CN104278017A - 一种重组表达人溶菌酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效表达人溶菌酶的方法。本发明人在综合考虑各种影响表达的因素后，优化人溶菌酶cDNA序列，采用菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin)的信号肽和人溶菌酶的成熟肽构建成的溶菌酶表达盒，表达人溶菌酶，大幅度地提高了溶菌酶表达的效率。本发明的方法表达的溶菌酶接近天然，酶活性非常高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种高效表达人溶菌酶的方法。
背景技术
人溶菌酶包含130个氨基酸，分子量为14.7kD。溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β-1.4糖苷键。使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对于破坏革兰氏阳性菌G+细菌的细胞壁较革兰氏阴性菌G-细菌强。对于革兰氏阳性菌(G+)，如藤黄微球菌、枯草杆菌或溶壁微球菌等，溶菌酶的作用相当明显，但是，如大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等一些革兰氏阴性菌(G-)也有一定溶菌作用。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复合物，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液富含溶菌酶，鸟类和家禽的蛋清、微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。溶菌酶是一种碱性蛋白质，有较强的抗热性。有机溶剂的处理也不能使溶菌酶失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；冷冻或干燥处理溶菌酶，其活性仍保持稳定；溶菌酶最适宜pH在5.3-6.4之间。溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于革兰氏阳性菌，对部分革兰氏阴性菌也有抑制效果，可用于低酸性食品防腐。溶菌酶作为防腐剂，其安全性很高，几乎没有毒副作用。其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。1992年FAO/WTO的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。溶菌酶可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染，口服和肌注均有效。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药。
由于人溶菌酶只能从乳汁、胎盘等体液和组织中少量提取，而且分离纯化成本较高，无法进行大规模生产。因而人溶菌酶的广泛应用只能通过生物技术手段才得以实现。现有技术中已经在酵母等菌株中成功表达过人溶菌酶，然而表达的效率以及表达的规模仍然不够理想(一般摇瓶表达量在40mg/L以下，发酵罐表达量低于350mg/L)，需要从分子构建的源头上对人溶菌酶的重组表达进行深入研究，以达到高表达这一目的。
Pichia pastoris酵母较多被用于异源蛋白的基因重组表达，应用该系统成功表达了人血清白蛋白、人胰岛素原C肽、肿瘤坏死因子、破伤风毒素B片段等。为了达到异源蛋白的高表达，强启动子发挥很大作用，如这些高表达蛋白均是用AOX1启动子启动的。但是其它因素也可以影响重组蛋白的表达水平。研究人员还经常使用一些其它方法来提高目的蛋白的表达水平，最常用的方法是提高插入到酵母基因组的目的蛋白表达盒拷贝数，此法可以提高表达量。但是这个策略有局限，提高拷贝数不一定必然伴随着目的蛋白表达量的增高。即使有所增高，也不呈现和表达盒的拷贝数成正相关的状况。蛋白表达量受很多因素的制约，有转录阶段的调控，翻译阶段的制约，以及翻译后的蛋白修饰等，因此特定的蛋白，需要找到合适的策略并结合大量的研究试验工作来优化表达。
综上，本领域还有必要进行进一步的研究，以提高人溶菌酶的表达效率，使得人溶菌酶真正实现高效地大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组表达人溶菌酶的方法。
在本发明的第一方面，提供一种重组表达人溶菌酶的方法，所述方法包括：
(1)提供一种重组酵母细胞，所述酵母细胞中包含一重组表达盒，该重组表达盒含有：菜豆凝集素的信号肽编码序列以及人溶菌酶成熟肽编码序列；和
(2)培养(1)的重组酵母细胞，从而表达人溶菌酶。
在一个优选例中，所述的菜豆凝集素的信号肽编码序列的3’端与人溶菌酶成熟肽编码序列构建的人溶菌酶表达盒的5’端直接相连，制备成表达溶菌酶的重组表达盒。
在另一优选例中，所述的菜豆凝集素信号肽编码序列如SEQ ID NO:4所示；或
所述的人溶菌酶成熟肽编码序列是经密码子优化的序列，如SEQ ID NO:5中第64-456位所示。
在另一优选例中，所述的菜豆凝集素信号肽编码序列与所述的人溶菌酶成熟肽编码序列连接而成的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述的重组表达盒中，从5’至3’依次包括：启动子序列，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:5中第64-456位所示的人溶菌酶成熟肽编码序列，翻译终止子序列，这些序列操作性相连。
