SNP进行基因分型，其中在SNP rs6570136中存在基因型GG，在SNP rs7774663中存在基因型TT，在SNP rs11154915中存在基因型TT、CT和/或在SNPrs2064501中存在基因型CC，指示了在所述对象中发生异常ECMP沉积例如纤维变性的风险，或指示了异常ECMP沉积例如纤维变性的发生，或指示了纤维变性的不良预后。所述纤维变性更具体地是肝纤维变性。

或者，所述方法可以包括对与本文中提到的SNP处于连锁不平衡（LD）中的任何SNP进行基因分型。

优选地，所述IL22RA2基因座中的变化，通过进行选择性杂交测定法、测序测定法、微量测序测定法和/或等位基因特异性扩增测定法来确定。

在本发明的另一方面，IL22RA2基因中的所述变化通过限制性酶消化来确定，检测到至少一个所述SNP是纤维变性的指示。

本发明还涉及用于为患有异常ECMP沉积例如纤维变性或对发生异常ECMP沉积例如纤维变性易感的对象选择治疗性化合物的方法，所述方法包括将测试化合物与IL22RA2多肽或基因或其片段相接触，并确定所述测试化合物提高或降低与IL22RA2基因相关的途径的生物活性或功能的能力。

本发明的另一个主题是一种用于确定患有病毒感染的患者对使用抗病毒剂和/或干扰素的治疗做出响应的可能性的体外方法，所述方法包括确定所述患者的生物样品中IL22RA2基因座中、或IL22RA2蛋白表达或活性中的变化。

在特定实施方式中，所述方法包括对对象的生物样品中IL22RA2基因座中的SNP进行基因分型，其中对于SNP rs11154915来说TT基因型、对于SNP rs6570136来说AG或GG基因型、对于SNP rs2064501来说CT基因型和/或对于SNP rs1543509来说AA基因型的存在，有利于患者对所述治疗的阳性响应。或者，所述方法可以包括对与本文中提到的SNP处于连锁不平衡（LD）中的任何SNP进行基因分型。

在特定实施方式中，所述治疗包含抗病毒剂，并任选地连同干扰素。

优选地，所述抗病毒剂是病毒复制的抑制剂，例如利巴韦林。

图例说明

图1A和1B示出了来自于日本血吸虫流行区对象的PMBC的培养物中的IL-22和L-17水平。在来自于19个对照和70个流行区对象的经过144小时静置的培养物和被卵刺激的培养物中获得数据。图1C示出了来自于流行区对象血液的IL22+细胞的FACS分析。数据来自于20个实验中的一个代表性实验。

图2A示出了PBMC培养物中的IL-22水平随过去10年内抗血吸虫病治疗的次数而变。研究对象超过30岁并小于65岁，并且没有有活性的HBV感染（HBS Ag-）。

抗血吸虫治疗：对象在过去10年内按照下列方案服用吡喹酮：从未，1至4次，5-10次，>10次。

对照是尚未暴露于日本血吸虫并且从未用吡喹酮治疗过的对象。星号：用日本血吸虫卵刺激的培养物；空心圆圈：静置培养物；每个组的对象数目：对照（19），处理：未治疗（9），1-4（30），5-10（23），<10（8）。

图2B示出了PBMC培养物中IL-22的水平随肝纤维变性的程度而变。

研究对象超过30岁并小于65岁，并且没有有活性的HBV感染（HBS Ag-）。对照是尚未暴露于日本血吸虫的对象；星号：用日本血吸虫卵刺激的培养物；空心圆圈：静置培养物。纤维变性等级如方法中所述进行评估，并且大多数是中央纤维变性等级，外周纤维变性只有在将具有轻度中央纤维变性的对象分成一个没有或具有轻度外周纤维变性的组（CLL）和一个具有轻度中央纤维变性并发展成严重（GNM，GNH）外周纤维变性的组（CLL，GNM）时才考虑在内。每个组的对象数目：对照（19），CLL（23），CLL GNM（27），CLM（10），CLH（7），D、E、F（3）。

图2C示出了具有不同肝纤维变性等级并使用不同治疗的对象中的IL-22水平。研究对象超过30岁并小于65岁，并且没有有活性的HBV感染（HBS Ag-）。对照是尚未暴露于日本血吸虫的对象。对象已被治疗0至4次（空心圆圈）或超过5次至20次（实心圆圈）。每个组的对象数目：治疗组合并如下：0至4次治疗以及>5次治疗，以便增加每个点的对象数目

对照：19；0-4次治疗：39；>5次治疗：对照：31。

图3A示出了抗血吸虫治疗对卵刺激的培养物中IL-22、IL-6、IL-1β或IL-23水平的影响。研究对象超过30岁并小于65岁，并且没有有活性的HBV感染（HBS Ag-）。对照是尚未暴露于日本血吸虫的对象。将来自于研究对象的PBMC用卵刺激，并在24小时（IL-1b、IL-23、IL-6）和144小时（IL-22）时评估上清液中的细胞因子。将IL-6水平乘以0.1。

图3B示出了在来自于对照和具有各种不同程度肝纤维变性的对象的卵刺激的PMBC中IL-22、IL-6、IL-1β或IL-23的水平。研究和每个组中的对象数目与图2A相同。

图4是在IL22RA2中定位SNP和关联性区段（correlation bin）的图谱。

发明详述

本发明提供了在人类中用于在纤维变性、尤其是肝纤维变性中预测疾病进展的有价值的遗传标志物。

ECMP的异常积累或纤维变性的早期检测，以及这样的积累或纤维变性的定期监测，允许启动抗纤维变性疗法，从而能够中止并甚至逆转这一过程。这将反过来防止发展为人类纤维变性疾病例如肝纤维变性或肝硬化，以及这种病症带来的发病和死亡。这些各种早期纤维变性检测技术的开发对于肝病患者未来的护理是一个好的兆头。

现在，本发明发明人已鉴定出与人类纤维变性相关的基因。他们显示，在分别被日本血吸虫和曼森氏血吸虫感染的中国人、苏丹人和巴西人组群中，纤维变性显著依赖于位于IL22RA2基因中的等位基因变体。IL22RA2（“白介素-22受体α-2”）基因，也称为IL22R-BP，编码IL-22受体的可溶形式，其竞争IL-22与其受体的结合。

更具体来说，本发明发明人对全都生活在血吸虫流行区的中国人（暴露于日本血吸虫）、苏丹人和巴西人（暴露于曼森氏血吸虫）的独立样品进行了病例对照研究。由至少两位观察者使用超声回波描记术对每个样品进行肝纤维变性（HF）评估。测试了IL22RA2中的所有标签SNP（次要等位基因频率>10%）。为了排除与相关SNP连锁不平衡的SNP是否能够解释观察到的关联性，发明人评估了在IL22RA2的3’和5’的500Kb区域内的SNP。

