CN104212440A - 一类喹唑啉类荧光探针及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类喹唑啉类荧光探针及其制备方法，该荧光探针结构为荧光素标记的Gefitinib(吉非替尼)，它对EGFR蛋白激酶有较强的抑制活性，具有潜在的癌症治疗功效；共聚焦荧光成像结果表明该荧光探针与多种细胞株作用后，均分布在细胞膜上，可用于癌细胞成像。流式细胞仪测定结果表明细胞荧光强度增强倍数与细胞中EGFR含量呈正相关性。借助流式细胞分析技术，该荧光探针能够应用于细胞中生物标志物EGFR的相对定量检测，为癌症诊断提供更为直接的信息。由于该荧光探针兼具癌症诊断和治疗功能，且可直接检测活细胞，分析快速、操作简便、成本低，具有开发应用价值。

Description

一类喹唑啉类荧光探针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的癌症诊断和治疗领域，具体涉及一类具有癌症诊断和治疗功能的喹唑啉类荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)是危害人类健康最严重的疾病之一，它是多基因参与的多阶段性复杂疾病。在复杂的细胞信号转导过程中，某些关键蛋白和调控因子的过表达，可导致细胞失去正常生长调控，导致过度增殖，形成肿瘤。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是具有酪氨酸蛋白激酶活性的一种跨膜糖蛋白。EGFR作为肿瘤形成、发展过程中重要的调控因子，已经作为肿瘤标志物成为肿瘤靶向治疗的主要靶标之一。

分子靶向药物Gefitinib(吉非替尼)是一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂(PKI)，已用于治疗表皮生长因子受体EGFR过表达的癌症。该药物可特异性地占据EGFR在细胞膜内的ATP结合域，有效抑制EGFR酪氨酸激酶活性，阻断EGFR信号转导通路，遏制肿瘤细胞的生长繁殖。EGFR高表达的肿瘤患者对Gefitinib(吉非替尼)类靶向药物敏感，反之，药效显著降低。因此，患者在接受EGFR靶向药物治疗前，需进行EGFR基因表达水平检测。

临床研究表明，肿瘤标志物的存在或量变已经成为肿瘤诊断、预后、及治疗过程中的重要指标，而且肿瘤标志物的含量与肿瘤恶性程度往往正相关。虽然DNA检测可以提供重要的诊断信息，而蛋白质是正常和病变细胞各种生理过程中更直接的介质。因此，某些肿瘤标志物蛋白质表达量的测定，可提供更为准确、直接的诊断、预后信息，用于患者病情监测和疗效评价。为此，我们基于分子靶向药物Gefitinib特异性调控EGFR信号转导过程的干预模式，构建了一种生物活性荧光探针分子，实现了对活细胞中EGFR的定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有癌症诊断和治疗功能的喹唑啉类荧光探针，该探针兼具癌症诊断和治疗功能。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一类具有癌症诊断和治疗功能的喹唑啉类荧光探针，其含有荧光发色基团和吉非替尼骨架结构，通式如下：

其中n值为1～5。

所述荧光探针含有吉非替尼骨架，能够特异性地占据EGFR在细胞膜内的ATP结合域，有效抑制EGFR酪氨酸激酶活性，阻断EGFR信号转导通路，遏制肿瘤细胞的生长繁殖，能够起到癌症治疗的效果。进一步地，酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)表明所述荧光探针对EGFR具有高的抑制活性，对癌症治疗具有潜在功效。

EGFR是一种跨膜蛋白，其与抑制剂结合的“口袋”位于细胞内，共聚焦荧光成像结果表明荧光素标记的Gefitinib分别与5种细胞株(4种肿瘤细胞，1种正常细胞)作用后，均分布在细胞膜上，定性表明了探针分子能跨膜进入细胞与EGFR结合。

进一步地，流式细胞仪分析表明，细胞与本发明的喹唑啉类荧光探针孵育后，细胞荧光增强的倍数与分子生物学方法检测出的细胞中EGFR含量呈正相关性。据此，本发明的喹唑啉类荧光探针结合流式细胞仪能够对细胞中的EGFR含量进行相对定量检测。而EGFR作为肿瘤标志物之一，其含量的测定，可为癌症诊断提供更为准确、直接的信息。

