CN104237168B - 一种检测液体样品中外囊体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测待测液体样品中外囊体的方法，所述待测液体样品含有外囊体；所述方法包括：在微阵列芯片表面通入待测液体样品进行接触，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，获得所述微阵列芯片在接触待测液体样品前后的表面等离子体共振信号变化值；所述微阵列芯片的表面等离子体共振信号变化值指示了待测液体样品中外囊体的数量。本发明所提供的方法依托于表面等离子体共振成像技术，不需要对待测液体样品进行复杂的提纯过程，能够准确可靠地实时定量检测液体样品中外囊体。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测液体样品中外囊体的方法。
背景技术
表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）传感技术是一种表面敏感的检测方法，与其他的生物检测方法相比，SPR传感分析系统具有非标记的、实时检测相互作用动力学等优点。基于SPR技术的表面等离子体共振成像（surface plasmon resonanceimaging，SPRi）分析系统在保持了SPR检测技术优点的基础上，增加了检测的容量，SPRi可以同时检测几百上千个相互作用，是一种高通量的检测技术。
外囊体（exosome）是直径在40-100纳米范围的由磷脂双分子层包围的扁平球形的微小囊泡体。外囊体的形成过程比较复杂，目前科学研究工作者普遍认为外囊体起源于细胞内吞过程中形成的多囊体（multivesicular body,MVB）。细胞内膜由于细胞内吞在细胞内部形成较大的泡状物，泡的底部与细胞内膜分离后在细胞内部独立行驶功能，泡的介膜再向内出芽(二次内吞)，在泡的内部形成膜包围的结构，这种结构在泡状物的膜上大量形成，其基部逐渐与MVB的膜分离，脱离后就形成了MVB内小囊泡，MVB膜胞质面形成了小囊泡的内面，小囊泡里面包裹的主要是细胞质。MVB的代谢途径一般有二种：一部分MVB被转运到溶酶体降解；另一部分MVB的泡膜与质膜融合后释放小泡到胞外空间形成外囊体。
外囊体不仅可以由细胞分泌，例如目前已经报道的B细胞，树状细胞，肥大细胞，上皮细胞以及肿瘤细胞，并且外囊体也可以在许多种的体液中发现，例如，在支气管肺泡灌洗液，血液，尿液和腹水都大量存在。生理学上来说，外囊体不仅仅在细胞内部行驶功能，并且也可以担任功能单元在细胞通信方面起到重要作用，在产生外囊体的细胞以及目标细胞之间交换蛋白以及其它脂类物质。然而，由于外囊体表面有大量的蛋白存在，并且其存在的环境不管是细胞培养上清还是体液中都存在大量的杂蛋白，这阻碍了外囊体的进一步研究。目前文献中报道的提纯外囊体的方法主要有两种：超高速（大于100,000g的离心力）离心超滤提纯以及蔗糖密度梯度离心，这两种方法都需要多个转移细胞培养上清的步骤转移，昂贵的设备和长时间的离心制备，并且有可能在转移的过程由于保存不当使上清变质破环外囊体的结构，从而影响检测结果，甚至于破坏检测的可信性；目前生物学上研究外囊体的常规技术主要有：质谱（MS），核磁共振（NMR）以及免疫印记（Western Blotting）和酶联免疫技术（ELISA），但是这些技术都需要提纯后才能进行检测，现有技术通常采用离心的方法对外囊体进行提纯，提纯的过程一般包括低速离心10分钟、高速离心30分钟和超高速离心150分钟，复杂的离心过程是现有技术检测液体样品中外囊体技术中存在的缺陷。因此目前需要一种省去复杂的离心过程的直接检测细胞培养上清中外囊体的方法来推进外囊体研究的进一步发展。虽然最近有一种基于免疫磁珠直接检测细胞培养上清中外囊体的方法，但是这种方法仍旧需要用HRP等二抗对外囊体进行标记才能进行功能上的研究，并且标记技术容易增加非特异性相互作用以及检测背景噪声，对检测结果的可信性造成负面影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有外囊体检测技术中存在的上述不足，提供一种依托于表面等离子体共振成像技术的不需要复杂提纯过程、准确可靠地实时定量检测液体样品中外囊体的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种检测液体样品中外囊体的方法，所述待测液体样品含有外囊体；所述方法包括：在微阵列芯片表面通入待测液体样品进行接触，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，获得所述微阵列芯片在接触待测液体样品前后的表面等离子体共振信号变化值；所述微阵列芯片的表面等离子体共振信号变化值指示了待测液体样品中外囊体的数量。