因此，本发明提供了在对象中确定发生肝纤维变性的风险或肝纤维变性的发生或肝纤维变性的不良预后的方法，所述方法包括在来自于所述对象的样品中检测IL22RA2基因座处风险相关的单核苷酸多态性（SNP）等位基因的存在。

更具体来说，本发明提供了确定发生肝纤维变性的风险或肝纤维变性的发生或肝纤维变性的不良预后的方法，所述方法包括对来自于所述对象的样品中IL22RA2基因座中的SNP进行基因分型。

本发明的另一个目的是提供用于预测对病毒感染治疗的响应的遗传学方法。本发明现在公开了抗病毒治疗响应基因座、即IL22RA2基因座的鉴定，所述基因座可用于预测患有病毒感染、尤其是HCV的患者对抗病毒治疗的响应。具体来说，本发明涉及一种方法，所述方法包括在来自于对象的样品中检测IL22RA2基因座中的变化的存在，所述变化的存在指示了对治疗的响应，即指示了患者不对治疗做出响应的风险水平。

本发明的方法允许预测对治疗的响应，所述治疗使用给药于患有病毒感染、尤其是丙型肝炎的患者的抗病毒剂例如利巴韦林和干扰素。

本发明提供了尤其是在丙型肝炎中用于预测对抗病毒治疗的响应的有价值的标志物。

对抗病毒治疗有响应和无响应对象的早期鉴定，允许根据患者的基因型启动个体化（个性化）治疗。这将进而帮助医生做出更合理的决定，避免不需要的开支和不必要的副作用。这些各种早期预测技术的开发对于患有病毒感染、尤其是丙型肝炎的患者未来的护理是一个好的兆头。

现在，本发明发明人已鉴定出与对抗病毒治疗的响应相关的基因。他们已显示，在被HCV感染的各种组群中，对抗病毒治疗利巴韦林-IFN的响应取决于位于IL22RA2基因中的等位基因变体。

尽管取决于被测试的群体，由本发明发明人收集的实验数据不能证实某些等位基因的关联性，但本发明不限于被发现在所有被测试的群体中与纤维变性显著相关的特定SNP。事实上，有几个原因可以解释在某些群体中证实显著关联性的失败，包括组群不足、混杂变量的评估不完全、所述群体中SNP的频率较低等。

定义

在本发明的上下文中，术语“细胞外基质蛋白（ECMP）的异常沉积”是指可能在所有类型的人类组织中积累的细胞外基质组分（包括层粘连蛋白、纤连蛋白EIIIA、胶原蛋白I和IV、前胶原蛋白III、弹性蛋白、腱生蛋白）。这样的积累可能是有害的，例如当它出现在动脉、心脏或脑中时。当沉积巨大时，积累导致组织的纤维变性。

在本发明的上下文中，“纤维变性”是指在所有人类纤维变性疾病例如肝病、肝硬化、皮肤瘢痕瘤、增生性瘢痕、硬皮病、肥胖症和任何纤维变性疾病中发生的所有类型的人类纤维变性。

在本发明的上下文中，“肝纤维变性”或“HF”是指在肝、其组织或其组织的任何部分中发生的所有类型的纤维变性。肝纤维变性尤其是在对损伤做出响应时发生。肝纤维变性可以是对慢性肝损伤的常见响应，最终引起肝硬化及其并发症、门静脉高压、肝衰竭和肝细胞癌。肝纤维变性是过分旺盛的伤口愈合，其中过量的结缔组织在肝脏中堆积。细胞外基质被过量产生、不充分地降解或两种情况皆有。触发事件是慢性损伤，特别是如果存在炎性组分的话。各种类型的慢性肝损伤可以引起纤维变性，例如化学性纤维变性（CCl₄）、细菌性（即布鲁氏菌病）、寄生虫性（即由裂体吸虫属（Schistosoma）物种引起的裂体吸虫病/血吸虫病；或包虫病感染）或病毒性（即由甲肝病毒（HAV）、乙肝病毒（HBC）或丙肝病毒（HCV）感染引起的肝炎）损伤。

在本发明的上下文中，“皮肤瘢痕瘤”是皮肤上瘢痕组织的过度生长。更具体来说，瘢痕瘤和增生性瘢痕（HSc）是人类特有的在创伤、炎症、手术、烧伤后以及有时自发发生的真皮纤维增殖性障碍。它们的特征在于胶原蛋白在真皮和皮下组织中的过度沉积。与正常伤口修复的细纹瘢痕特征相反，瘢痕瘤和HSc的旺盛的瘢痕形成通常引起毁容、挛缩、瘙痒和疼痛。瘢痕瘤在黑种人、西班牙人和东方人中发生在具有家族倾向性的个体中。与HSc不同，瘢痕瘤的瘢痕扩大并延伸到原始伤口的边缘之外并很少减退。这些障碍代表了伤口愈合的基础过程的失常，所述过程包括细胞迁移和增殖、炎性、细胞因子和细胞外基质（ECM）蛋白的合成和分泌增加以及新合成基质的重塑。在生物学上，瘢痕瘤是纤维变性组织，其特征在于过度沉积有细胞外基质组分、尤其是胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖的非典型性成纤维细胞的集合。总的来说，瘢痕瘤含有相对无细胞的中心和浓密丰富的胶原蛋白束，其在病变的真皮深层部分中形成结节。在愈合的炎性阶段期间生长因子的释放和活化是瘢痕形成过程的先决条件，所述过程包括血管生成、表皮再生、成纤维细胞的募集和增殖以及基质沉积。然后，调节性细胞因子包括IL22RA2的活性的异常产生，可能造成瘢痕瘤的发生。

在本发明的上下文中，“IL22RA2基因座”是指细胞或生物体中的所有序列或产物，包括IL22RA2编码序列、IL22RA2非编码序列（例如内含子）、控制转录和/或翻译的IL22RA2调控序列（例如启动子、增强子、终止子等）、所有相应的表达产物例如IL22RA2RNA（例如mRNA）和IL22RA2多肽（例如前体蛋白和成熟蛋白）；以及IL22RA2基因的起始密码子上游500kb区域、优选地100kb、优选地20kb区域和非翻译区（3’UTR）下游500kb区域、优选地100kb、优选地20kb区域的周围序列。例如，IL22RA2基因座包含含有表1的SNP的周围序列。

在本发明的上下文中，术语“预后”包括在成年人、儿童和胎儿中，在包括早期、症状出现前的阶段和晚期阶段的各个阶段检测、监测、给药、比较等。预后通常包括评估（预测）纤维变性的进展和确定对象特征以确定最适合的治疗（药物遗传学）等。本发明提供了用于确定由IL22RA2基因座中的突变或多态性引起的纤维变性或相关障碍的发展速度的预后方法。