在另一优选例中，所述的启动子是酵母表达启动子；较佳地，所述的启动子是AOX1启动子或GAP启动子。
在另一优选例中，所述的重组表达盒位于表达载体中，所述的表达载体是pPHIL-D2表达载体。
在另一优选例中，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
在另一优选例中，所述的毕赤酵母细胞是GS115亚型。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(3)分离(纯化)所述的人溶菌酶。
在另一优选例中，利用离子交换和/或分子筛进行人溶菌酶的分离纯化。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；或如SEQ ID NO:5中第64-456位所示，所述的多核苷酸表达人溶菌酶。
在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含一重组表达盒，该重组表达盒含有：菜豆凝集素的信号肽编码序列以及人溶菌酶成熟肽编码序列。
在本发明的另一方面，提供一种重组酵母细胞，所述的重组酵母细胞包含一重组表达盒，该重组表达盒含有：菜豆凝集素的信号肽编码序列以及人溶菌酶成熟肽编码序列。
在本发明的另一方面，提供所述的重组表达载体或所述的重组酵母细胞的用途，用于重组表达人溶菌酶。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：pHIL-D2载体为骨架，PHA信号肽引导的溶菌酶表达载体结构图。左图的溶菌酶序列未经优化，右图的溶菌酶序列经过优化。
图2：pPIC-9载体为骨架的溶菌酶表达载体结构图。左图的溶菌酶序列未经优化，右图的溶菌酶序列经过优化。
图3：含不同载体的酵母细胞株在摇瓶和发酵罐内表达的差异。
图4：含pHIL-D2-PHA-HLA(optimized)酵母细胞株在发酵罐中的表达和随后的纯化结果。图中“1”为含pHIL-D2-PHA-HLA(optimized)酵母细胞株在发酵罐内用甘油培养基生长3天后的发酵液上清；“2”为含pHIL-D2-PHA-HLA(optimized)酵母细胞株在发酵罐内用甘油培养基生长1天，甲醇诱导2天后的发酵液上清；“3”为纯化后获得的溶菌酶。“4”为蛋白分子量标准，从上到下为97、66、45、30、20、14KD。
具体实施方式
在生物技术领域中，异源蛋白的重组表达是一个重要研究课题。为了提高重组蛋白的表达率，需大量时间和大量的实验室工作，经多次试验、分析、总结与再试验的努力才能达到最后的成功。有很多因素可以影响重组蛋白表达率。重组蛋白为分泌表达时，信号肽就是一个影响因素；同时，重组蛋白本身的DNA序列对于是否能够实现高效表达也起了重要作用。本发明人经过深入的研究，首次用菜豆凝聚素信号肽取代通常使用的酵母α因子信号肽；同时综合考虑各因素并经反复试验论证后，优化了人溶菌酶cDNA序列来构建的表达人溶菌酶的Pichia pastoris表达载体，建立了一种新的重组表达系统，使得成熟的溶菌酶表达的效率大幅度地提高。
信号肽和成熟肽编码序列的优化
如本文所用，所述的“信号肽”是分泌蛋白新生肽链N端的一段氨基酸残基组成的肽段，其长度一般为20～30个氨基酸残基。信号肽将分泌蛋白引导进入内质网，同时这个肽段被切除。
信号肽对分泌性重组蛋白的表达有很大影响，一个合适的信号肽可以使目的蛋白的表达量成倍提高。毕赤酵母本身分泌的内源蛋白质较少，因而通过信号肽序列来引导外源蛋白质的分泌可方便纯化操作。目前常用的信号肽有酿酒酵母α交配因子(α-MF)和毕赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)信号肽，其中前者在应用上更为广泛。尽管α-MF信号肽是一个强信号肽，重组蛋白在此信号肽的引导下可以获得高表达。但是某些外源蛋白用α-MF信号肽进行分泌表达，会使得重组蛋白质的氨基末端有所延伸(Liu PT et al.Protein Expr Purif,2001,22:381-387)。如人α-1干扰素用α-MF信号肽来分泌表达，可见到部分重组蛋白的N-端带有9-11个α-MF信号肽氨基酸残基，这给纯化工艺造成很大的难题。在人溶菌酶的表达中也碰到类似问题(Nozomi Koganesawa et al,2001,14:605-710)。
本发明人在研究中意外发现，来源于菜豆凝集素的信号肽PHA当应用于Pichia pastoris分泌表达溶菌酶时，具有良好表达效率，与PHA信号肽融合的溶菌酶蛋白质能被正确加工，未见信号肽中的任何氨基酸残基与目的蛋白的N-端相连。
重组蛋白的DNA序列有时可起到关键作用。影响因素包括整个基因DNA中的GC/AT比例；碱基AT富集区的大小和分布；翻译起始区域的二级结构；GC簇(GC cluster)或者是G簇(G cluster)的分布；酵母偏好密码子和稀有密码子的分布等。DNA序列中高GC比例或高AT比例可以使得目的基因的表达量降低；过多的AT富集区域可以明显地影响酵母的重组基因表达，酵母对于聚腺苷信号的专一性没有高级真核细胞那样特异，较长的AT序列就可被酵母识别为聚腺苷信号，使得目的基因的mRNA提前终止转录，得到的mRNA比正常的mRNA短，重组蛋白的C-端序列缺失；GC簇或者是G簇(G cluster)的富集，直接影响DNA的转录；翻译起始区域的二级结构的强度可影响核糖体翻译的效率；酵母稀有密码子的存在，目的蛋白的翻译速度被也使得目的蛋白的表达受到影响。
因此，在研究过程中，本发明人综合考虑毕赤酵母偏爱的密码子、AT:GC的比例设计、碱基AT富集区的大小和分布、GC簇(GC cluster)或者是G簇(Gcluster)的分布、mRNA二级结构优化、翻译起始区域的二级结构等因素的基础上，对天然人溶菌酶cDNA序列进行了优化。