本发明还提供了一种微阵列芯片在制备用于检测液体样品中外囊体的试剂盒中的用途，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，且所述微阵列芯片用于测定表面等离子体共振信号变化值。
利用本发明所提供的方法能够快速、专一、实时、无需标记的定量检测液体样品中的外囊体。本发明所提供的微阵列芯片能够应用于检测液体样品中外囊体的试剂盒。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明所述的检测方法的原理图；
图2是用本发明所提供的方法检测得到的微阵列芯片表面抗体与细胞培养上清中外囊体的结合信号示意图；
图3A-3C是用原子力显微镜检测得到的微阵列芯片表面抗体与细胞培养上清中外囊体的结合情况示意图，图中标尺为200纳米；
图4A是用本发明用所述的方法检测空白培养基、细胞培养上清、过滤后细胞培养上清中的外囊体所得到的结合信号示意图，图4B是用免疫印迹方法检测空白培养基、细胞培养上清、过滤后细胞培养上清中的外囊体的免疫印迹结果；
图5是利用本发明所述的方法对细胞培养上清中的外囊体进行定量检测的示意图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种检测液体样品中外囊体的方法，所述待测液体样品含有外囊体；所述方法包括：在微阵列芯片表面通入待测液体样品进行接触，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，获得所述微阵列芯片在接触待测液体样品前后的表面等离子体共振信号变化值；所述微阵列芯片的表面等离子体共振信号变化值指示了待测液体样品中外囊体的数量。
在本发明所述的方法中，所述特异性抗体为能够与外囊体表面的特异性抗原发生特异性结合的抗体，优选地，所述抗体可以为：抗CD9b的特异性抗体、抗CD41b的特异性抗体、抗CD63的特异性抗体、抗CD81的特异性抗体、抗CD82的特异性抗体、抗EpCAM的特异性抗体或抗E-cadherin的特异性抗体；更为优选地，所述特异性抗体为抗CD9b的特异性抗体或抗CD41b的特异性抗体。
优选地，所述特异性抗体为抗CD41b的特异性抗体或CD9b的特异性抗体。
本发明所述的负载有外囊体表面膜蛋白特异性抗体的微阵列芯片的制备方法可以按照文献（Lausted,C.;Hu,Z.;Hood,L.;Campbell,C.T.Comb Chem High ThroughputScreen2009,12,(8),741-51.）中记载的方式进行，优选情况下，制备过程可以包括以下步骤：
打印：将一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体按0.1-10μg/μL的浓度打印在表面镀有金属层的芯片上，形成抗体微阵列，所述表面镀有金属层的芯片可以为SPRi技术中常用的镀金芯片或镀银芯片。所述芯片的尺寸可以为本领域所常规使用的尺寸，一般的，每平方厘米的芯片上抗体的打印密度为1-10000个点，优选为1-100个点，以蛋白量计，每个抗体点中的抗体量为0.02-2μg，优选为0.1-1μg。打印结束后，将打印有抗体微阵列的芯片置于湿度为10%-100%的湿盒中并在1℃-80℃的环境下孵育0.1-100h，使得打印的抗体微阵列充分的固定于芯片表面，另外，每个芯片上所打印的特异性抗体的数量和种类也没有特别的限制，可以在同一个芯片上打印单一的一种抗体，也可以同时打印有多种不同的抗体。另外，为了便于分析的进行，可以在同一微阵列芯片表面打印相应的对照组微阵列。
清洗：打印步骤结束后，依次用浓度为1-100ml0.11-1M的高倍缓冲液、1-100mL0.001-0.01M的低倍缓冲液和蒸馏水冲洗芯片，每次冲洗1-120min。
封闭：用封闭液对清洗后的微阵列芯片进行封闭，所述封闭液可以为脱脂奶粉浓度为2-20重量%的PBS-T溶液（pH=7.6）或BSA浓度为0.1-10重量%的PBS-T溶液（pH=7.6）。所述封闭的时间为0.1-5小时，封闭所需的温度为4-60℃。
封闭后清洗：在封闭步骤结束后，依次用浓度为1-100ml0.11-1M的高倍缓冲液、1-100mL0.001-0.01M的低倍缓冲液和蒸馏水冲洗芯片，每次冲洗1-120min并在4-60℃下温和吹干或自然风干微阵列芯片表面的液体，在微阵列芯片表面覆盖盖片，所述盖玻片为本领域常用的能够为液体样品的表面等离子体共振成像分析提供合适的微流道的盖片，在覆盖盖片后，可以在微阵列芯片表面形成一个微流道和相互作用腔室以允许通入到微阵列芯片表面的液体能够与微阵列芯片进行充分的接触。
