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CN104302316A - 在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒的有效疫苗接种 - Google Patents

在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒的有效疫苗接种 Download PDF

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CN104302316A
CN104302316A CN201380025700.XA CN201380025700A CN104302316A CN 104302316 A CN104302316 A CN 104302316A CN 201380025700 A CN201380025700 A CN 201380025700A CN 104302316 A CN104302316 A CN 104302316A
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vaccination
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J.G.卡尔弗特
R.G.安肯鲍尔
J.G.马克思
D.S.皮尔斯
M.L.基思
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Pfizer Corp Belgium
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Abstract

本发明提供包含编码感染性RNA序列的DNA序列的经分离多核苷酸分子，所述感染性RNA序列编码遗传修饰北美PRRS病毒；所述病毒和相关多肽、多核苷酸以及各种组分的制造方法。还提供了包含所述遗传修饰病毒和多核苷酸的疫苗以及一种用于区分自然感染的动物与接种疫苗的动物的诊断试剂盒。

Description

在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒的有效疫苗接种
技术领域
本发明是在动物健康领域中并且针对正极性RNA病毒、新颖RNA病毒以及其经修饰的活的形式的感染性cDNA克隆，并且使用所述cDNA克隆构造疫苗，具体来说，猪疫苗。更具体地说，本发明还提供了猪崽在断奶之前的安全并且早期疫苗接种，包括从出生之后即刻(即仅1日龄或更小)到两周龄，在所有时间任选地与多价组合猪疫苗组合，例如二价PRRSV/猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae；M.hyo)疫苗、二价PRRSV/2型猪圆环病毒(PCV2)疫苗以及三价PRRSV/M.hyo/PCV2疫苗，或简单地单价PRRSV疫苗。在所述条件下对抗PRRS的早期疫苗接种提供保护性免疫的早发，所述保护性免疫在接种疫苗之后不迟于约14天，即在生命第1天接种疫苗之后在第15天、在生命第7天接种疫苗之后在第21天以及在生命第14天接种疫苗之后在不迟于约第28天出现。虽然本发明说明书提供了北美PRRS病毒的“P129病毒株”的许多构造体(参见PCT/IB2011/055003和US6,500,662)，它们可作为高效疫苗，包括用于所述早期和安全使用，但是已经确定，所述保护性免疫的早发(即在早在出生之后第1天给予的接种疫苗免疫之后约2周)也适用于其它北美和欧洲PRRS病毒株的使用，例如在US 5,476,778、US 5,846,805、US6,380,376、US 6,982,160以及US 6,197,310中所述的那些。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的特征在于大母猪和小母猪中的流产、死产以及其它繁殖问题，以及幼猪中的呼吸道疾病。病原体是PRRS病毒(PRRSV)，动脉炎病毒科和巢状病毒目的一个成员。巢状病毒是具有由单股正极性RNA组成的基因组的包膜病毒。正链RNA病毒的基因组RNA实现了在遗传信息的储存和表达两方面的双重作用。没有DNA参与巢状病毒的复制或转录。非结构蛋白从巢状病毒的基因组RNA直接转译为大多蛋白并且随后被病毒蛋白酶裂解成朴素的功能蛋白。从所述基因组合成3'-同末端成套次基因组RNA(sgRNA)并将其用作用于结构蛋白的转译的信使RNA。因此，巢状病毒基因组RNA的复制是基因组复制与sgRNA合成的一个组合过程。
在1980年代后期，几乎同时出现了所述病毒的两种不同基因型，一种在北美洲而另一种在欧洲。PRRS病毒现在是几乎所有产猪国家的地方性病毒，并且被认为是影响全球猪肉行业的经济上最重要疾病之一。另外，已经在中国和周边国家分离出毒性极强的基因型，并且所述基因型一般与北美基因型相关。
尽管在了解PRRSV的生物学方面取得了显著进展，但是所述病毒的控制仍然困难。已证实本领域中动物的疫苗接种基本无效。PRRS通常在经免疫的畜群中重新出现，并且大部分农场上PRRSV疫苗接种运动最终未能控制所述疾病。
不受理论限制，使猪感染野生型PRRSV或用这种病原体的活减毒形式对其进行疫苗接种不幸地仅仅引发非中和抗体的大量产生。在这个时间间隔期间，举例来说，产生了仅有限数量的干扰素(IFN)-γ分泌细胞。因此，PRRSV似乎本能地刺激以一贯丰富的体液(基于抗体)免疫和可变并且有限但潜在保护性T辅助细胞(Th)1样IFN-γ反应为特征的不平衡的免疫反应。最可能有助于适应性免疫的不平衡发展的PRRSV感染的一个特征是缺乏足够的先天性免疫反应。通常，病毒感染的细胞分泌I型干扰素“IFN”(包括IFN-α和IFN-β)，它保护邻近细胞不被感染。另外，所释放的I型IFN与一子组初始T细胞相互作用以促进其转化成病毒特异性II型IFN(IFN-γ)分泌细胞。相比之下，猪对PRRSV暴露的IFN-α反应几乎不存在。病原体对IFN-α产生的如此低效的刺激预计将对宿主的适应性免疫反应的性质具有显著影响，因为IFN-α上调IFN-γ基因表达。因此，前一种细胞因子控制促进适应性免疫(即，T细胞介导的IFN-γ反应和峰值抗病毒免疫防御)的发展的主要路径。
就此而言，显然病毒感染中的先天性与适应性免疫之间的可能联系通过一种特殊类型的树突状细胞发生，这种细胞具有产生大量I型干扰素的能力，并且它在T细胞功能的极化中起关键作用。具体来说，一种罕见但显著类型的树突状细胞浆细胞样树突状细胞(PDC)，也称为天然的IFN-α/β产生细胞，借助于其引起初始T细胞分化成IFN-γ分泌细胞的能力而在抗病毒免疫中起关键作用。虽然稀有，但是PDC是IFN-α的强有力生产者，每一个细胞都能够响应于病毒产生3-10pgIFN-α。相比之下，单核细胞每一个细胞产生1/10到1/5的IFN-α。已经描述了猪PDC的表现型和一些生物特性(萨默菲尔德(Summerfield)等人,2003,免疫学(Immunology)110:440)。最新的研究已经确定，PRRSV不刺激猪PDC分泌IFN-α(卡尔扎达(Calzada)等人,2010,兽医免疫学与免疫病理学(Veterinary Immunology and Immunopathology)135:20)。
这个事实与在接种疫苗时外源地添加IFN-α的观察结果的结合已被发现可以改良PRRSV特异性IFN-γ反应的强度(W.A.迈耶(W.A.Meier)等人,兽医免疫学与免疫病理学(Vet.Immunol.Immunopath.)102,第299页-第314页,2004)，突出了IFN-α在猪感染这种病毒期间所起的关键作用。鉴于IFN-α对保护性免疫的发展的明显关键作用，确定不同PRRS病毒储备液刺激和/或抑制IFN-α的产生的能力是重要的。因此，存在对用于保护对抗PRRS的新的并且改良的经修饰活疫苗的迫切需要。如下所述，显然来源于新颖感染性cDNA克隆、pCMV-S-P129-PK等的病毒的表现型不同于野生型P129病毒或两种市售经修饰活PRRS疫苗。不受理论限制，本发明提供促进对抗病毒的基于细胞的免疫反应并且定义PRRS疫苗的新的并且有效的产生的疫苗。
发明内容
在第一实施例中，本发明提供一种包括编码感染性RNA分子的DNA序列的经分离多核苷酸分子，所述感染性RNA分子编码PRRS病毒，所述病毒经遗传修饰以使得作为一种疫苗，它在猪科动物中引发对抗PRRS病毒的有效免疫保护性反应。在某些方面，本发明提供一种如本文中所述的DNA序列，包括SEQ ID NO.:1、SEQ IDNO.:2、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:4或SEQ ID:NO:6，或与其至少70％一致，优选地与其80％一致，并且更优选地与其85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
在某些实施例中，本发明提供一种质粒，它包括如本文中所述的经分离多核苷酸分子和能够在合适的宿主细胞中转录所述多核苷酸分子的启动子。在另一个实施例中，质粒的北美或中国PRRS编码序列在本文中进一步编码一或多种可检测的异源抗原表位。本发明提供一种包括本文中所述的质粒的经转染宿主细胞。
在另一方面，本发明提供一种用于保护猪科动物不被PRRS病毒感染的疫苗。所述疫苗可以包括由感染性RNA分子编码的北美或中国PRRS病毒、所述感染性RNA分子或质粒，其中每一者都由本文中所述的经分离多核苷酸分子编码。在又另一方面，所述疫苗包括含有本文中的多核苷酸的病毒载体。本文中所述的疫苗可以任选地包括兽用可接受的疫苗载剂。在一个重要方面，所述疫苗具有相比于野生型P129PRRS病毒有所降低的干扰素-α抑制作用(参见ATCC 203488、203489、美国专利第6,500,662号)。
在一个实施例中，本发明提供包括多核苷酸分子的诊断试剂盒，它区分(所谓的DIVA测试)自然感染有PRRS病毒的野外病毒株的猪科动物与接种本文中所述的经修饰活疫苗的猪科动物。
在其它实施例中，本发明提供一种保护猪科动物不感染PRRS病毒的病毒株的方法，包括向所述动物投与免疫保护量的本文中所述权利要求书的疫苗。
本发明的其它并且优选的实施例包括一种经分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)或一种编码所述病毒的多核苷酸序列，其中由ORF1a编码的蛋白质选自由含有以下氨基酸序列中的任一者的蛋白质组成的群组，其中带下划线的残基被认为是新颖的：AMANVYD(SEQ ID NO:9)；IGHNAVM(SEQ ID NO:12)；TVPDGNC(SEQID NO:15)；CWWYLFD(SEQ ID NO:18)；HGVHGKY(SEQ ID NO:21)；AAKVDQY(SEQ ID NO:24)；PSATDTS(SEQ ID NO:27)；LNSLLSK(SEQ ID NO:30)；APMCQDE(SEQ ID NO:33)；CAPTGMD(SEQ ID NO:36)；PKVAKVS(SEQID NO:39)；AGEIVGV(SEQ ID NO:42)；ADFNPEK(SEQ ID NO:45)；以及QTPILGR(SEQ ID NO:48)。在本发明的另一优选实施例中，本发明提供一种经分离的北美或中国PRRS，它含有从ORF1a编码的蛋白质内的以上所鉴别序列中的任一者，包括这些所鉴别序列的任何组合(2、3、4……直到17)。
本发明进一步提供一种经分离猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中其由ORF1a编码的蛋白质选自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列组成的群组：ANV(参见SEQ ID NO:9)；HNA(参见SEQ ID NO:12)；PDG(参见SEQ ID NO:15)；WYL(参见SEQ ID NO:18)；VHG(参见SEQ ID NO:21)；KVD(参见SEQ ID NO:24)；ATD(参见SEQ ID NO:27)；SLL(参见SEQ ID NO:30)；MCQ(参见SEQ IDNO:33)；PTG(参见SEQ ID NO:36)；VAK(参见SEQ ID NO:39)；EIV(参见SEQID NO:42)；FNP(参见SEQ ID NO:45)；以及PIL(参见SEQ ID NO:48)，包括这些所鉴别序列的任何组合(2、3、4……直到17)。
在另一优选实施例中，本发明提供一种经分离北美或中国PRRS，其中不考虑编码病毒的多核苷酸或自其编码的蛋白质中在任何指向的任何其它特定的核苷酸或氨基酸序列位置的一致性，ORF1a病毒蛋白含有：
(a)在指定序列中的以下特定氨基酸中的任一者，
在氨基酸序列ANV(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N；
在氨基酸序列HNA(参见SEQ ID NO:12)内的氨基酸N；
在氨基酸序列PDG(参见SEQ ID NO:15)内的氨基酸D；
在氨基酸序列WYL(参见SEQ ID NO:18)内的氨基酸Y；
在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO:21)内的氨基酸H；
在氨基酸序列KVD(参见SEQ ID NO:24)内的氨基酸V；
在氨基酸序列ATD(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T；
在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L；
在氨基酸序列MCQ(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C；
在氨基酸序列PTG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T；
在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO:39)内的氨基酸A；
在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I；
在氨基酸序列FNP(参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N；以及
在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，包括这些所鉴别序列的任何组合(2、3、4……直到17)，或
(b)含有在任何其它北美或中国PRRS病毒的对应于如上所指定的3-残基序列的指定3-残基ORF1a肽序列中的所述特定带下划线的单一氨基酸，这是考虑到所述其它特定的3-残基氨基酸序列可以显示一个或两个附加氨基序列改变，但是仍然认为对应于以上所指定的序列。为了本发明的这个实施例，“对应”意指可以使用如在赫尼霍夫(Henikoff)等人美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.,USA),89,第10915页-第10919页,1992中所述的BLOSUM算法最佳地比对相对序列。
在本发明的另一个优选实施例中，提供一种经分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中其由ORF1a编码的蛋白质具有含有变异(a)、(b)、(c)以及(d)中的一或多者的氨基酸序列，其中每一种所述变异定义如下：
