CN104254604B - 对氨苄西林具有抗性的质地化乳酸菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乳酸菌的突变体,所述突变体对抗生素氨苄西林(ampicillin)具有抗性并且被发现当在乳中生长时产生增加的质地,同时维持亲本菌株的其它生长性质。此外,本发明涉及包含所述突变体的组合物,并且涉及利用所述对氨苄西林具有抗性的乳酸菌发酵的乳制品。
Description
技术领域
本发明涉及例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等乳酸菌的突变体,所述突变体对抗生素氨苄西林(ampicillin)具有抗性,并且被发现当在乳中生长时产生增加的质地,同时维持亲本菌株的其它生长性质。此外,本发明涉及包含所述突变体的培养物,例如起子培养物,并且涉及利用所述培养物发酵的乳制品。
背景技术
食品工业使用多种细菌、尤其是乳酸菌以改进食品的味道和质地,而且延长这些食品的贮存期。在乳业的情况下,广泛使用乳酸菌以引起乳的酸化(通过发酵),而且对并入它们的产品进行质地化。
在食品工业中使用的乳酸菌中,可以提到链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、小球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。嗜热链球菌种的乳酸菌广泛地单独或与例如德氏乳杆菌保加利亚亚种等其它细菌组合用于生产食品、尤其是发酵产品。它们尤其用于配制用以生产发酵乳、例如酸乳的发酵物。它们中的某些在改善发酵产品的质地方面具有显著作用。这一特性与多糖的生产密切相关。
酸乳的现行趋势是实现淡味和高质地。现在,这是通过使用产生淡味的培养物并且添加增稠剂或蛋白质以产生所需稠度实现的。酸乳生产者想要能够在不添加增稠剂的情况下制造具有这些性质的酸乳。这将帮助他们降低成本并得到更清洁的标记。一种实现这一目的的非常有吸引力的方式是具有产生高水平质地的起子培养物。
为了满足工业要求,必需提供乳酸菌、尤其是德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的新颖质地化菌株,用于对食品进行质地化。尤其需要可与嗜热链球菌的新颖质地化菌株一起使用的德氏乳杆菌保加利亚亚种的新颖质地化菌株。
本发明的发明人先前已研发出用于鉴定例如德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌等改进的乳酸菌的新颖选择方法,所述改进的乳酸菌在用于对用于发酵乳产品的乳基质进行发酵时产生高质地。
国际(PCT)专利申请号WO 2012/052557中所描述的方法涉及,本发明人已鉴定出乳酸菌对D-环丝氨酸和功能等效抗生素的抗性与改进的质地化性质之间令人惊讶的相关联系。
D-环丝氨酸(D-4-氨基-异唑烷酮(D-4-amino-isoxasolidone))是抑制丙氨酸外消旋酶、D-丙氨酰基-D-丙氨酸连接酶、D-丙氨酰基-丙氨酸合酶和D-丙氨酸通透酶从而引起细胞溶解的抗生素。D-丙氨酸外消旋酶对于D-丙氨酸的产生至关重要,所述D-丙氨酸是细胞壁的肽聚糖层的组成部分。
氨苄西林是β-内酰胺类抗生素中的一种抗生素并且可有效抵抗许多革兰氏阳性(gram-positive)细菌,包括多数乳酸菌。氨苄西林是DD-转肽酶型酶(EC 3.4.16.4)的竞争性抑制剂。氨苄西林对DD-转肽酶的抑制阻止形成为形成细菌细胞壁所需的肽键并且最终导致细胞溶解。
虽然已经描述了许多不同细菌的对氨苄西林具有抗性的突变体,但就本发明人所知,现有技术中并没有描述或提出本文中关于对氨苄西林的抗性与改进的质地化性质之间的任何相关联系。
发明内容
本发明的发明人已惊讶地发现了一组对氨苄西林具有抗性的乳酸菌突变体在用于对乳进行发酵时,生成高的剪切应力和/或凝胶硬度。
本发明人已研发了用于获得对抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性的所述质地化乳酸菌菌株的方法。
本文所述的用于获得乳酸菌菌株的方法包括以下两个步骤:
首先筛选和选择对氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株,可将其称作显著高于通常存在于天然/野生型乳酸菌中的对氨苄西林的抗性;和
从步骤(i)中鉴定的对氨苄西林具有抗性的菌株池来筛选和选择具有改进的质地化性质的乳酸菌菌株。
如本文中的实施例2中所示的,本发明人发现,从对氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株池筛选/选择具有改进的质地化性质的乳酸菌菌株是相对快速的。其原因基本上是本发明人已鉴定了非常高百分比的对氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株(在步骤(i)中选择的)也具有改进的质地化性质。