针对多种序列优化策略，本发明人进行了大量且反复地试验，最终确定了如SEQ ID NO:5中第64-456位所示的人溶菌酶编码序列。这一序列并非仅遵循已经报导的毕赤酵母优选密码子设计，而是综合考虑了多种影响因素，以及综合了重组表达实验结果。
重组表达载体
本发明构建了用菜豆凝集素的信号肽PHA引导的、经密码子优化的人溶菌酶cDNA序列的表达盒，用于转染到酵母细胞中进行表达。
作为本发明的优选方式，应用的酵母启动子可以是AOX1启动子，也可以是GAP启动子或其它酵母启动子。用相应的启动子连接菜豆凝集素信号肽序列和优化的人溶菌酶cDNA序列，构成重组表达盒。本发明中，所述的“重组表达盒”是指包含有表达目的蛋白(本发明中为人溶菌酶)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件：启动子、编码蛋白的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件时操作性相连的。
作为本发明的优选方式，本发明所述的人溶菌酶的表达盒中，从5’至3’依次包括：启动子序列，SEQ ID NO:4所示的菜豆凝集素信号肽核苷酸编码序列，密码子优化后的人溶菌酶成熟肽编码序列，翻译终止子序列，这些序列操作性相连。本发明中，所述的“操作性相连”，“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
重组表达的细胞
本发明用于重组表达人溶菌酶的细胞是酵母细胞。多种酵母细胞都可用于本发明，所述的酵母例如毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)或球拟酵母(Torulopsis)等。
作为本发明的优选方式，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。所述的外源基因表达框架包括启动子、外源基因克隆位点、信号肽、外源基因表达盒、终止序列、筛选标记等。表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；由于毕赤酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源，绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源，因此在发酵过程中可以减少杂菌的污染，而且大规模工业发酵技术相对比较成熟。包括培养基、发酵方法等已经经过详尽研究，使得发酵的重现性和自动化程度都极为良好。
作为本发明的一个优选实施方式，提供了一种人溶菌酶(HLY)在毕赤氏酵母(Pichia)中的重组表达方法。本发明的方法特征在于重组表达质粒pPHIL-D2-PHA-HLY(optimized)的构建，本发明特征一表现为在宿主细胞内转染由酵母强启动子驱动的密码子优化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列构建的HLY。本发明特征二表现为用密码子优化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列构建HLY的N端前面为菜豆凝集素信号肽序列。具体操作是宿主细胞用GS115pPHIL-D2-PHA-HLY(optimized)载体转录，以不含组氨酸的培养基进行筛选，在此基础上进一步用测定溶菌酶表达量的方法选择高表达克隆。经50次传代确认稳定高表达后选择其中表达量最高的一株作为工程细胞株。为了比较菜豆凝集素信号肽和酵母α因子信号肽对溶菌酶表达的影响，也为了比较天然人溶菌酶成熟肽cDNA和密码子优化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列对溶菌酶表达的影响，本发明人还构建了pPHIL-D2-PHA-HLY和pPIC9-HLY(optimized)两个溶菌酶表达载体，分别转录毕赤酵母宿主细胞，以不含组氨酸的培养基进行筛选，在此基础上进一步用测定溶菌酶表达量的方法选择高表达克隆，这些高表达克隆也需经50次传代，确认稳定高表达后选择其中表达量最高的一株来进行比较。
细胞培养和蛋白分离纯化
本发明的方法中，对于培养毕赤酵母的方法和培养基没有特别的限制，可以采用本领域常规使用的方法和培养基。在培养重组细胞分泌表达出人溶菌酶后，还可包括步骤：从培养产物(培养基或发酵液)中分离溶菌酶。从培养产物中分离或纯化溶菌酶可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、凝胶过滤法纯化、分子筛、或采用亲和层析法纯化。
本发明的主要优点在于表达量高：采用本发明构建的重组表达系统进行表达，可获得非常高的溶菌酶表达量；表达的蛋白接近天然：采用本发明的方法表达、纯化的重组人溶菌酶在分子量测定、N-端15个氨基酸序列、C-末端2个氨基酸序列、肽图、CD等实验中均与天然的人溶菌酶没有区别；本发明另外一个优点是操作、培养简单：采用本发明的构建的表达系统和方法，在简单合成培养基中可实现高密度培养，操作简单、能有大规模发酵设备进行表达，生产成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料及其来源
K1enow片段多聚酶和所有使用的内切酶均为NEB公司产品。pPIC9、pGAPZα、Pichia pastoris GSl15株为Invitrogen公司产品。Trizol RNA抽提试剂盒购自Promega公司，YNB(W/O氨基酸)购自Sigma公司。
实施例方法简述
