CN104293740A

CN104293740A - 表面展示sars双价抗原的重组杆状病毒及其制备方法和应用

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Publication number: CN104293740A
Application number: CN201310301800.2A
Authority: CN
Inventors: 张耀洲; 闫晶晶; 舒特俊; 陈剑清; 盖其静; 赵红玉
Original assignee: TEFEI (TIANJIN) BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TEFEI (TIANJIN) BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2033-07-18
Also published as: CN104293740B

Abstract

本发明公开了一种表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒及其制备方法和应用，该病毒是由重组蛋白SP-N-TM和SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将该基因组DNA转染家蚕细胞，在细胞内包装得到的重组杆状病毒；其中重组蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端连接GP64的信号肽SP，C-端连接GP64的跨膜域TM构成；SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端连接SP，C-端连接TM构成。该重组杆状病毒将SARS病毒的N蛋白及RBD蛋白基因在病毒衣壳表面展示，具有良好的免疫原性。

Description

表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒及其制备方法和应用。

背景技术

严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndromes），又称传染性非典型肺炎，简称SARS，是一种因感染SARS冠状病毒引起的新的呼吸系统传染性疾病。主要通过近距离空气飞沫传播，以发热、头痛、肌肉酸痛、乏力、干咳少痰等为主要临床表现，严重者可出现呼吸窘迫。本病具有较强的传染性，在家庭和医院有显著的聚集现象。首发病例，也是全球首例，于2002年11月出现在广东佛山，并迅速形成流行态势。2002年11月至2003年8月5日，29个国家报告临床诊断病例共8422例，死亡916例。报告病例的平均死亡率为9.3%。该病毒很可能来源于动物，由于外界环境的改变和病毒适应性的增加而跨越种系屏障传染给人类，并实现了人与人之间的传播。

虽然SARS已被控制，但SARS病毒不大可能在短期内被“消灭”或自动消失，SARS在人群中再次出现的可能性很大。再次发生SARS疫情的时间，主要与病毒侵袭人体的时间有关，不一定表现为冬春高发。动物携带病毒的季节性分布、人接触感染动物的机会等都将影响再次发生疫情的时间。动物仍然是病毒的可能来源，人群对SARS病毒仍然普遍易感，其疫苗仍是目前的研究重点。

目前SARS疫苗包括治疗性疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，已有一定进展，但也存在相应的问题，具体见下表。

表1

	优点	缺点
			治疗性疫苗	不需宿主识别抗体的Fc段	需要抗体人源化
灭活病毒疫苗	时间短；廉价；技术较易；疫苗相对稳定；不需要冷藏；易于运输	生产安全条件极高；存在安全性问题；需多次注射；免疫应答效果微弱
			核酸疫苗（基因疫苗或DNA疫苗）	制备简单；易大量生产；安全性好，可同时诱导体液免疫和细胞免疫应答；可在体内持续表达	持续表达外源可能产生一些不良后果；影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的不确定因素很多
多表位疫苗	可以和不同类型的MHC分子结合，实现高效提呈，并且可诱导很强的细胞免疫	缺乏对SARS-CoV蛋白抗原表位，特别是构象表位的深入了解；合成的多肽仅能覆盖少数的线性抗原表位，不可能诱导产生高水平的体液免疫应答

亟待研究一种新的SARS疫苗克服上述问题。

发明内容

为了克服现有技术疫苗的上述缺陷，本发明提供了一种表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒。

该表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒是由重组蛋白SP-N-TM和SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到所述的表面展示SARS抗原N基因的重组杆状病毒；

其中，所述重组蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成；所述重组蛋白SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成。

穿梭载体Bacmid（即 Baculovirus plasmid）为带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，均为现有技术。

优选地，上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，所述供体质粒为pFastBacDual，重组蛋白SP-N-TM的编码基因插入到供体质粒pFastBacDual的p10启动子下，重组蛋白SP- RBD -TM的编码基因插入到供体质粒pFastBacDual的pPolh启动子下，构建成重组转座质粒后再与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组。

其中，载体pFastBacDual是Bac-to-bac表达系统的供体质粒，可以插入外源基因并在辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBacDual已经商品化。

