CN104232606B - 一种改造的β‑葡萄糖苷酶及其表达基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改造的β‑葡萄糖苷酶及其表达基因与应用。改造的β‑葡萄糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该β‑葡萄糖苷酶的表达基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用本发明所述的β‑葡萄糖苷酶生产昆布二糖、纤维二糖、槐糖等二糖，与现有的二糖生产工艺相比，反应速度明显加快，反应温度更加温和，有效降低了生产能耗和生产成本，并且本发明所述的β‑葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量高，纯化过程简单，产生的昆布二糖、槐糖含量高，适合大规模的工业生产。

Description

一种改造的β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用

技术领域

本发明涉及一种改造的β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用，特别是一种改造β-葡萄糖苷酶和其表达基因与利用该酶生产昆布二糖、纤维二糖和槐糖的方法，属于生物技术和生物化工技术领域。

背景技术

二糖是由两个单糖分子经缩合反应除去一个水分子而成的糖。常见的双糖有蔗糖、昆布二糖、纤维二糖、槐糖等，昆布二糖是葡萄糖焦糖化的产物，多应用于农业领域，并可作为防腐剂之用。一般由植物天然多糖经水解或醋酸水解获得；纤维二糖是纤维素水解的产物，常作为木霉等菌株产纤维素酶的诱导物使用；槐糖则多用于医药、化工合成、生化研究，还广泛用于生物表面活性剂以及化妆品等行业，另外它还用于合成一种重要的可降解的生物表面活性剂--槐糖脂，具有非常广泛的应用价值。目前制造二糖的方法主要有从天然原料中提取、酶法合成等。但是从天然原料中提取存在提取产量低，价格昂贵，无法满足工业化生产等问题。而酶法生产二糖，存在着酶活性效率低、酶稳定性差、酶生产费用高昂等不利因素。目前酶法生产二糖，是以单糖或糖苷作为底物利用糖苷酶来生产二糖或以纤维素等多糖为底物经水解获得。

如中国专利文献CN101497633A(申请号200910025817.3)公开了一种利用甜菊糖苷来制备异甜菊醇和槐糖的专利，该发明采用一步水解法，在100～150℃、0.1～0.3MPa下反应20min～100min后通过过滤、萃取及吸附层析的方法，分离纯化得到异甜菊醇和槐糖两种产物。但是此方法存在对底物浓度要求苛刻，反应条件要求严格，反应时间难以精确控制等问题。到目前为止还没有报道有利用酶法来同时生产昆布二糖、纤维二糖和槐糖的文献。

昆布二糖目前试剂价格为170,000元/g，纤维二糖试剂价格为15元/g，槐糖试剂价格为350,000元/g，这三种二糖都未检索到规模化的工业产品，本发明的实施将有利于大幅度降低其昂贵的价格。

发明内容

本发明针现有技术的不足，提供一种改造的β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用。

发明概述

本发明通过对里氏木霉菌株中产生的β-葡萄糖苷酶(BGL)进行改造，发现与野生型β-葡萄糖苷酶(WT)相比，改造后的β-葡萄糖苷酶的作用产物的产量提高了3.2倍，其中槐糖的含量高达25g/L，并且反应条件更加温和，更加有利于工业化生产。

发明详述

本发明技术方案如下：

一种改造的β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种改造的β-葡萄糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，是将如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列插入表达载体获得。

根据本发明优选的，所述表达载体为pET-32A表达载体。

一种重组细胞，是将上述重组表达载体转化入细胞中获得。

根据本发明优选的，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述改造的β-葡萄糖苷酶在生产昆布二糖、纤维二糖和/或槐糖中的应用，步骤如下：

将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的表达基因导入到pET-32A表达载体中，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)中，通过亲和色谱分离纯化得到β-葡萄糖苷酶，然后将β-葡萄糖苷酶加入到以葡萄糖为底物的反应液中，在温度为28～32度、pH为7.2～7.6的条件下反应，经纯化，制得昆布二糖、纤维二糖和/或槐糖。

有益效果

1、本发明所述改造的β-葡萄糖苷酶在生产昆布二糖、纤维二糖和槐糖的酶活与野生型β-葡萄糖苷酶相比显著提高，昆布二糖、纤维二糖和槐糖的产量明显提高，反应速度明显加快。

2、本发明所述改造的β-葡萄糖苷酶的最适反应温度接近常温，在实际工业化生产中，有利于降低生产能耗，更加有利用降低成本。

3、本发明所述改造的β-葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量高，纯化过程简单，有利于大规模的工业化生产。