因此,所述首先筛选和选择对氨苄西林的抗性可被看作能够快速且有效地筛选和选择具有改进的质地化性质的乳酸菌菌株的一种预先步骤。
对于本领域技术人员来说显而易见的是,本文所述的筛选和选择方法的显著优点是能够相对快速且有效地筛选和选择具有改进的质地化性质的乳酸菌菌株。
例如,如果已经有了在用于制备发酵乳产品时具有关于例如低后酸化的商业相关性质的乳酸菌菌株,那么可以使用这一菌株作为用于诱变的起始细胞,然后相对快速地选择并获得具有改进的质地化性质、同时仍维持关于例如低后酸化的良好性质的新颖乳酸菌菌株。
如本文中的实施例2中所示的,约25%的首先选择的对氨苄西林具有抗性的菌株还产生显著更高的质地,如通过至少50秒的28ml酸化乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间所确定的。
认为不使用如本文所述的新颖的筛选和选择方法,将不可能(或将耗用非常长的时间)鉴定产生这样长的流出时间的乳酸菌菌株。
不受限于理论,本文令人惊讶地鉴定的氨苄西林抗性与改进的质地化性质间的联系的理论解释可能是所述对氨苄西林具有抗性的乳酸细胞产生更多的所谓的细胞外多糖(EPS)。那么其在理论上可能是所述EPS可在细胞周围产生一种保护,即,这些EPS保护细胞使氨苄西林不进入细胞中并且由此产生增加的氨苄西林抗性。不受限于理论,其还可能是EPS的产生增加使利用对氨苄西林具有抗性的乳酸菌发酵的乳的质地增加。
如上文所讨论的,针对对氨苄西林具有抗性(即,抗显著高于被天然/野生型乳酸菌耐受的氨苄西林浓度的氨苄西林浓度)来首先选择本文所鉴定的乳酸菌菌株。
根据上文令人惊讶的发现,本发明涉及对氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性的质地化乳酸菌菌株(例如德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌菌株)和用于获得所述菌株的方法。此外,本发明涉及包含突变体的培养物,例如起子培养物,并且涉及利用所述培养物发酵的乳制品,例如发酵乳产品。
具体实施方式
定义
如本文中所使用的,术语“乳酸菌”指发酵糖同时产生酸(包括乳酸作为主要产生的酸、乙酸和丙酸)的革兰氏阳性微需氧或厌氧菌。工业上最有用的乳酸菌发现于“乳杆菌目(Lactobacillales)”,所述乳杆菌目包括乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串球菌属(Leuconostocspp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)。另外,属于严格厌氧菌双歧杆菌的组(即双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.))的产乳酸菌一般包括在乳酸菌的组中。这些经常单独或与其它乳酸菌组合用作食物培养物。包括乳杆菌种和嗜热链球菌种的细菌在内的乳酸菌通常以冷冻或冻干培养物的形式供应给乳品业,以用于批量起子繁殖(bulk starter propagation),或以打算直接接种到发酵器皿或桶中的所谓的“直投式”(Direct Vat Set;DVS)培养物的形式供应给乳品业,以用于产生乳制品,例如发酵乳产品。所述培养物一般称作“起子培养物”或“起子”。
术语“乳”应理解为通过给任何哺乳动物(例如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)挤奶而获得的乳分泌物。在优选实施方案中,乳是牛乳。术语乳还包括由植物材料制得的蛋白质/脂肪溶液,例如豆乳。
术语“乳基质”可为可根据本发明方法经受发酵的任何生乳材料和/或加工乳材料。因此,有用的乳基质包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳状产品的溶液/悬浮液,所述乳或乳状产品是例如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉(reconstituted milkpowder)、炼乳(condensed milk)、乳粉(dried milk)、乳清、乳清渗透物、乳糖、由乳糖结晶获得的母液、乳清蛋白浓缩物或乳脂。显然,乳基质可来源于任何哺乳动物,例如是基本上纯的哺乳动物乳或复原乳粉。
优选地,乳基质中的至少部分蛋白质是天然存在于乳中的蛋白质,例如酷蛋白或乳清蛋白。然而,部分蛋白质可为非天然存在于乳中的蛋白质。
在发酵之前,乳基质可根据本领域中已知的方法进行均质化和巴氏灭菌(pasteurized)。
本文所用的“均质化”意指充分混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果均质化在发酵之前进行,那么其目的是将乳脂破碎成较小尺寸以使其不再与乳分离。这可通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。