优选地，上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，所述重组蛋白SP-N-TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述重组蛋白SP-RBD-TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，所述重组蛋白SP-N-TM的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

本发明还提供了上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒的制备方法，步骤如下：

（1）PCR扩增获得杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因、SARS病毒的N蛋白的编码基因、SARS病毒的RBD蛋白的编码基因和杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因；

（2）通过重叠PCR扩增的方法获得由SP的编码基因、N蛋白的编码基因和TM的编码基因依次连接的重组基因SP-N-TM，且在其5’和3’端分别引入SmaI和Kpn I酶切位点；重叠PCR获得由SP的编码基因、RBD蛋白的编码基因和TM的编码基因依次连接的重组基因SP-RBD-TM，且在其5’和3’端分别引入BamH 和Spe 酶切位点；将重组基因SP-N-TM连接到载体pFastBacDual的p10启动子下，SP-RBD-TM连接到载体pFastBacDual的pploh启动子下，构建成重组转座质粒；

（3）重组转座质粒转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，白斑继续培养24~48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；

（4）取步骤（3）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒；

所述PCR鉴定使用两组引物，分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12构成的引物组，以及SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18构成的引物组。

优选地，上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒的制备方法，步骤（1）中扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示；扩增SARS病毒N蛋白的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示；扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示。

优选地，上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒的制备方法，步骤（1）中扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示；扩增SARS病毒RBD蛋白的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示；扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示。

本发明还提供了上述表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒在制备SARS疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

通过分析SARS病毒的基因组结构，发现 S蛋白含1255aa，是结构蛋白区编码的最大的跨膜糖蛋白，由S1和S2两个亚单位组成，位于S蛋白N端的S1段(17~672aa)是同受体血管紧缩素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)结合的关键部位，也是中和抗体作用的主要作用靶点, 基于相关研究结果,对S蛋白的S1段进行抗原表位分析，211~550aa的区段（即RBD）不仅是一个功能结构域，而且含有S蛋白主要的中和表位。用S 基因构建的DNA 疫苗可诱导中和抗体免疫和细胞免疫，但以体液免疫为主。

SARS病毒的N蛋白含422个氨基酸，以与RNA结合的形式存在于病毒颗粒的核心部分，参与病毒的转录与复制，比其他蛋白如S、M等保守。N蛋白的N末端存在一高度保守的序列FYYLGTGP（SEQ ID NO:22），这一序列在所有其他冠状病毒N蛋白中均有存在。因此成功的N基因疫苗能诱导产生强的、广谱的、持久的中和抗体和保护性的T细胞免疫应答。

家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64含有两个高度疏水区：N-末端的分泌性信号肽（SP）和C-末端的跨膜结构域(TM)，与跨膜结构域相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜与宿主细胞膜内的糖蛋白连接在一起。本发明将SARS病毒的N蛋白基因与家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64基因融合，实现目的N蛋白在病毒衣壳上的表面展示。

本发明构建的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，可以利用家蚕BmN细胞作为生物反应器，通过家蚕杆状病毒表达系统高效表达具有极高临床应用价值的SARS病毒的N蛋白和RBD蛋白，其可以制备疫苗，也可以直接用重组病毒制备疫苗，适用于大规模生产，可降低成本，提高产量，所生产的SARS疫苗应用价值大。

SARS疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产，家蚕杆状病毒表达系统是真核表达，具有翻译后修饰功能。N蛋白的免疫原性与其正确构型有关，利用真核表达可以具备较好的免疫原性。

附图说明

图1：载体pFastBacDual的结构示意图。

图2：含有gp64-N-RBD的重组转座质粒pFstBacDual-gp64-N-RBD构建示意图，其中p10：多角体启动子；pPolh：多角体启动子；SP：gp64基因的信号肽序列；N蛋白：Nucleocapsid protein（核衣壳蛋白）；RBD蛋白：Receptor-binding domain（受体结合功能区）蛋白；TM：gp64基因的跨膜区序列；Sma 、Kpn 、BamH 、Spe ：酶切位点。

图3： SP-N-TM基因和SP-RBD-TM基因PCR扩增产物，其中，左图M：10kb DNA分子量标准，1：SP-N-TM基因PCR扩增产物，箭头位置为目的序列，1458bp；右图M：10kb DNA分子量标准，1：SP-RBD-TM基因PCR扩增产物，箭头位置为目的序列，1212bp。

图4：重组转座质粒pFastBacDual-gp64-N-RBD的PCR鉴定电泳图，其中左图M：10kb DNA分子量标准，1：SP-N-TM目的基因，2：pFastBacDual-gp64-N双酶切产物；右图M：10kb DNA分子量标准，1：SP-RBD-TM目的基因，2：pFastBacDual-gp64-RBD双酶切产物。

图5: 重组杆状病毒基因组Bacmid-gp64-N-RBD的PCR产物电泳鉴定结果，其中，M：10kb DNA分子量标准，1和4：空白对照，2：pH （F）和SV40(R)为引物扩增的1580bp片段，3：Psp-F2和M13R为引物扩增的1762bp片段；5：Psp-F1和Ptm-R1为引物扩增的1458bp片段，6：Psp-F1和M13F互为引物扩增的4107bp片段。

图6：重组杆状病毒Bmp64-N-RBD的PCR产物电泳鉴定结果，其中，M：10kb DNA分子量标准，1和5：空白对照，2和6：阴性对照，3：Psp-F2和Ptm-R2互为引物扩增的1212bp片段，:4：Psp-F2和M13R互为引物扩增的1762bp片段7：Psp-F1和Ptm-R1互为引物扩增的1458bp片段，8：Psp-F1和M13F互为引物扩增的4107bp片段。

图7：重组杆状病毒Bmp64-N-RBD的抗原蛋白Western Blot检测结果（N蛋白兔抗检测），M：蛋白分子量标准，1：原核表达N蛋白，2：阴性对照上清，3：阴性对照沉淀，4：Bmgp64-N上清，5：Bmgp64-N沉淀，6：Bmgp64-N-RBD上清7：Bmgp64-N-RBD沉淀。

图8：重组杆状病毒Bmp64-N-RBD的抗原蛋白Western Blot检测结果（RBD蛋白兔抗检测），M：蛋白分子量标准，1：原核表达N蛋白，2：阴性对照上清，3：阴性对照沉淀，4：Bmgp64-RBD上清，5：Bmgp64-RBD沉淀，6：Bmgp64-N-RBD上清7：Bmgp64-N-RBD沉淀。

图9：重组杆状病毒Bmp64-N-RBD的抗原蛋白功能Western Blot检测结果（N蛋白、RBD蛋白鼠抗作为探针），M:蛋白分子量标准，1：原核表达RBD蛋白，2：Bmgp64-RBD；3：原核表达N蛋白；4：Bmgp64-N；5：Bmp64-N-RBD。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明通过PCR扩增获得SARS主要抗原N蛋白的编码基因序列和RBD蛋白的编码基因序列，同时扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因和杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因，通过重叠PCR，得到SP-N-TM重组基因片段和SP-RBD-TM重组基因片段，并将其插入昆虫细胞表达载体pFastBacDual的多克隆位点，获得重组转座质粒（命名为pFastBacDual-gp64-N-RBD），重组转座质粒转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA（重组质粒命名为Bacmid-gp64-N-RBD），将其通过脂质体转染家蚕BmN细胞，在细胞内装配形成表面展示SARS抗原N基因的重组杆状病毒（命名为Bmgp64-N-RBD），并复制扩增，用第三代Bmgp64-N-RBD接种家蚕BmN细胞，经3~5天后收集病毒液，离心、分离纯化，制成SARS疫苗。下面详细阐述本发明的具体内容。

实施例1 重组转座质粒pFastBacDual-gp64-N-RBD的构建

1. gp64-N序列的获得

以家蚕杆状病毒gp64序列（SEQ ID NO:19）为模板，分别用表2所示的引物Psp-F、Psp-R和Ptm-F、Ptm-R进行PCR扩增，获得gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区 (TM)序列，以SARS病毒的N蛋白基因序列（SEQ ID NO:20）为模板，Pn-F、Pn-R为引物，PCR扩增获得N蛋白基因序列。PCR产物通过重叠PCR得到SP基因序列、N基因序列和TM基因序列依次连接的重组目的片段SP-N-TM，将重组目的片段插入到载体pFastBacDual的p10启动子下，构建重组转座质粒pFastBacDual-gp64-N，利用该多角体启动子启动N基因的表达，使融合蛋白N端具有信号肽(SP)，C端具有跨膜区(TM)，由于该启动子属于极晚期基因启动子且为强启动子，即使融合蛋白是对杆状病毒和宿主细胞有毒性的蛋白，由于以该启动子启动融合基因表达时病毒粒子已经形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表达。

表2 SP-N-TM序列引物序列设计

Psp-F1	ACACCCGGGATGGTAGGCGCTATTG（SEQ ID NO:7）
		Psp-R1	TATCAGACATCGCCGCAAAG（SEQ ID NO:8）
Pn-F	CTTTGCGGCG ATGTCTGATAATGGAC（SEQ ID NO:9）
		Pn-R	CTTCAGCCAT TGCCTGAGTTGA（SEQ ID NO:10）
Ptm-F1	AACTCAGGCAATGGCTGAAGGC（SEQ ID NO:11）
		Ptm-R1	GCCGGTACCTTAATATTGTCTACTATTACGG（SEQ ID NO:12）

表2中下划线处为Sma ，Kpn 酶切位点。

(1) gp64信号肽(SP)基因的扩增

以家蚕杆状病毒gp64序列（SEQ ID NO:19）为模板，Psp-F1和Psp-R1 为引物，进行PCR扩增。PCR的反应体系为50μL，具体成分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL 的Psp-F1和Psp-R1各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s, 72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。待反应结束后，电泳鉴定扩增产物片断,目的片断大小为60bp，同时切胶回收目的片断。

(2) gp64跨膜域(TM)的扩增

以家蚕杆状病毒gp64序列（SEQ ID NO:19）为模板，Ptm-F1 和Ptm-R1为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系50μL，具体组分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL 的Ptm-F1 1μL和Ptm-R1各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s, 72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。待反应结束后，电泳鉴定扩增产物片断, 目的片断大小为132bp，同时切胶回收目的片断。

(3) SARS病毒的N基因扩增

以SARS病毒的N蛋白基因序列（SEQ ID NO:20）为模板，Pn-F 和Pn-R为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系50μL，具体组分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL 的Pn-F和Pn-R各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s, 72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断, 目的片断大小为1266bp（已删除终止子），同时切胶回收目的片断。

(4) gp64-N的获得

同时以步骤（1）至（3）得到的SP基因序列、N基因序列和TM基因序列为模板，进行PCR扩增。扩增体系为50 μL，成分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，SP基因序列3μL，N基因序列3μL，TM基因序列3μL，Taq DNA聚合酶2μL，ddH₂O 29μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性40s，50℃复性40s，72℃延伸1min35s，35个循环，72℃延伸10min。按上述反应参数设计35个循环，获得重叠目的片段SP-N-TM（命名为gp64-N）。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断, 目的片断大小为1458bp（参见图3），同时切胶回收目的片断。

(5)gp64-N的扩增

以重叠PCR产物SP-N-TM为模板， Psp-F1和Ptm-R1为引物，进行PCR扩增。扩增体系为50 μL，成分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL 的Psp-F1和Ptm-R1各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性45s，50℃复性45s，72℃延伸1min35s，30个循环，72℃延伸10min。按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。

2. gp64-RBD序列的获得

以家蚕杆状病毒gp64序列（SEQ ID NO:19），分别用表3所示的引物Psp-F2、Psp-R2和Ptm-F2、Ptm-R2进行PCR扩增，获得gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区 (TM)序列。以SARS病毒的RBD蛋白基因序列（SEQ ID NO:21）为模板，以Prbd-F、Prbd-R为引物进行PCR扩增获得RBD蛋白基因序列。PCR产物通过重叠PCR得到SP基因序列、RBD基因序列和TM基因序列依次连接的重组目的片段SP-RBD-TM，将重组目的片段插入到载体pFastBacDual的pPolh启动子下，构建重组转座质粒pFastBacDual-gp64-RBD，利用该多角体启动子pPolh启动RBD基因的表达，使融合蛋白N端具有信号肽(SP)，C端具有跨膜区(TM)，由于该启动子属于极晚期基因启动子且为强启动子，即使融合蛋白是对杆状病毒和宿主细胞有毒性的蛋白，由于以该启动子启动融合基因表达时病毒粒子已经形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表达。RBD蛋白通过杆状病毒囊膜蛋白gp64的信号肽（SP）引导和跨膜区（TM）锚定展示于杆状病毒表面，形成刺猬状（伪病毒），末端的多腺苷酸化信号PolyA对融合蛋白的翻译有重要作用。

表3SP-RBD-TM序列引物序列设计

Psp-F2	CGGATCCATGGTAGGCGCTATT（SEQ ID NO:13）
		Psp-R2	TAAAACCCATCGCCGCAAAG（SEQ ID NO:14）
Prbd-F	CTTTGCGGCGATGGGTTTTAACACTT（SEQ ID NO:15）
		Prbd-R	CTTCAGCCAT TTGTTGAAATGGT（SEQ ID NO:16）
Ptm-F2	ATTTCAACAAATGGCTGAAGGC（SEQ ID NO:17）
		Ptm-R2	GCCACTAGTTTAATATTGTCTACTA（SEQ ID NO:18）

表3中下划线处为BamH ，Spe 酶切位点。

(1) gp64信号肽(SP)基因的扩增

以家蚕杆状病毒gp64序列（SEQ ID NO:19）为模板，Psp-F2和Psp-R2 为引物，进行PCR扩增。PCR的反应体系为0.5mL，具体成分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL 的Psp-F2和Psp-R2各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s, 72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。待反应结束后，电泳鉴定扩增产物片断,目的片断大小为60，同时切胶回收目的片断。

(2) gp64跨膜域(TM)的扩增

以家蚕杆状病毒gp64序列（SEQ ID NO:19）为模板，Ptm-F 2和Ptm-R2为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系50μL，具体组分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL 的Ptm-F2和Ptm-R2各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s, 72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。待反应结束后，电泳鉴定扩增产物片断, 目的片断大小为132bp，同时切胶回收目的片断。

(3) SARS病毒的RBD基因扩增

以SARS病毒的RBD蛋白基因序列（SEQ ID NO:21）为模板，Prbd-F 和Prbd-R为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系50μL，具体组分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL 的Prbd-F和Prbd-R各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s, 72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断, 目的片断大小为1020bp，同时切胶回收目的片断。

(4) gp64-RBD的获得

同时以步骤（1）至（3）得到的SP基因序列、RBD基因序列和TM基因序列为模板，进行PCR扩增。扩增体系为50 μL，成分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，SP基因序列3μL，RBD基因序列 3μL，TM基因序列3 μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 29μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性40s，50℃复性40s，72℃延伸1min35s，35个循环，72℃延伸10min。按上述反应参数设计35个循环，获得重叠目的片段SP-RBD-TM（命名为gp64-RBD）。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断, 目的片断大小为1212bp（参见图3），同时切胶回收目的片断。

(5)gp64-RBD的扩增

以重叠PCR产物SP-RBD-TM为模板，Psp-F2和Ptm-R2为引物，进行PCR扩增。扩增体系为0.5mL，成分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol /μL的Psp-F2和Ptm-R2各1μL，模板 2μL，Taq DNA聚合酶 2μL，ddH₂O 34μL。各组分混匀后，放入PCR仪中，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性45s，48℃复性45s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。

