CN104277989A

CN104277989A - 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用

Info

Publication number: CN104277989A
Application number: CN201410495185.8A
Authority: CN
Inventors: 虞龙; 吴奎; 李玉燕
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-09-25
Also published as: CN104277989B

Abstract

本发明公开了一株面包酵母及其在发酵生产辅酶I中的应用，该面包酵母由原始出发菌株sc-00经过低能氮离子束注入诱变后，通过初筛、摇瓶发酵复筛得到，其分类命名为面包酵母（Saccharomycescerevisiae）SC-Z180，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCM2014317。该菌株可以大幅提高发酵过程中辅酶I的组分，并减少其他组分，得到的菌株进行发酵复筛，该菌株可以大大提高发酵产率低的问题，在5L发酵罐中，辅酶I产量比原始出发菌提高了45.8%。

Description

一株面包酵母及其在发酵生产辅酶I中的应用

技术领域

本发明涉及一株面包酵母及其在发酵生产辅酶I中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

辅酶I(尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+) 是一种重要的生化试剂，常从面包酵母中提取。是生物体内许多还原酶的重要辅酶，用于生命体内代谢过程中乳酸、异柠檬酸、α一酮戊二酸、苹果酸、β一羟酯酰辅酶A等的脱氢反应，生物氧化过程中起递氢作用，活化各种酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，增加物质转运和调节控制，改善代谢功能。临床作为辅助治疗用于冠心病，可改善胸闷、心绞痛等症状。辅酶I本身并无催化作用，但参与氧化还原或酰基载体的作用，若失去这种辅助因子，脱氢酶将失去催化能力。许多代谢中间物上的两个氢原子经以NAD为辅酶的脱氢酶作用，使NAD还原为NADH ，再经过NADH脱氢酶作用，脱去氢。这是一条电子传递途径，NAD在呼吸链中的作用是接受由脱氢酶脱下的电子。

随着我国经济的不断发展、人民生活水平的显著提高，人们的饮食结构也发生了较大的变化，粮、薯、豆类在食品结构中的比例明显下降，而动物及油脂类的摄入量则明显增加，致使人们的身体素质日益下降。最近几年，各种老年性疾病像动脉硬化、心肌梗塞、高血脂、帕金森病等呈明显上升趋势。目前在我国，患帕金森病的比率比较高，大约1500人中就有6人患病。因此，对于能用于治疗缺血性心脏病、肝病、各种原因的代谢紊乱以及可以作为化疗辅助药物的复合辅酶制剂来说，其市场需求十分庞大。

由于众多疾病的起因大多是因为体内糖、脂肪和蛋白质代谢下降或不良引起，而辅酶I是参与体内乙酰化反应、氧化还原反应和能量代谢的关键辅酶，对体内糖、脂肪和蛋白质代谢起重要作用。如何强化上述糖、脂肪和蛋白质代谢已成为药物研发主攻方向之一。

现在国内外主要通过以下几种方法制备辅酶I，分别是提取法、发酵法、生物合成法、强化法、和有机合成法等。但是这些方法都没有进行大规模投产。国内中国科学院上海生化所曾用离子交换树脂从酵母中取NAD每吨鲜酵母(湿重)得70克左右，纯度为70 %，产率和纯度较低。国内一直沿袭此法生产再用酶法合成NADH。微生物发酵法是近年兴起的新的辅酶I生产方法，由于微生物细胞易于大规模培养生长，产品完全为天然的全反式构型，生物利用度高。而且相对于化学合成法安全、高效，产品中几乎无毒害化学物质残留，易于分离纯化，临床疗效较好，是最有开发前景的生产方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一株面包酵母及其在发酵生产辅酶I中的应用，该面包酵母通过简单、安全高效的诱变筛选方法获得，可大幅提高发酵产物中辅酶I的含量。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-Z180，已于 2014 年 7 月 3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO: M 2014317。