变异(a)，
在氨基酸序列ANV(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N；
在氨基酸序列HNA(参见SEQ ID NO:12)内的氨基酸N；
在氨基酸序列PDG(参见SEQ ID NO:15)内的氨基酸D；
在氨基酸序列WYL(参见SEQ ID NO:18)内的氨基酸Y；
在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO:21)内的氨基酸H；或变异(a)的任何子组；
变异(b)，
在氨基酸序列KVD(参见SEQ ID NO:24)内的氨基酸V；
在氨基酸序列ATD(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T；
在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L；
在氨基酸序列MCQ(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C；或变异(b)的任何子组；
变异(c)，
在氨基酸序列PTG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T；
在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO:39)内的氨基酸A；或变异(c)的任何子组；以及
变异(d)，
在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I；
在氨基酸序列FNP(参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N；
以及在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:20)内的氨基酸I；或其变异(d)的任何子组。
所述PRRS病毒可以进一步含有在变异(a)中所鉴别的五个氨基酸序列中的两个或更多个，和/或在变异(b)中所鉴别的四个氨基酸序列中的两个或更多个，和/或在变异(c)中所鉴别的两个氨基酸序列，和/或在变异(d)中所鉴别的三个氨基酸序列中的两个或更多个。
本发明还提供了一种能够直接转染合适的宿主细胞并且从如此转染的合适的宿主细胞表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)的质粒，所述质粒包含：(a)编码感染性RNA分子的DNA序列，所述感染性RNA分子编码PRRS病毒，和(b)能够转录所述感染性RNA分子的启动子，其中由所述病毒的ORF1a编码的蛋白质具有含有以下的氨基酸序列：
(1)在氨基酸序列ANV(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N；
在氨基酸序列HNA(参见SEQ ID NO:12)内的氨基酸N；
在氨基酸序列PDG(参见SEQ ID NO:15)内的氨基酸D；
在氨基酸序列WYL(参见SEQ ID NO:18)内的氨基酸Y；
在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO:21)内的氨基酸H，或其任何子组；和/或
(2)在氨基酸序列KVD(参见SEQ ID NO:24)内的氨基酸V；
在氨基酸序列ATD(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T；
在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L；
在氨基酸序列MCQ(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C，或其任何子组；和/或
(3)在氨基酸序列PTG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T；
在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO:39)内的氨基酸A，或其任何子组；和/或
(4)在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I；
在氨基酸序列FNP(参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N；
在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I；或其任何子组。
应了解，ORF1a编码包含蛋白酶功能的多蛋白，并且ORF1b编码包含复制酶(RNA聚合酶)和解螺旋酶功能的多蛋白。关于从PRRS的各种ORF(开放阅读框)编码的蛋白质的功能的附加信息可见于例如美国专利第7,132,106号中。关于ORF7和其它开放阅读框的功能，还参见美国专利第7,544,362号。如在本领域中应了解，预计ORF1编码的蛋白质具有已知和未知的附加功能，并且适用于本发明实践中的新颖氨基酸改变通过其对ORF1编码的蛋白质的任何一种特定功能的作用而不受限制。
在其它优选实施例中，所述质粒含有一种启动子，它是能够允许目标真核细胞中的DNA发射的真核启动子，或能够指导质粒的体外转录的原核或噬菌体启动子。本发明类似地提供一种产生PRRS病毒的方法，所述方法包含用适当的质粒转染合适的宿主细胞并且获得由转染细胞产生的PRRS病毒。
因此，在特定并且优选的实施例中，本发明提供一种包含编码感染性RNA分子的DNA序列的经分离多核苷酸分子，所述感染性RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序列选自由以下组成的群组：
(a)SEQ ID NO:6；
(b)与(a)的DNA序列至少85％一致的序列，其中其由ORF1a编码的蛋白质具有含有以下的氨基酸序列：
来自组(b)(1)
在氨基酸序列ANV(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N；
在氨基酸序列HNA(参见SEQ ID NO:12)内的氨基酸N；
在氨基酸序列PDG(参见SEQ ID NO:15)内的氨基酸D；
在氨基酸序列WYL(参见SEQ ID NO:18)内的氨基酸Y；
在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO:21)内的氨基酸H，或其任何子组；和/或
来自组(b)(2)
在氨基酸序列KVD(参见SEQ ID NO:24)内的氨基酸V；
在氨基酸序列ATD(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T；
在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L；
在氨基酸序列MCQ(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C，或其任何子组；和/或
来自组(b)(3)
在氨基酸序列PTG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T；
在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO:39)内的氨基酸A，或其任何子组；和/或
来自组(b)(4)
在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I；
在氨基酸序列FNP(参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N；
以及在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:20)内的氨基酸I，或其任何子组；以及
(c)与(a)或(b)的DNA序列的互补序列在非常严格的条件下杂交的DNA序列，这些非常严格的条件包含在65℃下在0.5M NaHPo4、7％SDS、1mM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在68℃下在0.1SSC/0/1％SDS中洗涤。
本发明还提供了经多核苷酸分子转染的宿主细胞并且提供了用于保护猪科动物不被PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗包含：(a)由上述多核苷酸分子编码的遗传修饰北美PRRS病毒，或(b)所述感染性分子，或(c)呈质粒形式的所述多核苷酸分子，或(d)病毒载体，它包含所述多核苷酸分子，其中所述PRRS病毒能够以可有效地产生不被感染的免疫保护的量引发不被PRRS病毒感染的有效免疫保护反应，和适用于兽用的载剂。
本发明还提供了对应于(即通过具有互补的碱基编码序列)以下的RNA多核苷酸序列：
(a)DNA序列SEQ ID NO:6；
(b)与(a)的DNA序列至少85％一致的DNA序列，其中其由ORF1a编码的蛋白质具有含有以下中的任一者和任何以下的任何组合的氨基酸序列：
在氨基酸序列ANV(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N；
在氨基酸序列HNA(参见SEQ ID NO:12)内的氨基酸N；
在氨基酸序列PDG(参见SEQ ID NO:15)内的氨基酸D；
在氨基酸序列WYL(参见SEQ ID NO:18)内的氨基酸Y；
在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO:21)内的氨基酸H；
在氨基酸序列KVD(参见SEQ ID NO:24)内的氨基酸V；
在氨基酸序列ATD(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T；
在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L；
在氨基酸序列MCQ(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C；
在氨基酸序列PTG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T；
在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO:39)内的氨基酸A；
在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I；
在氨基酸序列FNP(参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N；
以及在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:20)内的氨基酸I；或
(c)与(a)或(b)的DNA序列的互补序列在非常严格的条件下杂交的DNA序列，这些非常严格的条件包含在65℃下在0.5M NaHPo4、7％SDS、1mM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在68℃下在0.1SSC/0/1％SDS中洗涤。
因此，本发明还提供了包含多核苷酸分子的诊断试剂盒，它们区分自然感染有PRRS病毒的野外病毒株的猪科动物与接种本发明疫苗的猪科动物，所述疫苗(病毒)优选地证明了相比于野生型P129PRRS病毒(SEQ ID NO:5)有所降低的干扰素-α抑制作用。
附图说明
表1示出了感染性cDNA克隆和通过转染到PK-9细胞中得到的对应病毒。
表2示出了野生型PRRS病毒和适于在细胞培养液中生长的衍生物的干扰素-α抑制作用。
表3描绘了野生型PRRS病毒P129和其适于在表达CD163的PK-9细胞中生长的基因工程改造衍生物的干扰素-α抑制作用。
表4示出了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒相比于野生型P129病毒和PRRSIngelvac疫苗有所降低的干扰素-α抑制作用。
表5描绘了为了评估疫苗病毒的安全性和功效而进行的研究的设计。
表6示出了P129第0代与P129-PK-FL第17代之间由于基因组位置所造成的所有核苷酸差异和所得氨基酸差异。
表7示出了P129第0代与P129-PK-FL第17代之间由于病毒蛋白质所造成的核苷酸和氨基酸差异的汇总。
表8示出了见于感染性cDNA克隆pCMV-S-P129和pCMV-S-P129-PK17-FL中的PRRSV基因组之间由于基因组位置所造成的所有核苷酸差异和所得氨基酸差异。
表9和表10示出了有助于第52代病毒(SEQ ID NO:6)的表现型的氨基酸改变。
表11示出了在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗之后具有临床症状的猪的数量。
表12示出了在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗之后的血清平均滴度。
表13示出了在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗的7周龄猪攻击之后的肺部病灶百分比。
表14示出了在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗的18周龄猪攻击之后的肺部病灶百分比。
表15示出了在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗的26周龄猪攻击之后的肺部病灶百分比。
表16示出了在先前接种经修饰活PRRSV疫苗的5周龄猪崽攻击之后的肺部病灶百分比。
图1示出了接种疫苗后的直肠温度。
图2示出了用毒性PRRSV NADC20攻击后的直肠温度。
图3示出了接种疫苗后和攻击后的体重。
图4示出了攻击后具有PRRS病灶的肺的百分比数据。
图5示出了关于所观察到的病灶严重性的攻击后肺评估评分(LAS)。
图6是一个直方图，描绘了接种疫苗后和攻击后在血清中的抗PRRSV抗体水平(ELISA S/P比率)。
图7是血清中的攻击后病毒载量的图形表示(PAM细胞上的log TCID50/ml)。
图8是用于获得疫苗的方法的图示，所述疫苗包括如本文所披露的SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:6。
主要序列的简要说明
SEQ ID NO:1提供P129-PK-FL第17代全基因组。
SEQ ID NO:2提供P129-PK-d43/44第17代全基因组。
SEQ ID NO:3提供P129-PK-FL第24代全基因组。
SEQ ID NO:4提供P129-PK-d43/44第34代全基因组。
SEQ ID NO:5提供P129第0代全基因组。
SEQ ID NO:6提供P129第52代全基因组。
具体实施方式
除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，举例来说，提到“所述方法”包括一或多种方法，和/或本领域的普通技术人员在阅读了本发明时所清楚的本文中所述类型的步骤等等。