“样品”可以是源自于患者或对象的含有核酸或多肽的任何生物样品。这样的样品的实例包括流体、组织、细胞样品、器官、活检样品等。最优选的样品是血液、血浆、唾液、尿液、精液等。样品可以按照常规技术来收集并直接用于诊断或储存。

“患者”可以是任何哺乳动物，优选为人类，无论其年龄或性别如何。患者可能被病毒感染，所述病毒包括选自下列病毒科的病毒：沙粒病毒科（例如拉沙病毒），冠状病毒科（例如严重急性呼吸综合征病毒），黄病毒科（例如丙肝或乙肝病毒、登革病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒），纤丝病毒科（例如埃博拉病毒、马尔堡病毒），疱疹病毒科（例如单纯性疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、水痘带状疱疹病毒），正粘病毒科（例如流感A和B病毒），副粘病毒科（例如呼吸道合胞体病毒、副流感病毒、PMV、麻疹病毒），痘病毒科（例如痘苗病毒、天花病毒），弹状病毒科（例如水疱性口炎病毒、病毒性出血性败血症病毒、狂犬病病毒），反转录病毒科（例如HIV和其他反转录病毒），披膜病毒科（例如基孔肯亚病毒、辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、罗斯河病毒、东部马脑炎病毒）。在特定实施方式中，患者被丙肝病毒例如基因型1的丙肝病毒感染。

在用于确定患有病毒感染的患者对使用抗病毒剂和/或干扰素的治疗做出响应的可能性的方法中，术语“病毒感染”是指可以用利巴韦林和/或IFN治疗的所有类型的人类病毒感染，例如丙型肝炎、乙型肝炎、呼吸道合胞体病毒（RSV）细支气管炎、腺病毒病、流感和用利巴韦林和/或IFN治疗的任何人类病毒感染。

在本发明的上下文中，“响应者”是指对使用抗病毒剂、尤其是利巴韦林和/或IFN的治疗做出响应的患者的表型，即病毒载量降低，其至少一种症状减轻，或疾病的发展停止或减缓。

在本发明的上下文中，“非响应者”是指对使用抗病毒剂、尤其是利巴韦林和/或IFN的治疗没有响应，或者做出响应但在1或2年内复发的患者的表型。对治疗无响应是指病毒载量没有显著降低，患者症状没有减轻或疾病继续发展。复发患者对治疗做出短期响应，但是它们的病毒载量和症状在治疗结束后的1或2年内再次增加。

术语“治疗”或“抗病毒治疗”是指抗病毒剂和/或干扰素（IFN）的给药。

优选地，干扰素是干扰素γ。然而也涵盖其他干扰素，包括干扰素α2B、PEG化的干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。在优选实施方式中，干扰素是PEG化的干扰素，例如PEG化的干扰素γ。

“抗病毒剂”可以是干扰病毒进入细胞或病毒复制或抑制病毒蛋白的活性的任何化合物。例如，它可以是干扰RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、次黄苷5’-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺或金刚乙胺。更通常地，它可以是病毒蛋白酶抑制剂。

当所述病毒是HCV病毒时，抗病毒剂可以是HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV排出或HCV NS5A蛋白的抑制剂。

在优选情况下，干扰素是干扰素γ，例如PEG化的干扰素γ。在另一种优选情况下，干扰素是干扰素α，例如PEG化的干扰素α。在特定实施方式中，治疗包括利巴韦林和干扰素γ或α，优选地PEG化的干扰素γ或α。

变化

变化可以在IL22RA2DNA、RNA或多肽的水平上确定。任选地，通过对IL22RA2基因座的全部或一部分进行测序，或者通过对IL22RA2基因座的全部或一部分进行选择性杂交或扩增，来进行检测。更优选地，在变化鉴定步骤之前进行IL22RA2基因座特异性扩增。IL22RA2基因座中的变化可以是基因座的编码和/或非编码区中的任何形式的突变、缺失、重排和/或插入，其可以单独地或以各种组合出现。更具体来说，突变包括点突变。缺失可以涵盖基因座的编码或非编码区中具有两个或更多个残基的任何区域，例如从2个残基直至整个基因或基因座。典型的缺失影响较小的区域，例如少于约50个连续碱基对的结构域（内含子）或重复序列或片段，尽管较大的缺失也可能发生。插入可以涵盖在基因座的编码或非编码部分中添加一个或几个残基。插入通常可以包含在基因座中添加1至50个碱基对。重排包括序列的倒置。IL22RA2基因座变化可以导致产生终止密码子、移码突变、氨基酸替换、特定RNA拼接或加工、产物不稳定性、产生截短的多肽等。变化可能导致产生具有改变的功能、稳定性、靶向或结构的IL22RA2多肽。变化还可能导致蛋白质表达的降低或所述生产的增加。

在优选实施方式中，所述变化是一个或多个碱基的突变、插入或缺失。在本发明方法的特定实施方式中，IL22RA2基因座中的变化选自IL22RA2基因或相应的表达产物中的点突变、缺失和插入，更优选地为点突变和缺失。变化可以在IL22RA2DNA、RNA或多肽的水平上确定。

在最优选实施方式中，方法包括对IL22RA2基因进行基因分型，以确定在表1A中指明的位置中的任意处SNP的存在。

表1A：IL22RA2基因座中与纤维变性相关的SNP

Hapmap：CEU欧洲人组群，YOR非洲人组群（约鲁巴人），CHB亚洲人组群(中国人)

优选地，方法包括对选自rs6570136、rs7774663、rs11154915和rs2064501的SNP进行基因分型。

对于SNP rs6570136来说G等位基因、更具体来说GG基因型的存在，对于患者是有害的，即它指示了患者可能发生ECMP异常沉积或纤维变性，尤其是肝纤维变性。

对于SNP rs7774663来说T等位基因、更具体来说TT基因型的存在，对于患者是有害的，即它指示了患者可能发生ECMP异常沉积或纤维变性，尤其是肝纤维变性。

对于SNP rs11154915来说T等位基因、更具体来说TT或CT基因型的存在，对于患者是有害的，即它指示了患者可能发生ECMP异常沉积或纤维变性，尤其是肝纤维变性。