所述的面包酵母SC-Z180在发酵生产辅酶I中的应用。

所述的面包酵母在发酵生产辅酶I中的应用，包括如下步骤：

1）平板培养：将面包酵母SC-Z180接于平板培养基上培养，培养温度为28-34℃，培养时间1-2d；

2）斜面培养：将步骤1）中平板培养的面包酵母SC-Z180转接到斜面培养基上，培养时间18-20h，培养温度28-34℃；

3）种液培养：将步骤2）中斜面培养的面包酵母SC-Z180接到种子培养基中培养，培养时间8-11h，培养温度28-34℃，摇床转速为150-200r/min；

4）发酵培养：将步骤3）中的种液转接到发酵培养基中，接种量为2-10% (V/V)，培养时间为36-38 h，培养温度为28-34℃，摇床转速为160-220r/min。

步骤1）和2）中的平板和斜面培养基包含按质量百分比的如下成分：碳源2-3%、氮源2-4%、琼脂1.5-2%，余量为水；其中所述的碳源为葡萄糖或玉米淀粉中的一种或两种，所述氮源为蛋白胨或酵母膏的一种或两种。

步骤3）种子培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源5%、氮源 0.5-1%，无机盐0.1-0.2%，余量为水，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖或糖蜜中的至少一种；氮源为酵母膏或硫酸铵中的一种或两种；无机盐为硫酸镁或磷酸氢二铵中的至少一种。

步骤4）发酵培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源2-6%、氮源1-2%、无机盐0.2-0.5%、生长因子0.1-0.6%，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖或糖蜜中的至少一种；氮源为酵母膏或者硫酸铵中的至少一种，无机盐为磷酸氢二铵；生长因子为色氨酸或尼克酰胺的至少一种。

本发明所述的面包酵母SC-Z180的筛选方法是：面包酵母原始出发菌株sc-00经过低能氮离子束注入诱变后，通过初筛、摇瓶发酵复筛得到辅酶I产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株。重复上述步骤，最后得到目标菌株SC-Z180；具体诱变步骤如下：

a）单孢子悬浮液的制备：将面包酵母出发菌株孢子制成浓度为1×10⁶个/ml悬浮液；

b）氮离子注入诱变：取100μL步骤a）孢子悬浮液，均匀涂布到无菌空平板上，以无菌风吹干，在能量为18 Kev，注入剂量为170×10¹⁴ions/cm²，靶室真空度为1.5×10^-3Pa进行氮离子诱变，离子注入完毕后，在无菌环境下用1ml 无菌水进行洗脱；

c）诱变菌株的初筛：将步骤b）的洗脱液在无菌条件下均匀涂布到平板培养基上，在28-34℃下培养1-2d；

d）诱变菌株的复筛：将步骤c）筛选出的菌株接入斜面培养基上，在28-34℃下培养18h，然后斜面转入种子培养基中，在28-34℃下培养8-10h。取种子液按接种量2-10%（v/v）接入发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度28-34℃，摇床转速为160-220r/min，发酵36h后检测辅酶I的含量，挑选辅酶I含量最高的菌株作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤直至筛选出辅酶I产量高的面包酵母SC-Z180。

步骤c）和步骤d）中的平板培养基和斜面培养基为：碳源2-3%、氮源2-4%、琼脂1.5-2%，余量为水，pH自然，各组分按质量百分比。其中所述的碳源为葡萄糖或玉米淀粉中的一种或两种，所述氮源为蛋白胨或酵母膏的一种或两种。

步骤d）的种子培养基为：碳源5%、氮源 0.5-1%，无机盐0.1-0.2%，余量为水，pH=5.5，各组分按质量百分比，其中碳源为葡萄糖或糖蜜中的一种或混合物；氮源为酵母膏或硫酸铵中的一种或两种；无机盐为硫酸镁或磷酸氢二铵。

步骤d）的发酵培养基为：碳源2-6%、氮源1-2%、无机盐0.2-0.5%、生长因子0.1-0.6%，余量为水，pH=5.5，各组分按质量百分比，其中碳源为葡萄糖或糖蜜中的一种或两种；氮源为酵母膏、硫酸铵中的一种或两种，无机盐为磷酸氢二铵；生长因子为色氨酸或尼克酰胺的一种或两种。