综上，本发明的喹唑啉类荧光探针兼具癌症诊断和治疗功能。

本发明进一步提供了上述喹唑啉类荧光探针的制备方法，其中包括以下步骤：(1)在有机溶剂中，30℃～50℃温度下，溴乙酸乙酯、4-(3’-氯-4’-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-羟基喹唑啉和碳酸钾混合，得到乙酸酯衍生物；(2)将乙酸酯衍生物中间体与强碱在第二溶剂混合体中接触，再与酸液接触，反应得到乙酸衍生物；(3)将步骤(2)得到的乙酸衍生物与5-氨基荧光素，在催化剂作用下于第三有机溶剂中接触反应得到目标产物喹唑啉类荧光探针。

步骤(1)中碳酸钾作为缚酸剂，与副产物HBr反应，减少反应中HBr的含量，促进反应向生成乙酸酯衍生物的方向进行，使反应产率提高。

合成路线如下所示：

作为本发明所述荧光探针的制备方法的一个优选方案，其中步骤(1)中的有机溶剂为DMF，所述温度为40℃。

步骤1中选择DMF作溶剂，使难溶的原料4-(3’-氯-4’-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-羟基喹唑啉完全溶解，使两个主要原料在均相体系中充分接触，促进反应进行，提高产率。

作为本发明喹唑啉类荧光探针的制备方法的另一个优选方案，步骤(2)中第二溶剂体系为水-甲醇-四氢呋喃的混合溶剂，体积比为1:1:3，所述强碱为NaOH，所述酸液为HCl。

水-甲醇-四氢呋喃混合溶剂，便于氢氧化钠及水解产物的溶解，四氢呋喃的使用便于乙酸酯衍生物的溶解，维持反应在一个均相体系中进行，使反应物充分接触，提高产率。

选用常用的强碱NaOH和常用的酸液HCl使乙酸酯衍生物转化为乙酸衍生物，副产物为NaCl，无副作用。

作为本发明荧光探针的制备方法的又一个优选方案，步骤(3)中第三有机溶剂为吡啶，催化剂为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐。

步骤3中选择吡啶作反应溶剂，吡啶分子上N原子的孤对电子能够提供一个碱性环境，使其既可以做非质子性溶剂又可以充当缚酸剂，促进反应进行；EDCI是优良高效的酰胺合成催化剂，不需加热，其反应副产物易溶解于水，反应结束后加水即可方便除去，合成及提纯条件温和，工艺简单，且产率高。

本发明还提供了所述荧光探针在癌症诊断和治疗中的应用。

作为本发明所述的荧光探针在癌症诊断和治疗中的应用的一种优选方案，其中癌症诊断通过相对定量检测细胞中EGFR含量进行，具体步骤如下：(1)所述荧光探针与细胞作用一段时间，使荧光强度稳定；(2)采用流式细胞仪检测所述荧光探针作用细胞后荧光强度增强倍数；(3)采用分子生物学方法测定细胞中EGFR含量；(4)根据测得的荧光强度增强倍数与细胞中EGFR含量的正相关性，对细胞中EGFR含量进行相对定量检测。

作为上述优选方案的进一步优选方案，所述荧光探针与细胞作用后荧光强度稳定时间为1～4h，所述荧光探针在细胞培养液中的浓度为1～50μM，作为再进一步的优选方案，所述荧光探针与细胞作用后荧光强度稳定时间为3h，所述荧光探针在细胞培养液中的浓度为10μM。

本发明荧光探针浓度大于50μM时，因浓度大溶解不彻底，有颗粒物，不利于成像及流式细胞仪检测；若浓度小于1μM时，所有细胞荧光强度都太弱，细胞荧光成像无强度差别，使所得荧光增强倍数数值误差大。因此选择所述荧光探针在细胞培养液中的浓度为1～50μM，使所述荧光探针在对细胞中EGFR含量进行相对定量检测更准确。

所述荧光探针与细胞作用后荧光强度稳定时间为1～4h，达到稳定后，便可进行检测，与传统方法相比，所需时间短，分析检测速度快。所述荧光探针与细胞作用一段时间使荧光强度稳定后再检测其荧光强度增强倍数，使测得的数据准确且重现性好，使本发明的喹唑啉类荧光探针在细胞中EGFR相对定量分析更为准确。

另外，本发明还提供了所述荧光探针在癌细胞成像中的应用，共聚焦荧光成像表明了荧光探针分布在细胞膜上，其可以作为一种具有EGFR抑制活性的、高灵敏的荧光探针应用于癌细胞的成像。

本发明的有益效果：本发明提供了一种具有荧光发色基团和吉非替尼骨架结构的喹唑啉类荧光探针，对EGFR具有高的抑制活性，本发明的喹唑啉类荧光探针兼具癌症诊断和治疗的作用；本发明提供了一种喹唑啉类荧光探针的制备方法，条件温和，工艺合理；本发明的喹唑啉类荧光探针结合流式细胞仪能够对细胞中的EGFR含量进行相对定量检测，与传统方法相比，该方法可直接检测活细胞，且分析快速、操作简便、成本低，具有潜在的开发应用价值；本发明的荧光探针能够用于癌细胞成像，具有高荧光强度。

附图说明

图1为ELISA方法测定的化合物d抑制EGFR激酶活性的IC₅₀曲线。

图2为化合物d与MCF-7细胞孵育后的激光共聚焦成像图。

图3为化合物d与A431细胞孵育不同时间后细胞内的荧光强度。

图4为本发明的喹唑啉类荧光探针的结构式。

具体实施方式

其中部分试验材料：

表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)购自美国Sigma公司；生物素标记的EGFR底物(Tyr66)，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，双对氯苯基三氯乙烷(DTT)，Phospho-Tyrosine MousemAb(P-Tyr-100)，Tyrosine Kinase Buffer均购自美国Cell Signaling公司。Human EGFR(Full length)Kit为美国invitrogen公司产品。

实施例1

荧光探针的制备

(1)在100mL的单口烧瓶中将1.1g(约6.59mmol)的溴乙酸乙酯、2.0g(约6.27mmol)原料a：(4-(3’-氯-4’-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-羟基喹唑啉)、2.6g(约18.8mmol)碳酸钾分散到20mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，在40℃下搅拌，用TLC跟踪观察反应进程，约0.5小时反应完全，停止反应，过滤反应液，收集滤液，将滤液滴入到80mL的蒸馏水中，立刻析出大量的黄色沉淀，静置2小时后，过滤，收集滤饼，真空干燥得到粗产品，用V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20:1的混合溶剂重结晶，得淡黄色沉淀纯产物b，即乙酸酯衍生物中间体，产率为75％；测定其熔点，并对其进行质谱，核磁表征，结果如下：

mp.219–220℃ ESI-MS(m/z):406.2[M+H]⁺,444.2[M+K]⁺(C₁₉H₁₇ClFN₃O₄理论[M+H]⁺m/z:406.09)，¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.51(s,1H),8.51(d,1H),8.14–8.01(m,1H),7.81(d,1H),7.78–7.73(m,1H),7.46(t,1H),7.24(s,1H),4.96(d,2H),4.22(q,2H),3.97(s,3H),3.76(s,1H),1.24(t,3H).¹³C NMR(DMSO-d⁶,600MHz)δ(ppm):168.99,168.43,156.58,154.82,153.46,147.70,137.06,124.15,123.93,119.28,117.08,108.91,108.11,103.68,65.823,61.23,56.42,52.41,14.50.Anal.Calcd(％)for C₁₉H₁₇ClFN₃O₄(F.W.405.81):C,56.23；H,4.22；N,10.35；Found:C,55.34；H,3.93；N,10.32。