对于SNP rs2064501来说C等位基因、更具体来说CC基因型的存在，对于患者是有害的，即它指示了患者可能发生ECMP异常沉积或纤维变性，尤其是肝纤维变性。

相同区段中的SNP是高度关联的（r2>0.8），并且在本发明的方法中用途相近。本发明还涵盖了处于强连锁不平衡中的SNP（得到_r2>0.6）。

本发明的另一种方法可以包括确定患者是否包含表1B中所定义的非响应性基因型。

分析在123位都感染有HCV的对象（69位响应对象和54位非响应对象）上进行。

表1B：IL22RA2基因座中与抗病毒治疗响应性相关的变化

优选地，方法包括对选自rs11154915、rs6570136、rs2064501和rs1543509的SNP进行基因分型。

对于SNP rs11154915来说TT基因型的存在，有利于患者对所述抗病毒治疗的阳性响应。

对于SNP rs6570136来说AG或GG基因型的存在，有利于患者对所述抗病毒治疗的阳性响应。

对于SNP rs2064501来说CT基因型的存在，有利于患者对所述抗病毒治疗的阳性响应。

对于SNP rs1543509来说AA基因型的存在，有利于患者对所述抗病毒治疗的阳性响应。

相同区段中的SNP是高度关联的（r2>0.8），并且在本发明的方法中用途相近。本发明还涵盖了处于连锁不平衡中的SNP。

与每种基因型相关的比值比注明在表1B中。当每个SNP被单独评估时，它们在1.9至4之间变化；当所有SNP在同一多变量模型（其考虑了SNP之间的混杂效应）中一起评估时，OR在1.9至13之间变化，并且携带所有4种多态性的响应性基因型的对象，与携带所有基因型的非响应性基因型的对象相比，对治疗做出响应的可能性高出约50至300倍。

连锁不平衡（LD）被定义为整个基因组上不同基因座处等位基因的非随机关联。两个或更多个基因座处的等位基因，如果它们的组合以比在群体中通过概率所预期的更高或更低的频率出现，则处于LD中。

当由于LD造成在DNA区域中存在因果基因座（causal locus）时，一个或多个邻近的SNP也可能伴有该特性。因此，与和异常ECMP沉积相关的第一SNP处于强LD（得到r2>0.6）中的任何SNP，也将伴有该特性。

与给定SNP处于连锁不平衡的其他SNP的鉴定包括：（a）从大量个体，从包含或围绕第一SNP的基因组区域扩增片段；（b）在带有或围绕所述第一SNP的基因组区域中鉴定第二SNP；（c）在所述第一SNP与第二SNP之间进行连锁不平衡分析；以及（d）当与所述第一标志物处于连锁不平衡时，选择所述第二SNP。还设想了包含步骤（b）和（c）的子组合。

鉴定SNP和进行连锁不平衡分析的方法，可以由专业技术人员使用公知的方法，不需过多实验来进行。

众所周知，许多SNP具有与其他邻近SNP等位基因显示出强LD的等位基因，并且在具有强LD的基因组区域中，选择均匀间隔的SNP或在它们与其他SNP（代理（proxy）SNP或标签SNP）的LD的基础上选择的SNP，能够捕获没有进行基因分型的SNP的大多数遗传信息，并且仅仅略微损失统计功效。在关联性研究中，使用很少的SNP（标签SNP）足以覆盖LD的这个区域，并且SNP与所研究的表型之间的统计学关联性意味着所述SNP是因果变体或与因果变体处于LD中。最通常用于度量LD的两个指标是D’和r²，并且可以根据彼此和等位基因频率来书写。普遍的共识是，代理（或标签SNP）被定义为与一个或多个其他SNP处于LD（r²≥0.8）中的SNP。代理SNP的基因型能够通过LD预测其他SNP的基因型，反之亦然。具体来说，与本文中使用的SNP之一处于LD中的任何SNP可以被一个或多个代理SNP代替，所述代理SNP根据它们的LD为r²≥0.8来定义。

这些处于连锁不平衡的SNP也可用于本发明的方法中，更具体地用于本发明的诊断方法中。

IL22RA2基因中的变化可以通过确定改变的IL22RA2RNA表达的存在来检测。改变的RNA表达包括存在改变的RNA序列、存在改变的RNA拼接或加工、存在改变的RNA量等。它们可以通过本领域中已知的各种技术来检测，包括例如通过对IL22RA2RNA的全部或一部分进行测序，或通过选择性杂交或选择性扩增所述RNA的全部或一部分。

在其他变体中，方法包括检测改变的IL22RA2多肽表达的存在。改变的IL22RA2多肽表达包括存在改变的多肽序列、存在改变的IL22RA2多肽的量、存在改变的组织分布等。它们可以通过本领域中已知的各种技术来检测，包括例如通过测序和/或与特异性配体（例如抗体）的结合。

如上所示，可以使用本领域中已知的各种技术来检测或定量改变的IL22RA2基因或RNA表达或序列，这些技术包括测序、杂交、扩增和/或与特异性配体（例如抗体）的结合。其他适合的方法包括等位基因特异性寡核苷酸（ASO）、等位基因特异性扩增、Southern印迹（用于DNA）、Northern印迹（用于RNA）、单链构象分析（SSCA）、PFGE、荧光原位杂交（FISH）、凝胶迁移、夹具式变性凝胶电泳、异源双链体分析、RNase保护、化学错配切割、ELISA、放射免疫测定法（RIA）和免疫-酶测定法（IEMA）。这些方法中的一些（例如SSCA和CGGE）是基于作为存在改变的序列的结果而发生的核酸电泳迁移率的变化。按照这些技术，通过在凝胶上的迁移率变化来观察改变的序列。然后可以对片段进行测序以证实变化。一些其他方法是基于来自于对象的核酸与特异性针对野生型或改变的IL22RA2基因或RNA的探针之间的特异性杂交。探针可以在悬液中，或者固定在基材上。探针通常被标记以便于杂交体的检测。这些方法中的一些特别适用于评估多肽序列或表达水平，例如Northern印迹、ELISA和RIA。这些后面的方法需要使用特异性针对多肽的配体，更优选为特异性抗体。

在优选实施方式中，方法包括检测来自于对象的样品中改变的IL22RA2基因表达情况的存在。如上所示，这更优选地可以通过对所述样品中存在的核酸进行测序、选择性杂交和/或选择性扩增来实现。

测序

测序可以使用本领域中公知的技术，使用自动测序仪来进行。测序可以在完整的IL22RA2基因座上，或者更优选地在其特定结构域上，通常为已知或怀疑携带有害突变或其他变化的结构域上进行。

扩增

扩增是基于互补核酸序列之间用于引发核酸复制的特异性杂交体的形成。扩增可以按照本领域中已知的各种技术来进行，例如通过聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、链置换扩增（SDA）和基于核酸序列的扩增（NASBA）。这些技术可以使用可商购的试剂和流程来进行。优选的技术使用等位基因特异性PCR或PCR-SSCP。扩增通常需要使用特异性核酸引物来引发反应。可用于从IL22RA2基因座扩增序列的核酸引物，能够与IL22RA2基因座在所述基因座的靶区域侧翼的部分特异性杂交，所述靶区域在某些具有纤维变性或相关障碍的对象中被改变。

本发明利用了可用于从IL22RA2基因或基因座、包括周围区域扩增序列的核酸引物。这样的引物优选地与IL22RA2基因座中的核酸序列互补并与其特异性杂交。特定引物能够与IL22RA2基因座在所述基因座的靶区域侧翼的部分特异性杂交，所述靶区域在某些具有纤维变性或相关障碍的对象中被改变。