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等效于本文中所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
除非明确相反地指出，否则本发明的实践将采用在本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学以及重组DNA技术的常规方法，其中许多出于说明的目的如下描述。在文献中全面解释了所述技术。参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989)；马尼亚迪斯(Maniatis)等人分子克隆实验指南(1982)；DNA克隆实用方法(DNA Cloning:APractical Approach),第I卷和第II卷(D.格洛弗(D.Glover)编)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(N.盖特(N.Gait)编,1984)；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)(B.哈梅斯(B.Hames)和S.希金斯(S.Higgins)编,1985)；转录和转译(Transcription and Translation)(B.哈梅斯和S.希金斯,1984)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.弗瑞旭尼(R.Freshney)编,1986)；佩巴尔(Perbal),分子克隆实践指导(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)。
“北美PRRS病毒”意指具有与北美PRRS病毒分离株相关的遗传特性的任何PRRS病毒，例如(但不限于)最初在美国在约1990年代初期分离的PRRS病毒(参见例如柯林斯,J.E.(Collins,J.E.)等人,1992,兽医诊断研究杂志(J.Vet.Diagn.Invest.)4:117-126)；北美PRRS病毒分离株MN-1b(光,J.(Kwang,J.)等人,1994,兽医诊断研究杂志6:293-296)；PRRS的Quebec LAF-exp91病毒株(梅尔达希,H.(Mardassi,H.)等人,1995,病毒学文献(Arch.Virol.)140:1405-1418)；以及北美PRRS病毒分离株VR 2385(孟,X.-J(Meng,X.-J)等人,1994,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)75:1795-1801)。遗传特性是指由北美PRRS病毒株所共享的基因组核苷酸序列类似性和氨基酸序列类似性。中国PRRS病毒株一般显示出与北美病毒株约80-93％的核苷酸序列类似性。
“欧洲PRRS病毒”是指具有与最初在欧洲在约1991年分离的PRRS病毒相关的遗传特性的PRRS病毒的任何病毒株(参见例如，温斯福德,G.(Wensvoort,G.)等人,1991,兽医问题(Vet.Q.)13:121-130)。“欧洲PRRS病毒”在本领域中有时也指“莱利斯塔德病毒(Lelystad virus)”。
出于本发明的目的，“有效免疫保护反应”、“免疫保护”等术语意指在接种疫苗的动物中针对病原体的一或多个抗原表位从而保护不被病原体感染的免疫反应。出于本发明的目的，保护不被病原体感染不仅包括感染的绝对预防，而且包括相比于未接种疫苗的感染动物，在接种疫苗的动物中，被病原体感染的程度或比率的任何可检测的降低，或由被病原体感染产生的疾病或任何症状或病状的严重程度的任何可检测的降低。可以在先前尚未感染病原体和/或在接种疫苗时未感染病原体的动物中诱导有效免疫保护反应。还可以在接种疫苗时已经感染了病原体的动物中诱导有效免疫保护反应。
如果遗传修饰PRRS病毒的毒性低于其未修饰的亲本病毒株，那么它是“减毒的”。如果病毒株显示出决定疾病严重程度的一或多个参数的统计显著减少，那么它的“毒性较低”。所述参数可以包括病毒血症的程度、发烧、呼吸窘迫的严重程度、繁殖症状的严重程度、或肺部病灶的数量或严重程度等。
“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”意指能够在感染本发明病毒时产生感染性PRRS的细胞。所述细胞包括单核细胞/巨噬细胞系的猪细胞，例如猪肺泡巨噬细胞和衍生物、MA-104猴肾细胞和衍生物(例如MARC-145细胞)以及经PRRS病毒受体转染的细胞。术语“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”还可以包括在活猪内的细胞。
如本文中所用的“开放阅读框”或“ORF”意指用于编码特定PRRS病毒蛋白所需的不含中间终止密码子的最小核苷酸序列。
“猪(Porcine)”和“猪(swine)”在本文中可互换地使用并且是指作为猪科的成员的任何动物，例如猪(pig)。除非另外指出，否则如本文中所用的术语“PRRS病毒”意指北美或欧洲PRRS病毒的任何病毒株。
“PRRS”涵盖猪中由PRRS病毒感染所引起的疾病症状。所述症状的实例包括(但不限于)发烧、怀孕母畜的流产、呼吸窘迫、肺部病灶、食欲不振以及幼猪的死亡。如本文所用的“不能够产生PRRS”的PRRS病毒是指可以感染猪，但是在猪中不产生通常与PRRS感染相关的任何疾病症状的病毒。
如本文中所用的PRRSV“N蛋白”或“ORF7”定义为由PRRS病毒的欧洲和北美基因型两者的ORF7编码的多肽。当前已知的N蛋白的具体同型的实例是在基因库中通过寄存编号PRU87392报告的北美PRRS原型分离株VR2322的123氨基酸多肽，和在基因库中通过寄存编号A26843报告的欧洲原型PRRS分离株莱利斯塔德的128残基N蛋白。
“PRRSV N蛋白NLS-1区”或“PRRSV ORF7NLS-1区”是指“pat4”或“nuc1”核定位信号(中井(Nakai)和兼久(Kanehisa),1992；罗兰(Rowland)和柳(Yoo),2003)，它含有四个连续的碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸)或三个碱性残基和一个组氨酸或脯氨酸，位于成熟N蛋白的约前15个N端残基内。举例来说，VR2332NLS-1区序列是KRKK并且位于残基9-12，而莱利斯塔德分离株序列是KKKK并且位于N蛋白的残基10-13。
“PRRSV N蛋白NLS-2区”或“PRRSV ORF7NLS-2区”是指在N蛋白内的第二核定位信号，它可以采用两种形式中的一种。在北美PRRS病毒中，NLS-2具有一种被我们命名为“pat8”基元的模式，它始于脯氨酸，之后的三个残基内跟随一个五残基序列，所述序列在五个残基中含有至少三个碱性残基(K或R)(由中井和兼久,1992；罗兰和柳,2003描述的“pat7”或“nuc2”基元的轻微修饰)。举例来说，此类序列位于北美PRRSV分离株VR2332的N蛋白残基41-47，并且由序列P……K表示。在欧洲PRRS病毒中，NLS-2具有“pat4”或“nuc1”基元，它是四个碱性氨基酸或与组氨酸或脯氨酸相连的三个碱性残基的连续延伸(中井和兼久,1992；罗兰和柳,2003)。欧洲PRRSV分离株莱利斯塔德的NLS-2位于残基47-50并且由序列K……K表示。
“PRRSV N蛋白NoLS区”或“PRRSV ORF7NoLS区”是指核仁定位信号，具有约32个氨基酸的总长度并且在其氨基端附近并有NLS-2区。举例来说，VR2332NoLS区序列位于残基41-72并且由序列P……R表示(罗兰和柳,2003)，而对应莱利斯塔德分离株序列位于残基42-73并且由序列P……R表示。
“经转染宿主细胞”意指如美国专利第5,600,662号中所述，在经PRRS病毒RNA转染时可以产生至少第一轮PRRS病毒粒子的几乎任何宿主细胞。
出于本发明的目的，“感染性DNA分子”是编码用于支持从合适的宿主细胞复制、转录以及转译成功能性病毒粒子所需要素的DNA分子。
类似地，“经分离多核苷酸分子”是指包含从其天然存在状态(如果存在的话)纯化到任何可检测程度的本发明多核苷酸分子的物质组合物。
出于本发明的目的，第二多核苷酸分子(RNA或DNA)的核苷酸序列是与第一多核苷酸分子的核苷酸序列“同源的”，或与所述第一多核苷酸分子具有“一致性”，其中如基于遗传密码的简并，或当第二多核苷酸分子的核苷酸序列编码足够类似于由第一多核苷酸分子的核苷酸序列编码的聚氨基酸的聚氨基酸以便适用于实践本发明时，它编码与第一多核苷酸分子的核苷酸序列相同的聚氨基酸。同源多核苷酸序列也是指有义链和反义链，并且在所有情况下是指任何所述链的互补序列。出于本发明的目的，多核苷酸分子适用于实践本发明，并且因此是同源的或具有一致性，其中它可以用作用于检测被感染的猪的体液或组织样品中PRRS病毒或病毒多核苷酸的存在的诊断探针，例如通过标准杂交或扩增技术。一般来讲，如基于BLASTN算法(美国国立卫生研究院(United States National Institute of Health)的美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，另被称为NCBI，(美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Maryland,USA)))，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有至少约70％核苷酸序列一致性，那么它与第一多核苷酸分子的核苷酸序列同源。在用于根据本发明实践计算的具体实例中，提到了BLASTP2.2.6[塔图索瓦TA(Tatusova TA)和TL马登(TL Madden),“BLAST 2序列-一种用于比较蛋白质和核苷酸序列的新工具(BLAST 2sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences).”(1999)FEMS微生物学快报(FEMS MicrobiolLett.)174:247-250.]。简单来说，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分0.1以及赫尼霍夫(Henikoff)和赫尼霍夫(美国国家科学院院刊89:10915-10919.1992)的“blosum62”评分矩阵比对两个氨基酸序列以优化比对评分。然后如下计算一致性百分比：一致匹配的总数×100/除以较长序列的长度+为了比对两个序列而引入到较长序列中的空位的数量。
优选地，同源核苷酸序列具有至少约75％核苷酸序列一致性，甚至更优选地至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列一致性。由于遗传密码是简并的，所以同源核苷酸序列可以包括任何数量的“沉默”碱基改变，即仍然编码相同氨基酸的核苷酸取代。
同源核苷酸序列可以进一步含有非沉默突变，即在所编码的聚氨基酸中产生氨基酸差异的碱基取代、缺失或添加，只要所述序列保持与由第一核苷酸序列编码的聚氨基酸至少约70％一致或以其它方式适用于实践本发明即可。就此而言，可以进行公认为不使整体蛋白质功能失活的某些保守氨基酸取代：例如关于带正电荷的氨基酸(且反之亦然)赖氨酸、精氨酸和组氨酸；关于带负电荷的氨基酸(且反之亦然)天冬氨酸和谷氨酸；以及关于某些不带电氨基酸的群组(并且在所有情况下，也反之亦然)，(1)丙氨酸和丝氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，(6)甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪氨酸，(8)丝氨酸和苏氨酸，(9)色氨酸和酪氨酸，(10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。可以根据物理性质和对二级与三级蛋白质结构的贡献对氨基酸进行分类。保守取代在本领域中被认为是一种氨基酸被具有类似性质的另一种氨基酸取代。例示性保守取代可见于1997年3月13日公开的WO 97/09433第10页(PCT/GB96/02197，1996年9月6日提交)中。可替代地，保守氨基酸可以如勒宁格尔(Lehninger)(生物化学(Biochemistry),第二版；沃斯出版社公司(Worth Publishers,Inc.)NY:NY(1975),第71页-第77页)中所述进行分组。其它合适的保守改变和其应用如下所述。
可以通过比较核苷酸序列，例如通过使用上文的BLASTN来确定同源核苷酸序列。可替代地，可以通过在选定条件下杂交来确定同源核苷酸序列。举例来说，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的互补序列在适当严格的条件下杂交，例如在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(参见奥斯贝(Ausubel)等人编,分子生物学实验方法汇编(Protocols in Molecular Biology),威利父子公司(Wiley and Sons),1994,第6.0.3页到第6.4.10页)，或将以其它方式引起如下文所定义的编码PRRS病毒的序列的杂交的条件，那么它与SEQ ID NO:1(或任何其它特定多核苷酸序列)同源。可以凭经验确定或基于探针的长度和鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的百分比准确计算杂交条件的修改。可以如萨姆布鲁克等人(编),分子克隆实 验指南,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press):冷泉港(ColdSpring Harbor),纽约州(New York)(1989),第9.47页到第9.51页所述计算杂交条件。
在另一个实施例中，如果第二核苷酸序列与SEQ ID NO:1的互补序列在非常严格的条件下杂交，例如在65℃下在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤，如本领域中已知(奥斯贝(Ausebel)等人最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in MolecularBiology),格林出版社和威利国际科学出版社(Greene Publishing and WileyInterscience),纽约,1989)，那么它与SEQ ID NO:1(或本发明的任何其它序列)同源。
此外应了解，本发明的经分离多核苷酸分子和经分离RNA分子包括合成分子和通过重组技术，例如通过体外克隆和转录获得的分子两者。
多核苷酸分子可以使用本领域普通技术人员已知的重组技术进行基因突变，包括通过定点诱变，或通过随机诱变，例如通过暴露于化学诱变剂或辐射，如本领域中已知。可以通过本领域中已知的标准方法进行突变，例如如(例如莫伊伦贝格(Meulenberg)等人,实验医学与生物学进展(Adv.Exp.Med.Biol.),1998,440:199-206)所述的感染性拷贝的定点诱变(参见例如萨姆布鲁克等人(1989)分子克隆实验指南,第2版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州)。