根据酵母偏爱的密码子和cDNA序列的GC/AT比例；碱基AT富集区的大小和分布；翻译起始区域的二级结构；GC簇(GC cluster)或者是G簇(G cluster)的分布等因素综合考虑后设计一条DNA序列，此序列的5’端有一个EcoRI酶切位点，紧接着为菜豆凝集素信号肽序列，然后为溶菌酶成熟肽序列，最后为终止密码子EcoRI酶切位点。该DNA插入到PUC18载体中，定名为PUC18-PHA-HLY(optimized)。将PUC18-PHA-HLY(optimized)克隆载体中插入的PHA-HLY(optimized)片段用EcoRI酶切下，1.5%琼脂糖电泳分离，回收DNA片段。将约0.45Kb的PHA-HLY(optimized)基因回收片段与用EcoRI酶切并经碱性磷酸酶处理过的pHIL-D2载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，以含有Ampicillin LB琼脂板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。用5’-AOX1primer(GACTGGT TCCAATTGAC AAGC)(SEQ ID NO:6)和优化后溶菌酶cDNA内部的一个primer(5’-TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC-3’)(SEQID NO:12)作为一对引物，与所得到的重组载体进行PCR反应，PCR反应产物用1.5%琼脂糖电泳分离，如PCR产物为500bp左右大小DNA片段的，则表明PHA-HLY(optimized)插入的方向正确。插入正确的重组载体分别用5’AOXlprimer和3’AOXl primer进行测序，确认插入的PHA-HLY(optimized)的序列完全正确，此载体用于转录Pichia pastoris GS115细胞。
pHIL-D2-PHA-HLY载体的构建为PHA信号肽序列与天然溶菌酶成熟肽序列(SEQ ID NO:2)的5’端连接后插入到pHIL-D2的EcoRI位点。pPIC9-HLY(optimized)载体的构建为HLY(optimized)成熟肽序列插入到pPIC9的XhoI和EcoRI位点。
实施例1、含有人溶菌酶编码序列的载体构建
天然的人溶菌酶cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(5’端第1-54位编码信号肽)，编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
为了利用人溶菌酶的表达，对序列进行设计改造，在人溶菌酶cDNA5’端去除第1-54位信号肽编码序列，加上带有部分酵母α信号肽3’端的编码序列CTC GAG AAG AGA(SEQ ID NO:8)，合成的序列如SEQ ID NO:2，在DNA的3’端为翻译终止信号TAA，将该DNA插入到PUC18载体(购自New EnglandBiolabs)中，定名为PUC18-HLY。
实施例2、人溶菌酶cDNA序列优化
在综合考虑毕赤酵母偏爱的密码子、AT:GC的比例设计、mRNA二级结构优化、碱基AT富集区的大小和分布、GC簇(GC cluster)或者是G簇(G cluster)的分布等一系列因素的基础上，在天然的溶菌酶cDNA序列(SEQ ID NO:1)基础上进行优化，同时在3’末端加上EcoRI酶切位点的序列GAATTC，优化后的溶菌酶成熟肽cDNA序列为SEQ ID NO:3。
实施例3、菜豆凝集素信号肽-优化溶菌酶cDNA序列的构建
菜豆凝集素信号肽(PHA)序列核苷酸序列如SEQ ID NO:4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15。人工合成PHA-HLY(optimized)DNA序列，在5’末端加上PHA信号肽编码序列以及EcoRI酶切位点，获得PHA-HLY序列，其顺序为EcoRI酶切位点序列紧接着为PHA信号肽序列(SEQ ID NO:4)其后为序列优化后的溶菌酶成熟肽序列，随后为终止子序列，最后为EcoRI酶切位点序列。人工合成的全序列为SEQ ID NO:5。该合成序列插入到PUC18载体中，构建成PUC18-PHA-HLY(optimized)载体。
实施例4、菜豆凝集素信号肽-天然溶菌酶cDNA序列的构建
合成引物
引物(SEQ ID NO:9)：G TTC CTG GTA CTA CTG ACA CAC GCA AACTCG AAG GTC TTT GAA AGG TGT GAG TTG
引物(SEQ ID NO:10)：GAA TTC ATG GCA AGT AGC AAC CTG TTGAGT CTA GCA CTG TTC CTG GTA CTA CTG ACA CAC G
引物(SEQ ID NO:11)：TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC
以PUC18-HLY作为模板，用引物SEQ ID NO:9和引物SEQ ID NO:1)组成的引物进行PCR扩增；以获得PCR产物提纯后作为模板，与引物SEQ ID NO:10和引物SEQ ID NO:11组成的引物对进行PCR反应，获得的PCR产物插入到PUC18的EcoRI位点中，构建成PUC18-PHA-HLY载体。此载体进行插入片段PHA-HLY全长DNA测序，测序结果证明所有序列完全正确，PCR反应没有引入任何突变。
实施例5、Pichia pastoris表达载体的构建
(1)pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)表达载体构建