选择性杂交

杂交检测方法是基于互补核酸序列之间用于检测核酸序列变化的特异性杂交体的形成。具体检测技术包括使用特异性针对野生型或改变的IL22RA2基因或RNA的核酸探针，然后检测杂交体的存在。探针可以在悬液中，或固定在基材或支持物上（如在核酸阵列或芯片技术中）。探针通常被标记以便于杂交体的检测。就此而言，本发明的特定实施方式包括将来自于对象的样品与特异性针对改变的IL22RA2基因座的核酸探针相接触，并评估杂交体的形成。在特别优选的实施方式中，方法包括将样品同时与分别特异性针对野生型IL22RA2基因座及其各种改变形式的一组探针进行接触。在这样的实施方式中，可以直接检测样品中IL22RA2基因座的各种变化形式的存在。此外，还可以并行地处理来自于各个对象的各种不同样品。

在本发明的上下文中，探针是指与IL22RA2基因或RNA（的靶部分）互补并能够与其特异性杂交的多核苷酸序列，并且其适用于检测与IL22RA2等位基因相关联的多核苷酸多态性，所述等位基因对纤维变性易感或与纤维变性相关。探针优选地与IL22RA2基因、RNA或其靶部分完全互补。探针通常包含长度在8至1000个核苷酸之间，例如10至800之间、更优选地15至700之间、通常20至500之间的单链核酸。应该理解，也可以使用更长的探针。本发明的优选探针是长度在8至500个核苷酸之间的单链核酸分子，其能够与IL22RA2基因座或RNA带有变化的区域特异性杂交。

本发明的方法利用特异性针对改变的（例如突变的）IL22RA2基因或RNA的核酸探针，即与所述改变的IL22RA2基因或RNA特异性杂交并且基本上不与缺少所述变化的IL22RA2基因或RNA杂交的核酸探针。特异性是指与靶序列的杂交产生可以与通过非特异性杂交产生的信号区别开的特异性信号。完全互补的序列对于本发明探针的设计来说是优选的。然而，应该理解，可以容忍一定的错配，只要特异性信号可以与非特异性杂交区分开即可。这样的探针的具体实例是与基因组区域的靶部分互补的核酸序列，所述靶部分包括带有上面表1中列出的点突变的IL22RA2基因座或RNA。

探针的序列可以源自于本申请中提供的IL22RA2基因和RNA的序列。可以进行核苷酸替换以及探针的化学修饰。可以进行这样的化学修饰以提高杂交体的稳定性（例如嵌入基团）或标记探针。标记物的典型实例包括但不限于放射活性、荧光、发光、酶标记等。本发明还涉及将如上所述的核酸探针用于在对象中检测纤维变性或相关障碍的存在或易感性的方法中，或用于评估对象对纤维变性或相关障碍的治疗的响应的方法中。

特异性配体结合

如上所示，IL22RA2基因座中的变化，也可以通过筛选IL22RA2多肽序列或表达水平中的变化来检测。就此而言，还描述了将样品与特异性针对IL22RA2多肽的配体相接触，并测定复合物的形成。可以使用不同类型的配体，例如特异性抗体。在特定实施方式中，将样品与特异性针对IL22RA2多肽的抗体相接触，并测定免疫复合物的形成。可以使用用于检测免疫复合物的各种方法，例如ELISA、放射免疫测定法（RIA）和免疫-酶学测定法（IEMA）。在本发明的上下文中，抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体及其具有基本上相同的抗原特异性的片段或衍生物。片段包括Fab、Fab’2、CDR区等。衍生物包括单链抗体、人源化抗体、多功能抗体等。特异性针对IL22RA2多肽的抗体是指选择性结合IL22RA2多肽的抗体，即针对IL22RA2多肽或其含表位片段产生的抗体。尽管可能发生针对其他抗原的非特异性结合，但与靶IL22RA2多肽的结合以较高亲和性发生，并可以与非特异性结合可靠地区分开。

还公开了诊断试剂盒，其包含用于检测来自于对象的样品中，在IL22RA2基因座或多肽、IL22RA2基因或多肽表达和/或IL22RA2活性中的变化的存在的产品和试剂。所述诊断试剂盒包含本发明中描述的任何引物、任何引物对、任何核酸探针和/或任何配体，优选抗体。所述诊断试剂盒还可以包含用于执行杂交、扩增或抗原-抗体免疫反应的试剂和/或流程。

药物筛选

还描述了用于筛选药物候选物或先导物的新方法。这些方法包括结合测定法和/或功能测定法，并且可以在体外、细胞系统、动物等中进行。本发明的具体目的在于一种筛选生物活性化合物的方法，所述方法包括在体外将测试化合物与本发明的IL22RA2基因或多肽相接触，并确定所述测试化合物结合所述IL22RA2基因或多肽的能力。与所述基因或多肽的结合，为所述化合物调节所述靶的活性的能力以及因此影响在对象中造成任何ECMP异常沉积或纤维变性的途径的能力，提供了指示。在优选实施方式中，所述方法包括在体外将测试化合物与本发明的IL22RA2多肽或其片段相接触，并确定所述测试化合物结合所述IL22RA2多肽或片段的能力。所述片段优选地包含IL22RA2多肽的结合位点。优选地，所述IL22RA2基因或多肽或其片段是改变的或突变的IL22RA2基因或多肽或其包含所述变化或突变的片段。本发明的具体目的在于一种筛选对任何ECMP异常沉积或纤维变性有活性的化合物的方法，所述方法包括在体外将测试化合物与本发明的IL22RA2多肽或其含有结合位点的片段相接触，并确定所述测试化合物结合所述IL22RA2多肽或其片段的能力。优选地，所述IL22RA2多肽或其片段是改变的或突变的IL22RA2多肽或其包含所述变化或突变的片段。用于筛选药物候选物的方法包括将表达本发明的IL22RA2多肽的重组宿主细胞与测试化合物相接触，并确定所述测试化合物结合所述IL22RA2以及调节IL22RA2多肽的活性的能力。优选地，所述IL22RA2多肽或其片段是改变的或突变的IL22RA2多肽或其包含所述变化或突变的片段。结合的确定可以通过各种技术来进行，例如通过测试化合物的标记、通过与标记的参比配体的竞争等。选择生物活性化合物的方法还包括在体外将测试化合物与IL22RA2多肽相接触，并确定所述测试化合物调节所述IL22RA2多肽的活性的能力。优选地，所述IL22RA2多肽或其片段是改变的或突变的IL22RA2多肽或其包含所述变化或突变的片段。为已患有任何ECMP异常沉积或纤维变性、或对发生任何ECMP异常沉积或纤维变性易感的对象选择生物活性化合物的方法，还包括在体外将测试化合物与本发明的IL22RA2基因相接触，并确定所述测试化合物调节所述IL22RA2基因的表达的能力。优选地，所述IL22RA2基因或其片段是改变的或突变的IL22RA2基因或其包含所述变化或突变的片段。