因此，本发明进一步提供一种用于制造遗传修饰北美PRRS病毒的方法，所述方法包含使编码感染性RNA分子的DNA序列突变，所述感染性RNA分子编码如上所述的PRRS病毒；并且使用合适的表达系统表达遗传修饰PRRS病毒。可以使用本领域中通常已知的合适表达系统，从经分离多核苷酸分子表达遗传修饰PRRS病毒，其实例描述在本申请中。举例来说，经分离多核苷酸分子可以呈能够在合适的宿主细胞中体外表达所编码病毒的质粒形式，如下文进一步详细描述。
北美PRRSV N蛋白序列是高度保守的并且所报告的序列彼此具有约93-100％一致性。北美和欧洲PRRSV N蛋白是约57-59％一致的并且共享共同的结构基元。一般来讲，当比较PRRS编码序列和分离株(它们可以与特定核苷酸或所编码的氨基酸以不同方式编号)时，易于通过鉴别相关PRRS病毒株中所保存的特征氨基酸并且将它与参考病毒株进行比对来实现恰当区域的鉴别。
重组DNA技术包含旨在以DNA水平修饰核酸的极其多变并且强大的分子生物学技术，并且使在分子水平分析和修饰基因组成为可能。在这方面，例如PRRS病毒等病毒由于其基因组的适度大小而尤其能够经受所述操作。然而，重组DNA技术并不可立即应用于非反转录病毒RNA病毒，因为这些病毒在其复制过程中不涵盖DNA中间步骤。关于所述病毒，必须在重组DNA技术可以应用于其基因组以产生修饰病毒之前发展感染性cDNA克隆。感染性克隆可以通过构造在研究中的病毒的全长(基因组长度)cDNA(这里是在RNA的DNA拷贝的广泛意义上并且不仅在mRNA的DNA拷贝的严格意义上使用)得到，之后在经全长cDNA转染的细胞中体内合成感染性转录物，但是感染性转录物还可以通过在具有原核启动子的质粒中在存在转录混合液的情况下从全长cDNA体外转录获得，或同样使用包含完整病毒基因组的接合部分长度cDNA片段体外获得。在所有情况下，所转录的RNA携带已被引入到cDNA中的所有修饰并且可以用以使如此修饰的病毒进一步传代。
欧洲PRRS病毒分离株或莱利斯塔德病毒的感染性克隆的制备描述在美国专利第6,268,199号中，所述专利以引用的方式完全并入本文中。命名为P129(李(Lee)等人,2005；柳等人,2004)的北美PRRS病毒分离株的感染性cDNA克隆的制备描述在美国专利第6,500,662号中，所述专利以引用的方式完全并入本文中。P129cDNA的序列披露于基因库寄存编号AF494042中和美国专利第6,500,662号中。我们以下的工作利用这类感染性克隆，它在质粒的情况下通过CMV即刻早期启动子表达并且已被命名为pCMV-S-P129并且也披露在美国专利第6,500,662号内。如美国专利第6,500,662号中所描述，存在适用于此的其它质粒和启动子。
鉴于任何相关开放阅读框的全序列和相关氨基酸残基的位置，普通技术人员仅仅需要查询密码子表来设计在所希望的特定位置的改变。
密码子构成了mRNA和其对应cDNA分子中核苷酸的三重序列。密码子当存在于mRNA分子中时以碱基尿嘧啶(U)为特征，但是当存在于DNA中时以碱基胸苷(T)为特征。多核苷酸内相同氨基酸残基的密码子简单改变将不改变所编码多肽的序列或结构。显然当短语陈述特定3核苷酸序列“编码”任何特定氨基酸时，一般熟练的业内人士将认识到上表提供了讨论中的特定核苷酸的鉴别手段。举例来说，如果特定三核苷酸序列编码赖氨酸，那么上表披露了两种可能的三重序列是AAA和AAG。甘氨酸是由GGA、GGC、GGT(如果在RNA中，那么是GGU)以及GGG编码的。为了将所编码蛋白质中的赖氨酸变成甘氨酸残基，可以用GGA和GGC、GGT或GGG中的任一者替换编码核酸中的AAA或AAG三联体。
如上文所提到，本发明是针对提供PRRS的疫苗病毒株，其中除了其它反应以外，不下调由干扰素路径介导的宿主对病毒的反应。如下文详细描述，存在对病毒基因组的各种修饰，这些修饰就此而言是有效的，尤其是在如本文所披露的ORF1a中所发现的那些，以及其组合。应注意，类似修饰点可见于PRRS基因组的其它开放阅读框中，也披露在本文中(参见表9)。
值得注意的是，为了减弱PRRS病毒而用于PRRS多核苷酸修饰的某些其它先前方法已经成功了，有可能提供疫苗使用的适合性，但是所得减毒的确切原因尚未普遍知晓。举例来说，已经披露了通过突变或删除病毒的核衣壳或N蛋白(由ORF7编码)中的NLS-2区、NoLS区或NES区，从而包括开放阅读框7(ORF7)中的缺失而使毒性PRRS病毒减弱。在另一方面，ORF7缺失是在编码衣壳蛋白的核定位信号(NLS)的序列内。在编码NLS的序列内的ORF7缺失可以包括在位置43-48的一或多个氨基酸的缺失或在位置43和44中的任一者或两者的氨基酸缺失。参见例如美国专利7,544,362的完整披露内容，所述专利以引用的方式并入本文中。由ORF7编码的PRRSV的核衣壳蛋白(N)是一种被磷酸化的小碱性蛋白(伍顿(Wootton)、罗兰以及柳,2002)并且形成同型二聚体(伍顿和柳,2003)。近来已经确定了晶体结构(多恩(Doan)和多克兰(Dokland),2003)。N蛋白在感染细胞中似乎具有多种功能。除了形成内部包装有基因组RNA的球形衣壳结构，一种在细胞质中发生的过程以外，一部分N蛋白还被输送到细胞核中并且更明确地说被输送到被感染细胞的细胞核。N蛋白的氨基酸序列含有两种核定位信号(NLS)：核仁定位信号(NoLS)和核输出信号(NES)，它们对应地促进输送到细胞核和核仁中并且从细胞核输出(罗兰等人,1999；罗兰等人,2003；罗兰和柳,2003)。同时在核仁中，N蛋白与小核仁RNA相关蛋白纤维蛋白相互作用并且可以调节感染细胞中的rRNA加工和核糖体生物合成以便促进病毒复制(柳等人,2003)。这种类型的病毒突变单独或与其它减毒突变组合对于设计新颖PRRS疫苗是有价值的。在已经减毒的PRRS病毒的另一个实例中，采用了对ORF1a的修饰。采用了编码在ORF1a的非结构蛋白2编码区中的高变区中的氨基酸616到752之间的抗原表位的DNA序列的缺失，参见美国专利7,618,797，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
关于PRRS病毒的免疫生物学的研究表明，PRRS病毒与PDC的相互相用有益于检查。这种细胞类型代表了人类、小鼠、大鼠、猪以及猴中0.2％-0.8％的外周血单个核细胞。尽管其稀少，但是这种细胞是先天免疫系统的一种重要组分并且能够在病毒刺激之后分泌大量IFN-α。PDC是通过IFN-α的分泌而在调节抗病毒先天性和适应性免疫中起主要作用，因为它们促进了自然杀伤细胞、B细胞以及T细胞的功能。此外，通过PDC分泌的IFN-α帮助了猪单核细胞来源树突状细胞(MoDC)的成熟，产生MoDC对所存在抗原和活化T细胞的强化能力。在病毒感染的后期，PDC分化成独特类型的成熟树突状细胞，它直接调节T细胞的功能并且指导T细胞分化成能够分泌IFN-γ的细胞，IFN-γ是对抗病毒(包括PRRS病毒)的抗病毒免疫的主要介体。不出意料，存在已知抑制PDC分泌IFN-α的能力的人类病毒，例如呼吸道合胞病毒和麻疹病毒。这种抑制作用被认为在由于感染了这些病毒所观察到的体液免疫反应的优势和相关免疫病理学中，以及在宿主对继发性细菌和病毒感染的增加易感性中起一定作用。
相比之下，野生型PRRSV分离株以及两种Ingelvac PRRS疫苗病毒株(参见下文中的实例5和以下实例)抑制猪PDC的经纯化群体产生IFN-α的能力，而新颖P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒储备液(参见下文)展现出对这种PDC功能的最小到无的抑制作用。这些观察结果的重要性部分在于IFN-α在调节对病毒的适应性免疫反应的发展中的重要性。因此，来源于最小IFN-α抑制病毒的减毒病毒疫苗极有可能将引发强烈的抗病毒保护免疫反应。先前已经证明了IFN-α对Ingelvac PRRS MLV疫苗诱导的病毒特异性T细胞介导的IFN-γ反应的辅助作用，并且在野外和实验室条件下，由疫苗引起的病毒特异性T细胞介导的IFN-γ反应的强度与对抗病毒的保护性免疫具有正相关。因此，虽然不受理论限制，但是可以合理预计细胞介导的免疫反应和由非IFN-α抑制PRRSV引起的保护性免疫的水平将显著大于展现野生型(IFN-α抑制)表现型的PRRSV分离株。
参看本发明，值得注意的是，P129-PK-FL病毒以及来源于pCMV-S-P129-PK感染性cDNA克隆的所有五种缺失突变体都失去了抑制IFN-α产生的能力。因此，这种与众不同的表现型可能不是仅仅由于缺失，但是一定至少部分地由于在感染性克隆的构造期间变成固定的基因改变。有趣的是，在PK-9细胞上连续传代63次的未克隆的P129病毒保留了抑制IFN诱导的能力(表1)。在所有感染性克隆来源病毒中所看到的常见IFN表现型的最可能解释是在感染性克隆的产生期间并入了一或多个突变。这些突变本来应该可能以低水平存在于用来构造感染性克隆的病毒RNA中。最终，这些突变可能已经存在于猪的初始(第0代)病毒中或它们可以在使病毒适应在PK-9细胞上生长持续16次传代的过程期间产生并且富集。不能排除突变是PCR诱导错误或克隆假象的结果的可能性。无论如何，导致IFN-α抑制功能丢失的突变在感染性克隆构造期间变成“固定”的，并且预计将存在于来源于这种特定感染性克隆的所有病毒中。
考虑到已知PRRSV由于病毒RNA依赖性RNA聚合酶的错误而易于产生随机遗传多样性，导致改变的IFN-α抑制表现型的突变预存在于用来构造cDNA克隆的病毒RNA中的可能性是可能的。病毒准种由自然地出现于病毒体内复制期间的密切相关的遗传变异体的不均匀混合物组成。甚至更相关的是在来源于感染性cDNA克隆的PRRSV的多次体外传代之后，病毒准种的观察结果。这是值得注意的，因为在先前进行的研究中病毒基因组的起始群体由基因同源群体组成，并且序列多样性在传代期间在细胞培养液中迅速地产生。在当前研究中，基因组异源性水平本来应该更高，因为初始P129病毒在构造感染性克隆之前的16次PK-9传代之前尚未被克隆(以生物学方式或以分子方式)。因此，准种之中导致IFN-α抑制功能丢失的PRRSV RNA变异体的机会选择和并入到pCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆中似乎是合理的。在一些情况下，考虑到所有衍生病毒应该共享可以证明对有效的下一代PRRS疫苗的发展至关重要的这种独特生物表现型，将这些突变并入到感染性克隆中可以被视为偶然的。
野生型PRRS病毒株P129如这种病毒的其它病毒株一样，展现出对外周血单个核细胞(PBMC)和浆细胞样树突状细胞(PDC)产生干扰素(IFN)-α的能力的强烈抑制作用。另一方面，来源于P129的感染性cDNA克隆(pCMV-S-P129-PK17-FL)的病毒展现出IFN-α抑制表现型显著减少。这种感染性克隆是从先前经适应以在表达CD163的猪肾细胞系PK-9上生长的病毒在16次连续传代的过程中构造的(参见美国专利7,754,464，所述专利以全文引用的方式并入本文中)。P129-PK-FL和P129-PK-d43/44的IFN-α抑制表现型在低到可忽略的之间变化并且与两种Ingelvac PRRS修饰活病毒疫苗病毒株中的任一者所展现的IFN-α抑制表现型形成鲜明对比，这两种病毒株均是高度抑制性的。这些结果表明P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒在生物学上不同于亲本低传代P129分离株、其它野生型PRRS病毒以及两种Ingelvac PRRS疫苗。讨论了降低的IFN-α抑制性表现型的潜在含义以及表现型改变的可能原因。
本发明的氨基酸修饰
根据本发明的实践，PRRS的新颖分离株，无论具有北美或中国基因型，都可以被野外鉴别，这些分离株在从ORF1编码的蛋白质中的特定位置含有特定含有氨基酸，并且赋予这些病毒所希望的表现型。在替代方案中，如上文所提到，可以采用标准基因程序来修饰所编码ORF1蛋白的基因序列(并且由此修饰氨基酸序列)，此外产生经修饰北美和中国PRRS病毒以及来自这些病毒的感染性克隆和疫苗，所有这些都提供所述表现型。在优选实例中，表现型包括(但不限于)如相比于野生型PRRS病毒有所降低的干扰素-α抑制作用，并且任选地，用于在宿主动物(猪)中繁殖或存留同时触发稳固的免疫反应的能力，但是具有极少的可检测病理学。
因此，在本发明的实践中，可以充当有用的起始点的北美PRRS病毒株或分离株包括例如在美国专利6,500,662；7,618,797；7,691,389；7,132,106；6,773,908；7,264,957；5,695,766；5,476,778；5,846,805；6,042,830；6,982,160；6,241,990；以及6,110,468中披露的那些。关于可以充当有用的起始点的中国PRRS病毒株和分离株，参见例如来自关于TJM-92病毒的中国申请CN201633909的公开中国申请CN200910091233.6。
结合以下讨论，关于由DNA编码的大多数常见氨基酸使用国际公认的单字母和三字母名称：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)以及缬氨酸(Val，V)。
表9和表10鉴别所观察到的导致北美(和中国)PRRS的毒力减弱的氨基酸改变，这些改变与干扰素α活性的抑制降低有关，从而允许对疫苗的安全并且稳固的免疫反应。表10鉴别在ORF1a内就此而言高度优选的氨基酸修饰，并且显示这些突变如何关于从其它P129培养物的传代出现(应注意，这个历史的检查也有助于用于(重新)构造具有本发明氨基酸改变中的任一者(根据需要)的编码DNA的诱变策略的设计)。就此而言，ORF1a的最优选氨基酸改良(如通过P129第52代所证明)包括：在182的天冬酰胺、在189的天冬酰胺、在273的酪氨酸、在302的组氨酸、在665的苏氨酸、在943的半胱氨酸、在1429的苏氨酸、在1505的丙氨酸、在2410的天冬酰胺，这些改良也潜在地增加了许多糖基化机会并且可以进一步改变蛋白质功能。
因此，本发明进一步提供一种经分离猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中其由ORF1a编码的蛋白质选自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列组成的群组：
在氨基酸序列AMANVYD(SEQ ID NO:9)内的氨基酸N；
在氨基酸序列IGHNAVM(SEQ ID NO:12)内的氨基酸N；
在氨基酸序列TVPDGNC(SEQ ID NO:15)内的氨基酸D；
在氨基酸序列CWWYLFD(SEQ ID NO:18)内的氨基酸Y；
在氨基酸序列HGVHGKY(SEQ ID NO:21)内的氨基酸H；
在氨基酸序列AAKVDQY(SEQ ID NO:24)内的氨基酸V；
在氨基酸序列PSATDTS(SEQ ID NO:27)内的氨基酸T；
在氨基酸序列LNSLLSK(SEQ ID NO:30)内的氨基酸L；
在氨基酸序列APMCQDE(SEQ ID NO:33)内的氨基酸C；
在氨基酸序列CAPTGMD(SEQ ID NO:36)内的氨基酸T；
在氨基酸序列PKVAKVS(SEQ ID NO:39)内的氨基酸A；
在氨基酸序列AGEIVGV(SEQ ID NO:42)内的氨基酸I；
在氨基酸序列ADFNPEK(SEQ ID NO:45)内的氨基酸N；以及
在氨基酸序列QTPILGR(SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