封片结束后，得到的微阵列芯片可以在4-60℃，湿度10-100%的条件下储存备用。
在上述微阵列芯片的制备过程中，所述缓冲液可以为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液，当缓冲液为磷酸盐缓冲液时，其浓度以磷酸根的浓度进行计量，当缓冲液为碳酸盐缓冲液时，其浓度以碳酸根的浓度进行计量，优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液。
此外，一种优选地实施方式包括对所述微阵列芯片的表面进行修饰，所述修饰步骤可以在打印步骤前进行，修饰的步骤可以包括：将巯基-聚乙二醇溶液的浓度调整为0.1-10μg/mL，在4-60℃条件下与芯片共孵育0.1-10小时，修饰的目的是降低液体样品中的物质与芯片表面的非特异性结合，提高检测的灵敏度。
利用本发明的微阵列芯片通过表面等离子体共振成像分析检测液体样品中外囊体的方法包括：
在4-60℃下将本发明所述的负载有所述抗体的微阵列芯片置于表面等离子体共振分析系统中，在所述微阵列芯片表面以0.1-50μL/s的流速通入500-2000μL1×磷酸缓冲液或碳酸缓冲液，再以0.1-50μL/s的流速通入100-10000μL待测液体样品，使待测的液体样品通过微流道与微阵列芯片表面的抗体充分的进行接触，然后在微阵列芯片表面以0.1-50μL/s的流速通入500-2000μL1×磷酸缓冲液或碳酸缓冲液，洗去微阵列芯片表面的非特异性吸附的杂质，优选地，缓冲液和待测液体样品的通入速度可以为0.5-45μL/s。同时利用等离子体共振成像技术按照（Lausted,C.;Hu,Z.;Hood,L.;Campbell,C.T.Comb Chem HighThroughput Screen2009,12,(8),741-51.）中记载的方法获得所述微阵列芯片在接触待测液体样品前后的表面等离子体共振信号的变化值。
当利用本发明所提供的方法对液体样品中外囊体的浓度进行分析时，可以首先利用大于等于100,000g的离心力分离获得液体样品中的外囊体制成待测外囊体溶液，再通过BCA蛋白定量法对制备得到的待测外囊体溶液的浓度进行定量，在SPRi检测结束后利用待测外囊体溶液的浓度与SPRi检测结果建立关系方程，该方程可以用于分析液体样品中的外囊体浓度。
本发明所述的方法优选还包括，在检测结束后在所述微阵列芯片表面以0.1-50μL/s的流速通入100-10000μL浓度为0.01-20mol/L的酸，以洗去微阵列芯片表面所特异性结合的物质使得芯片能够重复的使用。所述酸可以为磷酸或盐酸，在通入酸后，可以再以1-50μL/s的流速通入磷酸缓冲液（PH=7.6）对芯片进行清洗，清洗的时间可以为1-100分钟。
优选地，本发明所述的方法还可以包括对每个抗体点的结合信号进行矫正，所述矫正可以在检测前或检测后进行，具体的信号矫正方式可以按照（Lausted,C.;Hu,Z.;Hood,L.;Campbell,C.T.Comb Chem High Throughput Screen2009,12,(8),741-51.）中记载的方式进行进行。
在本发明所述的方法中，用以检测的液体样品可以为来自受试者的液体样品或细胞培养上清。例如，所述液体样品可以为细胞培养上清或受试者的血清、尿液、组织液、淋巴液、唾液、精液、泪液、汗液、支气管肺泡灌洗液、腹水等体液。优选地，所述液体样品为细胞培养上清或受试者的血清、尿液、组织液、淋巴液。
本发明对细胞培养上清的种类没有特别的限制，优选地，所述细胞培养上清可以为肿瘤细胞系的细胞培养上清，例如可以为肝癌细胞系MHCC97H的细胞培养上清或MHCC97L的细胞培养上清。
当本发明所述的液体样品为细胞培养上清时，可以不对细胞培养上清进行预处理，而直接进行检测。
优选地，为了排除背景的干扰从而提高检测的灵敏度和准确度，在检测前也可以预先进行如下处理：当所述液体样品为细胞培养上清时，可以将细胞培养上清在4℃以2000rpm离心5min，去除死细胞及较大的细胞碎片；然后再在4℃，以12000rpm离心10min，去除所有细胞碎片，最后再采用300kD滤膜过滤，收集过滤后的大于300kD部分并用1×PBS缓冲液进行重悬浮。当所述液体样品为血清时，也可以对血清进行简单的预处理步骤，所述预处理步骤包括将来自于受试者的血清进行过滤并收集滤液，过滤所采用的滤膜为50-300kD滤膜以去除血清中存在的小于300kD的蛋白等杂质（如血清白蛋白），过滤后用1×PBS缓冲液将血清中大于300kD的部分重悬浮。通过上述预处理步骤可以减少反应过程中与微阵列芯片表面所负载的抗体发生非特异性结合的杂质的量。