筛选、选择或鉴定活性化合物、尤其是对任何ECMP异常沉积或纤维变性有活性的化合物的方法，还包括：将测试化合物与包含报告构建物的重组宿主细胞相接触，所述报告构建物包含在IL22RA2基因启动子控制下的报告基因；以及选择调节（例如激活或抑制）报告基因的表达的测试化合物。优选地，所述IL22RA2基因启动子或其片段是改变的或突变的IL22RA2基因启动子或其包含所述变化或突变的片段。

上面的筛选测定法可以在任何适合的装置例如板、试管、培养皿、摇瓶等中进行。通常，测定法在多孔板中进行。几种测试化合物可以并行地测定。此外，测试化合物可以具有各种不同的来源、性质和组成。它可以是任何有机或无机物质，例如脂类、肽、多肽、核酸、小分子等，可以是孤立的或与其他物质形成混合物。例如，化合物可以是产物组合文库的全部或一部分。

本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，所述实验部分应该被当作说明性的，而不是限制本申请的范围。

实施例

实施例1：人类血吸虫感染中IL-22的生产和调节

人类血吸虫感染中IL-22的生产

本发明发明人将来自于140位暴露于日本血吸虫感染的对象的PBMC培养物，与以前没有暴露于血吸虫感染但在相同地区在可比的生活条件下生活的20位对照的培养物中的IL-22水平进行比较（图1A）。在72和144小时时，在暴露对象的静置培养物中检测到IL-22，并且通过在培养的0时添加血吸虫卵，IL-22显著提高。在对照静置培养物中，仅在144小时时检测到IL-22，并且添加卵不提高IL-22。本发明发明人在144小时培养物中检测到显著水平的IL-17A，但是IL-17水平不被卵刺激提高（图1B）。因此，培养物中的IL-22不可能由Th17产生。暴露患者的血液中IL22+细胞的FACS分析显示，IL-22由CD3+CD4+和CD3-CD4-细胞产生，这些细胞群体都不产生IL-17（图1C）。后者可能是NK细胞。对照和流行区对象中CD3+CD4+IL17-IL22+T细胞和CD3-CD4-IL17-IL22+细胞的百分率示出在图1C上。

IL-22生产的调节被抗血吸虫治疗改变，并且根据肝纤维变性被相应调节。

在暴露的对象中，卵刺激的培养物中的IL-22水平显著变化。由于抗血吸虫的吡喹酮治疗破坏蠕虫并切断卵的生产直至发生再次感染，因此我们评估了吡喹酮治疗中的差异是否可能调节IL-22生产。某些患者已经至少10年每年进行治疗，还有些患者从未被治疗过，其他患者在过去10年中接受过1至10次治疗。图2A示出了吡喹酮治疗的次数对由对象的PBMC生产的IL-22的显著影响：卵刺激的培养物中的IL-22随着过去10年中的治疗次数显著增加（p=0.005，回归模型中的协变量是性别，p=0.08）；然而，对于每年治疗至少一次的对象来说这种影响小得多，可能是因为这些对象没有被再次感染（参见下文）。其次，过去10年中吡喹酮治疗的频率对来自于暴露对象的PMBC的IL-22生产具有显著影响。

然后，本发明发明人评估了培养物中的IL-22水平是否与患者肝病的程度相关。图2B显示，在具有通过肝纤维变性等级度量为轻度肝病的对象中IL-22低，并且随着纤维变性等级的提高稳定地增加，在具有重度中央门静脉周纤维变性的对象中达到最高水平。这表明，发生IL-22生产的提高可能是对严重肝病做出的响应/与严重肝病相关。然而，严格来说，来自患有非常严重的肝纤维变性（HF等级D、E、F）的患者的IL-22不能产生大量IL-22。

吡喹酮治疗的次数对这种模式的影响示出在图2C上。吡喹酮治疗影响由来自于所有纤维变性组的细胞产生的IL-22。三种观察与我们的研究最相关：首先，在重度纤维变性（CLH）中增加的IL-22生产在不同的吡喹酮治疗方式中被观察到，并且不是由该患者的治疗频率的差异造成的；其次，吡喹酮治疗在除了来自于具有严重纤维变性等级的对象的细胞培养物之外的所有培养物中提高IL-22生产；第三，具有高吡喹酮治疗方式（>10，至少每年一次）的对象在轻度纤维变性组中，并解释了在该组中观察到的IL-22生产的增加。概括来说，IL-22受到吡喹酮治疗和肝病程度这两种独立因子的影响。此外，患有严重肝病的对象不能生产大量IL-22，并且这不能通过吡喹酮治疗来改进，然而同样的治疗对具有轻度至重度肝纤维变性的对象的IL-22生产具有显著的增强效应。

在具有不同肝纤维变性等级和不同治疗方式的对象中，IL-6以及或许IL-1β，可能是IL-22生产的关键调节因子。

本发明发明人观察到，通过卵刺激，在来自于暴露对象的PBMC的24小时培养物中细胞因子IL-6、IL-1β和IL-23显著增加（IL-23（p=3.10-6），IL-6（p<10-6）和IL-1β（p<10-6））（图3A）。为了确定这3种细胞因子中的任一种是否在调节IL-22水平中发挥作用，我们使用包括这三种细胞因子的卵刺激的培养物中的IL-22水平、患者年龄和性别，进行了线性回归分析。该分析显示出IL-22与IL-6之间的高度显著（p=0.0002）的关联性以及与IL-1β的弱的关联性（p=0.06）。从回归模型中排除了IL-23。该结果示出在图3B、3C中，其示出了IL-6、IL-1β和IL-23随着吡喹酮治疗（图3B）和肝纤维变性（图3C）的变差。因此，吡喹酮治疗与IL-22之间以及纤维变性等级与IL-22之间的联系，至少部分是IL-6。

上面提出的结果，与保护性IL-22应答的募集随肝损伤而增加以及最严重的肝病可能部分地由不能募集这种应答而引起的观点相一致。为了进一步测试这种假说，本发明发明人寻找表明IL-22在肝纤维变性的控制中事实上是关键的并对肝病具有显著影响的遗传证据。

实施例2：在生活在日本血吸虫流行区的中国渔民和农民的两种样品中IL22RA2编码IL22BP中的多态性与肝纤维变性相关。

材料和方法

统计分析

使用多变量逻辑回归来分析个体发生纤维变性的可能性与包括已知在被血吸虫感染的对象中影响疾病进展的主要协变量的遗传变异体之间的关系。将统计SPSS软件（10.0版）用于这一分析。在回归模型中测试了年龄、性别和对感染的暴露，并且当它们显示出与疾病的关联性（p<0.05）时得以保持。由于组群在性别和年龄上匹配，因此这些协变量对遗传变异体与疾病之间的关联性几乎没有影响。被HBV的感染和对感染的暴露，当这些协变量如在中国渔民（暴露，治疗次数）或在中国农民（HBV感染，出生地）中能够被准确评估时，被包含在回归模型中。