更具体来说，本发明提供一种经分离猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中其由ORF1a编码的蛋白质选自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列组成的群组：
在氨基酸序列ANV(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N；
在氨基酸序列HNA(参见SEQ ID NO:12)内的氨基酸N；
在氨基酸序列PDG(参见SEQ ID NO:15)内的氨基酸D；
在氨基酸序列WYL(参见SEQ ID NO:18)内的氨基酸Y；
在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO:21)内的氨基酸H；
在氨基酸序列KVD(参见SEQ ID NO:24)内的氨基酸V；
在氨基酸序列ATD(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T；
在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L；
在氨基酸序列MCQ(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C；
在氨基酸序列PTG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T；
在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO:39)内的氨基酸A；
在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I；
在氨基酸序列FNP(参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N；以及
在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
如上文所提到，存在北美和中国PRRS的许多已知病毒株和分离株，并且新颖病毒株继续进化或分离。虽然在所有这些病毒株之间存在高水平的氨基酸序列同源性，但是本领域的普通技术人员将立即认识到，的确存在一些变异，并且实际上可以采用这些差异和相似性的优点以进一步改良所有疫苗病毒株的表现型特性。
首先，关于通过刚刚(在第19页-第20页)在上文指定的SEQ ID NO定义的所有氨基酸基元，带下划线的并且优选的氨基酸(如从P129第52代提供)一般保持完全有益的，即使相邻氨基酸已经以其它方式从指定SEQ ID NO序列改变。因此，关于AMANVYD(SEQ ID NO:9)，作为一个特定并且代表性实例，检查来自任何北美或中国PRRS的对应ORF1表达的蛋白质序列，从而发现对应氨基酸基元一般来说是可能的，即使在所述其它病毒株中由于进化而发生了其它改变，引起取代和/或缺失或添加。如本领域的技术人员将了解，通过P129第52代证明的优选氨基酸改变因此也应该保持可操作的，尽管在第52代的正好5'或3'到指定氨基酸的整体氨基酸序列中有其它改变。如果在对比氨基酸改变被认为是保守的时尤其将如此。因此关于AMANVYD(SEQ ID NO:9)和其子序列ANV，如果例如其中的缬氨酸被异亮氨酸或亮氨酸或任何其它残基替换，或如果简单地缺失残基或添加附加残基，那么应该可能易于鉴别另一种PRRS病毒株中的类似基元。存在用于鉴别比对的许多计算机程序并且由此确定多肽序列基元是否对应于例如所谓的Blosum表(基于指定的一致性百分比水平)，参见S.赫尼霍夫等人“来自蛋白序列块的氨基酸取代矩阵(Amino Acid Substitution matricesfrom protein blocks)”,美国国家科学院院刊,89(22),第10915页-第10919页,1992年11月15日，并且还参见A.L.勒宁格尔(A.L.Lehninger)等人生物化学原理(Principles of Biochemistry),2005,麦克米伦公司(MacMillan and Company),第4版。保守氨基酸改变也基于分成以下总共5组来识别：巯基(Cys)；芳香族(Phe、Tyr和Trp)；碱性(Lys、Arg、His)；脂肪族(Val、Ileu、Leu、Met)以及亲水性(Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser以及Thr)。因此，在适当的并且对应的位置并入关于P129第52代所指定的氨基酸改变中的任一者来修饰编码任何北美或中国PRRS的核苷酸序列是在本发明的实践内，即使与所指定位置相邻的其它氨基酸中的一或多者已经被添加、缺失或取代。
另外，基于类似原理，本领域的普通技术人员将认识到，一旦根据本发明实践从关于ORF1a所鉴别的特定第52代改变鉴别出优选的氨基酸，那么也可以将任何所述第52代氨基酸之保守替换用于P129变异体中或关于任何其它北美或中国病毒株，伴随对预期第52代表现型的实质性保护。因此，作为代表性实例：关于SLL(在SEQ IDNO:30内)，指定亮氨酸残基可以进一步用异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸替换；关于FNP(在SEQ ID NO:45内)，指定天冬酰胺可以用Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Ser以及Thr中的任一者替换；以及关于VAK(参见SEQ ID NO:39)，指定丙氨酸可以用Asn、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Ser以及Thr中的任一者替换等等，但是将容易认识到，任何所述替换氨基酸与最初鉴别的在指定位置的独特第52代氨基酸改变一样好地起作用不是本发明的要求。当然，在本发明中也实践了根据任何其它公认模型的标准保守氨基酸改变的使用。举例来说并且在所有情况下都包括反之亦然，Asp用于Glu并且反之亦然，Asn用于Gln，Arg用于Lys，Ser用于Cys或Thr，Phe用于Tyr，Val用于Leu或Ileu，Ala用于Gly等等。
此外，在本发明的实践内，虽然单独的第52代氨基酸改变(如以上关于ORF1a所鉴别)中的任一者可以有用地放在具有所希望的表现型作用的任何北美或中国PRRS中，但是进一步优选的是在最终构造体中包括尽可能多的表9或表10氨基酸选择，所述最终构造体通常如通过编码多核苷酸序列的适当修饰来提供。因此，本发明的实践包括提供中国或北美PRRS病毒(和对应编码多核苷酸)，这些病毒提供约17种所鉴别的第52代ORF1a改变(表9)中的2、3、4、5、6、7、8、9种并且多达其中的任何种(所有都在最终病毒序列内)，从而包括所有总体鉴别的第52代氨基酸改变的任何特定配对、三联体或其它更高组合。当然，所述氨基酸改变可以通过定点诱变、PCR以及在本领域中众所周知的其它技术被引入到病毒的对应编码核苷酸序列中。
为了证明特定遗传修饰病毒株被减毒，可以使用如下所述的实验。
在每一个试验中包括每组至少10只小母猪，它们来源于不含PRRSV的农场。这些动物经测试不含PRRS病毒特异性血清抗体并且是PRRSV阴性的。试验中所包括的所有动物具有相同的来源和品种。将动物随机分成数组。
在怀孕第90天以每鼻孔105TCID50鼻内施加1ml PRRSV进行攻击。每一个测试设置存在至少三组：一组关于P129攻击；一个测试组关于用可能减毒的病毒攻击；以及一个严格对照组。
当严格对照组在研究的时间过程内保持PRRSV阴性并且在P129攻击组中出生相比于严格对照组少至少25％的健康活猪崽时，认为所述研究是有效的。
减毒(换句话说毒性更小)定义为决定繁殖性能或其它症候学的一或多个参数的统计显著改变：
相比于未修饰亲本病毒株感染组，测试组(可能减毒的病毒)的以下参数中的至少一者的显著降低将是一种减毒指示：
a)死产频率
b)在怀孕第112天或在这之前流产
c)木乃伊化猪崽的数量
d)较不活跃并且虚弱的猪崽的数量
e)断奶前死亡率
此外，相比于未修饰亲本病毒株感染组，测试组的以下参数之一显著增加是优选的：
f)每只大母猪的断奶猪崽的数量
g)每只大母猪生出的健康活猪崽的数量
在替代方案中，可以检查PRRSV感染的呼吸道症状和其它症状以建立减毒。
减毒病毒株对于配制疫苗来说是有价值的。如果本发明疫苗保护猪不被PRRS病毒感染，那么它是有效的。如果在向一或多只未感染的猪投与疫苗之后，生物学上纯的病毒分离株(例如，VR 2385、VR 2386、P129等)的随后攻击引起疾病的任何总体或组织病理学改变(例如，肺部病灶)和/或症状的严重程度相比于无保护的类似猪(即，相对于适当的对照组)中通常由分离株引起的那些改变或症状有所减弱，那么所述疫苗保护猪不被PRRS病毒感染。更具体地说，通过向对其有需要的一或多只合适的猪投与疫苗，然后在适当的时间长度(例如，4周)之后，用生物学上纯的PRRSV分离株的大样品(10(3-7)TCID(50))攻击，可以显示出本发明疫苗是有效的。然后在约一周之后从被攻击的猪抽取血液样品，并且然后试图从所述血液样品中分离出病毒。大量病毒的分离说明所述疫苗可能不是有效的，而有所降低的量的病毒(或无病毒)的分离说明所述疫苗可以是有效的。
因此，可以在数量上(即，固结的肺组织的百分比相比于适当的对照组有所减小)或质量上(例如，从血液分离PRRSV，通过免疫分析检测肺、扁桃体或淋巴结组织样品中的PRRSV抗原)评估本发明疫苗的有效性。可以在数量上(例如，温度/热度)或半数量上(例如，一或多种症状的存在或不存在或一或多种症状的严重程度的降低，所述症状例如发绀、肺炎、肺部病灶等)评估猪繁殖与呼吸疾病的症状。
未感染猪是尚未暴露于猪繁殖与呼吸疾病感染剂，或已经暴露于猪繁殖与呼吸疾病感染剂但是未显示出所述疾病的症状的猪。被感染的猪是显示出PRRS症状或可以从中分离出PRRSV的猪。
本发明疫苗可以遵循公认惯例来配制，包括用于动物，包括人类(如果适用)的可接受载剂，例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂；并且也可以经配置以促进持续释放。稀释剂包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等张性的添加剂尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它合适的疫苗媒剂和添加剂，包括尤其适用于配制经修饰活疫苗的那些，为本领域的普通技术人员所知晓或将是清楚的。参见例如雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Science),第18版,1990,马克出版(Mack Publishing)，它以引用的方式并入本文中。
本发明疫苗可以进一步包含一或多种附加免疫调节组分，尤其例如佐剂或细胞因子。可以用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(蒙大拿州汉密尔顿的瑞比公司(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.))、明矾、矿物凝胶(例如氢氧化铝凝胶)、水包油型乳液、油包水型乳液(例如弗氏(Freund's)完全和不完全佐剂)、嵌段共聚物(佐治亚州亚特兰大(Atlanta,Ga.)的CytRx)、QS-21(马萨诸塞州剑桥的剑桥生物技术公司(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.))、SAF-M(加利福尼亚州爱莫利维尔的凯龙公司(Chiron,Emeryville Calif.))、AMPHIGEN.RTM.佐剂、皂苷、植物皂苷(Quil A)或其它皂苷部分、单磷酰基脂质A以及阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂。适用于本发明疫苗的水包油型乳液的非限制性实例包括经修饰SEAM62和SEAM 1/2配制品。经修饰SEAM62是一种水包油型乳液，它含有5％(v/v)角鲨烯(西格玛(Sigma))、1％(v/v)SPAN.RTM.85清洁剂(ICI表面活性剂)、0.7％(v/v)TWEEN.RTM.80清洁剂(ICI表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200pg/ml植物皂苷、100[mgr]g/ml胆固醇以及0.5％(v/v)卵磷脂。经修饰SEAM 1/2是一种水包油型乳液，它包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)SPAN.RTM.85清洁剂、0.7％(v/v)吐温80清洁剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml植物皂苷以及50μg/ml胆固醇。可以包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一或多种介白素、干扰素或其它已知细胞因子。
本发明疫苗可以任选地经配制用于持续释放本发明的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体。所述持续释放配制品的实例包括与生物相容性聚合物的复合物组合的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体，所述生物相容性聚合物例如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。药物传递媒剂中可降解聚合物的结构、选择和使用已经在若干出版物中有所综述，这些出版物包括A.多姆(A.Domb)等人,1992,先进技术聚合物(Polymers for Advanced Technologies)3:279-292，它以引用的方式并入本文中。关于药物配制品中聚合物的选择和使用的附加指导可见于本领域中已知的文本中，例如M.蔡辛(M.Chasin)和R.兰格(R.Langer)(编),1990,“作为药物传递系统的生物可降解聚合物(Biodegradable Polymers as DrugDelivery Systems)”药物与制药科学(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),第45卷,M.德克(M.Dekker),纽约州，它也以引用的方式并入本文中。可替代地或另外，可以对病毒、质粒或病毒载体进行微封装以改良投药和功效。用于对抗原进行微封装的方法在本领域中是众所周知的，并且包括在以下各者中所述的技术，例如美国专利第3,137,631号；美国专利第3,959,457号；美国专利第4,205,060号；美国专利第4,606,940号；美国专利第4,744,933号；美国专利第5,132,117；以及国际专利公开WO 95/28227，所有这些都以引用的方式并入本文中。
还可以使用脂质体来提供病毒、质粒或病毒载体的持续释放。关于如何制造并使用脂质体配制品的细节尤其可见于美国专利第4,016,100号；美国专利第4,452,747号；美国专利第4,921,706号；美国专利第4,927,637号；美国专利第4,944,948号；美国专利第5,008,050；以及美国专利第5,009,956中，所有这些都以引用的方式并入本文中。