本文所用的“巴氏灭菌”意指处理乳基质以减少或消除诸如微生物等活生物体的存在。优选地,巴氏灭菌是通过维持在指定温度指定时段获得的。指定温度通常通过加热获得。可选择温度和持续时间以杀死或灭活某些细菌,例如有害细菌。随后可进行快速冷却步骤。
本发明方法中的“发酵”意指通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。优选地,本发明方法中的发酵包括将乳糖转化为乳酸。
将用于产生发酵乳产品的发酵工艺是众所周知的,并且本领域技术人员将了解如何选择适宜的工艺条件,例如温度、氧、微生物的量和特性以及处理时间。显然,应对发酵条件进行选择以支持本发明的实现,即,获得固体形式或液体形式的乳制品(发酵乳产品)。
在本上下文中,酸乳起子培养物是包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株的细菌培养物。据此,“酸乳”是指可通过对乳接种包含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和嗜热链球菌菌株的组合物并进行发酵而获得的发酵乳产品。
“质地”或“口感”意指产品在口中的物理和化学相互作用。
用于确定乳的质地的方法包括测量发酵乳的剪切应力(粘度)、凝胶硬度和胶粘性,其容易获得且为本领域内已知并且例示于本文中。
在本上下文中,术语“剪切应力”、“凝胶硬度”和“胶粘性”决定粘度。
粘度(单位是Pa s)定义为剪切应力(Pa)/剪切速率(1/s)。
剪切应力值在本文中报告为剪切速率=3001/s下的标准。感官实验已显示(数据未显示),当使用在剪切速率3001/s下测量的粘度时,发现流变学测量与感官粘度/口稠度(mouth thickness)之间的最好相关性。
术语“凝胶硬度”或“凝胶坚度”是发酵乳产品在经受压力时其结构保持时长的量度并且以1HZ(Pa)测量。
本文所用的术语“胶粘性”是指发酵乳产品中形成线和丝和发酵乳产品的粘结性(cohesiveness)。胶粘性是如Int.Dairy J.16(2);111-118(Folkenberg等人2006)中所述定义和测量的。
术语“对氨苄西林具有抗性”在本文中意指在培养基中存在该抗生素时,不被杀死、或相比于得到突变菌株的相应非突变菌株显著更缓慢地被杀死的特定突变菌株。取决于培养基中抗生素化合物的浓度,抗性也可反映为突变菌株和非突变菌株的改变的生长性质。例如,培养基中低浓度的抗生素将防止或显著地减缓非突变菌株的生长,而突变菌株的生长不受影响。可用作评估抗性的敏感参考菌株的非突变菌株优选包括菌株CHCC13995。
对抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株在本文中定义为以下乳酸菌菌株,其中将在适于乳酸菌菌株生长的培养基(例如用于德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的MRS培养基和用于嗜热链球菌的含有2%(w/v)乳糖的M17)中在37℃生长20小时后的OD600测量的生长相比于在不含抗生素氨苄西林的所述培养基中的OD600测量的生长降低20%的抗生素氨苄西林的量高于400ng/ml。
对氨苄西林具有抗性的突变体乳酸菌菌株在本文中进一步定义为:突变体乳酸菌菌株在E-测试中读取的最小抑制浓度(MIC)值比得到突变体菌株的亲本菌株高至少1个增量。
在本上下文中,术语“突变体”应当理解为借助例如遗传改造、辐射和/或化学处理从本发明菌株(或亲本菌株)得到的菌株或可从本发明菌株(或亲本菌株)得到的菌株。突变体还可为自发地发生的突变体。优选地,突变体为功能上等效的突变体,例如与亲本菌株具有基本上相同或改进的性质(例如关于粘度、凝胶硬度和胶粘性)的突变体。所述突变体是本发明的一部分。尤其地,术语“突变体”是指通过使本发明菌株经受任何常用的诱变处理(包括用诸如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理)而获得的菌株,或自发地发生的突变体。突变体可能已经受若干诱变处理(单次处理应理解为一个诱变步骤、之后是筛选/选择步骤),但目前优选地,实施不超过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中,相比于亲本菌株,细菌基因组中小于1%、小于0.1%、小于0.01%、小于0.001%或甚至小于0.0001%的核苷酸已被另一核苷酸替代、或缺失。
在本上下文中,术语“变体”应当理解为在功能上等效于本发明菌株的菌株,例如具有基本上相同或改进的性质(例如关于粘度、凝胶硬度和胶粘性)的菌株。可使用适当的筛选技术鉴定的所述变体是本发明的一部分。
