CN104215703B - 一种注射用益气复脉中糖苷类大分子物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种注射用益气复脉（冻干）中糖苷类大分子物质的检测方法，具体为：采用高效凝胶色谱法及ELSD检测器进行测定，即Ultrahydrogel250色谱柱(7.8mm×300mm)并已甲酸‑水（1:5000）为流动相进行检测，建立了大分子物质（杂质）的液相测定方法，该方法操作简便、结果准备可靠且灵敏度高。
Description
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物的检测方法，特别涉及一种注射用益气复脉中糖苷类大分子物质的检测方法。
背景技术：
注射用益气复脉(冻干)是由红参、麦冬、五味子制成的用于静脉滴注的中药复方制剂，具有益气复脉，养阴生津的疗效。主要用于冠心病劳累性心绞痛气阴两虚证，症见胸痹心痛，心悸气短、倦怠懒言、头晕目眩、面色少华、舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代；冠心病所致慢性左心功能不全II、III级气阴两虚证，症见心悸、气短甚则气急喘促，胸闷隐痛，时作时止，倦怠乏力，面色苍白，动则汗出，舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代。
注射用益气复脉(冻干)性状：本品为浅黄色的疏松块状物；有引湿性。取1瓶内容物，加水2～3ml溶解后，为棕红色澄明液体。用法用量：静脉滴注。每日1次，每次8瓶，用250ml～500ml 5％葡萄糖注射液或生理盐水稀释后静脉滴注。每分钟约40滴。疗程2周。
注射用益气复脉(冻干)中主要成分为糖类、皂苷类、木脂素类等；其中主要活性成分为皂苷类和木脂素类，其分子量大多数不超过1000。而处方药材中相对分子量 较大的物质如蛋白质、多肽、多糖等在提取和制剂工艺过程中是作为杂质而去除的物质。成品中不应存在，为保证成品的质量，有必要对这些大分子物质进行定性和定量的检测，本研究正是基于上述情况，建立了高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测法并对注射用益气复脉(冻干)中可能存在的大分子量物质进行检测，此方法简便、快捷和灵敏，可用于注射用益气复脉(冻干)中大分子物质的检查，具有实用意义。
发明内容：
本发明提供一种注射用益气复脉中糖苷类大分子物质的检测方法，所述方法为用高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测法对注射用益气复脉样品进行检测，其中，进样检测参数为：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱；柱温25-35℃；流动相为甲酸-水1:2500-7500，流动相pH值为2-7；流速0.25-0.75ml·min-1；检测器：飘移管温度85-100℃，气压0.1-0.2MPa。
其中进样检测流动相优选为甲酸-水1:5000，流速0.5ml·min-1、流动相pH值为3；检测器参数优选：飘移管温度90℃，气压0.17MPa；
上述注射用益气复脉中糖苷类大分子物质的检测方法，优选检测参数为：柱温30℃；流动相为甲酸-水1:5000，流动相pH值为3；流速0.5ml·min-1；检测器参数：飘移管温度90℃，气压0.17MPa。
上述用高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测法对注射用益气复脉(冻干)样品的检测方法包括：
被检测样品的配制，方法如下：
取注射用益气复脉(冻干)用超纯水配制成浓度约为50-200mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.25-0.65μm微孔滤膜过滤，得到被检测样品。
进样检测，方法如下：
取续滤液，注入色谱仪，进样量10-40μL，
所述色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；
柱温(25-35)℃；
流动相为甲酸-水(1:2500-7500)，流动相pH值为2-7；
流速0.25-0.75ml·min-1。
检测器参数：飘移管温度85-100℃，气压0.1-0.2MPa；进样量10-40μL。
保留时间大于16min的均为小分子量物质，保留时间在16min内的为大分子物质。
本发明最优选的技术方案如下：
其中，样品的配制方法：
取1注射用益气复脉(冻干)用超纯水配制成浓度约为100mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μL，
色谱条件：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；
柱温30℃；
流动相为甲酸-水1:5000，流动相pH值为3；
流速0.5ml·min-1。
检测器参数：飘移管温度90℃，气压0.17MPa；进样量20μL。
本发明的检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器和试药
