CN104232667A - FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法 - Google Patents
FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法，包括如下步骤：(1)目的基因Eg95的扩增(2)小鼠野生型Fc片段(Fc/wFc)和突变型Fc片段(Fc/mFc)的扩增(3)Eg95-Fc/wFc(mFc)的扩增(4)Eg95-Fc/wFc(mFc)融合蛋白在杆状病毒表面的展示(5)Eg95-Fc/wFc(mFc)重组病毒粒子的纯化。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和疫苗学技术领域，尤其涉及一种FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法。
背景技术
1.1细粒棘球蚴病概况
细粒棘球蚴病(Echinococcosis granulosus)亦称囊型包虫病(Cystic Echinococcosis,CE)是由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,Eg)的续绦期幼虫所引起的一种严重危害人畜健康的人兽共患寄生虫病，是当前国家卫生部规划防治的重要寄生虫病之一。包虫病患者主要通过误食细粒棘球蚴虫卵或幼虫而发生感染，虫卵六钩蚴在肠内孵出后经迁移最后定居于宿主肝、肺等脏器。该病呈世界性分布，现已证实在我国已有29个省市区存在棘球蚴病感染病例，有100多万棘球蚴病现症患者，受威胁人口约5000余万人，棘球蚴病畜超过4000万头，每年新增病畜达800多万头，年经济损失超过10亿元。宁夏是我国包虫病的高发区之一，2011年中国疾病预防控制中心网络直报统计分析，宁夏包虫病平均感染率为10.8％，估计全区感染者约50万，病人约24万，该病已成为当地群众因病致贫、因病返贫的主要原因之一。冯运灵等对1991-2010年宁夏包虫病住院病例的回顾性调查时发现，随着城市化进程的加快带来的农村和城市之间的物质和人员流动的增加，导致包虫病有从农村向城市蔓延的趋势，对这种现象已有专家表示担忧。因此，包虫病的防治重要性和紧迫性刻不容缓。
1.2FcRn与疫苗
目前对包虫病的治疗主要通过手术和药物，但手术治疗术后常继发感染或难以根除，而药物治疗会产生严重的毒副作用和耐药性。有保护作用的疫苗将成为控制该病的有效工具。黏膜疫苗是现在疫苗研究的一个方向。
黏膜疫苗要想获得理想的免疫效果就必须要穿过黏膜上皮细胞，然后将免疫原递呈给免疫效应细胞。然而，由于黏膜上皮细胞间的紧密连接，致使大分子抗原物质无法穿过上皮细胞而发挥有效的黏膜免疫。研究发现，新生儿Fc受体(Neonatal Fc receptor,FcRn)是识别免疫球蛋白IgG Fc片段的受体。FcRn可以通过黏膜表面的上皮细胞，特异性的与IgG Fc片段结合，从而介导黏膜上皮细胞主动转运IgG，使机体获得抵御病原体的能力。FcRn最早是在新生啮齿动物肠道上皮细胞中发现的，近些年发现FcRn在成年小鼠的鼻黏膜上皮细胞中表达量很高，而在小肠上皮细胞中表达量却很低，在人体的许多组织中也存在，包括心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉、胰腺、胎儿和成人小肠。FcRn与IgG结合具有pH依赖性，即在酸性pH条件下结合，在中性pH条件下释放。FcRn-IgG复合物在pH5～6之间相对稳定，但当pH上升到7.0时，其结合力显著下降两个数量级以上。FcRn除了具有胞转IgG作用外，还可以保护循环中的IgG免受降解，延长IgG半衰期，从而可以长时间发挥免疫作用。
1.3杆状病毒表面展示系统
要进行疫苗的研究，表达载体的选择至关重要。本实验室前期对包虫抗原做了大量的原核表达研究，尽管一些蛋白表现出了免疫原性和一定的保护力，但由于蛋白表达量低以及纯化费时费力，限制了该蛋白的进一步研究。更重要的是，原核表达系统由于缺乏真核生物蛋白正确折叠所需的分子伴侣及相关酶类，所以不能完成复杂真核生物蛋白磷酸化、糖基化等翻译后修饰加工过程，致使表达的蛋白活性受到限制。本研究构建了一个全新的真核表达载体系统——杆状病毒表面展示系统，不仅具有外源蛋白高效表达的特性，而且使表达的蛋白直接展示在病毒粒子的表面，只需超速离心得到重组病毒粒子即可同时获得目的蛋白，简化了蛋白纯化费时费力不经济等缺陷。杆状病毒表面展示系统，和其他灭活疫苗和以病毒为载体的疫苗不同，杆状病毒对人类和哺乳动物不引起致病，能在一般的生物实验室进行操作；能在生物反应器内进行感染昆虫细胞而大量的表达目的蛋白，加速生产过程。杆状病毒表面展示系统的构建，不但可为真核表达系统开发提供理想的技术模型，具有重要的理论意义，而且利用杆状病毒表面展示系统具有周期短、费用低、可控性强等优点，用其表达一些具有特殊应用价值和药用价值的蛋白，将会产生巨大的潜在的社会和经济效益。杆状病毒表面展示系统的建立，可为试验的研究提供充足的实验材料，为包虫病疫苗的研制提供了一个理想的表达载体。