pHIL-D2载体(购自Invitrogen)用EcoRI酶切，获得的线性DNA片段用碱性磷酸酶处理脱去5’-端磷酸基团；PUC18-PHA-HLY(optimized)载体用EcoRI酶切，1.5%琼脂糖电泳获得0.5kb片段；将0.5kb片段与EcoRI酶切、经碱性磷酸酶处理脱去5’-端磷酸基团的pHIL-D2线性化DNA相连，转染E.coli DH5α细胞，用含Ampicillin的LB板筛选，挑取生长的克隆，直接与5’-AOX1 primer(SEQ ID NO:6)和优化后溶菌酶cDNA内部的一个primer(5’-TTA GAC GCCGCA ACC CTG AAC-3’)(SEQ ID NO:12)引物对进行PCR反应。如PCR反应产物为700bp左右时，则证明PHA-HLY(optimized)已插入到pHIL-D2载体中，而且PHA-HLY(optimized)的插入方向正确。挑选正确的克隆，扩增获得10微克以上质粒DNA备用。该表达载体的图谱如图1右图。
(2)pHIL-D2-PHA-HLY酵母表达载体构建
将PUC18-PHA-HLY质粒用E.coRI酶切，用1.5%琼脂糖电泳，分离0.5kb片段，将此片段与经碱性磷酸酶处理脱去5’-端磷酸基团的pHIL-D2线性化DNA相连，转染E.coli DH5α细胞，用含Ampicillin的LB板筛选，挑取生长的克隆，直接与5’-AOX1primer(GACTGGT TCCAATTGAC AAGC)(SEQ ID NO:6)和溶菌酶cDNA内部的一个primer(5’-TTA CAC TCC ACA ACC TTG AAC-3’)(SEQ ID NO:11)构成的引物对进行PCR反应，如PCR反应产物为700bp左右时，则证明PHA-HLY已插入到pHIL-D2载体中，而且PHA-HLY的插入方向正确。挑选正确的克隆用于酵母转录。该表达载体的图谱如图1左图。
(3)pPIC9-HLY(optimized)载体构建
pPIC9用XhoI和EcoRI酶切，酶切产物用1%琼脂糖电泳分离，回收DNA片段；合成引物5’-CTC GAG AAG AGA AAG GTC TTT GAA AGA TGC-3’(SEQ ID NO:13)；将此引物和3’AOX1引物(SEQ ID NO:7)组成引物对，以pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)为模板，进行PCR反应，获得的DNA直接和XhoI和EcoRI酶切后的线性pPIC9 DNA连接，转染E.coli DH5α感受态细胞，用含有Ampicillin的LB板筛选。挑选阳性克隆，用5’AOX1引物和3’AOX1引物为引物对，以阳性克隆为模板，进行PCR反应，产物为2kb的克隆为插入正确的克隆，此克隆进行插入DNA的全长序列测定，DNA序列测定证明无PCR反应引入的突变，含完全正确的阅读框。此克隆作为酵母转录用。该表达载体的图谱如图2右图。
(4)pPIC9-HLY载体构建
pPIC9用XhoI和EcoRI酶切，酶切产物用1%琼脂糖电泳分离，回收DNA片段；将引物5’-CTC GAG AAG AGA AAG GTC TTT GAA AGG TGT-3’(SEQID NO:14)和3’AOX1引物(SEQ ID NO:7)组成引物对，以pHIL-D2-PHA-HLY为模板，进行PCR反应，获得的DNA直接和XhoI和EcoRI酶切后的线性DNA连接，转染E.coli DH5α感受态细胞，用含有Ampicillin的LB板筛选。挑选阳性克隆，用5’AOX1引物和3’AOX1引物为引物对，以阳性克隆为模板，进行PCR反应，产物为2kb的克隆为插入正确的克隆，此克隆进行插入DNA的全长序列测定，DNA序列测定证明无PCR反应引入的突变，含完全正确的阅读框。此克隆作为酵母转录用。该表达载体的图谱如图2左图。
实施例6、HLY在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
(1)pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)载体转染巴斯德毕赤酵母
取一个含pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)载体的大肠杆菌克隆，在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天，离心收集菌体，采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)载体DNA20微克，用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室温中干燥去除乙醇后溶于20微升纯水中。