本发明面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-Z180的形态学及生理化学特性：

菌落颜色：乳白色

需氧方式：兼性厌氧

菌落大小：1-4μm

生长温度：28-32℃

最适pH ：5.4-6.5

菌落形态：卵圆形

生殖方式：芽殖

革兰氏染色：革兰氏阳性

有益效果：本发明提供一株面包酵母菌株，该菌株产辅酶I能力很强，本发明采用了低能N⁺注入诱变技术，最终筛选得到一株辅酶I高产菌朱面包酵母SC-Z180，该菌株可以大幅提高发酵过程中辅酶I的组分，并减少其他组分，得到的菌株进行发酵复筛，该菌株可以大大提高发酵产率低的问题，在5L发酵罐中，辅酶I产量比原始出发菌提高了45.8%。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明做进一步描述，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1 本实施例说明将面包酵母出发菌株进行诱变筛选目的菌株的方法。

以实验室保藏的面包酵母SC-00为出发菌株进行诱变处理，具体步骤如下：

a）单孢子悬浮液的制备：取已培养好的面包酵母斜面菌种一支，加入10ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2~3次，最终使滤液体积达到10ml，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度为1×10⁶个/ml；

c)诱变株的筛选：将步骤b）的洗脱液在无菌条件下均匀涂布到平板培养基上，在28-34℃下培养1-2d；

步骤c）中所用的平板培养基为：葡萄糖2%、胰蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%，其余为水。

步骤d）中所用的种子培养基为：葡萄糖5%、酵母膏0.5%、硫酸铵1%、磷酸氢二铵0.1% ，pH5.5，其中葡萄糖需要分消(分消的意思是分开灭菌)。

步骤d）中所用的发酵培养基为：葡萄糖4%、酵母膏0.1%、、硫酸铵1%、磷酸氢二铵0.5%，色氨酸0.2%， PH5.5，其中葡萄糖需要分消。

步骤d）中所用的斜面培养基为：葡萄糖2%、胰蛋白胨2%、琼脂2%、酵母膏2%，其余为水。

实施例2

本实施例说明诱变株面包酵母SC-Z180的生物学形态及遗传稳定性

本发明面包酵母SC-Z180的形态学及生理化学特性：

菌落颜色：乳白色

需氧方式：兼性厌氧；

菌落大小：1-4μm；

生长温度：28-32℃；

最适PH ：5.4-6.5；

菌落形态：卵圆形；

生殖方式：芽殖；

革兰氏染色：革兰氏阳性。

传代发酵试验结果如表1所示。

表1面包酵母SC-Z180的遗传稳定性

传代次数	辅酶I产量（g/L）
		1	4.36
2	4.45
		3	4.20
4	4.31
		5	4.49
6	3.89

从遗传稳定性实验结果分析可知，经过6次传代试验，突变株面包酵母SC-Z180发酵产辅酶I基本稳定，具有很好的遗传稳定性，可以作为进一步研究和开发产业化菌株。

实施例3

本实例说明辅酶I高产菌菌株面包酵母SC-Z180发酵生产辅酶I的生产工艺

本实施例中所述培养基配方如下：

平板培养基(g/L)：葡萄糖20、鱼粉蛋白胨20、琼脂20、酵母膏20，其余为水，pH自然。

斜面培养基(g/L)：葡萄糖20、鱼粉蛋白胨20、琼脂20、酵母膏20，其余为水，pH自然。

种子培养基(g/L)：葡萄糖45、酵母膏8、硫酸镁0.1、硫酸铵2、磷酸氢二铵1、用1mol/L盐酸调pH为5.5，其中葡萄糖分消。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖50、酵母膏10、硫酸镁0.1、硫酸铵2、磷酸氢二铵1、色氨酸3，用1mol/L盐酸调pH为5.5，其余为水，其中葡萄糖分消。

将酿酒酵母SC-Z180接种到平板培养基，培养温度30℃，培养36h后转入斜面培养基，在30℃下培养18h，然后斜面转入种子培养基中，在30℃下培养9 h。取种子液按10%（v/v）接种量接入发酵培养基中，摇瓶装液量20%，摇床转速为200r/min，发酵温度30℃，发酵36h，测定发酵液中辅酶I的含量达到4.82g/L，比原始出发菌株提高了40.1%。