除非本文另外指明或者上下文明显矛盾,否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)所用术语“a”和“an”和“所述”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非另有说明,否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(即,意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明,否则本文叙述的值的范围仅仅打算作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法,并且每一单独值都被并入本说明书中,就如同其在本文中被个别地叙述一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾,否则,本文所描述的所有方法都可按任何适宜的顺序进行。除非另外要求,否则,使用本文所提供的任何和所有示例或示例性用语(例如,“诸如”)仅仅打算用于更好地阐明本发明,而并不对本发明范围构成限制。本说明书中的任何用语都不应当理解为表明是任何非实施本发明必不可少的要求要素。
本发明的实施方式和方面
如本文所讨论的,发现高百分比的对抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌相比于商业相关质地化菌株当在乳中生长时,产生增加的质地。
本领域技术人员将认识到与氨苄西林具有相同作用模式或相同靶标的其它抗生素可单独或与氨苄西林组合用于分离本文所述类型的突变体。因此,本发明还涵盖所述其它功能上等效的抗生素(例如其它DD-转肽酶抑制剂)的用途。所述抗生素包括但不限于阿莫西林(amoxicillin)、青霉素G(penicillin G)、普鲁卡因青霉素(procainepenicillin)、苄星青霉素(benzathine penicillin)和青霉素V。
在第一方面,本发明涉及特征在于以下的乳酸菌菌株:
(i)所述乳酸菌菌株对抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性,其被定义为将在适于所述乳酸菌菌株生长的培养基中在37℃生长20小时后的OD600测量的生长相比于在不含所述抗生素的所述培养基中的OD600测量的生长降低20%的所述抗生素的量高于400ng/ml;并且
(ii)接种至少104个CFU/ml的所述乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是至少50秒。
优选地,步骤(i)的抗生素是氨苄西林。
用于确定点(i)的将OD600测量的生长降低20%的抗生素的量的测定与用于确定点(ii)的28ml酸化乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间的测定两者都是基于已知的商购标准元件。
本领域技术人员将知道适于乳酸菌菌株生长的标准培养基,包括适于德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株生长的MRS培养基和适于嗜热链球菌菌株生长的含有2%(w/v)乳糖的M17培养基,如本文所例示的。
因此,基于本文对于测定的详细描述(参见例如实施例2),本领域技术人员能够常规地重复这些测定以客观地确定特定目标乳酸菌菌株是否符合对氨苄西林和/或抑制DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性(点(i))和是否符合具有改进的质地化性质(点(ii))。
在优选实施方案中,乳酸菌菌株选自由德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的组。在更优选的实施方案中,乳酸菌菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
在优选实施方案中,点(i)的将OD600测量的生长降低20%的抗生素的量高于500ng/ml,例如高于600ng/ml,例如高于700ng/ml。
在其它优选实施方案中,点(ii)的流出时间是至少60秒,例如至少70秒,例如至少80秒,例如至少90秒,例如至少100秒,例如至少110秒。
在第二方面,本发明涉及特征在于以下的乳酸菌菌株:
(i)所述乳酸菌菌株对抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性,其被定义为突变体乳酸菌菌株在E-测试中的最小抑制浓度(MIC)比得到所述乳酸菌菌株的亲本菌株的MIC高至少1个增量;并且
(ii)接种至少104个CFU/ml的突变体乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是接种至少104个CFU/ml的亲本菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间的至少两倍。
优选地,步骤(i)的抗生素是氨苄西林。
点(i)的E-测试与用于确定点(ii)的28ml酸化乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间的测定两者都是基于已知的商购标准元件。