上述疫苗中的任一者的有效量可以通过常规手段确定，以低剂量的病毒、病毒蛋白质粒或病毒载体开始，并且然后增加剂量同时监测作用。可以在单次投与疫苗之后或在多次投与疫苗之后获得有效量。当确定每种动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因素包括所述动物的物种、大小、年龄以及一般情况、所述动物中其它药物的存在情况等等。优选地在考虑了来自其它动物研究(参见例如以下实例2和3)的结果之后选择实际剂量。
是否已经实现了足够的免疫反应的一种检测方法是测定在接种疫苗之后动物中的血清转化和抗体滴度。接种疫苗的时间安排和辅助剂(如果存在的话)的数量优选地将基于所有相关因素的分析由医生或兽医确定，所述因素中的一些在上文已有描述。
本发明的病毒、蛋白质、感染性DNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以使用已知技术，考虑可以由本领域的技术人员确定的因素(例如待接种疫苗的动物的体重)来确定。本发明疫苗中本发明病毒的剂量优选地介于约101到约109pfu(空斑形成单位)，更优选地约102到约108pfu，并且最优选地约103到约107pfu的范围内。本发明疫苗中本发明质粒的剂量优选地介于约0.1mg到约100mg，更优选地约1mg到约10mg，甚至更优选地约10mg到约1mg的范围内。本发明疫苗中本发明感染性DNA分子的剂量优选地介于约0.1mg到约100mg，更优选地约1mg到约10mg，甚至更优选地约10mg到约1mg的范围内。本发明疫苗中本发明病毒载体的剂量优选地介于约101pfu到约109pfu，更优选地约102pfu到约108pfu，并且甚至更优选地约103到约107pfu的范围内。合适的剂量大小介于约0.5ml到约10ml，并且更优选地约1ml到约5ml的范围内。
根据本发明的实践，病毒蛋白或肽疫苗的合适剂量的范围一般是1到50微克/剂量或更高的量，如可以通过标准方法确定，其中关于每种所述物质的佐剂的量通过公认方法确定。在关于猪的疫苗接种的一个本发明优选实例中，动物的最佳年龄目标是在约1与21天之间，在断奶之前，还可以与安排的其它疫苗接种一致，例如抗猪肺炎支原体或PCV。另外，育种大母猪的疫苗接种的优选安排将包括类似剂量与每年再接种安排。
上述疫苗中的任一者的有效量可以通过常规手段确定，以低剂量的病毒、质粒或病毒载体开始，并且然后增加剂量同时监测作用。可以在单次投与疫苗之后或在多次投与疫苗之后获得有效量。当确定每种动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因素包括所述动物的物种、大小、年龄以及一般情况、所述动物中其它药物的存在情况等等。优选地在考虑了来自其它动物研究的结果之后选择实际剂量。
是否已经实现了足够的免疫反应的一种检测方法是测定在接种疫苗之后动物中的血清转化和抗体滴度。接种疫苗的时间安排和辅助剂(如果存在的话)的数量优选地将基于所有相关因素的分析由医生或兽医确定，所述因素中的一些在上文已有描述。
本发明的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以使用已知技术，考虑可以由本领域的技术人员确定的因素(例如待接种疫苗的动物的体重)来确定。举例来说，可以经口、非经肠、皮内、皮下、肌内、鼻内或静脉内传递疫苗。经口传递可以涵盖例如向动物的饲料或饮料中添加组合物。与疫苗剂量有关的因素包括例如猪的体重和年龄。
本发明进一步提供一种制备包含本文中所述的PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的疫苗的方法，所述方法包含将有效量的本发明的PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体中的一种与药用或兽用可接受的载剂组合。
另外，如美国专利第6,500,662号中所述，可以对本发明的活减毒疫苗进行修饰以编码使用已知的重组技术插入到PRRS病毒基因组中的异源抗原表位。还参见美国专利7,132,106，它以全文引用的方式并入本文中。适用作本发明异源抗原表位的抗原表位包括来自除PRRS病毒以外的猪病原体的抗原表位，包括(但不限于)来自选自由以下组成的群组的猪病原体的抗原表位：猪细小病毒、猪圆环病毒、猪轮状病毒、猪流感病毒、假狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、古典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、脑心肌炎病毒、猪副粘病毒、细环病毒、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、溶血梭状芽胞杆菌(Clostridium haemolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、大肠杆菌(Escherichia coli)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、钩端螺旋体属(Leptospiraspp.)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynovia)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、类马链球菌(Streptococcus equismilis)以及猪链球菌(Streptococcus suis)。编码来自上述猪病原体的抗原表位的核苷酸序列是本领域中已知的并且可以在万维网上从公共基因数据库获得，例如(美国)国家生物技术信息中心的基因库。
本领域的普通技术人员将从本申请的全部内容(包括详细描述)清楚本发明的其它特征和变化形式，并且所有所述特征打算作为本发明的方面。类似地，本文中所述的本发明特征可以重新组合成附加实施例，这些附加实施例也打算作为本发明的方面，这与上文是否具体提到特征组合作为本发明的方面或实施例无关。此外，只有本文中描述为对本发明至关重要的所述限制才应该如此看待；缺乏本文中尚未描述为至关重要的限制的本发明变化形式打算作为本发明的方面。应该清楚，本发明可以与以上说明和实例中具体描述的不同的方式来实践。
鉴于以上传授内容，本发明的许多修改和变化形式是可能的并且因此，在本发明的范围内。
以下实例旨在说明但不限制本发明。
实例1
PRRSV分离株P129对PK-9细胞的适应和减毒
在1995年在印地安那州普渡大学(Purdue University)的动物疾病诊断实验室，从病猪中分离出了毒性PRRS分离株P129。使来自此猪的血清样品在高健康状态的猪中传代一次以扩大血清和肺匀浆储备液。从血清和肺匀浆中提取病毒RNA并将其用于测定P129第0代病毒的全基因组共同序列。RNA先用无规六聚物预致敏并用于合成cDNA。使用高保真度(校正)PCR，在三个重叠碎片中扩增基因组。来自三个单独的PCR反应(每一个基因组区段)的PCR产物被T/A克隆并且用于DNA测序以产生全长基因组共同序列(参见SEQ ID NO:1)。
使用用于DNA测序的含有P129第0代的相同猪血清的等分试样来感染原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞。通过0.1微米针筒过滤器过滤来自PAM感染的子代病毒(第1代)并将其用于感染PK-9细胞。
PK-9细胞是通过用编码猪CD163基因和新霉素抗性基因的缺失版本的质粒稳定地转染PK0809猪肾细胞系得到的转基因细胞系。先前已经描述了PK-9细胞系的构造和特征的细节。
使来自PAM细胞的第1代病毒适应在PK-9细胞上生长是困难的，并且需要用多个平行谱系尝试若干次。通过具有复孔的免疫荧光法，使用对病毒核衣壳蛋白具有特异性的FITC结合的单克隆抗体SDOW17(南达科他州布鲁金斯的农村技术公司(Rural Technologies Inc,Brookings South Dakota))来监测感染。早期传代产生了一些小焦点，但是未产生足以起始新鲜单层的感染的无细胞病毒粒子。这些传代是通过用Accutase(胰蛋白酶替代物)处理被感染的单层并且再播种于含新鲜培养基的多个孔中的细胞中来实现的，所述培养基添加或未添加未感染的PK-9细胞。在若干次所述传代之后，一些谱系显示出荧光焦点的频率和大小清楚增加。这些当中的一些已经获得了使用无细胞病毒体液传代的能力。通过传代17次(1次在PAM细胞上，16次在PK-9上)，可以使用来自先前传代的无细胞体液的稀释液可靠地维持一个谱系，并且所述谱系在几天内引起整个单层的感染。所述病毒在任何传代水平都不引起对PK-9细胞的细胞病变效应。在病毒第17代，从被感染的PK-9细胞提取RNA并将其用于构造感染性cDNA克隆。
实例2
P129-PK第17代的感染性cDNA克隆的构造
使用如先前所述的骨架质粒构造P129-PK第17代病毒的感染性cDNA克隆。通过在重叠区中含天然存在的独特限制性核酸内切酶位点的三个重叠区段中逆转录和PCR来扩增病毒基因组。对来自三个单独的PCR反应的产物进行克隆和测序，并且比对以产生每个基因组区段的共同序列。如果指定区段的三个克隆产物中没有一个匹配关于那个区段所预测的共同氨基酸序列，那么通过亚克隆和/或定点诱变来修饰这些克隆中的一个直到它匹配所预测的共同氨基酸序列为止。使用标准克隆技术和限制性核酸内切酶位点连接三个基因组区段和质粒骨架。命名为pCMV-S-P129-PK17-FL的所得全长克隆当被转染到PK-9细胞中时是感染性的。这种感染性cDNA克隆的序列给出在SEQID NO:2中。所述基因组基本上与构造它的第17代病毒一致，具有可靠末端，并且相对于第17代的共同序列缺乏任何插入或缺失。在这种感染性cDNA克隆的病毒基因组内不存在工程改造限制性位点或其它目标改变。
P129第0代的全基因组共同序列与感染性克隆pCMV-S-P129-PK17-FL的基因组序列之间的核苷酸和氨基酸差异单独地列在表6中。表6包括由于基因组位置所造成的所有核苷酸差异和所得氨基酸差异。这些突变的子组导致从IFN抑制性(第0代)到IFN非抑制性(来源于第17代感染性cDNA克隆的所有病毒)的表现型改变。表7概述了由于PRRSV开放阅读框(ORF)或非结构蛋白(nsp)所造成的核苷酸、氨基酸以及非保守氨基酸差异。为了表7，以下各组氨基酸是在被认为保守的那些当中：[K、R]、[D、E]、[L、I、V、A]以及[S、T]。
实例3
P129-PK第17代中的缺失突变体
将基因组的两个区域中的缺失工程改造到感染性cDNA克隆pCMV-S-P129-PK17-FL中，从而产生五个遗传修饰感染性克隆。
经历修饰的基因组的一个区域是位于核衣壳蛋白(由PRRSV ORF 7编码)的氨基酸位置41-47的核定位序列(NLS)。制作了两种类型的缺失。先前已经在另一种PRRSV感染性克隆的情况下描述了这些缺失。氨基酸残基41-49的野生型序列是PG……KN。在突变体“d43/44”(也称为“PG--KS”)中，赖氨酸残基43和44缺失并且天冬酰胺残基49变成了丝氨酸。在突变体“d43/44/46”(也称为“PG--S-KS”)中，赖氨酸残基43、44和46缺失并且天冬酰胺残基49变成了丝氨酸。来源于并有这些缺失的pCMV-S-P129-PK17-FL的感染性克隆分别是pCMV-S-P129-PK17-d43/44和pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46。参见美国专利第7,544,362号。
经历修饰的基因组的第二区域是在ORF1a内的nsp2的高变区中。131个氨基酸(393个核苷酸)的缺失先前已经在另一种PRRSV感染性克隆的情况下有所描述。来源于并有这种缺失的pCMV-S-P129-PK17-FL的感染性克隆是pCMV-S-P129-PK17-nsp2。
在pCMV-S-P129-PK17-FL骨架内还产生了组合了NLS和nsp2缺失的感染性克隆，并且这些感染性克隆被命名为pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44和pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46。
实例4
病毒在PK-9细胞上的产生和生长
将实例3中所述的六种感染性克隆转染到PK-9细胞中以产生如表1中所示的六种病毒。通过使用脂染胺2000将环状质粒直接转染到PK-9细胞中从这些感染性克隆产生病毒。在转染之后，使回收的病毒在PK-9细胞上再次连续传代以便进一步增加滴度并且减弱毒性。制作储备液作为候选疫苗进行体外测试和体内评估。在来源于非修饰的pCMV-S-P129-PK17-FL感染性克隆的P129-PK17-FL病毒的情况下，培养所述病毒直到达到总共52次从猪传代为止。在第24代(SEQ ID NO:3)和第52代(SEQ IDNO:6)，对这种病毒的全基因组进行测序。
实例5
来源于抑制IFN-α诱导的能力有所降低的P129-PK第17代感染性CDNA克隆的病毒
病毒和细胞.使MARC-145和ST细胞在补充有5％胎牛血清(FBS)和抗生素(50μg/ml庆大霉素、100UI青霉素以及100μg/ml链霉素)的改良伊格尔培养基(modified Eagle's medium；MEM)中生长。使猪肺泡巨噬细胞ZMAC-1细胞在补充有10％FBS的RPMI-1640中生长。通过在改良伊格尔培养基中以多个0.01感染汇合ST细胞单层来制备TGE病毒株Purdue。1h后去除病毒接种物并且在补充有2.5％FBS的MEM中在37℃下在5％CO2氛围中培育细胞。在观察到80％细胞病变效应之后，通过冷冻和解冻细胞单层释放病毒。使TGE病毒储备液在4℃下在3,500rpm下离心15分钟并且储存在-80℃下直到使用为止。病毒储备液(来自PK-9细胞)如下：P129-PK-FL和P129-PK-dnsp2-d43/44/46是在第8/25代(8来自感染性克隆，25来自猪)。其它四种病毒(P129-PK-d43/44、P129-PK-d43/44/46、P129-PK-dnsp2以及P129-PK-dnsp2-d43/44)是在第21/38代。各种PRRS病毒的操作储备液通过在ZMAC-1细胞上进行单次传代来制备，除了市售疫苗Ingelvac PRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP根据制造商的说明书复原并且直接用于感染。
猪PBMC的分离.用汉克氏(Hank's)稀释新鲜肝素化静脉血并且通过菲科尔-泛影钠(Ficoll-Hypaque)1077(西格玛)梯度密度离心来分离PBMC。在汉克氏中洗涤两次之后，将细胞悬浮于含L-谷氨酰胺(美的泰克(Mediatech))的RPMI培养基中，所述培养基补充有5％胎牛血清(吉毕科(Gibco))、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸(美的泰克)100U/ml庆大霉素以及250mM 2-巯基乙醇(西格玛)。