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2420型蒸发光散射检测器，WatersUltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm；i.d)，XWK-3A空气泵(天津市华生分析仪器厂)，XS105梅特勒精密电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；右旋糖苷分子量标准品由中国药品生物制品鉴定所提供(批号140640-201002相对分子量分180,2500,4600,7100,10000,21400,41100,84400)，
注射用益气复脉(冻干)由天津天士力之骄药业有限公司提供，超纯水自制。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；柱温30℃；流动相为甲酸-水；流动相PH 3流速0.5ml·min-1。检测器参数：飘移管温度90℃，气压0.17MPa；进样量20μL。
2.2分子量标记物保留时间考察精密称取8份相对分子量为180,2500,4600,7100,10000,21400,41100,84400的右旋糖苷分子量标准品适量，用超纯水配制成各约1mg·mL-1的溶液，同时水作空白对照溶液，按上述色谱方法，分别进样，测定，图谱见图1。图1是8种不同分子量右旋糖酐对照品及空白对照的HPGPC图
表1是8种不同分子量右旋糖酐对照品的保留时间
从表1结果可知，保留时间大于16min的均为小分子量物质，故保留时间在16min内的可初步推测其为大分子物质。
2.3仪器精密度考察精密称量相对分子量为2500、4600、10000和41100的右旋糖酐对照品，分别用水稀释得浓度为1.18mg·mL-1、1.24mg·mL-1、1.32mg·mL-1和1.36mg·mL-1的溶液，分别连续进样6次，测定保留时间，计算RSD，结果相对分子量为4600、10000和41100的右旋糖酐标准品和保留时间的RSD分别为0.3093％、0.3077％和0.2717％(n＝6)，表明精密度良好。
2.4对照品最低检出限精密称量取相对分子质量为2500、4600、10000和41100的右旋糖酐对照品，分别用水稀释至刻度，得浓度为2.16mg·mL-1、2.25mg·mL-1、 2.08mg·mL-1和2.44mg·mL-1的溶液，分别稀释至20倍、50倍、100倍、200倍、500倍，进样分析。结果表明，二者在稀释到500倍时，样品峰的s/n分别为7.52、3.13、4.21和3.37，故可判断右旋糖苷对照品的最低检出限约为4μg·mL-1。
2.5对照品稳定性考察取上述两种右旋糖酐对照品溶液，分别放置0、2、4、8h后按上述条件进样测定，计算保留时间的RSD，结果相对分子质量为2500、4600、10000和41100的右旋糖酐对照品的保留时间的RSD分别为0.1013％、0.1260％、0.3514％和0.2237％(n＝4)，结果表明对照品溶液在8h内稳定。
2.6样品测定分别取10批注射用益气复脉(冻干)(来源:天津天士力之骄药业有限公司)用超纯水配制成浓度约为100mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μL，用步骤2.1所述的方法进行测定。样品HPGPC图见图2。图2是10批注射用益气复脉(冻干)的HPGPC-ELSD图
结果表明所测10批注射用益气复脉(冻干)样品的出峰时间均高于16min，可判断样品中无大分子物质或含量极低。
为证明本方法的准确性，向以上无大分子糖苷类物质的3批样品中添加右旋糖酐对照品进行测定得下图,图3是3批注射用益气复脉(冻干)外加浓度约1mg·mL-1分子量为10000和41100的2种右旋糖酐标准品的HPGPC-ELSD图，其他参数与上述方法相同。
2.7样品稳定性考察精密称取注射用益气复脉(冻干)，用水溶解并定容至100mg·mL-1。分别考察在0、2、4、8h放置后样品在水溶液中的稳定性。所得HPGPC图见图4。图4样品在水溶液中的稳定性
结果表明:样品溶解于水溶液中后在8h内测定没有出现大分子物质，因此样品在水溶液中8h内稳定性良好。
3分析与讨论
3.1目前，对于中药注射剂中的大分子量物质的检测尚无法规性方法可作参考。本研究中的方法学验证是参照《中国药典》2010版一部附录ⅩⅧ中药质量标准分析方法验证基本要求进行的。
3.2结合注射用益气复脉(冻干)中的各类化学成分所占的比例的研究结果：其中总糖含量在制剂中的比例较高，故本研究选用右旋糖苷分子量标准品为标记，来建立检测方法，用于检测制剂中可能存在的大分子物质。
3.3依据凝胶色谱的分离原理：相同实验条件下，物质的分子质量越大，越不易进入凝胶空隙，保留时间越短；反之分子质量越小，保留时间越长。基于这一原理建立此方法对中药注射剂生产工艺过程中的大分子量物质进行检测，简便易行。并通过对Ultrahydrogel 250色谱柱(7.8mm×300mm)和Ultrahydrogel 500色谱柱(7.8mm×300mm)的适用性进行对比，选用Ultrahydrogel 250色谱柱(7.8mm×300mm)来建立方法。蒸发光散射检测器设计用于高效液相色谱系统，较之前所利用示差折光检测器所建立的方法更有优势，此方法不仅稳定性更高，精密度更好，而且灵敏度也有提高，最低检出限(以右旋糖酐计)约为4μg·mL-1。此外，蒸发光散射检测器可以用于梯度洗脱，较示差折光检测器更便于进一步优化开发新方法，适用范围更广。