因此,基于本文对于测定的详细描述(参见例如实施例1和实施例2),本领域技术人员能够常规地重复这些测定以客观地确定特定目标乳酸菌菌株是否符合对氨苄西林和/或抑制DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性(点(i))和是否符合具有改进的质地化性质(点(ii))。
在优选实施方案中,乳酸菌菌株选自由德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的组。在更优选的实施方案中,乳酸菌菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
在优选实施方案中,点(i)的突变体乳酸菌菌株在E-测试中的MIC比亲本菌株的MIC高至少2个增量,例如至少3个增量,例如至少4个增量,例如至少5个增量。
在其它优选实施方案中,点(ii)的流出时间是至少50秒,例如至少60秒,例如至少70秒,例如至少80秒,例如至少90秒,例如至少100秒,例如至少110秒。
本发明的第三方面涉及选自由以保藏号DSM 25852保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC15466和由其得到的突变体和变体组成的组的乳酸菌菌株。
本领域技术人员很清楚,通过使用保藏的菌株作为起始材料,本领域技术人员可通过常规诱变或再分离技术常规地获得其保留本文所述的相关特征和优点的另外的突变体或衍生物。因此,术语“由其得到的突变体”涉及通过使用保藏的菌株作为起始材料获得的突变体菌株并且其中所述突变体保留了保藏的菌株的基本性质,其中所述基本性质是接种至少104个CFU/ml的乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是至少50秒。
本发明的第四方面涉及包含104到1014个CFU/g的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的乳酸菌菌株的组合物。
在优选实施方案中,所述组合物包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。优选地,所述组合物包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株。
在另一优选实施方案中,所述组合物可用作起子培养物。
在再一优选实施方案中,所述组合物呈冷冻形式或冻干形式或液体形式。
根据本发明的乳酸菌菌株(其对氨苄西林和/或抑制DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性且具有改进的质地化性质)可优选用于制备发酵乳产品。.剂量和施用可根据现有技术进行。
此外,本文中所有用于制备发酵乳产品的其它相关步骤均可根据现有技术进行。所述所有用于制备发酵乳产品的其它相关步骤均为本领域技术人员所熟知的常规步骤。
因此,本发明的第五方面涉及用于制备发酵乳产品的方法,其包括利用根据本发明的第一方面、第二方面或第三方面的乳酸菌菌株或根据本发明的第四方面的组合物对乳基质进行发酵。
第六方面涉及可通过根据本发明的第四方面的方法获得的发酵乳产品。
第七方面涉及包含根据本发明的第一方面、第二方面或第三方面的乳酸菌菌株或根据本发明的第四方面的组合物的发酵乳产品。
本发明的第八方面涉及根据本发明的第一方面、第二方面或第三方面的乳酸菌菌株或根据本发明的第四方面的组合物用于制备乳制品的用途。
在优选实施方案中,乳制品是发酵乳产品。优选地,发酵乳产品是酸乳。
本发明的第九方面涉及用于获得乳酸菌菌株的方法,所述方法包括:
a)从乳酸菌菌株池中选择和分离对抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性的乳酸菌菌株池,其被定义为将在适于乳酸菌菌株生长的培养基中在37℃生长20小时后的OD600测量的生长相比于在不含所述抗生素的所述培养基中的生长降低20%的所述抗生素的量高于400ng/ml;并且
b)从步骤a)的对氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶具有抗性的另一抗生素的乳酸菌菌株池中选择和分离以下乳酸菌菌株,其中接种至少104个CFU/ml的乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是至少50秒。
优选地,所述方法包括:
a)从乳酸菌菌株池中选择和分离对抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株池,其被定义为将在适于乳酸菌菌株生长的培养基中在37℃生长20小时后的OD600测量的生长相比于在不含氨苄西林的所述培养基中的生长降低20%的氨苄西林的量高于400ng/ml;并且
b)从步骤a)的对抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株池中选择和分离以下乳酸菌菌株,其中接种至少104个CFU/ml的乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是至少50秒。