毕赤酵母GS115细胞株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中于30℃、200rpm生长过夜，取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜，直至培养液的OD600在1.3-1.5之间，离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水，混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清，沉淀重悬于20毫升冰的1M山梨糖醇(sorbitol)，混合物离心去上清，最后细胞重悬于1毫升冰的1M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中，混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS115细胞内。电击后立即加1毫升冰的1Msorbitol，然后转移到1.5毫升无菌管，30℃静止培养1-2小时，分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)平板，置30℃培养直至克隆生长。选择200个克隆分别接种到5毫升YPD培养基，30℃，200rpm生长2天，离心弃去上清，加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为0.5%)30℃，200rpm诱导，每隔24小时补加培养体积为0.5%的甲醇，补加2次，第二次补加24小时后，离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测溶菌酶的表达。选择表达量最高的克隆为pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)阳性克隆。
(2)pHIL-D2-PHA-HLY载体转染巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
取一个含pHIL-D2-PHA-HLY载体的大肠杆菌克隆，在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天，离心收集菌体，采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pHIL-D2-PHA-HLY载体DNA20微克，用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室温中干燥去除乙醇后溶于20微升纯水中。
毕赤酵母GS115细胞株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中于30℃、200rpm生长过夜，取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜，直至培养液的OD600在1.3-1.5之间，离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水，混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清，沉淀重悬于20毫升冰的1M山梨糖醇(sorbitol)，混合物离心去上清，最后细胞重悬于1毫升冰的1M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中，混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS115细胞内。电击后立即加1毫升冰的1Msorbitol，然后转移到1.5毫升无菌管，30℃静止培养1-2小时，分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)平板，置30℃培养直至克隆生长。选择200个克隆分别接种到5毫升YPD培养基，30℃，200rpm生长2天，离心弃去上清，加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为0.5%)30℃，200rpm诱导，每隔24小时补加培养体积为0.5%的甲醇，补加2次，第二次补加24小时后，离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测溶菌酶的表达。选择表达量最高的克隆为pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)阳性克隆。
(3)pPIC9-HLY(optimized)载体转染GS115细胞
取一个含pPIC9-HLY(optimized)载体的大肠杆菌克隆，在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天，离心收集菌体，采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPIC9-HLY(optimized)载体DNA20微克，用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀在空气中干燥除去乙醇后溶于20微升纯水中，-20℃保存备用。GS115克隆在5毫升YPD中生长过夜，取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜，直至培养液的OD600在1.3-1.5之间，离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水，混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清，沉淀重悬于20毫升冰1M sorbitol，混合物离心去上清，最后细胞重悬于1毫升冰1Msorbitol，置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中，混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS115细胞内。电击后立即加1毫升冰1M sorbitol，然后转移到15毫升无菌管，30℃静止培养1-2小时，200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)平板，置30℃培养直至克隆生长。选择200个克隆分别接种到5毫升YPD培养基，30℃，200rpm生长2天，离心弃去上清，加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为0.5%)30℃，200rpm诱导，每隔24小时补加培养体积为0.5%的甲醇，补加2次，第二次补加24小时后，离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测溶菌酶的表达。选择表达量最高的克隆为pPIC9-HLY(optimized)阳性克隆。