猪浆细胞样树突状细胞的纯化.猪浆细胞样树突状细胞的纯化如先前所述(卡尔扎达·诺瓦(Calzada-Nova)，已提交)进行，并且是基于这些细胞对CD4和CD172的特征表达(萨默菲尔德等人,2003)。简单来说，将新鲜猪PBMC悬浮于含0.5％BSA的PBS中并且用最佳量的识别猪CD172(74-22-15，VMRD)的mAb标记。在洗涤一次之后，然后使细胞与结合到PE(南方生物技术(Southern Biotech))的第二山羊抗小鼠抗体一起培育并且在洗涤之后，与FITC标记的抗CD4(74-12-4，VMRD)一起培育。在反射细胞分类器(iCyt)上对PDC进行分类，在CD4+/CD172低群体上设置分类门(sort gate)。在分类之后，通过再分析证实细胞纯度。在所有情况下，纯度是>95％。
细胞因子分泌测量结果的分析.用不同刺激物刺激PBMC或PDC 16小时(37℃，5％CO2)或模拟刺激。在培育之后，使用用可商购的单克隆抗体(抗猪IFN-αmAb K9和F17)制备的夹心ELISA分析上覆刺激细胞的培养基中IFN-α的存在。简单来说，通过在4℃下培育过夜，接着用补充有5％胎牛血清的RPMI培养基封闭，用抗猪IFN-αmAb F17(PBL实验室)涂布Immulon II板(戴雷泰克公司(Dynatech Inc.))。1小时后，丢弃培养基并且将五十微升有待测试的上清液一式两份地添加到分析孔中。在1小时培育之后，分析孔洗涤4次并且然后依次用生物素标记的抗猪IFN-αmAb K9(PBL实验室)、HRP结合的链霉亲和素(扎美德实验室(Zymed Laboratories))以及TMB底物(KPL)培育。用ELISA读板仪测定光密度。
来源于P129-PK第17代感染性CDNA克隆的病毒缺乏抑制IFN-α诱导的能力。使用猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC-1，从一组四种不同PRRS野生型病毒分离株(P3412、P129、IND5、NADC20)制备操作病毒储备液。其它储备液也从前两种野生型病毒的衍生物制备，这些衍生物通过在PK-9、FK.D4或MARC-145细胞中反复传代已经适应于在细胞培养液中生长。四种野生型分离株中的三种(P129、IND5、NADC20)容易地并且有效地在ZMAC-1细胞中生长到约107TCID50/ml的滴度，而P3412野生型分离株到达仅仅105TCID50/ml的滴度。值得注意地，在ZMAC-1细胞系中制备的P129病毒的储备液的滴度达到了在PK-9或MARC-145细胞(病毒已适应这些细胞)中获得的滴度的10倍。这些病毒刺激PBMC分泌IFN-α的能力的检查揭示了有一个例外(分离株P3412克隆C)，这些细胞响应于其暴露于所测试的PRRS病毒储备液中的任一者分泌出极少量(<50pg)的IFN-α，相比于相同细胞由于其暴露于猪冠状病毒传染性胃肠炎病毒(TGEv)所产生的IFN-α的大量分泌(17,540pg)，这是可忽略的。
PRRSV不仅不能够刺激猪PBMC产生IFN-α，而且主动地抑制其产生。通过测量在存在或不存在PRRSV的情况下，PBMC响应于暴露于TGEv所分泌的IFN-α的量来测定PRRSV储备液的抑制作用。如表2中所示，经测试的所有4种野生型PRRS病毒分离株以及所有细胞培养液适应的衍生物都展现出对PBMC对TGEv的IFN-α反应的强烈抑制作用(>80％)。进行了对来源于感染性cDNA克隆(pCMV-S-P129-PK17-FL)，包括全长P129-PK-FL病毒和若干基因工程改造的缺失突变体的一组病毒储备液的分析。如表3中所示，当与亲本野生型分离株P129(第1代)的强烈抑制作用(95％)相比时，P129-PK-FL病毒和所有缺失突变体展现出在PBMC中抑制TGEv诱导IFN-α的能力明显有所降低。为了进一步评估这些病毒的IFN-α表现型，随后的实验集中于进行P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒、亲本P129野生型病毒株和/或由勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)生产的两种市售经修饰活PRRSV疫苗(IngelvacPRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP)之间的直接比较。还测试了附加低传代参考分离株NVSL-14。如表4中所示，在四个独立实验中，P129-PK-FL和P129-PK-d43/44展现出明显低于亲本P129病毒、两种Ingelvac减毒病毒株或参考病毒株的IFN-α抑制作用。在一个例子中，与P129-PK-FL或P129-PK-d43/44病毒的协同感染促使TGEv的IFN-α反应明显增强。
表2中所示的结果显示适于在细胞培养液中生长的野生型PRRS病毒和衍生物的干扰素-α抑制作用。所指定的PRRS病毒储备液在ZMAC-1细胞中生长并且使用ZMAC-1细胞测定这些新产生的储备液的滴度。通过ELISA测定在存在或不存在TGE病毒的情况下，暴露于指定PRRS病毒储备液18小时的猪外周血单个核细胞的培养物上清液中所存在的IFN-α的量。*仅对TGEv起反应。
表3中所示的结果证明了适于在表达CD163的PK-9细胞中生长的野生型PRRS病毒P129和其基因工程改造衍生物的干扰素-α抑制作用。通过ELISA测定在存在或不存在TGE病毒的情况下，暴露于指定PRRS病毒储备液18小时的猪外周血单个核细胞(PBMC)的培养物上清液中所存在的IFN-α的量。na＝不适用；*仅对TGEv起反应。
表4示出了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒相比于野生型P129病毒和PRRSIngelvac疫苗有所降低的干扰素-α抑制作用。通过ELISA测定在存在或不存在TGE病毒的情况下，暴露于指定PRRS病毒储备液18小时的猪外周血单个核细胞(PBMC)的培养物上清液中所存在的IFN-α的量。na＝不适用；*仅对TGEv起反应。
由PBMC响应于其暴露于TGEV分泌的大量IFN-α主要来源于包含小于0.3％PBMC群体的细胞子组。这种罕见的但是重要的细胞子组由浆细胞样树突状细胞(PDC)构成，它们由于特征性浆细胞样形态而接受这种名称。为了进一步检查P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒的IFN-α表现型，进行了一系列实验，这些实验类似于上文所述的那些实验，除了采用从PBMC中新鲜分离到>95％纯度的PDC。如图1所示，这一系列的实验证实了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒引起的对TGEV诱导IFN-α的抑制可忽略不计。此外，在一个实验中，观察到了对PDC响应于P129-PK-FL和P129-PK-d43/44PRRS病毒的TGEV介导的IFN-α诱导的明显强化作用。相比之下，Ingelvac PRRS MLV病毒展现出对IFN-α反应的强烈抑制作用，如图1所示。
实验部分中所述的结果揭示了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44PRRS病毒以及pCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆的其它衍生物在被感染的PBMC或PDC细胞中抑制TGEV诱导IFN-α的能力大大降低。这与野生型(低传代)PRRS病毒和两种市售经修饰活病毒疫苗(Ingelvac PRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP)所观察到的IFN抑制作用形成了鲜明的对比。假设这些细胞在介导抗病毒感染的先天性免疫中所起的主要作用，P129-PK-FL和P129-PK-d43/44最低限度地抑制PDC的这种重要功能这一观察结果是潜在地显著的。
还应该指出，本发明提供适于在重组地表达CD163受体的受纳细胞上生长的临床上有效的市售疫苗病毒，并且所述病毒和疫苗不取决于历史“猿猴细胞”培养技术，也不在任何时候用历史“猿猴细胞”培养技术发展。具体参见美国专利7,754,464。
实例6
候选疫苗的安全性和功效
为了评估其作为对抗PRRS的疫苗的安全性和功效，在幼猪呼吸道疾病模型中评估来源于pCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆、P129-PK-FL(第7/24代)、P129-PK-d43/44(第17/34代)以及P129-PK-d43/44/46(第17/34代)的病毒中的三种。这些病毒的来源示出在图8中，并且实验设计(处理组)列在表5中。使用低传代毒性PRRSV分离株NADC20在7周龄(疫苗接种之后四周)进行异源攻击。对照处理组包括模拟疫苗和市售PRRS疫苗Ingelvac MLV。
非处理(NT)组如下：NT1猪是用于监测来源猪的健康状态的哨兵。将它们分开圈养并且在PRRSV攻击之前进行尸体剖检。NT2猪是分开圈养在两圈接种疫苗的猪之间的猪圈中的接触对照组，对于T02到T05中的每一个，每个处理组总共两个接触对照组。NT3猪是每个猪圈与接种疫苗的猪一起圈养的接触对照组，每个处理组(T01到T05)总共两个接触对照组。只有NT3猪被分配到T01组。
在接种疫苗之后测量接种疫苗的动物的直肠温度并且将其与T01(模拟疫苗)处理组进行对比。结果示出在图1中。没有一种疫苗诱导发烧。在接种疫苗后的整个观察阶段中，所有组平均小于104℃。
测量攻击后猪的直肠温度。结果示出在图2中。未接种疫苗的T01猪显示维持大于104℃的热度。相比之下，这些疫苗中的三种在攻击后热度显著降低。P129-PK-FL在降低热度方面最有效。
记录接种疫苗之前和之后的动物体重。结果示出在图3中。在研究的前1天(在接种疫苗之前)、第10天、第24天、第27天(在攻击之前)以及第37天记录体重。在未接种疫苗的猪中，用毒性NADC20病毒攻击几乎完全消除了10天观察阶段期间的体重增加。所述疫苗不同程度地否定这种作用。
在攻击之后，在尸体剖检时检查被攻击动物的肺。每个肺的涉及病灶的百分比示出在图4中。T01模拟疫苗组平均25.1％肺部病灶涉及率。所述疫苗不同程度地降低了肺部病灶。P129-PK-FL是最有效的，使肺部病灶涉及率降低到1.1％。
使用肺评估评分(LAS)来评估肺部病灶的严重程度，如图5所示。所述疫苗中的三种降低LAS。P129-PK-FL使平均LAS从模拟接种疫苗组中的1.63降低到0.14。
通过接种疫苗和攻击两者诱导针对PRRSV的血清抗体。在研究的第27天和第37天测量IDEXX ELISA S/P比率。结果示出在图6中。接种P129-PK-FL诱导出最高水平的抗PRRS抗体。
在PAM细胞上滴定被攻击的猪的血清中的病毒血症。结果(TCID50/mL)给出在图7中。P129-PK-FL在减少攻击后病毒血症方面是最有效的。
虽然已经参见以上实例和附件(所述附件中的每一个的完整内容以其全文引用的方式并入本文中)描述了本发明，但是应了解，在本发明的精神和范围内涵盖修改和变化形式。因此，本发明仅受以下权利要求书的限制。
实例7
来自感染性CDNA克隆PCMV-S-P129的感染性CDNA克隆PCMV-S-P129-PK17-FL的 衍生物
本发明的PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129-PK17-FL可以使用定点诱变技术，由本领域的技术人员容易地从先前所述的PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129得到。PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129描述于美国专利第6,500,662号中，并且以寄存编号203489保藏于ATCC。这种克隆中的PRRSV基因组的DNA序列也可在基因库(NCBI)数据库中以寄存编号AF494042获得。定点诱变试剂盒可购自多个供应商，并且能够在大质粒中在多个位点同时制造许多核苷酸改变。所述试剂盒包括(但不限于)Change-ITTM多点突变定点诱变试剂盒(昂飞(Affymetrix)/USB)、QuikChange快速多定点诱变试剂盒(安捷伦技术-斯塔津产品(Agilent Technologies-Stratagene Products))以及AMAP多定点诱变试剂盒(MBL国际性组织(MBLInternational))。
PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129(可自ATCC获得)与本发明的PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129-PK17-FL之间的核苷酸改变的清单呈现在表8中。所有改变都是在基因组的蛋白质编码区域中。存在总共74种核苷酸改变，它们可以使用74种突变诱发引物和与市售定点诱变试剂盒的多个序列反应被引入到pCMV-S-P129感染性克隆中，产生在序列上与本文中所述的pCMV-S-P129-PK17-FL一致的质粒分子。实际上，可以在少于74种突变诱发引物的情况下得到相同结果，因为可以使用单一突变诱发引物改变在彼此的约50-60个核苷酸内的突变簇。举例来说，可以使用单一突变诱发引物改变核苷酸735、750和756，如同可以改变核苷酸965、992和1009一样。因此引物数量被降到约60。
在74种核苷酸改变中，大多数(42种)是同义或“沉默”的，意指它们编码相同氨基酸。这些核苷酸改变不太可能对病毒的干扰素诱导或抑制表现型造成任何可测量的影响。其余的32种核苷酸改变是非同义或“非沉默”的，并且引起病毒蛋白中的氨基酸改变。预测这32种核苷酸改变直接导致病毒的干扰素诱导/抑制表现型，并且应该被改变以便将由感染性克隆pCMV-S-P129编码的病毒转化成如由感染性克隆pCMV-S-P129-PK17-FL编码的病毒所示的相同干扰素表现型。此类改变将需要最多32种突变诱发引物，如果考虑到一些相关核苷酸的成簇，那么更少。
实例8
感染性CDNA克隆PCMV-S-P129-PK17-FL的从头合成
作为定点诱变的一个替代方案，本发明的PRRS病毒基因组可以用适当的5'和3'衔接子序列以化学方式从头合成，并且克隆到用于PRRS感染性cDNA克隆pCMV-S-P129(可自ATCC以寄存编号203489获得)的质粒骨架或类似质粒骨架中。长度大于50kb(PRRSV基因组是约15.5kb)的基因的委托合成可以商业服务形式从许多供应商获得，所述供应商包括(但不限于)：金斯瑞(GenScript)、DNA 2.0以及生物基础公司(Bio Basic Inc.)。通过使用侧接基因组的5'PacI和3'SpeI限制酶位点替换感染性克隆pCMV-S-P129中的病毒基因组，将合成病毒基因组定向克隆到pCMV-S载体中。为了切割合成基因组，将24个核苷酸的延伸部分(5'-GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-基因组-3'，它包括带下划线的PacI位点)构建到合成基因组的5'端中，并且将83个核苷酸的延伸部分(5'-基因组-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3'，它包括带下划线的SpeI位点)构建到合成基因组的3'端中。在用PacI和SpeI切割质粒和合成基因组之后，纯化适当片段，使用DNA连接酶连接，并且使用本领域的普通技术人员众所周知的标准克隆技术转型到大肠杆菌中进行筛选和繁殖。
表1.