发明内容
针对现有技术不足，基于目前对包虫病尚无有效的疫苗问世，而且现有的方法在制备黏膜疫苗中效果不好，提供一种FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明涉及一种FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)目的基因Eg95的扩增
合成引物
P1：3’-GCTCTCGAGATGGCATTCCAGTTA-5’,
P2：3’-GAAGAATTCAGTAAGGACAACCAC-5’；
处死细粒棘球蚴感染小鼠，无菌分离Eg包囊，抽提囊液，分离原头节，按RNAeasy Mini试剂盒提取总RNA，然后以总RNA为模板，用Oligo(dT)18随机引物进行反转录，再以P1,P2为引物进行PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离大小约为468bp特异性条带，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
(2)小鼠野生型Fc片段(Fc/wFc)和突变型Fc片段(Fc/mFc)的扩增
合成引物P3：3’-GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGC-5’,
P4：3’-TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG-5’，
用于扩增Fc片段，然后通过点突变将Glu318、Lys320、Lys322突变为Ala，将扩增出的片段命名为Fc/wFc，其核苷酸序列为SEQ IDNO.2；进一步通过点突变的方式，以Fc/wFc为模板，将His310、His433突变为Ala残基，将扩增出的片段命名为Fc/mFc,其核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
(3)Eg95-Fc/wFc(mFc)的扩增
在Eg95下游引物的5′端和Fc/wFc或Fc/mFc基因上游引物的5′端引入14个柔性氨基酸linker(GSGGGGSGGGGSGS)，然后通过长片段无模板扩增法获得融合片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定和序列测定正确的片段命名为Eg95-Fc/wFc和Eg95-Fc/mFc，Eg95-wFc融合基因序列为SEQ ID NO.4；Eg95-mFc融合基因序列为SEQ IDNO.5；
(4)Eg95-Fc/wFc(mFc)融合蛋白在杆状病毒表面的展示
将测序后正确的融合基因的PCR产物经XhoI和PstI双酶切后回收并纯化，然后定向插入与同样双酶切的转座质粒pBacSC的MCS中，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落，提取质粒，进行序列测定鉴定；
将鉴定正确的重组质粒转化至含有杆状病毒DNA的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，经过卡那霉素、庆大霉素和四环素三种抗性LB平板筛选，挑取白斑菌落，提取重组杆状病毒DNA；
将重组杆状病毒DNA利用脂质体2000转染Sf-9细胞；待细胞出现病变或大量荧光出现后，收集培养上清作为原毒种，分小管贮存于-80℃冰箱。
悬浮培养昆虫细胞，待细胞浓度达到1×106个/ml，以1MOI的重组杆状病毒量感染昆虫细胞，利用病毒在昆虫细胞中复制达到病毒增殖，感染3～4d后离心除去细胞及细胞碎片，收集上清液，便完成病毒量扩增；
(5)Eg95-Fc/wFc(mFc)重组病毒粒子的纯化