在优选实施方案中,乳酸菌菌株选自由德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的组。在更优选的实施方案中,乳酸菌菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
在优选实施方案中,点(i)的将OD600测量的生长降低20%的抗生素的量高于500ng/ml,例如高于600ng/ml,例如高于700ng/ml。
在其它优选实施方案中,点(ii)的流出时间是至少60秒,例如至少70秒,例如至少80秒,例如至少90秒,例如至少100秒,例如至少110秒。
第十方面涉及用于获得乳酸菌菌株的方法,所述方法包括:
a)提供乳酸菌亲本菌株;
b)选择和分离对抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶的另一抗生素具有抗性的突变体乳酸菌菌株池,其被定义为突变体乳酸菌菌株在E-测试中的最小抑制浓度(MIC)比得到突变体乳酸菌菌株的亲本菌株的MIC高至少1个增量;并且
c)从步骤b)的对氨苄西林和/或抑制酶DD-转肽酶具有抗性的另一抗生素的突变体乳酸菌菌株池中选择和分离以下突变体乳酸菌菌株,其中接种至少104个CFU/ml的突变体乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是接种至少104个CFU/ml的亲本菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间的至少两倍。
优选地,所述方法包括:
a)提供乳酸菌亲本菌株;
b)选择和分离对抗生素氨苄西林具有抗性的突变体乳酸菌菌株池,其被定义为突变体乳酸菌菌株在E-测试中的最小抑制浓度(MIC)比得到突变体乳酸菌菌株的亲本菌株的MIC高至少1个增量;并且
c)从步骤b)的对氨苄西林具有抗性的突变体乳酸菌菌株池中选择和分离以下突变体乳酸菌菌株,其中接种至少104个CFU/ml的突变体乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是接种至少104个CFU/ml的亲本菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间的至少两倍。
在优选实施方案中,乳酸菌亲本菌株选自由德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的组。在更优选的实施方案中,乳酸菌菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
在本发明的甚至更优选的实施方案中,亲本菌株是以保藏号DSM24021保藏于德国微生物菌种保藏中心的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC13995。
在优选实施方案中,点(i)的突变体乳酸菌菌株在E-测试中的MIC比亲本菌株的MIC高至少2个增量,例如至少3个增量,例如至少4个增量,例如至少5个增量。
在其它优选实施方案中,接种至少104个CFU/ml的突变体乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂乳从25ml聚苯乙烯移液管的点(ii)的流出时间是至少50秒,例如至少60秒,例如至少70秒,例如至少80秒,例如至少90秒,例如至少100秒,例如至少110秒。
在第十一方面中,本发明涉及可通过根据本发明的第八方面或第九方面的方法获得的乳酸菌菌株。
本发明进一步通过以下非限制性实施例来说明。
实施例
材料:
培养基:对于嗜热链球菌来说,合适培养基包括具有以下组成的已知的M17琼脂培养基:
琼脂,12.75g/L
抗坏血酸,0.5g/L
酪蛋白胨(胰蛋白酶),2.5g/L
β-甘油磷酸二钠五水合物,19g/L
硫酸镁水合物,0.25g/L
肉膏(meat extract),5g/L
肉蛋白胨(meat peptone)(胃蛋白酶),2.5g/L
大豆蛋白胨(木瓜蛋白酶),5g/L
酵母提取物,2.5g/L
和具有这一组成的M17肉汤培养基:
抗坏血酸,0.5g/L
乳糖,5g/L
硫酸镁,0.25g/L
肉膏,5g/L
肉蛋白胨(胃蛋白酶),2.5g/L
甘油磷酸钠,19g/L
大豆蛋白胨(木瓜蛋白酶),5g/L
胰蛋白胨,2.5g/L
酵母提取物,2.5g/L
最终pH7.0±0.2(25℃)
这些培养基通常在添加20g/l的乳糖(2%w/v)后使用。
对于德氏乳杆菌保加利亚亚种来说,合适培养基包括已知的MRS培养基。
MRS琼脂培养基具有以下组成:
并且MRS肉汤培养基具有这一组成:
如本领域技术人员已知的,M17培养基是被认为适于嗜热链球菌生长的培养基,并且MRS培养基是被认为适于德氏乳杆菌保加利亚亚种生长的培养基。