采用本发明的方法，可以检测直径为40-100nm的外囊体，优选地，所述外囊体的直径为50-90nm。
在本发明所述的方法中，可以采用与所述特异性抗体有相同生物种类来源的IgG作为阴性对照抗体，例如，如果所使用的特异性抗体为鼠源的特异性抗体，那么就应该选用鼠源的IgG作为阴性对照组抗体。
本发明还提供了微阵列芯片在制备用于检测液体样品中外囊体的试剂盒中的用途，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，且所述微阵列芯片用于测定表面等离子体共振信号变化值。
其中，所述特异性抗体为：抗CD9b的特异性抗体、抗CD41b的特异性抗体、抗CD63的特异性抗体、抗CD81的特异性抗体、抗CD82的特异性抗体、抗EpCAM的特异性抗体或抗E-cadherin的特异性抗体。优选地，所述特异性抗体为抗CD41b的特异性抗体或抗CD9b的特异性抗体。
在本发明的一种实施方式中，本发明的方法用于获得中间信息，不能通过该中间信息直接的判定主体的健康状况或患病几率。在本发明的一种实施方式中，本发明的方法不以疾病诊断和/或治疗为目的。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中：
超速离心机：购自日本日立公司，型号：Hitachi CP80MX，转子型号：P40ST。
SPRi分析仪为Plexera公司PlexArray HT型号SPRi分析仪；
镀金芯片为购自Plexarray公司，镀金芯片为玻璃材质型号为BK7，表面金膜厚度为47.5nm；
鼠源抗-CD41b的特异性抗体购自BD公司，货号555468；
鼠源抗-CD63的特异性抗体购自R&D公司，货号MAB5048；
鼠源抗-CD82的特异性抗体购自R&D公司，货号MAB4616；
鼠源抗-EpCAM的特异性抗体购自R&D公司，货号MAB9601；
鼠源抗E-cadherin的特异性抗体购自Abcam公司，货号MB2；
鼠源抗-CD81的特异性抗体购自R&D公司，货号MAB4615；
鼠源抗-CD9的特异性抗体购自R&D公司，货号MAB1880；
鼠IgG购自BD公司，货号557273。
微阵列芯片的表面等离子体共振信号变化值的检测以及微阵列芯片表面各个抗体点的信号矫正均按照文献（Lausted,C.;Hu,Z.;Hood,L.;Campbell,C.T.Comb Chem HighThroughput Screen2009,12,(8),741-51.）中所记载的方法进行。
制备例1
本制备例用于说明本发明所提供的微阵列芯片的制备方法，在本制备例中制备相同的微阵列芯片1-6以用于后续测试实施例，具体制备步骤为：
（1）打印：在25℃下分别将鼠抗-CD63IgG、鼠抗-CD9IgG、鼠抗-CD41b IgG、鼠抗-E-cadherin IgG、鼠抗-EpCAM IgG和鼠抗-CD82IgG以及作为对照组的IgG按5μg/μL的浓度以5000个/cm2的打印密度固定至经聚乙二醇修饰的等离子共振成像镀金芯片表面，形成抗体微阵列，每种抗体各打印1个点（每个点中的蛋白量为0.5μg），将微阵列芯片置于湿度为50%的湿盒中并在40℃的环境下孵育2h；
（2）清洗：在25℃下依次用100ml1M的高倍磷酸缓冲液、100ml0.1M低倍磷酸缓冲液和200ml蒸馏水，依次各冲洗芯片60min。
（3）封闭：用溶解有5重量%的脱脂奶粉的PBS-T溶液对微阵列芯片进行封闭，封闭的时间为1小时，封闭所需的温度为40℃。
（4）清洗：在25℃下依次用100ml1M的高倍磷酸缓冲液、100ml0.1M低倍磷酸缓冲液和200ml蒸馏水各冲洗芯片60min。
（5）封片：在4-60℃下晾干微阵列芯片表面的液体，在微阵列芯片表面覆盖盖玻片。
（6）封片结束后，将得到的微阵列芯片在37℃，湿度50%的条件下储存备用。
测试实施例1
本实施例用于说明本发明提供的检测液体样品中外囊体的方法