附图说明

图1、亲和层析纯化蛋白结果SDS-PAGE图谱；

其中：M、marker，1、WT镍亲和层析柱洗脱峰，2、改造的BGL镍亲和层析柱洗脱峰

图2、薄层层析分析产物成分；

其中：1、葡萄糖，2、昆布二糖，3、纤维二糖，4、槐糖，5、龙胆二糖，6，WT，7，改造后的BGL。

图3、HPLC分析WT型β-葡萄糖苷酶处理后产物成分结果图；

图4、HPLC分析改造的β-葡萄糖苷酶处理产物成分；

图5、在条件为pH7.4、温度为30度时，分别以质量浓度40％、60％、80％的葡萄糖溶液为底物，用改造的β-葡萄糖苷酶处理96小时后产物成分的柱状图；

图6、在条件为30℃、pH为7.4时，分别用野生型β-葡萄糖苷酶和改造的β-葡萄糖苷酶处理反应液后，不同时间产物产量的柱状图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述，应该说明的是，本发明的保护范围不仅限于此。

里氏木霉(trichoderma reesei)QM6a购自美国标准生物品保藏中心，菌种保藏号ATCC No.13631；

pET-32A质粒载体购自Novagen公司。

实施例1

(1)里氏木霉QM6a总RNA的提取：

里氏木霉QM6a菌株在加有2wt％微晶纤维素的MM培养基中培养2天，用滤纸过滤收集菌丝。将收集的菌丝放入预冷的研钵中研磨，其中研磨时加入一定的液氮。将研磨成的菌丝粉末移至1.5ml离心管中，并加入1ml RNAiso(购自生工生物工程有限公司B6402-1)于振荡器中震荡均匀，室温放5min。然后12000rpm离心10min。然后将上清吸到干净的1.5ml离心管中。然后加入160μl氯仿，震荡15s混匀，室温放置5min，12000rpm，4度离心5min。然后吸上清至新的1.5ml离心管。然后再加入800μl异丙醇，上下颠倒5次。室温放置10min，12000rpm，4度离心10min。弃上清。加入1ml预冷的75％乙醇清洗RNA，震荡后7500rpm离心5min。加入50μl DEPC处理过的水，溶解RNA。

MM培养基组分如下：硫酸铵3g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸镁0.18g，二水氯化钙0.24g尿素1.5g，1000×微量元素(七水硫酸铁5g/L，一水硫酸锰1.6g/L，七水硫酸锌1.4g/L，氯化钴2g/L)30μl，用水补足到300ml。

(2)β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：

以里氏木霉QM6a总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA(购自takara反转录试剂盒BK1201)：

①基因组DNA的去除反应

按以下比例配制反应液：

将上述反应液在42度条件下反应2min。

②反转录反应：

按以下比例配制反应液：

将上述反应液在37℃反应15min，接着在85℃反应5s。

以F，R为上下游引物扩增出bgl基因：

引物F：CCGGAATTCATGCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC；

引物R：CCCAAGCTTTGCCGCCACTTTAACCCTCTGC；

PCR反应在50μl体系中进行：2×PCR Buffer25μl，2mM dNTPs10μl，引物F1.5μl，引物R1.5μl，模板DNA1μl，KOD FX聚合酶1μl，加双蒸水补足到50μl。

PCR反应体系：在94℃变性2min后开始循环，然后98℃变性10s,60℃退火30s，68℃延伸90s，35个循环后，于68℃延伸10min，扩增得到PCR片段，进行切胶回收，并将回收的片段连接于pET-32A质粒载体上，连接位置位于质粒载体的多克隆位点EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ之间。接着将连接产物进行大肠杆菌DH5α的转化，并将产物涂布在含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10个小时后提取质粒，制得质粒PET32A-BGL。

(3)β-葡萄糖苷酶基因的改造

将上述重组质粒中的β-葡萄糖苷酶基因进行定点突变，突变位点为I177S、I174S、W173H。

首先突变位点I177S，以F1，R1为反向引物进行定点突变(试剂盒来源于东洋纺公司KOD-PLUS-Mutagenesis Kit167300)，序列如下：

F1：AGCTATGGATATGCCACCGGCAGCAACGC；

R1：GGCCTGAATCCAGGGTTCGTTGATGGTG；

①反向PCR

按以下比例配制PCR反应液：

PCR反应体系：在94℃变性2min后开始循环，然后98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸7min，共5个循环。

②DPN I酶对模板质粒的消化

在上述反应后的反应液中加入1μl的DPN I酶，在37℃条件下反应1个小时；

③PCR产物的自身环化

按以下比例配制反应液

将上述反应液在16度条件下反应1小时

反应后转化大肠杆菌DH5α，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10个小时后提取质粒。将此质粒进行序列测定。挑选出突变正确的质粒。

以上述突变位点I177突变正确的质粒为模板，突变I174位点，设计反向PCR引物F2和R2。按照上述同样的方法设计反向PCR引物F3和R3进行第三个位点的突变，最后挑选出突变正确的质粒。

F2:AGTCAGGCCAGCTATGGATATGCCACCG

R2：CCAGGGTTCGTTGATGGTGATCCAGTTCT

F3:CACAGTCAGGCCAGCTATGGATATGCCACC

R3：GGGTTCGTTGATGGTGATCCAGTTCTGG

制得的β-葡萄糖苷酶表达基因经华大基因生物工程公司测序验证，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，制得重组质粒。

将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，将得到的含有重组质粒的大肠杆菌扩大培养，培养至OD₆₀₀为0.6时，加入浓度为100mM的IPTG溶液，IPTG溶液的加入量为培养基质量的千分之一，16℃条件下诱导16个小时。然后在7000rpm条件下离心10min，收集菌体，用pH为7.4，100mM磷酸氢二钠/磷酸二氢钠(PBS)缓冲液洗涤菌体两遍。通过超声破碎后，用离子交换色谱的方式纯化出目的蛋白(结果如图1所示)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将纯化的蛋白与反应液按每1ml反应液添加0.35mg的酶量进行反应。反应条件为30℃，pH为7.4，反应液成分为10ml体系中加入80wt％的葡萄糖，500μl叠氮化钠，1mL的pH7.4的100mMPBS缓冲溶液。反应96小时后，样品沸水浴10min将酶灭活。然后通过HPLC(图4)和薄层层析(图2)鉴定产物浓度和种类。

实施例2

将实施例1纯化得到目的蛋白(改造的β-葡萄糖苷酶)和野生(WT)型β-葡萄糖苷酶分别取100μl加入到含5mM的p-nitrophenyl glucoside的100mM的PBS缓冲溶液中(含10wt％甘油)，pH为7.4，温度为30℃，反应30分钟。用10wt％碳酸氢钠溶液150μl终止反应。取适量的体积在420nm光波长处测定OD值，检测水解酶活。使用Bradford试剂盒(上海生工生物工程SK3041-1)测定其蛋白质浓度。

酶活定义如下：每分钟转化产生1mM pNP为一个酶活单位(U)。结果如表1所示。从表中可以看出改造的β-葡萄糖苷酶的表达量提高，但水解酶活下降，与野生(WT)型β-葡萄糖苷酶相比，这更有利于二糖积累。

表1

	蛋白(g/L)	水解酶活(U/L)	比酶活(U/g)
				野生型β-葡萄糖苷酶	9.97	2020	200
改造的β-葡萄糖苷酶	17.06	1580	90

实施例3

将实施例2中的条件进行优化，使转糖基活性达到较高水平。分别设定不同的温度，pH值优化本发明改造的β-葡萄糖苷酶的转糖基作用。通过实验得出在条件为pH7.4，温度为30度时，转糖基活性最高，并在96小时左右达到最高值。在此条件下分别以质量浓度40％，60％，80％的葡萄糖溶液为底物，得到96小时的昆布二糖、纤维二糖和槐糖的含量如图5所示。

实施例4

将实施例1纯化后目的蛋白(改造的β-葡萄糖苷酶)与反应液按每1ml反应液添加0.35mg的酶量进行反应。反应条件为30℃，pH为7.4，反应液成分为10ml体系中加入质量浓度为80％的葡萄糖溶液，500μl叠氮化钠，1mL的pH7.4的100mM PBS缓冲溶液。反应阶段定时取样，样品沸水浴10min灭酶活，结果如图6。

Claims (7)

1.一种β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种β-葡萄糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，是将如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列插入表达载体获得。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征是所述表达载体为pET-32a表达载体。

5.一种重组细胞，是将权利要求3或4所述的重组表达载体转化入细胞获得。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征是所述细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

7.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在生产昆布二糖、纤维二糖和槐糖中的应用，其特征在于，步骤如下：

将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的表达基因导入到pET-32a表达载体中，然后转化大肠杆菌BL21（DE3）中，通过亲和色谱分离纯化得到β-葡萄糖苷酶，然后将β-葡萄糖苷酶加入到以葡萄糖为底物的反应液中，在温度为28～32度、pH为7.2～7.6的条件下反应，经纯化，制得昆布二糖、纤维二糖和槐糖。