在本上下文中并且如本领域技术人员所理解的,特定M17和MRS培养基浓缩物可由不同的供应商供应,并且独立于特定的供应商,将(在标准的测量不确定度内)得到与本文相关的目标菌株的相关氨苄西林抗性的本文所述的相同结果。
实施例1:氨苄西林抗性选择测定
所述方法是使用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株说明的。为了利用嗜热链球菌实施氨苄西林抗性选择测定,应当使用添加有2%w/v乳糖的M17培养基代替MRS培养基。
将目标德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株接种到10ml MRS肉汤培养基中并且在厌氧条件下在37℃生长至少20小时。将棉签浸入培养物中并且用于在MRS琼脂板(直径为90mm)的整个表面上划线。将用于抗微生物敏感性测试(Antimicrobial SusceptibilityTesting)的氨苄西林E-测试条(0.016-256μg/ml)(Biomerieux,目录编号为501558)置于琼脂的顶部上,并且将所述板在厌氧条件下在37℃培育不超过24小时。氨苄西林的最小抑制浓度(MIC)是将抑制平铺的菌株的可见生长的最低浓度并且在椭圆抑制区与E-测试条相交的点处读取。
如本文所讨论的具有增加的对氨苄西林的抗性的德氏乳杆菌保加利亚亚种细胞在本文中被定义为以下德氏乳杆菌保加利亚亚种细胞,其中读取的MIC值比亲本菌株的高至少1个增量,如E-条上所示的。
能够符合这一增加的对氨苄西林的抗性准则的细胞在本文中被定义为在本实施例1的氨苄西林抗性测定中对氨苄西林具有抗性的细胞。
结论:
基于本实施例1的氨苄西林抗性选择测定–对于特定目标菌株(例如来自相关商业产品的菌株)–本领域技术人员可常规地测试这一特定目标菌株是否具有本文中的相关氨苄西林抗性。
实施例2:使用氨苄西林来分离具有改进的流变学性质的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变体
菌株:
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC13995
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC15466(CHCC13995的对氨苄西林具有抗性的突变体)
突变体分离:
为了分离德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC13995的对氨苄西林具有抗性的突变体,将由单菌落生长得到的细胞厌氧地接种到含有以下量中的一个的氨苄西林的10ml MRS肉汤中:0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml或700ng/ml,并且在37℃生长至少20小时。
生长20小时后,测量所有样品的OD600。
通常,相比于在不含氨苄西林(即,具有0ng/ml氨苄西林)的MRS培养基中的生长,将德氏乳杆菌保加利亚亚种的OD600测量的厌氧生长降低至少20%的氨苄西林的浓度高于300ng/ml。对氨苄西林的浓度为500ng/ml的培养物进行稀释,并且将其平铺于未添加氨苄西林的MRS琼脂板上且然后在37℃厌氧地培育至少20小时。然后挑取菌落并且针对其在存在500ng/ml氨苄西林的微量滴定板中在37℃的厌氧生长进行筛选。通常,25%的所得菌落被鉴定为氨苄西林存在下的快速生长者。选择这些用于进一步研究。将所选对氨苄西林具有抗性的突变体进一步纯化并且测试其在乳中生长的能力。在这一研究期间,观察到一些突变体在这些条件下产生显著多于亲本菌株的质地。
粘度筛选:
对于每个样品来说,将添加有2%(w/v)脱脂乳粉的全脂牛乳以至少104个细胞/ml乳的量接种对氨苄西林具有抗性的突变体,并在37℃酸化20小时。
在移液测试前,通过搅拌将酸化乳轻轻地均质化,然后将其加载到25ml聚苯乙烯移液管中的顶部(28ml),并且对于每个样品来说,将从移液管的流出时间测量3次。表1列出了对于由21个对氨苄西林具有抗性的突变体在37℃发酵20小时的乳的移液管粘度测试的结果。结果显示这些突变体中的多数比亲本菌株产生更高的粘度。21个对氨苄西林具有抗性的突变体中的6个得到的流出时间是亲本菌株的两倍,并且约25%的对氨苄西林具有抗性的突变体得到至少50秒的流出时间。
尤其地,突变体18(amp mut 18)具有高流出时间。将这一突变体衍生物指定为CHCC15466并且用于实施例3中所述的流变学测试。
表1.从加载有28ml酸化乳的25ml聚苯乙烯移液管的以秒测量的流出时间(3次测量的平均值)
结论
可将本文所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种的对氨苄西林具有抗性的突变体并入产生合意的高水平的质地的培养物(例如起子培养物)中。
实施例3:嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的对氨苄西林具有抗性的突变体用于制备发酵乳产品的用途.