通过病毒感染Sf-9细胞完成病毒量的扩增后，收集病毒感染3～4d的细胞，经反复冻融、离心收集上清液，然后通过超速离心和蔗糖密度梯度离心获得纯化的重组病毒粒子，用BCA法测重组蛋白浓度，置-80℃保存备用。
附图说明
图1Eg95基因的RT-PCR鉴定；
图2Eg95-Fc/wFc融合基因的PCR鉴定；
图3pBacSC质粒构建模式图；
图4转染后不同时间细胞的生长表现情况(400×)；
图5转染后不同时间绿色荧光蛋白的表现情况(100×)；
图6激光共聚焦显微镜观察重组蛋白在Sf-9细胞膜上的表现；
图7纯化的重组杆状病毒Western blot分析：
1.BacSC-Eg95病毒粒子经Triton X-100裂解后的囊膜蛋白部分；2.BacSC-Eg95病毒粒子经Triton X-100裂解后的核衣壳蛋白部分；3.完整的BacSC-Eg95病毒粒子。
图8体外FcRn介导Eg95-Fc/wFc重组蛋白胞转；
图9体内FcRn介导Eg95-Fc/wFc重组蛋白胞转。
具体实施方案
下面结合实例对本发明做进一步详细说明，但是此说明不会构成对本发明的限制。
实施例1
(一)细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建
1.目的基因Eg95的扩增
根据GenBank上登录的Eg95(X90928.1)cDNA序列，设计引物P1 3’-GCTCTCGAGATGGCATTCCAGTTA-5’,P23’-GAAGAATTCAGTAAGGACAACCAC-5’。处死细粒棘球蚴感染小鼠，无菌分离Eg包囊，抽提囊液，分离原头节，按RNAeasy Mini试剂盒提取总RNA，然后以总RNA为模板，用Oligo(dT)18随机引物进行反转录，再以P1,P2为引物进行PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见一条特异性条带，大小约为468bp，与预期的Eg95目的基因大小一致(如图1所示)，其中Eg95的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。
2.小鼠野生型Fc片段(Fc/wFc)和突变型Fc片段(Fc/mFc)的扩增
根据GenBank上收录的小鼠IgG2a的重链序列(V00798.1)，设计一对引物P3 GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGC,P4TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG，用于扩增Fc片段，然后通过点突变，使其丧失结合补体C1q位点的能力(将Glu318、Lys320、Lys322突变为Ala)，而保留结合FcRn的能力，将扩增出的片段命名为Fc/wFc，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2；进一步通过点突变的方式，以Fc/wFc为模板，将His310、His433突变为Ala残基，使其丧失与FcRn结合的能力，将扩增出的片段命名为Fc/mFc，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
3.Eg95-Fc/wFc(mFc)的扩增
在Eg95下游引物的5′端和Fc/wFc或Fc/mFc基因上游引物的5′端引入14个柔性氨基酸linker(GSGGGGSGGGGSGS)，然后通过长片段无模板扩增法获得融合片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定和序列测定正确的片段命名为Eg95-Fc/wFc和Eg95-Fc/mFc，Eg95-wFc融合基因序列为SEQ ID NO.4：(全长1209bp)。(结果如图2所示)。Eg95-mFc融合基因序列为SEQ ID NO.5：(全长1209bp)
4.Eg95-Fc/wFc(mFc)融合蛋白在杆状病毒表面的展示
展示Eg95-Fc/wFc(mFc)供体质粒的构建 将测序后正确的融合基因的PCR产物经XhoI和PstI双酶切后回收并纯化，然后定向插入与同样双酶切的转座质粒pBacSC(模式图如图3所示)的MCS中，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落，提取质粒，进行序列测定鉴定。