3.4此方法选用甲酸-水为流动相pH约为3.0，经考察用此流动能够排除皂苷类和木脂素类成分因物理聚合形式聚集物而对大分子物质测定结果产生干扰。样品测定时选用样品浓度约为100mg·mL-1，即取本品1瓶，加注射用水2.6mL使溶解；与RID检测方法[4]相比既明显增大了样品浓度，提高检测样品中大分子物质的灵敏度，又与注射用益气复脉(冻干)质量标准检查项中杂质检测的浓度相一致。
以下附图为上诉无糖苷类物质的10批次产品，但测定过程中流动相改为水，其他方法与本申请测定方法相同：图5,10批注射用益气复脉(冻干)的HPGPC-ELSD图.
由以上附图可知当流动相为水时，本身不含大分子糖苷类物质的样品，其图谱中出现了大分子杂峰，说明当以水为流动相时不能避免皂苷类和木脂素类成分因物理聚合形式聚集物而对大分子物质测定结果产生干扰。
本研究采用HPGPC-ELSD检测注射用益气复脉(冻干)中糖苷类大分子物质，操作简便、结果准备可靠且灵敏度更高，原先测定方法检测器要平衡12h后才能测定，每个样品测定需1h，灵敏度不高。新方法：检测器平衡时间短约15-30min，每个样品测定需30min，灵敏度高。因此，本方法可作为益气复脉(冻干)的质量控制方法。也可为其他中药制剂中大分子物质的检测提供参考。
本发明的测定方法效果好，操作简单，易于推广。
附图说明
图1为8种不同分子量右旋糖酐对照品及空白对照的HPGPC图；
图2为本发明方法检测10批注射用益气复脉(冻干)得到的HPGPC-ELSD图；
图3为3批注射用益气复脉(冻干)外加分子量为10000和41100的2种右旋糖酐标准品的HPGPC-ELSD图；
图4为样品在水溶液中的稳定性；
图5为本发明方法中的流动相为水时检测10批注射用益气复脉(冻干)得到的HPGPC-ELSD图。
具体实施方式：
以下通过实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
取注射用益气复脉(冻干)(来源:天津天士力之骄药业有限公司)用超纯水配制成浓度约为100mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μL，色谱条件:色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；柱温30℃；流动相为甲酸-水(1:5000)；流动相PH 3,流速0.5ml·min-1。检测器参数：飘移管温度90℃，气压0.17MPa；进样测定。
检测结果：保留时间大于16min
实施例2
取注射用益气复脉(冻干)(来源:天津天士力之骄药业有限公司)用超纯水配制成浓度约为50mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.25μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样10μL，色谱条件:色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；柱温25℃；流动相为甲酸-水(1:2500)；流动相PH 2,流速0.25ml·min-1。检测器参数：飘移管温度85℃，气压0.1MPa；进样测定。
实施例3
取注射用益气复脉(冻干)(来源:天津天士力之骄药业有限公司)用超纯水配制成浓 度约为200mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.65μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样40μL，色谱条件:色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；柱温35℃；流动相为甲酸-水(1:7500)；流动相PH 7,流速0.75ml·min-1。检测器参数：飘移管温度100℃，气压0.2MPa；进样测定。
实施例4
取注射用益气复脉(冻干)(来源:天津天士力之骄药业有限公司)用超纯水配制成浓度约为150mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.5μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样30μL，色谱条件:色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；柱温35℃；流动相为甲酸-水(1:6000)；流动相PH 5,流速0.65ml·min-1。检测器参数：飘移管温度85℃，气压0.17MPa；进样测定。
实施例5
取注射用益气复脉(冻干)(来源:天津天士力之骄药业有限公司)用超纯水配制成浓度约为80mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μL，色谱条件:色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；柱温30℃；流动相为甲酸-水(1:4000)；流动相PH 6,流速0.7ml·min-1。检测器参数：飘移管温度95℃，气压0.17MPa；进样测定。
实施例6
检测方法包括：