在37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养MHCC97H细胞（参见文献Li,Y.,Tian,B.,Yang,J.,Zhao,L.et al.,Stepwise metastatic human hepatocellular carcinoma cellmodel system with multiple metastatic potentials established throughconsecutive in vivo selection and studies on metastaticcharacteristics.J.Cancer Res.Clin.Oncol.2004,130,460-468.），细胞培养基为含有20%胎牛血清的DMEM培养基，在细胞的汇合率达到70%时收集细胞培养上清作为待测液体样品，在40℃下将制备例1获得的微阵列芯片1置于SPRi分析仪中。
在室温下首先按照文献（Lausted,C.;Hu,Z.;Hood,L.;Campbell,C.T.Comb ChemHigh Throughput Screen2009,12,(8),741-51.）中记载的方法对制备例1得到的微阵列芯片1表面各个抗体点进行信号矫正，再以20μL/s的流速在微阵列芯片表面通入100μL1×PBS缓冲液，然后将100μL待测液体样品以20μL/s的流速通入微阵列芯片表面，接着在所述微阵列芯片表面以20μL/s的流速通入100μL1×PBS缓冲液，洗去微阵列芯片表面非特异性吸附的杂质，再用SPRi仪对微阵列芯片按其说明书进行表面等离子体共振成像分析，获得表面等离子体共振信号变化值，结果如图2所示。图2中的结果显示，微阵列芯片表面的各个特异性抗体点均检测到了明显的表面等离子体共振信号变化值，并且，各抗体点的信号变化值明显高于同型IgG对照，说明液体样品中的外囊体与微阵列芯片表面的抗体点发生了特异性结合。
测试实施例2
本实施例用于说明本发明所述的方法的微阵列芯片与液体样品中外囊体的结合情况。
在37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养MHCC97H细胞，细胞培养基为含有20%胎牛血清的DMEM培养基，在细胞的汇合率达到70%时收集2×107个细胞的培养上清3ml，在4℃保存，在检测前将细胞培养上清在4℃以2000rpm离心5min，然后再在4℃，以12000rpm离心10min，最后再采用300kD滤膜过滤，收集过滤后的大于300kD部分，过滤后用1×PBS缓冲液将血清中大于300kD的部分重悬浮，获得3ml过滤后细胞培养上清。并首先按照文献（Lausted,C.;Hu,Z.;Hood,L.;Campbell,C.T.Comb Chem High Throughput Screen2009,12,(8),741-51.）中记载的方法对制备例1得到的微阵列芯片2上的各个抗体点进行信号矫正，信号矫正结束后在微阵列芯片表面以20μL/s的流速通入100μL1×PBS缓冲液，然后将100μL待测液体样品以20μL/s的流速通入微阵列芯片表面，接着在所述微阵列芯片表面以20μL/s的流速通入100μL1×PBS缓冲液，洗去微阵列芯片表面非特异性吸附的杂质。将芯片置于原子力显微镜中（atom force microscope,AFM）观察细胞培养上清中的外囊体能否被固定于芯片表面的抗体捕获，结果如图3A-C所示。
由图3可知，固定于芯片表面的CD9b和CD41b的抗体均能捕获直径为76纳米左右的囊泡，这与文献（Yuana,Y.;Oosterkamp,T.H.;Bahatyrova,S.;Ashcroft,B.;GarciaRodriguez,P.;Bertina,R.M.;Osanto,S.J Thromb Haemost2010,8,(2),315-23.）报道中利用原子力显微镜观察外囊体的形态类似，大小一致，而作为对照组的同型IgG却未能捕获外囊体。由于CD9b为外囊体的标志性蛋白，说明CD9b和CD41b抗体捕获的囊泡为外囊体。也就是说，本发明所提供的微阵列芯片能够对液体样品中的外囊体进行特异性的结合，通过本发明所提供的方法可以对结合在微阵列芯片上的外囊体进行检测，从而完成对液体样品中的外囊体的检测。
测试实施例3
本实施例用于说明本发明所述方法检测样品中外囊体时与芯片上的抗体结合的为外囊体而并非为其它杂蛋白。
在37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养MHCC97H细胞48小时，在细胞的汇合率达到70%时收集2×107个细胞的培养上清3ml，利用300kD的滤膜过滤，除去溶液中的外囊体获得3ml过滤后细胞培养上清。利用与实施例1相同的方法通过制备例1得到的微阵列芯片3-5分别检测3ml空白培养基、3ml细胞培养上清和3ml过滤后细胞培养上清中的外囊体。同时将上述细胞培养上清和过滤后细胞培养上清与作为对照的全细胞裂解液用免疫印迹实验进一步验证。结果如图4A-B所示。