重组质粒的转座 将鉴定正确的重组质粒转化至含有杆状病毒DNA的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac(商品化产品，购买于Invitrogen公司)中，经过卡那霉素、庆大霉素和四环素三种抗性LB平板筛选，挑取白斑菌落，提取重组杆状病毒DNA。
重组杆状病毒DNA转染Sf-9细胞 将重组杆状病毒DNA利用脂质体2000转染Sf-9细胞，每天观察细胞形态及荧光表现。实验结果表明，普通倒置光学显微镜下观察，对照细胞未见明显变化，细胞长势良好，轮廓清晰，大小均一，胞体明亮；转染后第3天细胞停止生长，部分细胞直径增大，脱落，胞核充满整个细胞；第5天则可看到大部分细胞从瓶底脱落、悬浮，最终裂解死亡(如图4所示)。倒置荧光显微镜下观察，对照细胞未见荧光产生，而转染的细胞则出现绿色荧光，且随着转染时间的延长荧光逐渐增多、增强(如图5所示)。说明重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞后包装产生了具有感染活性的重组杆状病毒。待细胞出现病变或大量荧光出现后，收集培养上清作为原毒种，分小管贮存于-80℃冰箱。
重组杆状病毒的扩增 悬浮培养昆虫细胞，待细胞浓度达到1×106个/ml，以1MOI的重组杆状病毒量感染昆虫细胞，利用病毒在昆虫细胞中复制达到病毒增殖。感染3～4d后离心除去细胞及细胞碎片，收集上清液，便完成病毒量扩增。
在Sf-9细胞表面的展示 将重组病毒感染的Sf-9细胞接种于30mm共聚焦专用培养皿内，进行共轭聚焦显微镜分析。第一抗体分别为鼠抗His6单克隆抗体、兔抗Eg95阳性血清，第二抗体分别为FITC标记的羊抗鼠IgG和FITC标记的羊抗兔IgG。结果如图6所示，证明Eg95-Fc/wFc融合蛋白展示在了病毒感染的细胞膜上。
在病毒囊膜上的展示 将重组杆状病毒粒子经蔗糖密度梯度超速离心纯化后用Triton X-100处理，离心后分别收集病毒囊膜蛋白部分和核衣壳部分，用于Western blot分析。结果如图7所示，用兔抗Eg95抗体检测，完整的BacSC-Eg95病毒粒子可以检测到一条特异性条带，当将BacSC-Eg95用Triton X-100处理后，囊膜蛋白部分可检测到特异性条带，而核衣壳部分则检测不到任何条带，蛋白条带的大小与预测的Eg95融合蛋白的大小一致(Mr约为46 000)。说明Eg95融合蛋白展示在了出芽病毒粒子的囊膜上。
5.Eg95-Fc/wFc(mFc)重组病毒粒子的纯化
通过病毒感染Sf-9细胞完成病毒量的扩增。收集病毒感染3～4d的细胞，经反复冻融、离心收集上清液，然后通过超速离心和蔗糖密度梯度离心获得纯化的重组病毒粒子，用BCA法测重组蛋白浓度，置-80℃保存备用。
(二)FcRn介导外源蛋白胞转作用研究
1.体外FcRn介导外源蛋白胞转作用研究
将MDCK-FcRn细胞(将小鼠FcRnα链全长基因插入到pcDNA3.1质粒中，通过脂质体法将重组质粒转入MDCK细胞，然后通过G418筛选获得单克隆细胞株，由本实验构建并保存)和正常MDCK细胞接种在Transwell filterinserts培养板上，待长成单层，用组织电阻检测仪测定跨膜上皮电阻达到300Ω/cm2时，弃掉培养基，用无血清DMEM培养基平衡3h，然后将Eg95-Fc/wFc、Eg95-Fc/mFc和Eg95重组蛋白分别加入到内小室的细胞中，同时在DMEM培养基中加入(或不加入)1mg/ml鼠IgG或鸡IgY作为对照，在5％CO2，37℃培养箱中孵育2h，然后收集外小室的培养液，用于Western blot分析。
结果如图8所示，单独加入外源蛋白Eg95-Fc/wFc时，用Eg95抗体进行Western blot检测，发现有一条特异性的条带出现；当同时加入过量的小鼠IgG或鸡IgY时，由于IgG和融合Fc片段的外源蛋白对FcRn的竞争作用，抑制了外源蛋白的胞转，所以没有检测出特异性蛋白条带，而IgY由于和FcRn不结合，因而会有特异条带出现。而当加入外源蛋白Eg95-Fc/mwFc或Eg95时，用同样的方法处理，结果没有检测到任何蛋白条带。结果证明FcRn可介导融合Fc片段的外源蛋白发生胞转。
2.体内FcRn介导外源蛋白胞转作用研究
将50μg Eg95-Fc/wFc、Eg95-Fc/mFc和Eg95蛋白分别加入到50μl PBS中，将小鼠用100μl三溴乙醇(40mg/ml)麻醉后，通过鼻腔免疫C57BL/6小鼠，免疫后8h，分离小鼠血清，用ELISA方法测定血清中不同免疫组Eg95的抗体浓度。