3. 重组转座质粒pFstBacDual-gp64-N-RBD的构建

将上述PCR扩增获得的gp64-N（即SP-N-TM）序列分别通过限制性内切酶Sma 和Kpn (购自Fermentas公司)进行双酶切，上述PCR扩增获得的gp64-RBD（即SP-RBD-TM）序列分别通过限制性内切酶BamH 、Spe I (购自Fermentas公司)进行双酶切，两种酶切产物分别插入经过两次双酶切的pFastBacDual载体的p10、pPolh启动子下游多克隆位点上下游两端，构建含有gp64-N序列和gp64-RBD的重组转座质粒，命名为pFstBacDual-gp64-N-RBD。构建完成的重组转座质粒通过酶切分析和双向测序鉴定基因序列正确后，重组转座质粒构建成功。图4为重组转座质粒pFastBacDual-gp64-N-RBD的PCR鉴定电泳图。

实施例2 家蚕重组杆状病毒Bmgp64-N-RBD的获得

将鉴定重组成功的重组转座质粒pFastBacDual-gp64-N-RBD转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞（购自Invitrogen公司），在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板（购自上海生工生物公司，按照说明书进行操作）上培养，通过转座进行同源重组（pFastBacDual-gp64-N-RBD上的gp64-N序列和gp64-RBD序列通过同源转座插入到Bacmid的多克隆位点）后进行蓝白斑筛选，避光培养48h后挑取白斑，白斑继续在含四环素、卡那霉素、庆大霉素、X-gal和IPTG的LB培养液中摇菌培养24-48h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组DNA，用M13F、Psp-F1和Ptm-R1构成的引物组，以及M13R、Psp-F2和Ptm-R2构成的引物组通过PCR扩增鉴定重组Bacmid中目的基因插入情况，插入成功的质粒命名为Bacmid-gp64-N-RBD（即重组杆状病毒基因组）。图5为基因组Bacmid-gp64-N-RBD的PCR鉴定结果。

其中，M13通用引物序列：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT（SEQ ID NO:5）；

M13R：CAGGAAACAGCTATGACC（SEQ ID NO: 6）。

鉴定成功的质粒Bacmid-gp64-N-RBD通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞（购自Invitrogen公司），转染使用Invitrogen 公司脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent，转染方法参照该转染试剂说明书，转染具体步骤：

前一天晚上将16μL的质粒Bacmid-gp64-N-RBD和8μL转染试剂加到76μL的无血清培养基中，室温孵育20min，使脂质体充分包裹质粒Bacmid-gp64-N-RBD，然后将其加入到1mL生长良好的家蚕BmN细胞中，置入培养箱培养过夜，第二天早上将无血清培养基吸走，换成有血清培养基培养5~7天，待细胞发病。

细胞发病后（显微镜观察）获得一代病毒悬液4℃保存，提取病毒基因组用M13F、Psp-F1和Ptm-R1构成的引物组，以及M13R、Psp-F2和Ptm-R2构成的引物组进行PCR鉴定，鉴定结果见图6，其中阴性对照为野生杆状病毒，结果表明病毒构建成功，获得表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，命名为Bmgp64-N-RBD。

实施例3 N-RBD融合蛋白在家蚕BmN细胞的表达

将重组杆状病毒Bmgp64-N-RBD以5×10^-6pfu/cell的剂量感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增，感染3~5天后，收集病毒液，经分离纯化，取10μL上清液加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris-HCl，4%SDS，0.15%溴酚蓝，10%甘油)，100℃加热10min，取加热后的混合液2μL进行SDS-PAGE分析，结果表明，该家蚕重组杆状病毒已表达N、RBD蛋白。

实施例4从家蚕BmN细胞中分离纯化Bmgp64-N-RBD病毒

（1）取200mL经Bmgp64-N-RBD感染的家蚕BmN细胞病毒液；

（2）将病毒液加入50mL离心管中，8000rpm离心30min，取上清，重复三次以除去细胞残渣；

（3）将步骤（2）获得的离心上清液倒入50mL离心管，15000rpm离心60min，取上清，重复三次；

（4）将步骤（3）获得的离心上清液，用截留分子量为100KD的中空纤维膜进行超滤，不断加入无菌水，所用无菌水体积约为样品的10倍，整个超滤过程均在4℃环境下操作，重复5次；