(2)在100mL的单口烧瓶中，将1.5g(约3.69mmol)化合物b、0.74g(约18.5mmol)的NaOH溶解到30mL的水-甲醇-四氢呋喃(1:1:3)混合溶剂中，室温下，搅拌约2小时。反应停止后，真空旋蒸浓缩反应液到10mL，用25％HCl溶液调节至弱酸性pH<7，用氯仿萃取3×10mL，合并有机相，浓缩析出白色沉淀，过滤，干燥，得到纯目标产物c，即乙酸衍生物，产率为81％；测定其熔点，并对其进行质谱，核磁表征，结果如下：

mp.265–266℃ ESI-MS(m/z):378.1[M+H]⁺(C₁₇H₁₃ClFN₃O₄理论[M+H]⁺m/z:378.06)；¹HNMR(600MHz,DMSO)δ(ppm)13.11(br,1H),11.45(s,1H),8.85(s,1H),8.37(s,1H),8.04–8.02(q,1H),7.76-7.74(m,1H),7.55-7.52(t,1H),7.41(s,1H),4.99(s,2H),4.02(s,3H).¹³CNMR(DMSO-d⁶,600MHz)δ(ppm):169.54,158.64,156.78,154.68,149.69,149.03,134.78,127.03,125.72,125.67,119.55,117.30,107.64,105.40,101.11,65.93,56.97.Anal.Calcd(％)forC₁₇H₁₃ClFN₃O₄·H₂O(F.W.395.75):C,51.59；H,3.82；N,10.62；Found:C,50.73；H,3.79；N,9.38。

(3)将83mg(0.43mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)加入到3mL溶有5-氨基荧光素150mg(0.43mmol)和化合物c 161.59mg(0.43mmol)的吡啶溶液中，室温搅拌过夜，停止反应，将反应倒入15mL的蒸馏水中，用浓HCl调节酸碱性至pH<2，搅拌1h后，沉淀物析出并过滤，用少许的蒸馏水多次冲洗，再溶于少量乙酸乙酯中，加入少许环己烷，析出橙红色沉淀，分离并收集沉淀，干燥得到化合物d，即目标产物喹唑啉类荧光探针，产率为58％；测定其熔点，并对其进行质谱，核磁表征，结果如下：

mp.272–274℃.MALDI-TOF-MS(m/z):707.23[M+H]⁺,(C₃₇H₂₄ClFN₄O₈理论[M+H]⁺m/z:707.13)；¹H NMR(DMSO-d⁶,400MHz)δ(ppm):10.86(s,1H),10.67(s,1H),10.12(s,2H),8.74(s,1H),8.36-8.28(t,1H),8.10(s,1H),8.09-8.08(t,1H),7.94-7.92(t,1H),7.78-7.75(m,1H),7.52-7.48(t,1H),7.32(s,1H),7.26-7.24(d,1H),6.68(s,1H),6.67(s,1H),6.58-6.54(t,4H),5.10(s,2H),4.04(s,3H)；¹³C NMR(DMSO-d⁶,600MHz)δ(ppm):168.98,166.87,159.96,157.83,156.08,152.35,151.35,148.70,147.74,140.49,135.72,129.56,127.46,127.19,125.83,125.04,124.59,119.54,117.23,117.05,114.41,113.06,110.07,108.21,105.22,102.68,68.49,56.79,40.47,40.31,40.14,39.97,39.81,39.64,39.47.Anal.Calcd(％)for C₃₇H₂₄ClFN₄O₈·H₂O(F.W.725.08):C,61.29；H,3.61；N,7.73；Found:C,60.62；H,3.68；N,7.66。

实施例2

探针生物活性检测

(1)ELISA测定本发明的喹唑啉类荧光探针抑制EGFR蛋白激酶活性的IC₅₀

利用酶联免疫吸附分析(Enzyme Immunosorbent Assay,ELISA)测定合成的化合物d的激酶抑制活性。使用CST公司的蛋白激酶检测试剂盒：PTP1B(Tyr66)Biotinylated Peptide做为激酶EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)的底物，采用分光光度法，考察化合物d对激酶底物磷酸化反应的抑制程度，测定IC₅₀值。

在ELISA实验中，以阳性对照与阴性对照来控制实验条件。为了提高测试准确度，每一个浓度作三组平行实验。阳性对照选用一个已知的EGFR抑制剂(4-(3’-氯-4’-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-羟基喹唑啉)，阴性对照选择未加激酶及抑制剂的空白样品。首先测定化合物d在浓度为10μM时对EGFR的相对抑制率。实验结果表明，在这个浓度下测得该化合物对EGFR的相对抑制率为100％以上。然后，我们选取10μM作为待测化合物的最高浓度，共设定7个浓度(10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、1nM、0.1nM、0.01nM)。应用ELISA方法测定了不同浓度下的抑制率，然后在Origin 8.0软件中，根据不同浓度的抑制曲线拟合计算出化合物d的IC₅₀为78.77±3.29nM，如图1所示。表明本发明的探针对EGFR有较高的抑制活性。

(2)MTT考察探针7小时内对细胞增殖影响

将生长良好的同一代A431细胞制成细胞悬液，按5×10⁴/mL，接种于96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时，细胞贴壁后，吸弃原培养液，用于后续实验。将培养板分别设置为加药组(含细胞、化合物d、噻唑蓝MMT溶液)，无药物对照组(含细胞、噻唑蓝MMT溶液)，调零组(含培养基、噻唑蓝MMT溶液)，每组设置3个复孔。加药组中化合物d的浓度为10μM。加药后，培养板重置37℃，5％CO₂培养箱中分别培养1、2、3、4、5、6、7小时，吸弃孔内培养基，每孔中加100μL的MTT(0.5mg/mL)，继续培养4小时。倾弃上清液，加二甲基亚砜100μL/孔。在全自动酶标仪上于λ＝570nm处，测其吸光度A值。

结果表明，在7小时内探针对细胞增殖基本无影响，因此采用本发明的喹唑啉类荧光探针结合流式细胞仪对活细胞中EGFR进行相对定量分析时，本发明的喹唑啉类荧光探针与细胞的孵育时间小于7h时，荧光强度不受细胞增殖的影响。

实施例3

确定探针在细胞膜上的定位分布

(1)细胞培养

5种细胞株(均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)：A431表皮鳞癌细胞株，A549人肺腺癌细胞株,HeLa人宫颈癌细胞细胞株,MCF-7人乳腺癌细胞株,HBE人支气管上皮细胞株。培养基组成：DMEM中添加抗生素(100U mL^-1青霉素和100mg mL^-1链霉素)和10％胎牛血清。细胞接种密度：每100mm培养皿中接种细胞5×10⁶个，在37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养至细胞覆盖80-90％，每两天左右更换一次培养基。

(2)荧光共聚焦成像

实验前，以每皿1×10⁴个细胞接种到共聚焦玻璃小皿中，每皿加入培养基1.5mL，在37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养12h，更换新鲜培养基1.5mL。加入化合物d到培养基中使其终浓度为10μM，继续在培养箱中孵育3小时，弃去培养基，用PBS洗涤三次，然后每皿加入1.5mL PBS。用488nm激光(FV10-LD559)激发荧光素标记的吉非替尼衍生物化合物d，观察细胞成像状况。

荧光成像结果如图2显示，化合物d与5种细胞株作用后，荧光均分布在细胞膜上，表明化合物d分子能够跨膜进入细胞与EGFR结合，可以作为一种具有EGFR抑制活性的、高灵敏的荧光探针应用于肿瘤细胞的成像。而且，探针在细胞膜上分布越多，表明细胞中含有的EGFR含量越多，为EGFR含量分析提供了直观的信息。

实施例4

本发明的喹唑啉类荧光探针结合流式细胞仪对细胞中EGFR的含量进行相对定量检测，采用经典分子生物学方法测定细胞中EGFR的含量，并与前述流式细胞以测定结果进行比较，以说明本发明的荧光探针可结合流式细胞技术对活细胞中的EGFR含量进行相对定量检测。

(1)确定细胞荧光强度达到稳定所需时间

细胞培养同实施例3所述方法。对照组只加培养基，样品组加入化合物d到培养基中使其终浓度为10μM，继续在培养箱中分别孵育0.5、1、2、3、4小时，弃去培养基，用PBS洗涤一次。然后，用胰酶消化，收集细胞到离心管中，再用PBS洗涤离心三次。每管中加入0.7mL PBS，过细胞筛(孔径400目)收集到BD流式细胞仪试管中，在488nm激光激发下以流式细胞仪检测细胞荧光强度。如图3所示结果表明，5种细胞与探针(10μM)作用3小时荧光强度达到稳定。