实施例7、高表达克隆的比较
(1)DNA水平上的确认
为了进一步确认重组克隆的基因组内插入了目的蛋白表达盒，提取上述实施例6中(1)获得的工程细胞候选株(选择5株)的基因组DNA，同时也提取了上述实施例6中(2)和(3)获得的各1株最高表达细胞株的基因组DNA，以及GS115的基因组DNA。这8株细胞的基因组DNA作为模板，分别用5’AOX1 primer/3’AOX1 primer引物对进行PCR。
PCR结果显示，除GS115细胞株外，其它7株用5’AOX1 primer/3’AOX1primer引物对均能获得插入的目的基因信号，而且信号强度相同。
(2)蛋白表达水平上的确认
为了验证PHA-HLY(optimized)要比PHA-HLY、α-signalpeptide-HLY(optimized)转染时的目的蛋白的表达量高。设计了几组实验。
第一组：
上述9个克隆(包括GS115、实施例3中(1)获得的5株工程细胞候选株、pPIC9-HLY阳性克隆、pPIC9-HLY(optimized)阳性克隆和pHIL-D2-PHA-HLY克隆对照株各1株)在30℃，200rpm条件下，5毫升YPD培养基中生长2天，离心取沉淀，加含0.5%(v/v)甲醇的YP培养基，使各株的细胞密度相同，体积均为5毫升，仍置于30℃，200rpm条件下培养，每隔24小时补加0.5%(v/v)甲醇，共补加2次，第3天末，取上清检测溶菌酶的含量。
实验结果，GS115没有目的蛋白的表达，pPIC9-HLY阳性克隆株的表达量为43毫克/升，pPIC9-HLY(optimized)克隆株的表达量为62毫克/升、pHIL-D2-PHA-HLY克隆株表达量为87毫克/升、5株工程细胞候选株的表达量在120-170毫克/升之间，平均表达量150毫克/升，明显高于pPIC9-HLY、pPIC9-HLY(optimized)、pHIL-D2-PHA-HLY等对照克隆株，如图3上图。
第二组：
从获得的5株工程细胞候选株挑选出一株表达量高的克隆株、pPIC9-HLY、pPIC9-HLY(optimized)、pHIL-D2-PHA-HLY克隆株分别进行5升发酵罐培养。发酵条件按照Invitrogen的Pichia Fermentation Process Guidelines所述，甘油生长期27小时，待甘油消耗殆尽，启动甲醇诱导，共诱导72小时。
诱导结束后检测各克隆的表达量，pPIC9-HLY、pPIC9-HLY(optimized)、pHIL-D2-PHA-HLY克隆株的溶菌酶表达量分别为315毫克/升、523毫克/升、587毫克/升，pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)克隆株的表达量为892毫克/升，pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)克隆株的表达量明显高于对照克隆，如图3下图。
实施例8、工程细胞株表达的溶菌酶确认
为了在蛋白分子结构水平上确认与天然的人溶菌酶一致。pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)细胞株之一(克隆1)在200毫升YPD培养基中生长2天，然后添加200毫升含2%甲醇的YP培养基继续生长3天，培养条件为30℃，200rpm。培养结束后离心，收集培养上清。上清液用醋酸调pH至6.0，过pH6.0，20mM醋酸钠缓冲液平衡过的SP-Sepharose FF离子交换柱，目的蛋白用pH8.0，含500mM氯化钠，20mM磷酸钠缓冲液洗脱。洗脱蛋白过用pH7.0，含50mM氯化钠，20mM磷酸钠缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱，进行缓冲液交换。交换了缓冲液后的SP-Sepharose FF洗脱蛋白过pH7.0，含50mM氯化钠，20mM磷酸钠缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose FF层析柱，溶菌酶不结合离子交换树脂，直接在pH7.0，含50mM氯化钠，20mM磷酸钠平衡缓冲液洗涤时随缓冲液流穿。用菜豆凝集素信号肽引导的溶菌酶纯化后SDS-PAGE显示其纯度大于99%。
纯化的重组溶菌酶用TRYPSIN消化后用C18柱进行肽图分析，结果与人溶菌酶的TRYPSIN酶切肽图完全一致。N-端15个氨基酸序列测定结果为LysVal Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu，与SEQ ID NO:16的第1-15位氨基酸序列完全一致；C-末端两氨基酸的序列测定结果为Gly Val，与人溶菌酶的C-末端两个氨基酸相同。纯化的重组溶菌酶还进行了园二色谱检测，检测的结果与人溶菌酶一致。而用α信号肽引导表达的溶菌酶经上述方法纯化后有高分子量的杂条带，WESTERN BLOT方法检测时高分子量条带能被抗人溶菌酶抗体所识别。
上述实验确认，本发明的用菜豆凝集素信号肽引导人溶菌酶成熟肽在Pichia pastoris分泌表达的方法可以高效正确地表达人溶菌酶。