被检测样品的配制，方法如下：
取注射用益气复脉(冻干)用超纯水配制成浓度约为50mg·mL-1的溶液，摇匀， 经0.5μm微孔滤膜过滤，得到被检测样品。
进样检测，方法如下：
取续滤液，注入色谱仪，进样量30μL，
所述色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；
柱温(25)℃；
流动相为甲酸-水(1:2500)，流动相pH值为2；
流速0.25ml·min-1。
检测器参数：飘移管温度85℃，气压0.1MPa；进样量20μL。
检测结果：保留时间大于16min。
实施例7
检测方法包括：
被检测样品的配制，方法如下：
取注射用益气复脉(冻干)用超纯水配制成浓度约为200mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.65μm微孔滤膜过滤，得到被检测样品。
进样检测，方法如下：
取续滤液，注入色谱仪，进样量40μL，
所述色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；
柱温(35)℃；
流动相为甲酸-水(1:7500)，流动相pH值为7；
流速0.75ml·min-1。
检测器参数：飘移管温度100℃，气压0.2MPa；进样量40μL。
检测结果：保留时间大于16min。
实施例8
检测方法包括：
被检测样品的配制，方法如下：
取注射用益气复脉(冻干)用超纯水配制成浓度约为150mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.5μm微孔滤膜过滤，得到被检测样品。
进样检测，方法如下：
取续滤液，注入色谱仪，进样量30μL，
所述色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱(7.8×300mm)；
柱温(25)℃；
流动相为甲酸-水(1:2500)，流动相pH值为2；
流速0.25ml·min-1。
检测器参数：飘移管温度85℃，气压0.1MPa；进样量10μL。
检测结果：保留时间大于16min。
Claims (4)
1.一种注射用益气复脉中糖苷类大分子物质的检测方法，所述方法包括以下步骤：
用高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测法对注射用益气复脉冻干样品进行检测，检测方法包括：
被检测样品的配制，方法如下：
取注射用益气复脉冻干粉用超纯水配制成浓度约为50-200mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.25-0.65μm微孔滤膜过滤，得到被检测样品；
所述色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱，7.8×300mm；
柱温25-35℃；
流动相为甲酸-水1:5000，流动相pH值为3；
流速0.5ml·min-1；
检测器参数：飘移管温度85-100℃，气压0.1-0.2MPa；
通过高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测后，将样品谱图与对照品谱图进行比对，确定样品中是否含有糖苷类大分子物质,从样品谱图中保留时间/出峰时间是否大于16min，判断是否含有糖苷类大分子物质,保留时间大于16min的均为小分子量物质，保留时间在16min内的推测为大分子物质。
2.如权利要求1的检测方法，其特征在于，检测器参数：飘移管温度90℃，气压0.17MPa。
3.如权利要求1的检测方法，其特征在于，进样检测参数为：
柱温30℃；
流动相为甲酸-水1:5000，流动相pH值为3；
流速0.5ml·min-1；
检测器参数：飘移管温度90℃，气压0.17MPa。
4.如权利要求1的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
用高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测法对注射用益气复脉冻干样品进行检测，检测方法包括：
被检测样品的配制，方法如下：
取注射用益气复脉冻干粉用超纯水配制成浓度约为100mg·mL-1的溶液，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到被检测样品；
所述色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为Waters UltrahydrogelTM 250凝胶色谱柱；
柱温30℃；
流动相为甲酸-水1:5000，流动相pH值为3；
流速0.5ml·min-1；
检测器参数：飘移管温度90℃，气压0.17MPa；
通过高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测后，将样品谱图与对照品谱图进行比对，确定样品中是否含有糖苷类大分子物质,从样品谱图中保留时间/出峰时间是否大于16min，判断是否含有糖苷类大分子物质,保留时间大于16min的均为小分子量物质，保留时间在16min内的推测为大分子物质。
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