感染性克隆 病毒
pCMV-S-P129-PK17-FL P129-PK-FL
pCMV-S-P129-PK17-d43/44 P129-PK-d43/44
pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46 P129-PK-d43/44/46
pCMV-S-P129-PK17-nsp2 P129-PK-nsp2
pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46 P129-PK-nsp2-d43/44
pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46 P129-PK-nsp2-d43/44/46
表2.
表3.
表4.
表5.
表6.
表7.
ORF或nsp 核苷酸差异 氨基酸差异 非保守氨基酸差异
Nsp1a 2 1 1
Nsp1b 7 6 5
Nsp2 19 8 5
Nsp3 8 2 1
Nsp4 5 3 2
Nsp5 3 1 0
Nsp6 0 0 0
Nsp7 1 1 1
Nsp8 0 0 0
Nsp9 8 1 0
Nsp10 3 1 1
Nsp11 2 1 1
Nsp12 1 1 1
ORF2a 1 1 1
ORF2b 0 0 0
ORF3 2 1 0
ORF4 1 0 0
ORF5 7 4 2
ORF6 4 3 2
ORF7 3 1 1
表8.
表9
导致降低的干扰素抑制和毒性减弱的氨基酸改变.
表10
导致降低的干扰素抑制和毒性减弱的氨基酸改变
实例9.
由P129-PKC12-FL病毒组成的疫苗用于1日龄猪是安全的并且可有效持续至少26周。
现有的经PRRS修饰的活疫苗仅建议用于两周龄或更大的猪。进行研究以确定减毒P129-PKC12-FL病毒在第57代(2.13log10TCID50/2mL剂量)用于1日龄新生猪是否安全，并且免疫原性是否足以在接种疫苗之后长达6个月(26周)提供对抗毒性异源攻击的保护。(这与如SEQ ID No:6中所述的第52代病毒基本上相同)。
24只PRRSV血清反应阴性的怀孕大母猪来源中的总共22只生下了健康猪崽。根据分配，在约1日龄(第0天)，以肌内注射向这些猪(猪崽)投与单一2.0mL剂量的模拟疫苗或P129-PKC12-FL病毒疫苗。产仔/分娩笼中所有健康猪崽在同一天接受相同模拟疫苗(11窝，100只猪崽)或P129-PKC12-FL病毒疫苗(11窝，91只猪崽)。
模拟接种的大母猪和猪崽在整个疫苗接种阶段中保持PRRSV阴性。没有检测到混杂的疾病因素。用于证明在1日龄接种疫苗的猪崽中的安全性的主要变量是接种疫苗后的临床观察结果。使用血清学来证实所有猪崽的成功疫苗接种。
观察并记录所有猪崽在接种疫苗后第1天到第10天的临床观察结果。在投与对照产品(T01)的100只猪(猪崽)和投与测试产品(T02)的91只猪崽中，分别观察到15和14只猪不正常(表11，涉及在本具体实例内编号的表格)。观察到不正常的猪崽进一步指出具有异常的一般状况和/或沮丧。
表11：曾在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗之后观察到临床征象的猪的数量[观察到具有异常健康状况的动物的数量(观察到具有异常病状的动物的百分比)]
IDEXX ELISA结果证实了所有的猪在接种疫苗之前对于PRRSV都是阴性的(S/P比率<0.4)并且所有模拟疫苗对照组在此研究的疫苗接种阶段期间保持血清学阴性。在接种疫苗之后，P129-PKC12-FL疫苗组中所有的猪到第21天或第22天都是血清反应阳性的(S/P比率>0.4)(下表12)。
表12：在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗之后的血清几何平均PRRSV滴度(IDEXX Elisa)[平均滴度(阳性动物*/全部动物)]
处理组 第0天 第10天/第11天 第21天/第22天
模拟疫苗 0.002(0/100) 0.000(0/86) 0.001(0/85)
P129-PKC12-FL疫苗 0.002(0/91) 1.322(76/85) 2.412(81/81)
所述数据支持以下结论：减毒P129-PKC12-FL病毒在第57代当以单一2mL IM剂量向由血清反应阴性的大母猪所生的猪崽投与时是安全的，观察时所述猪崽是一日龄但在21或22日龄断奶。
在攻击之前，将模拟接种的和P129-PKC12-FL病毒接种的猪崽重新圈养在房间内的猪圈中(每个猪圈2只来自同一疫苗接种组的猪崽)，以使得每个房间包含来自每个疫苗接种组的12个猪圈。在接种疫苗后7、18或26周，用毒性异源PRRS分离株NADC20进行攻击。攻击剂量等于4.0mL(1.0mL/鼻孔加上2.0mL肌内注射)2.27log10TCID50/mL NADC20储备溶液(2.87log10TCID50/4mL剂量)。NADC-20是一种毒性很强的基因型2PRRS病毒，由美国农业部国家动物疾病中心(National AnimalDisease Center,USDA)(爱荷华州艾姆斯(Ames,Iowa))的凯莉·拉格尔(KellyLager)医生提供。NADC-20ORF5氨基酸序列与P129-PKC12-FL 94.5％一致。
确定疾病预防的主要变量是具有病灶的肺的百分比。在尸体剖检时(攻击后第10天)对肺部病灶进行评分，以使得以所观察到的具有病灶的叶的百分比形式评分并记录每个叶(左颅、左中、左尾、右颅、右中、右尾以及附件)的固结百分比。
在接种疫苗后7周，模拟接种的猪中具有病灶的肺的百分比明显大于P129-PKC12-FL病毒接种猪崽(P≤0.0001)(表13)。
表13：在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或模拟疫苗的7周龄猪崽的PRRSV NADC20攻击之后具有病灶的肺的逆转换最小二乘均值百分比
在接种疫苗后18周，模拟接种的猪崽中具有病灶的肺的百分比明显大于P129-PKC12-FL病毒接种猪崽(P≤0.0001)(表14)。
表14：在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗的18周龄猪崽的PRRSV NADC20攻击之后具有病灶的肺的逆转换最小二乘均值百分比
在接种疫苗后26周，模拟接种的猪中具有病灶的肺的百分比明显大于P129-PKC12-FL病毒接种猪崽(P≤0.0001)(表15)。
表15：在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗的26周龄猪崽的PRRSV NADC20攻击之后具有病灶的肺的逆转换最小二乘均值百分比
结果表明，减毒疫苗病毒P129-PKC12-FL在1日龄猪崽中是安全的，并且能够诱导强力免疫反应，具有超常的免疫持续时间。单一剂量保护1日龄猪崽不被毒性异源PRRS攻击持续至少26周。
1日龄猪崽中的安全性和26周PRRS免疫持续时间这些特性适用于多价组合猪疫苗，例如二价PRRSV/猪肺炎支原体(M.hyo)疫苗、二价PRRSV/2型猪圆环病毒(PCV2)疫苗以及三价PRRSV/M.hyo/PCV2疫苗，以及适用于单价PRRSV疫苗。
实例10.
由P129-PKC12-FL病毒组成的疫苗提供保护性免疫的早发。
现有经修饰活PRRS疫苗建议在暴露于毒性PRRS病毒株之前接种至少3到4周。这个时间间隔被认为是为了建立保护性免疫所必需的。在此所述的研究证明了在接种P129-PKC12-FL病毒疫苗和两种其它市售PRRS疫苗之后仅14天传递的抗毒性异源PRRS病毒攻击的显著保护作用。
在接种疫苗阶段期间，18只猪(在3周龄)的处理组圈养在四个单独的房间的猪圈中，每个猪圈6只动物。根据制造商的说明书，在约3周龄(第0天)时，向猪(猪崽)投与模拟疫苗(2mL)、减毒P129-PKC12-FL第57代病毒疫苗(3.62log10TCID50/2mL剂量)、Ingelvac PRRS MLV疫苗或Ingelvac PRRS ATP疫苗的单一肌内注射。
在攻击之前，所有其余动物重新圈养在猪圈中，每个猪圈3只动物，每个占用猪圈之间有一个空猪圈，以使得来自每个处理组的多个猪圈的动物被圈养在四个房间中的每一个中。在约5周龄(第14天)，用毒性异源PRRS分离株NADC20进行攻击。攻击剂量等于4.0mL(1.0mL/鼻孔加上2.0mL肌内注射)2.07log10TCID50/mLNADC20储备溶液(2.67log10TCID50/4mL剂量)。
确定疾病减少的主要变量是接种组相对于模拟疫苗组的肺部病变百分比。当与模拟接种组相比时，发现了所有接种组(P129-PKC12-FL，P＝0.0177；Ingelvac PRRSATP，P＝0.0255；Ingelvac PRRS MLV，P＝0.0137)之间的显著差异。当接种组相互比较时，未发现显著差异(表16)。
表16：在先前接种经修饰活PRRSV疫苗或模拟疫苗的五周龄猪的PRRSVNADC20攻击之后具有病灶的肺的百分比.
这些结果证明，在接种疫苗后14天诱导部分免疫和疾病减少可能是经修饰活PRRS病毒疫苗的一般特性。这种特性可能由猪(猪崽)中早期获得的免疫性(例如特异性抗体和细胞毒性T细胞)、先天性免疫(例如诱导干扰素和自然杀伤细胞)和/或疫苗病毒与攻击病毒之间关于有限数量的受纳宿主细胞(例如肺泡巨噬细胞)的竞争的组合引起。无论机制如何，可以采用这种特性来保护猪远离与天然或故意PRRS感染(例如使即将到来的后备小母猪故意暴露于毒性PRRS的地方性农场病毒株)相关的疾病。
因此，如上文所提到，PRRS免疫性的早发这种特性适用于多价组合猪疫苗，例如二价PRRSV/猪肺炎支原体(M.hyo)疫苗、二价PRRSV/2型猪圆环病毒(PCV2)疫苗以及三价PRRSV/M.hyo/PCV2疫苗，以及适用于单价PRRSV疫苗。关于适用于本发明实践(即，用于早在猪崽1日龄时提供早期并且安全的疫苗接种，任选地在此后两周的免疫性发作)的所述疫苗的组分，参考如在尼斯特尔(Niztel)等人于2012年4月4日提交的名称为“PCV/猪肺炎支原体/PRRSZ组合疫苗(PCV/Mycoplasmahyopneumoniae/PRRSZ Combination Vaccine)”的美国临时申请61/620189中所述的所有组合疫苗组分，所述申请的完全和完整揭示内容如以其全文阐述一般以引用的方式并入本文中。
关于可以用于本发明实践中(即，用于早在猪崽1日龄时提供早期并且安全的疫苗接种，任选地在此后两周的免疫性发作)的特异性PRRS疫苗(或PRRS疫苗病毒株)，请注意默托(Murtaugh)等人,疫苗(Vaccine),第29卷,第8192页-第8204页,(2011)的表1，参见其第8196页，其中鉴别了许多所述病毒/疫苗，包括(但不限于)Ingelvac PRRS MLV、Ingelvac PRRS ATP以及Suvaxyn PRRS(来源于爱荷华州病毒株ISU-55)。应注意，提供以上所提到的性能特征的疫苗预计还提供约6个月的免疫期持续时间。
生物材料的保藏
以下生物材料(也参见美国专利第6,500,662号)于1998年11月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801大学大道(University Blvd.),马纳萨斯(Manassas),弗吉尼亚(Virginia),20110-2209,USA，并且按以下寄存编号分配。
质粒pT7P129A，寄存编号203488
质粒pCMV-S-P129，寄存编号203489
以下美国专利的全文和披露内容如同全面阐述一般以引用的方式并入本文中：U.S.6,500,662和U.S 7,618,797。

Claims (6)

1.一种用于保护猪科动物不被PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗包含(a)北美PRRS病毒，它由多核苷酸分子SEQ ID NO:6或在非常严格的条件下与其杂交的任一多核苷酸编码，在65℃下在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤；(b)所述编码多核苷酸分子；(c)呈质粒形式的所述多核苷酸分子；或(d)病毒载体，它包含所述多核苷酸分子，其中所述PRRS病毒能够以可有效产生对抗感染的免疫保护的量引发不被PRRS病毒感染的有效免疫保护反应；和适用于兽用的载剂，并且其中所述疫苗早在猪崽1日龄时就提供了早期并且安全的疫苗接种，并且其中所述疫苗提供长达6个月的免疫持续时间。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中免疫的发生是在接种疫苗之后两周开始提供。
3.一种用于给猪科动物接种疫苗以不被PRRS病毒感染的方法，包含在出生之后约12小时与2周龄之间投与所述疫苗，其中所述疫苗包含
(a)包含编码感染性RNA分子的DNA序列的经分离多核苷酸分子，所述感染性RNA分子编码北美PRRS病毒，
(b)编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子；
(c)呈质粒形式的所述多核苷酸分子(a)，或
(d)包含感染性序列的病毒载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中保护性免疫在接种疫苗之后不迟于约14天出现。
5.根据权利要求4所述的方法，其中保护性免疫在生命第1天接种疫苗之后在第15天、在生命第7天接种疫苗之后在第21天或在生命第14天接种疫苗之后在不迟于约第28天出现。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所提供的保护性免疫的持续时间长达6个月。
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