流变学:
在添加有2%(w/v)脱脂乳粉的全脂牛乳中生长后,在来自ReoLogicaInstruments AB,Sweden的StressTech流变仪上实施流变学分析。
上述实施例对利用所选对氨苄西林具有抗性的突变体作为单培养物发酵的发酵乳的改进的质地进行了说明。在本实施例中,我们将分析制成酸乳的发酵乳的质地,即,利用了组合使用的嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。为了证明一些突变体的改进的质地化作用,利用一种固定的野生型嗜热链球菌菌株CHCC4895分别与德氏乳杆菌保加利亚亚种野生型菌株CHCC13995和对氨苄西林具有抗性的菌株CHCC15466的混合物的组合制备酸乳。将酸乳培养物以9:1比率的嗜热链球菌:德氏乳杆菌保加利亚亚种混合且接种到添加有2%脱脂乳粉的全脂牛乳中并且在40℃发酵到4.50的最终pH。在4℃储存5天后使用Stresstech流变仪分析以下混合物。如由Folkenberg等人(2006.Int.Dairy J.16(2);111-118)所述测量胶粘性。
结果呈现于表2中。
表2.利用嗜热链球菌菌株CHCC4896和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC13995或对氨苄西林具有抗性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC15466制得的酸乳的流变学测量。
结果清楚地显示,在嗜热链球菌菌株存在下也保留了如利用单培养物所观察到的对氨苄西林具有抗性的突变体CHCC15466的改进的质地化性质。
在使用德氏乳杆菌保加利亚亚种的突变体代替其野生型菌株用于酸乳发酵时,虽然剪切应力仅受到轻微影响,但凝胶硬度和胶粘性显著改进。
结论
可将本文所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种的对氨苄西林具有抗性的突变体并入培养物(例如起子培养物)中,这在发酵乳产品(例如酸乳)中产生合意的高水平的质地。
保藏物和专家解决方案
嗜热链球菌菌株CHCC4895于2007年3月29日以保藏号DSM 19242保藏于德国布伦瑞克豪丰大街7B(D-38124)(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。
德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC13995于2010年9月22日以保藏号DSM 24021保藏于德国布伦瑞克豪丰大街7B(D-38124)的德国微生物菌种保藏中心。
德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC15466于2012年4月3日以保藏号DSM 25852保藏于德国布伦瑞克豪丰大街7B(D-38124)的德国微生物菌种保藏中心。
在根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约(Budapesttreaty on the international recognition of the deposit of microorganisms forthe purposes of patent procedure)的条件下进行保藏。
申请人请求保藏微生物的样品应当仅供被申请人认可的专家可得。
Claims (12)
1.一种乳酸菌菌株,其为以保藏号DSM 25852保藏于德国微生物菌种保藏中心的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株CHCC15466。
2.一种组合物,其包含104到1014个CFU/g的根据权利要求1所述的乳酸菌菌株。
3.根据权利要求2所述的组合物,其包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
4.根据权利要求2和3中任一权利要求所述的组合物,其包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株。
5.根据权利要求2至4中任一权利要求所述的组合物,其呈冷冻形式或冻干形式或液体形式。
6.一种用于制备发酵乳产品的方法,其包括利用根据权利要求1所述的乳酸菌菌株或根据权利要求2到5中任一权利要求所述的组合物对乳基质进行发酵。
7.一种发酵乳产品,其通过根据权利要求6所述的方法获得。
8.一种发酵乳产品,其包含根据权利要求1所述的乳酸菌菌株或根据权利要求2到5中任一权利要求所述的组合物。
9.根据权利要求1所述的乳酸菌菌株或根据权利要求2到5中任一权利要求所述的组合物用于制备乳产品的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其中所述乳产品是发酵乳产品。
11.一种用于获得乳酸菌菌株的方法,所述方法包括:
a)从乳酸菌菌株池中选择和分离对抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株池,其被定义为将在适于所述乳酸菌菌株生长的培养基中在37℃生长20小时后的OD600测量的生长相比于在不含氨苄西林的所述培养基中的生长降低20%的氨苄西林的量高于400ng/ml;并且
b)从步骤a)的对抗生素氨苄西林具有抗性的所述乳酸菌菌株池中选择和分离以下乳酸菌菌株,其中接种至少104个CFU/ml的所述乳酸菌菌株且在37℃酸化20小时的含有2%(w/v)脱脂乳粉的28ml全脂牛乳从25ml聚苯乙烯移液管的流出时间是至少50秒。
12.一种乳酸菌菌株,其通过根据权利要求11所述的方法获得。
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