结果如图9所示，通过鼻腔免疫Eg95-Fc/wFc，可显著提高血液中Eg95蛋白的抗体浓度(达到了13.27±0.5)，而免疫Eg95-Fc/mFc和单独的Eg95，血液中的Eg95抗体浓度则比较低。经统计学分析，Eg95-Fc/wFc免疫组的抗体浓度值与Eg95-Fc/mFc和Eg95对照组比较，差异显著(P＜0.05)。实验结果说明通过Fc-FcRn的相互作用，可以使目的蛋白有效的穿过黏膜上皮进入血液中。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)目的基因Eg95的扩增
合成引物
P1：3’-GCTCTCGAGATGGCATTCCAGTTA-5’,
P2：3’-GAAGAATTCAGTAAGGACAACCAC-5’；
处死细粒棘球蚴感染小鼠，无菌分离Eg包囊，抽提囊液，分离原头节，按RNAeasy Mini试剂盒提取总RNA，然后以总RNA为模板，用Oligo(dT)18随机引物进行反转录，再以P1,P2为引物进行PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离大小约为468bp特异性条带，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
(2)小鼠野生型Fc片段(Fc/wFc)和突变型Fc片段(Fc/mFc)的扩增
合成引物P3：3’-GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGC-5’,
P4：3’-TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG-5’，
用于扩增Fc片段，然后通过点突变将Glu318、Lys320、Lys322突变为Ala，将扩增出的片段命名为Fc/wFc，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2；进一步通过点突变的方式，以Fc/wFc为模板，将His310、His433突变为Ala残基，将扩增出的片段命名为Fc/mFc,其核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
(3)Eg95-Fc/wFc(mFc)的扩增
在Eg95下游引物的5′端和Fc/wFc或Fc/mFc基因上游引物的5′端引入14个柔性氨基酸linker(GSGGGGSGGGGSGS)，然后通过长片段无模板扩增法获得融合片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定和序列测定正确的片段命名为Eg95-Fc/wFc和Eg95-Fc/mFc，Eg95-wFc融合基因序列为SEQ IDNO.4；Eg95-mFc融合基因序列为SEQ ID NO.5；
(4)Eg95-Fc/wFc(mFc)融合蛋白在杆状病毒表面的展示
将测序后正确的融合基因的PCR产物经XhoI和PstI双酶切后回收并纯化，然后定向插入与同样双酶切的转座质粒pBacSC的MCS中，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落，提取质粒，进行序列测定鉴定；
将鉴定正确的重组质粒转化至含有杆状病毒DNA的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，经过卡那霉素、庆大霉素和四环素三种抗性LB平板筛选，挑取白斑菌落，提取重组杆状病毒DNA；
将重组杆状病毒DNA利用脂质体2000转染Sf-9细胞；待细胞出现病变或大量荧光出现后，收集培养上清作为原毒种，分小管贮存于-80℃冰箱；
悬浮培养昆虫细胞，待细胞浓度达到1×106个/ml，以1MOI的重组杆状病毒量感染昆虫细胞，利用病毒在昆虫细胞中复制达到病毒增殖，感染3～4d后离心除去细胞及细胞碎片，收集上清液，便完成病毒量扩增；
(5)Eg95-Fc/wFc(mFc)重组病毒粒子的纯化
通过病毒感染Sf-9细胞完成病毒量的扩增后，收集病毒感染3～4d的细胞，经反复冻融、离心收集上清液，然后通过超速离心和蔗糖密度梯度离心获得纯化的重组病毒粒子，用BCA法测重组蛋白浓度，置-80℃保存备用。
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2014
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20141224 |