实施例9、基因工程表达的人溶菌酶活性研究
接种溶壁微球菌于LB液体培养剂中(1%Trypton,0.5%Yeast extract,1%NaCl)，28℃200rpm培养过夜，第二天收集培养液，离心沉淀细菌，菌体用pH6.2，0.1M磷酸钠缓冲液重悬洗涤后离心，获得的菌体用上述方法重复2次，加入同一缓冲液配制成OD450为0.7(±0.05)细菌悬液，置4℃备用。pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)细胞株之一(克隆1)产生的人溶菌酶浓度为2mg/ml的样品，用pH6.2，0.1M磷酸钠缓冲液稀释成1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/ml浓度，取试验菌悬浮液1.5毫升加0.1毫升人溶菌酶悬液置比色皿摇匀后与25℃450nm波长处每隔30秒读取OD数值。按照溶菌酶活性定义，在25℃，pH6.2条件下，OD450每分钟下降0.001为1个酶单位活性(IU)，酶单位活性计算公式为：
每毫克溶菌酶活性单位＝【OD450(0分)-OD450(60秒时)】×1000/样品毫克数。
经计算pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)细胞株之一(克隆1)产生的人溶菌酶活性为15900IU/mg蛋白。
实施例10、工程细胞株的发酵罐发酵工艺研究
将pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)细胞株之一(克隆1)接种到YPD平板生长2天，挑取单克隆接种到装有400毫升YPD培养基的摇瓶中，30℃250-300rpm条件下生长16-24小时直到OD600在2-6之间。
20L发酵罐内加含4%(v/v)甘油的基础盐培养液8升，加热高压灭菌。设置发酵温度30℃、pH控制5.2、转速200-1500rpm、通气条件为0.1-1.0vvm空气，用28%(w/v)氢氧化铵调节基础培养盐培养液pH到5.2，每升培养液加4.35ml PTM1痕量盐。待发酵罐内基础盐培养液的温度降至30℃后，将400毫升来自摇瓶中培养的OD600在2-6之间的种子液加入发酵罐。启动发酵罐温度、pH、通气和搅拌等装置使酵母细胞生长，继续细胞生长直到甘油消耗完毕。一旦所有的甘油都消耗完毕，启动甘油流加步骤来增加细胞的量，甘油补料中甘油的浓度为50%(v/v)，每升甘油补料内需含有12毫升PTM1痕量盐溶液，设置补料速度为18.15ml/hr/liter(起始体积)，甘油流加持续4小时。甘油流加结束后开始流加甲醇，流加的甲醇补料含100%(v/v)甲醇，每升甲醇添加12毫升PTM1痕量盐。设置流加速度为3ml/hr每升起始发酵体积。4小时后甲醇流加速度增加至6ml/hr每升发酵体积，以此速度补加2小时后甲醇补加速度调整至9ml/hr每升起始发酵体积，此补料速度一直维持到发酵结束，整个甲醇流加时间为48小时。
发酵结束后，放罐收集发酵液，发酵液通过陶瓷过滤膜过滤方法分离发酵上清，含重组溶菌酶的发酵上清用离子交换，分子筛等方法进行进一步处理。每升发酵上清经上述方法纯化后可获得纯度大于95%溶菌酶400毫克以上。发酵各阶段取样的电泳结果如图4。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种重组表达人溶菌酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供一种重组酵母细胞，所述酵母细胞中包含一重组表达盒，该重组表达盒含有：菜豆凝集素的信号肽编码序列以及人溶菌酶成熟肽编码序列；和
(2)培养(1)的重组酵母细胞，从而表达人溶菌酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菜豆凝集素信号肽编码序列如SEQ ID NO:4所示；或
所述的人溶菌酶成熟肽编码序列是经密码子优化的序列，如SEQ ID NO:5中第64-456位所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组表达盒中，从5’至3’依次包括：启动子序列，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:5中第64-456位所示的人溶菌酶成熟肽编码序列，翻译终止子序列，这些序列操作性相连。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组表达盒位于表达载体中，所述的表达载体是pPHIL-D2表达载体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(3)分离(纯化)所述的人溶菌酶。
7.一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；或如SEQ IDNO:5中第64-456位所示，所述的多核苷酸表达人溶菌酶。
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含一重组表达盒，该重组表达盒含有：菜豆凝集素的信号肽编码序列以及人溶菌酶成熟肽编码序列。
9.一种重组酵母细胞，其特征在于，所述的重组酵母细胞包含一重组表达盒，该重组表达盒含有：菜豆凝集素的信号肽编码序列以及人溶菌酶成熟肽编码序列。
10.权利要求8所述的重组表达载体或权利要求9所述的重组酵母细胞的用途，用于重组表达人溶菌酶。
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