（5）步骤（4）膜包超滤后的上清，在超净台上分装于灭菌的超滤离心管中，用注射器赶走管内气泡，放入日立CP70MX离心机以转速50000rpm离心40min，所得黑团用超滤液（即磷酸缓冲液PBS）重悬，用0.22μm的滤膜过滤除菌，获得纯化的重组杆状病毒。

通过Western Blot检测重组杆状病毒N蛋白的表达情况（用N蛋白的兔抗检测），结果见图7，其中泳道1为原核表达的N蛋白作为阳性对照，是使用将N蛋白基因构建在pET-28a上，用大肠杆菌BL21表达的蛋白产物；泳道2和3是阴性对照，阴性对照使用的是野生杆状病毒；泳道4和5分别是纯化的Bmgp64-N病毒上清液和沉淀；泳道6和7分别是纯化的Bmgp64-N-RBD上清和沉淀。用RBD蛋白兔抗检测的结果见图8，其中阴性对照使用野生杆状病毒。

以N蛋白鼠抗、RBD蛋白鼠抗作为探针通过Western Blot对重组杆状病毒Bmgp64-N-RBD的免疫原进行功能鉴定，检测结果见图9。

实施例5 SARS疫苗的效果

实施例2获得的重组杆状病毒株Bmgp64-N-RBD感染家蚕BmN细胞系，传代3次后收获病毒，进行动物体中和试验，免疫动物为BALB/c小鼠（购自天津市奥易得实验用品有限公司，5周龄，20±2g），皮下注射，注射剂量为5μg/20g，6周后检测抗体效价，其保护抗体效价大于1：150，攻毒试验结果显示该剂量（5μg/20g）疫苗能产生中和抗体并具有明显抵抗病毒的效果。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 特菲（天津）生物医药科技有限公司

<120> 表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒及其制备方法和应用

<130> 131181-I-CP-TJYU

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

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Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn

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Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln

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Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg

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Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr

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Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala

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His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe

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Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu

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<212> PRT

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<212> DNA

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attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg 1020

gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca 1080

tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct 1140

cagcctttgc cgcagagaca aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac 1200

atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact 1260

caggcataa 1269

<210> 21

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgggtttta acactttgaa acctattttt aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat 60

tttagagcca ttcttacagc cttttcacct gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca 120

gcctattttg ttggctattt aaagccaact acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt 180

acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt 240

aagagctttg agattgacaa aggaatttac cagacctcta atttcagggt tgttccctca 300

ggagatgttg tgagattccc taatattaca aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat 360

gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct 420

gattactctg tgctctacaa ctcaacattt ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct 480

gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag 540

ggagatgatg taagacaaat agcgccagga caaactggtg ttattgctga ttataattat 600

aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc cttgcttgga atactaggaa cattgatgct 660

acttcaactg gtaattataa ttataaatat aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc 720

tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct 780

gctcttaatt gttattggcc attaaatgat tatggttttt acaccactac tggcattggc 840

taccaacctt acagagttgt agtactttct tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt 900

tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat 960

ggactcactg gtactggtgt gttaactcct tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa 1020

taa 1023

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

1 5

Claims

1.一种表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒是由重组蛋白SP-N-TM和SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到所述的表面展示SARS抗原N基因和RBD基因的重组杆状病毒；

其中，所述重组蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成；

所述重组蛋白SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成。

2.根据权利要求1所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，其特征在于，所述供体质粒为pFastBacDual，重组蛋白SP-N-TM的编码基因插入到供体质粒pFastBacDual的p10启动子下，重组蛋白SP- RBD -TM的编码基因插入到供体质粒pFastBacDual的pPolh启动子下，构建成重组转座质粒后再与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组。

3.根据权利要求2所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组蛋白SP-N-TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述重组蛋白SP-RBD-TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求3所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组蛋白SP-N-TM的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.根据权利要求4所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒，其特征在于，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

6.权利要求2~5任一所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下：

7.根据权利要求6所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示；扩增SARS病毒N蛋白的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示；扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示。

8.根据权利要求6所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示；扩增SARS病毒RBD蛋白的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示；扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示。

9.权利要求1~5任一所述的表面展示SARS双价抗原的重组杆状病毒在制备SARS疫苗中的应用。