DNA提取

将5至15ml的血液等分试样收集在柠檬酸钠上并保持在-20℃。使用标准的盐析方法提取DNA（Sambrook等，1989）。

DNA扩增

在基因分型之前，对从FTA卡纯化的所有DNA进行预扩增。聚合酶链反应（全基因组扩增）在50μl反应中进行，所述反应含有FTA卡一圆片量的生物样品（FTA1-结合的口腔细胞DNA）或100ng基因组DNA、1.5OD的15个碱基的完全简并的随机引物（Genetix,Paris,France）、200mM dNTP、5mM MgCl₂、5ml10x PCR缓冲液和0.5单位的高保真Taq DNA聚合酶（BIOTAQ DNA聚合酶，Bioline London，England）。将样品在多模块热循环仪中如下所述进行扩增：94℃3分钟的预变性步骤，50个由94℃1分钟、37℃2分钟和1分钟匀变升温（37-55℃）构成的循环，以及55℃4分钟。最后的延伸步骤为72℃5分钟。

测序

纯化的PCR产物使用ABI Prism BigDye Terminator循环测序系统（PE AppliedBiosystems，Foster City，U.S.A.），在ABI Prism自动测序仪上测序。测序反应由GATCbiotech（GATC，Marseille France）在两条链上进行。

使用特异性TaqMan探针通过PCR进行多态性基因分型

使用TaqMan探针测定法（Applied Biosystems，Lafayette，USA）来评估等位基因分型。每个反应含有12.5ng基因组DNA、TaqMan通用PCR主混合物（Applied Biosystems，Lafayette，USA）、900nM每种引物和200nM每种荧光标记的杂交探针，总体积为5μl。RT-PCR在ABI Prism序列检测系统7900（Applied Biosystems，Lafayette，USA）中，使用下列条件来进行：50℃2分钟，95℃10分钟和40个扩增循环（95℃变性15秒，60℃退火/延伸1分钟）。

结果

在HapMap数据的基础上，本发明发明人选择了包含在IL22RA2（29.7Kb）和所述基因的3’和5’的10Kb内并且在中国人中具有大于10%的次要等位基因频率的SNP。这些SNP被分组成含有n=10（区段I）、5（II）、2（III）、3（IV）、13（V）和3（VI）的6个相关（r²=0.8）区段和4个单例，其位置如图4中所示。在已在日本血吸虫已流行至少40年的洞庭湖中捕鱼至少20年的中国渔民（n=268，176位对象具有轻度HF，92位患者具有严重HF）样品中，本发明发明人对来自于每个区段的一个或两个SNP进行基因分型。他们发现，属于2个区段的3个SNP与HF相关。区段I中的SNP rs6570136GG（p=0.007，OR=2.7（CI=1.3-5.6））和rs7774663TT（p=0.006，OR=2.5（1.3-4.7））两者以及rs7749054TT（p=0.045，OR=1.8（1.1-3.1））显示出与HF的一定关联性（表2）。在统计模型中引入的显著协变量是性别（p<10-3，OR=6.9（2.8-17））、暴露（捕鱼年数）（p=0.05，OR=1.02（1-1.05））、脾切除术（p=0.008，OR=6.6（1.6-27））。在存在相同协变量的情况下在同一模型中同时测试两个SNP的多变量分析表明，当在rs6570136（p=0.007，OR=2.9（1.4-6））存在下进行测试时，SNP rs11154915TC是相关的（p=0.04，OR=1.9（1-3.5））。有趣的是（参见在苏丹人和巴西人中的研究），SNP rs2064501显示出与HF相关联的趋势，当在回归模型中引入其他SNP时所述关联性不降低。

最后，rs7749054的关联性可能是由它与区段I中的SNP的LD造成的，因为在SNPrs6570136或SNP rs7774663存在下，rs7749054与HF的关联性完全丧失。

表2.IL22RA2的与肝纤维变性相关联的SNP：中国渔民中的分析

然后，本发明发明人尝试在来自于日本血吸虫流行地区的农民的第二个中国人样品中重现这些结果。该样品与渔民样品的区别在于它是基于医院的，从进行包括腹水、静脉曲张流血和肝硬化的严重肝病护理的门诊患者募集。92.2%的募集的患者生活在仍流行日本血吸虫的地区，7.8%曾经生活在血吸虫流行的地区但在这些地区的传播已在10至15年前中断。这些对象中的一部分（86.5%）有以前HBV感染的迹象（20.9%AgHBS+），一位患者感染有HCV。因此，该第二样品的大多数农民中的肝病可能由血吸虫和HBV感染两者引起。

将在渔民样品中测试的所有SNP，在农民样品中进行基因分型（298位对象，97位对象具有轻度肝病，201位对象具有严重肝病）。观察到来自于3个不同区段的4个SNP与肝病的关联性：SNP rs6570136GG、GA（p=0.009，OR=2（1.2-3.3）），rs7774663TT、TC（p=0.01，OR=2（1.2-3.3），两者在区段1中；SNP rs276466GA（p=0.01，OR=2.2（1.2-4）），其在区段IV中；SNPrs1114915CC、CT（p=0.04，OR=5.7（1.1-29.6）），其在区段V中（表3）。对于区段III中的SNPrs202563AA、GG（p=0.06），和SNP rs2064501CT（p=0.08），也观察到关联的趋势。这些关联性试验中的协变量是年龄（p=0.05，OR=1.03（1-1.06））、性别（p=0.02，OR=2.3（1.1-4.8））和患者生活在流行还是非流行地区（p=0.09，OR=2）。

对来自于不同区段的SNP进行的多变量分析指出了两种可能的统计模型：一种模型包括区段I中的SNPs rs6570136（或rs7774663）（p=.03，OR=1.8（1.1-3））和区段V中的SNPrs11154915（p=0.1，OR=4（0.8-21.2））；另一种模型包括SNP rs276466（p=0.02，OR=2（1.1-3.8））和SNP rs11154915（p=0.05，OR=9.2（1.1-80））。所述分析不能在这两种模型之间做出区分。

表3：IL22RA2的与肝纤维变性相关联的SNP：中国农民中的分析

实施例3：所述关联性向暴露于曼森氏血吸虫的苏丹和巴西人群的扩展

为了评估我们的观察是否能够扩展到被曼森氏血吸虫感染的对象，我们在来自于苏丹的样品和来自于巴西的样品中测试相同的SNP。同样地，苏丹人样品中显著部分的对象与中国农民中相同，也已被HBV感染，而只有非常少的巴西人具有HBV感染。

苏丹人样品（n=202，144个轻度HF和58个严重HF）的基因分型显示，SNPrs6570136GG（p=0.01，OR=3.1（1.3-7.2））、rs7774663TT、TC（p=0.01，OR=1.7（1-3.1）、rs11154915TT（p=0.05，OR=6.2（1-35.3））显示出与HF的关联性，而对于SNPrs7749054TT（p=0.07，OR=2（1-3.6））和rs2064501CC（p=0.06，OR=2.71-7.3））也检测到关联的趋势。参见表4.