实施例4

本实施例中所述培养基配方如下：

发酵培养基(g/L)：糖蜜47、酵母膏10、硫酸镁0.1、硫酸铵2、磷酸氢二铵1、色氨酸3，用1mol/L盐酸调pH为5.5，其余为水，其中葡萄糖分消。

将酿酒酵母SC-Z180接种到平板培养基，培养温度30℃，培养36h后转入斜面培养基，在30℃下培养18h，然后斜面转入种子培养基中，在30℃下培养9 h。取种子液按10%（v/v）接种量接入发酵培养基中，摇瓶装液量20%，摇床转速为200r/min，发酵温度30℃，发酵36h，测定发酵液中辅酶I的含量达到4.73g/L比原始出发菌株提高了37.5%。

实施例5

本实例说明面包酵母SC-Z180在5L发酵罐中发酵产辅酶I

本实施例中所述培养基配方如下：

发酵培养基(g/L)：葡萄糖50、酵母膏10、硫酸镁0.1、硫酸铵2、磷酸氢二铵1、色氨酸3，其余为水，pH 5.5。

将酿酒酵母SC-Z180接种到平板培养基，培养温度30℃，培养36h后转入斜面培养基，在30℃下培养18h，然后斜面转入种子培养基中，在30℃下培养9 h。取种子液按10%（v/v）接种量接入5L发酵罐中，发酵罐搅拌速度为200r/min，发酵温度30℃，发酵36h后测定发酵液中辅酶I的含量达到5.06g/L。

实施例6本实例说明酵母中辅酶I含量的检测方法。

仪器设备：高效液相色谱仪、离心机、超声清洗器、微孔滤膜等

试剂：色谱甲醇、纯净水、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾

检测条件：流动相：0.5mol的磷酸缓冲溶液pH6.5与甲醇10%水溶液混合，用TBAH调pH为 6.5；流速0.8ml/min，检测波长254nm，进样20μL，温度10℃。

具体操作步骤：

制备标准品：准确称取辅酶I标准品10mg，用纯净水于50mL容量瓶中摇匀定容，取10 mL标准品溶液，在4℃，10000 rpm下离心5 min，移去上清液，加入0.3mol/L HCl 3mL，于55℃水浴10 min，然后迅速放在冰中冷却至0℃，接着缓慢滴加0.3 mol/L NaOH进行中和，在4℃，10000 rpm下离心15 min，取上清液保存备用。

制备样品：取10 mL发酵液，在4℃，10000 rpm下离心5 min，移去上清液，加入0.3mol/L HCl 3mL，于55℃水浴10 min，然后迅速放在冰中冷却至0℃，接着缓慢滴加0.3 mol/L NaOH进行中和，在4℃，10000 rpm下离心15 min，取上清液至另一试管中待测辅酶I含量。

含量计算方法：

辅酶I含量（g/L）=（样品峰面积/标准品峰面积）×标准品浓度。

Claims

1.一株面包酵母，其分类命名为面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-Z180，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2014317。

2.权利要求1所述的面包酵母在发酵生产辅酶I中的应用。

3.根据权利要求2所述的面包酵母在发酵生产辅酶I中的应用，其特征在于包括如下步骤：

4）发酵培养：将步骤3）中的种液转接到发酵培养基中，接种量为2-10%(V/V)，培养时间为36-38h，培养温度为28-34℃，摇床转速为160-220r/min。

4.根据权利要求3所述的面包酵母在发酵生产辅酶I中的应用，其特征在于：步骤1）和2）中的平板和斜面培养基包含按质量百分比的如下成分：碳源2-3%、氮源2-4%、琼脂1.5-2%，余量为水；其中所述的碳源为葡萄糖或玉米淀粉中的一种或两种，所述氮源为蛋白胨或酵母膏中的一种或两种。

5.根据权利要求3所述的面包酵母在发酵生产辅酶I中的应用，其特征在于：步骤3）种子培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源5%、氮源 0.5-1%，无机盐0.1-0.2%，余量为水，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖或糖蜜中的至少一种；氮源为酵母膏或硫酸铵中的一种或两种；无机盐为硫酸镁或磷酸氢二铵中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的面包酵母在发酵生产辅酶I中的应用，其特征在于：步骤4）发酵培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源2-6%、氮源1-2%、无机盐0.2-0.5%、生长因子0.1-0.6%，pH=5.5，其中碳源为葡萄糖或糖蜜中的至少一种；氮源为酵母膏或者硫酸铵中的至少一种，无机盐为磷酸氢二铵；生长因子为色氨酸或尼克酰胺的至少一种。