(2)流式细胞仪检测细胞在探针作用后荧光增强的倍数

细胞培养同实施例3所述方法。对照组只加培养基，样品组加入化合物d到培养基中使其终浓度为10μM，将两组细胞继续在培养箱中孵育3小时，弃去培养基，用PBS洗涤一次。然后，用胰酶消化，收集细胞到离心管中，再用PBS洗涤离心三次。每管中加入0.7mL PBS，过细胞筛(孔径400目)收集到BD流式细胞仪试管中，在488nm激光激发下以流式细胞仪检测细胞荧光强度，测定各种细胞在探针作用后荧光增强的倍数，并与经典分子生物学方法测定细胞中EGFR的含量进行比较，结果如表1所示。

(3)经典分子生物学方法测定细胞中EGFR的含量

采用现有技术中的经典分子生物学方法测定细胞中EGFR的含量，步骤如下：用含10％胎牛血清培养基配成单个细胞悬液，细胞以每皿5×10⁶个细胞接种在100mm培养皿中，每皿8mL。培养24小时后，以PBS清洗细胞三次，用PBS/EDTA消化收集细胞，然后用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白；采用BCA蛋白质定量试剂盒测定提取液中膜蛋白总量；将从5种细胞中提取的膜蛋白浓度调整到100μg/mL，采用invitrogen公司的Human EGFR(full length)ELISA kit定量测定提取的膜蛋白中EGFR的含量，结果以ng/100μg(膜蛋白)表示(表1)。

表1本发明制备的探针与流式细胞仪结合测定细胞荧光增强倍数

与分子生物学方法测定的细胞中EGFR含量的结果比较

表1表明，A431细胞荧光强度增强倍数最大，而MCF-7增强倍数最小，而且流式细胞仪检测的探针作用前后细胞荧光增强倍数与细胞中的EGFR含量呈正相关性。根据所得到的正相关性，采用本发明的荧光探针结合流式细胞仪可对活细胞中的EGFR含量进行相对定量检测，用于癌症诊断。

Claims (10)

1.一类具有癌症治疗和诊断功能的喹唑啉类荧光探针，其特征在于：含有荧光发色基团和吉非替尼骨架结构，通式如下：

其中n取值为1～5。

2.一种权利要求1所述荧光探针的制备方法，其中具体步骤如下：

(1)在有机溶剂中，30℃～50℃温度下，溴乙酸乙酯、4-(3’-氯-4’-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-羟基喹唑啉和碳酸钾混合，得到乙酸酯衍生物；

(2)将乙酸酯衍生物中间体与强碱在第二混合溶剂体系中接触，再与酸液接触，反应得到乙酸衍生物；

(3)将步骤(2)得到的乙酸衍生物与5-氨基荧光素，在催化剂作用下于第三有机溶剂中接触反应得到目标产物喹唑啉类荧光探针。

3.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的有机溶剂为DMF，所述温度为40℃。

4.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中第二混合溶剂体系为水-甲醇-四氢呋喃的混合溶剂，体积比为1:1:3；所述强碱为NaOH，所述酸液为HCl。

5.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中第三有机溶剂为吡啶，催化剂为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐。

6.权利要求1所述的荧光探针在癌症诊断和治疗中的应用。

7.根据权利要求6所述的荧光探针在癌症诊断和治疗中的应用，其中癌症诊断通过相对定量检测细胞中EGFR含量进行，具体步骤如下：(1)所述荧光探针作用细胞一段时间后，使荧光强度稳定；(2)采用流式细胞仪检测所述荧光探针作用细胞后荧光强度的增强倍数；(3)采用分子生物学方法测定细胞中EGFR含量；(4)根据测得的荧光强度的增强倍数与细胞中EGFR含量的正相关性，对细胞中EGFR含量进行相对定量分析。

8.根据权利要求7所述的荧光探针在癌症诊断和治疗中的应用，所述荧光探针作用细胞后荧光强度稳定时间为1～4h，所述荧光探针在细胞培养液中的浓度为1～50μM。

9.根据权利要求7所述的荧光探针在癌症诊断和治疗中的应用，所述荧光探针作用细胞后荧光强度稳定时间为3h，所述荧光探针在细胞培养液中的浓度为10μM。

10.权利要求1所述的荧光探针在癌细胞成像中的应用。