表4.在中国人中检测到的关联性扩展至被曼森氏血吸虫感染的苏丹人

同样地，在巴西人样品（n=161，119个轻度HF和42个严重HF）中对这些相同SNP进行的基因分型，显示出SNP rs6570136GG（p=0.0001，OR=6（2.4-14.7））、rs7774663TT（p=0.03，OR=3（1.4-6.8））和SNP rs7749054TT（p=0.03，OR=2.8（1.2-5.6））与HF的关联性。此外，rs11154915TT、TC显示出与HF关联的趋势（p=0.14，OR=2.4（0.9-6.5））。

参见表5：

表5.在被曼森氏血吸虫感染的巴西人中关联性的重现

在苏丹人样品中进行的多变量分析证实了SNP rs6570136、20564501和11154915的独立的关联性。最显著的是，在多变量模型中证实了与rs11154915相关的高OR。此外，带有两个SNP的加重基因型的对象，在两种模型中具有对于HF大于25的OR。多变量分析显示，在存在SNP rs6570136的情况下SNP rs7749054的关联性丧失，证实了这种关联性不独立于SNP rs6570136。

概括来说，在所有测试的4个样品中，属于同一关联性区段的SNPrs6570136GG和rs7774663TT与HF相关联。在所有样品中，SNPrs11154915TT、CT和rs2064501CC显示出与HF相关联的趋势；更重要的是，这些趋势通过多变量分析得以证实，显示出这些SNP独立于SNPrs6570136起作用；将这两个SNP考虑在内增加了SNP rs6570136与HF的关联强度。

实施例4：IL22RA2中的SNP与对抗HCV治疗的响应之间的关联性

本发明发明人在被或曾被HCV基因型1或4感染的123位对象（69位对利巴韦林+IFN治疗的响应者，54位非响应者）上进行了他们的遗传分析。他们测试了使用Hapmap数据在IL22RA2中鉴定到的7个区段的每个中的至少一个SNP。单变量分析显示出与SNP rs2064501（区段VI，p=0.013）和SNP rs1543509（区段VII，p=0.012）的关联性，但是也暗示了与SNPrs7774663、rs6570136（区段I，p<0.13）、SNPrs77449054（区段II，p=0.1）、SNP rs202563（区段III，p=0.07）、SNP rs28366（区段IV，p=0.15）和SNP rs2064501（区段VI，p=0.2）的可能的关联性。这种与对治疗的响应可能相关联的SNP的大数量，可能是由被测试SNP之间的相关性造成的，这也暗示了不同的SNP可能彼此施加混杂影响。然后，进行逐步的多变量分析。

两个一组地测试所有的SNP，表明SNP rs202563和rs6570136与对治疗的响应的关联性是等同的，但是SNP rs276466和rs28366被SNPrs6570136明显排除在回归模型之外。所有的试验显示，SNP rs1154915与对治疗的响应的关联性，被回归模型中其他SNP（例如SNPrs6570136或SNP rs2064501或SNP rs1543509）的存在所增强。在SNP rs2064501或rs1543509存在下，rs6570136与对治疗的响应的关联性丧失，当时当向模型添加SNPrs11154915时（模型中存在3个SNP），这种关联性被重新获得。这是由SNP rs11154915与SNPrs6570136（或区段I中的任何SNP）之间的强连锁不平衡造成的，结果SNP rs1154915TT响应性基因型与区段I的非响应性基因型100%关联。因此，模型必须包括至少3个SNP（rs11154915（p=0.03），rs7774663（或rs6570136，p=0.03）和SNP rs2064501（p=0.001））。最后，SNP rs1543509和来自于区段I的SNP（p=0.15）也进入该模型。

概括来说，本发明发明人发现，属于IL22RA2中4个不同区段的SNP独立地与对治疗的响应相关联。重要的是，这些通过测试标签SNP获得的结果可以扩展到同一区段中的任何SNP。随后，预期区段I、V、VI和VII中即使不是所有也是大多数的SNP，是对IFN+利巴韦林治疗做出响应的遗传标志物。还可以看出，这些鉴定到的区段中的3个与纤维变性的发展相关联（尚未对区段VII中的SNP就纤维变性进行试验）。有趣的是，加重肝纤维变性的大多数基因型与对治疗更好的响应相关联。

参考文献

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Claims

1.用于检测对象的生物样品中IL22RA2基因座中SNP rs6570136中基因型GG的存在、SNP rs7774663中基因型TT的存在、SNP rs11154915中基因型TT、CT的存在和/或SNPrs2064501中基因型CC的存在的试剂在制备用于所述对象中发生细胞外基质蛋白(ECMP)的异常沉积的易感性检测或诊断和/或预后的试剂盒中的用途。

2.权利要求1的用途，所述试剂盒用于纤维变性的易感性检测或诊断和/或预后。

3.权利要求2的用途，所述试剂盒用于评估纤维变性的进展。

4.权利要求1至3任一项的用途，其中在SNP rs6570136中存在基因型GG，在SNPrs7774663中存在基因型TT，在SNP rs11154915中存在基因型TT、CT和/或在SNP rs2064501中存在基因型CC，指示了在所述对象中发生细胞外基质蛋白(ECMP)的异常沉积或纤维变性的风险，或指示了细胞外基质蛋白(ECMP)的异常沉积或纤维变性的发生，或指示了纤维变性的不良预后。

5.权利要求2或3的用途，其中所述纤维变性发生在选自肝纤维变性、肝硬化、皮肤瘢痕瘤、增生性瘢痕、硬皮病和肥胖症的人类纤维变性疾病中。

6.权利要求5的用途，其中所述肝纤维变性由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、日本血吸虫或曼森氏血吸虫感染引起。

7.权利要求1至3任一项的用途，其中所述IL22RA2基因座中SNP rs6570136中基因型GG的存在、SNP rs7774663中基因型TT的存在、SNP rs11154915中基因型TT、CT的存在和/或SNP rs2064501中基因型CC的存在，通过测序、选择性杂交和/或选择性扩增来检测。

8.权利要求1至3任一项的用途，其中SNP rs6570136中基因型GG的存在、SNPrs7774663中基因型TT的存在、SNP rs11154915中基因型TT、CT的存在和/或SNP rs2064501中基因型CC的存在通过限制性酶消化来检测。