测试实施例4
本实施例用于说明本发明所述方法可以应用于外囊体的实时定量检测。
在37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养MHCC97H细胞，细胞培养基为含有20%胎牛血清的DMEM培养基，在细胞的汇合率达到70%时收集细胞的培养上清，在4℃，100000×g（超速离心机，型号：Hitachi CP80MX，转子型号：P40ST）离心2小时后收取沉淀，再用4℃的细胞培养基将收集得到的沉淀悬浮获得含有外囊体的溶液，用BCA蛋白定量法获得溶液的蛋白浓度后分别制备浓度为93.4、46.7、23.3、11.7、5.8、2.9微克／微升的外囊体溶液（溶于空白培养基），在40℃下将制备例1获得的微阵列芯片6置于SPRi分析仪中。
首先对制备例1得到的微阵列芯片6上的各个抗体点进行信号矫正，信号矫正结束后以20μL/s的流速在制备例1制得的微阵列芯片6表面通入100μL1×PBS缓冲液，然后将100μL待测液体样品以20μL/s的流速通入微阵列芯片表面，用SPRi仪对微阵列芯片按其说明书中所记载的方法进行表面等离子体共振成像分析获得各个抗体位点的信号变化值。
分别取CD41b抗体点和CD9b抗体点的前90秒信号的变化值拟合直线，获得结合曲线初始斜率，以初始斜率为纵坐标，以外囊体浓度为横坐标，拟合对数曲线，获得CD41b抗体和CD9b抗体的外囊体浓度和结合曲线初始斜率的关系式。如图5A-C所示。
从测试实施例1的结果可以看出，本发明所提供的检测液体样品中外囊体的方法可以对液体样品中的外囊体进行快速实时的检测。
从测试实施例2的结果可以看出，本发明所提供的方法的微阵列芯片能够捕获液体样品中的外囊体。
从测试实施例3的结果可以看出，本发明所述的方法能够专一的检测液体样品中的外囊体。
从测试实施例4的结果可以看出，本发明所述的方法能够应用于液体样品中外囊体的实时定量检测。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (7)
1.一种检测待测液体样品中外囊体的方法，所述待测液体样品含有外囊体；所述方法包括：
在微阵列芯片表面通入待测液体样品进行接触，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，
获得所述微阵列芯片在接触待测液体样品前后的表面等离子体共振信号变化值；
所述微阵列芯片的表面等离子体共振信号变化值指示了待测液体样品中外囊体的数量；
其中，所述特异性抗体为抗CD9b的特异性抗体或抗CD41b的特异性抗体；所述液体样品为血清或细胞培养上清；
所述微阵列芯片的制备方法包括：分别将所述特异性抗体按0.1-10μg/μL的蛋白浓度固定至镀金芯片或镀银芯片上形成微阵列，每个抗体点中的蛋白量为0.02-2μg。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微阵列芯片的制备方法还包括：将固定有所述特异性抗体的微阵列芯片在湿度为10-100％，温度为1℃-80℃的条件下孵育0.1-100h。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述待测液体样品的通入速度为0.1-50μL/s，通入的量为100-10000μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外囊体来自肿瘤细胞。
5.微阵列芯片在制备用于检测液体样品中外囊体的试剂盒中的用途，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，且所述微阵列芯片用于测定表面等离子体共振信号变化值；
其中，所述特异性抗体为抗CD9b的特异性抗体或抗CD41b的特异性抗体；所述液体样品为血清或细胞培养上清；
所述微阵列芯片的制备方法包括：分别将所述特异性抗体按0.1-10μg/μL的蛋白浓度固定至镀金芯片或镀银芯片上形成微阵列，每个抗体点中的蛋白量为0.02-2μg。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述微阵列芯片的制备方法还包括：将固定有所述特异性抗体的微阵列芯片在湿度为10-100％，温度为1℃-80℃的条件下孵育0.1-100h。
7.根据权利要求5所述的用途，其中，所述外囊体来自肿瘤细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |