CN104204217A

CN104204217A - 抗cd20抗体利妥昔单抗的稳定化

Info

Publication number: CN104204217A
Application number: CN201280071350.6A
Authority: CN
Inventors: 罗斯玛丽·威尔顿
Original assignee: International Of Medical Protein LLC
Current assignee: International Of Medical Protein LLC; Therapeutic Proteins International LLC
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2014-12-10
Also published as: HK1203561A1; EP2804952A4; WO2013109279A3; EP2804952A2; WO2013109279A2; JP2015506687A; AU2012366290A1; CA2861428A1

Abstract

本发明提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法以及在诊断与治疗动物疾病方面的用途，所述疾病包括人类淋巴瘤、白血病和自体免疫性。

Description

抗CD20抗体利妥昔单抗的稳定化

背景技术

利妥昔单抗(Rituximab)(也称为IDEC-C2B8、RITUXAN、MABTHERA)是嵌合抗CD20单克隆抗体，其用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin′s lymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病、类风湿性关节炎和韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)(显微镜下多血管炎的一种形式)。CD20是在人类B细胞活化期间参与跨膜Ca²⁺传导和细胞周期进程的调节的B淋巴细胞特异性细胞表面分子。CD20首先通过骨髓中的人类前B细胞表达，在Ig重链重组之后显著表达，其中表达持续到浆细胞分化为止。CD20在90％B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的表面上表达，但未在造血干细、祖B细胞、正常浆细胞或正常非造血组织上发现。CD20不从细胞表面脱落并且未在循环中发现游离的CD20抗原。基于体外研究，当前认为利妥昔单抗Fc结构域补充免疫效应物功能以介导B细胞溶解。

抗体是通过免疫系统产生的用于鉴别和中和例如病毒和细菌等外来病原体的蛋白质分子。由于其极好的结合敏感性和特异性，所以抗体是具有各种治疗和诊断用途的有价值的试剂。抗原是刺激体内合成抗体的分子。当结合到抗原时，抗原可以活化多个可以用于攻击赘生性或自体免疫性B细胞的过程，包括例如锚定补体、吞噬抗原携带细胞和直接细胞介导的细胞毒性。

然而，与大部分蛋白质分子的情况一样，抗体需要维持在pH、温度和溶剂条件的狭窄范围内以保持化学和生物稳定性。此外，由于赋予每种抗体其独特的特异性的氨基酸序列方面的差异，单独的抗体在稳定性方面差别很大。近来已经描述了可以增强抗体稳定性同时维持其抗原结合活性的方法和组合物(参见例如，美国专利申请第13/002013号；公告号20110130324)。治疗性抗体的这种稳定可以改善血清半衰期、降低剂量要求、减少副作用、改善存放期并降低运送与储存成本。

因此，仍然存在对包括利妥昔单抗在内的所有治疗性抗体的稳定形式的长期需求。

发明内容

本发明提供经分离稳定的抗CD20抗体，其中(a)所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或包含具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQID NO：1的变异体：S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F和A79P；(b)所述经分离稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含SEQ IDNO：2或包含具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：2的变异体：V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L和V312I；以及(c)其中所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含(a)中所列举的SEQ ID NO：1中的所述氨基酸序列变化中的至少一者，或者所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含(b)中所列举的SEQ ID NO：2中的所述氨基酸序列变化中的至少一者。所述经分离稳定的抗CD20抗体和其单独的免疫球蛋白轻链和重链相比于“野生型抗CD20抗体”和其相应单独的免疫球蛋白轻链和重链是稳定的，其中所述“野生型抗CD20抗体”是指具有轻链(SEQ ID NO：1)和重链(SEQ IDNO：2)序列(这是基于最初在美国专利第5,843,439号中所报导的利妥昔单抗序列，但在本文中包括重链序列的两个校正)的抗体。

本发明还提供经分离核酸，其编码免疫球蛋白重链或轻链或两者，其包含由本发明提供的所述稳定的抗CD20抗体。本发明提供制造所述稳定的抗CD20抗体的方法。因此，本发明提供包含表达所述稳定的抗CD20抗体的免疫球蛋白重链和轻链中的一者或两者的载体的细胞。

本发明假设根据本发明的经分离稳定的抗CD20抗体包括(不限于)呈以下形式的抗体：完全抗体、Fv片段、单链可变区(ScFv)抗体、单克隆抗体、Fab抗体片段、Fab′抗体片段或Fab′2 Fab抗体片段。

本发明进一步提供治疗患者中的疾病的方法，其包含向所述患者投与治疗有效量的所述稳定的抗CD20抗体中的任何一或多者。在优选实施例中，本发明提供用所述稳定的抗CD20抗体来治疗非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、类风湿性关节炎、韦格纳氏肉芽肿病和显微镜下多血管炎的方法。

此外，本发明提供定量检测患者或生物样本中的CD20多肽的方法，其包含向所述患者投与或使所述样本接触诊断有效量的由本发明提供的稳定的抗CD20抗体。

附图说明

图1描绘不具有信号序列的野生型抗CD20抗体轻链氨基酸序列SEQ ID NO：1。

图2描绘不具有信号序列的野生型抗CD20抗体重链氨基酸序列SEQ ID NO：2。序列是基于由美国专利第5,843,439号揭示的抗CD20序列，其中两个序列校正通过加单下划线和加双下划线示出。

图3描绘具有信号序列的野生型抗CD20抗体轻链氨基酸序列SEQ ID NO：3。

图4描绘具有信号序列的野生型抗CD20抗体重链氨基酸序列SEQ ID NO：4。

图5描绘野生型和变异体抗CD20抗体的毛细管差示扫描热量测定分析的结果。野生型抗CD2认定为样品RW004。样品RW005-009由稳定的变异体组成。序列变化和T_m值示出在表8中。

图6描绘蛋白质A结合热挑战分析的结果。

具体实施方式

本发明涉及具有增强的稳定性的某些CD20结合抗体、所述抗体的产生和所述抗体的用途。

定义

“经分离”和“经纯化”在本文中可互换地使用并且是指呈某种状态的分子，其中所述分子与例如蛋白质、核酸、脂质和多糖等其它生物分子实质上分离。这是相比于此类分子的正常体内状态，在正常体内状态中，所述分子存在于大量其它分子的存在下。

如本文中所用，术语“稳定的”、“稳定的蛋白质”和“稳定的多肽”在本文中可互换地使用并且是指相比于野生型蛋白质(即，不具有所述氨基酸变化的蛋白质)，已经产生了致使蛋白质对例如热、冷、振动、张力等条件更具有抗性的氨基酸变化的蛋白质，所述条件倾向于降低蛋白质的正常功能。举例来说，蛋白质的稳定性与其去折叠的吉布斯自由能ΔGu有关，所述ΔGu与温度相关。大部分蛋白质的稳定性随温度降低；随着温度升高，ΔGu减小并在平衡时变为零，其中折叠和去折叠蛋白质的浓度相同。此时，所述温度视为“解链温度”(T_m)。可以使用蛋白质在荧光染料存在下的热去折叠来评定蛋白质T_m。虽然不是平衡方法，但是可以使用所述技术根据相对T_m对蛋白质进行排序。(此外参见例如，尼森F.H.(Niesen F.H.)、伯格伦德H.(Berglund H.)和维达迪M.(Vedadi M.)：使用差示扫描荧光测定来检测促进蛋白质稳定性的配体相互作用.(The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promoteprotein stability.)《自然实验手册》(Nature Protocols)2007，2：2212-21。)根据本发明的稳定的蛋白质将具有例如比野生型T_m高至少0.3℃的T_m，优选地比野生型T_m高至少0.3℃的T_m，更优选地比野生型T_m高至少0.5℃的T_m，甚至更是比野生型Tm高至少1.0℃的Tm，并且甚至更优选地比野生型T_m高至少5.0℃的T_m，其中T_m通过一般技术者已知的任何合适方法测定。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用并且是指由通过肽键连接的氨基酸残基链组成的化合物。多肽的“活性部分”意指小于全长多肽，但保留可测量的生物活性并且保留生物检测的肽。

如本文中所用，术语“肿瘤”是指任何赘生性生长、增殖或细胞团块，无论良性或恶性(癌性)，无论原发部位病变或转移。

如本文中所用，术语“癌症”是指由已经丢失对正常生长控制的易感性的细胞的增殖所引起或以所述增殖为特征的增生性病症。相同组织类型的癌症通常起源于相同组织，并且可以基于其生物特征分成不同亚型。癌症的四个一般类别是癌瘤(源于上皮细胞)、肉瘤(源于结缔组织或中胚层)、白血病(源于血液形成组织)和淋巴瘤(源于淋巴组织)。癌症可以涉及可被感染的身体的每一个器官和组织。癌症的特定实例(不限制癌症的定义)可以包括黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、霍奇金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病。可以被各种癌症感染的器官和组织的实例包括胰脏、乳房、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、垂体腺、肾上腺、肾、胃、食道、直肠、小肠、结肠、肝、胆囊、头颈部、舌、口、眼睛和眼眶、骨头、关节、脑、神经系统、皮肤、血液、鼻咽组织、肺、喉、泌尿道、子宫颈、阴道、外分泌腺和内分泌腺。或者，癌症可以是多中心的或具有未知的原发部位(CUPS)。

如本文中所用，“肿瘤靶向抗体”是指疾病靶向抗体，其中所述疾病是淋巴瘤、白血病、肿瘤、癌症、赘瘤等。

如本文中所用，“治疗有效量”是指减轻(到某种程度，如通过一般熟练的临床医生所判定)哺乳动物中的疾病或病状的一或多种症状的组合物的量。另外，组合物的“治疗有效量”意指部分地或完全地返回到正常的与疾病或病状相关或导致疾病或病状的生理学或生化参数的量。本领域的熟练的临床医生可以确定当例如静脉内、皮下、腹腔内、经口或通过吸入投与组合物时，为了治疗或预防特定疾病病状或病症，该组合物的治疗有效量。治疗有效所需的组合物的确切量将取决于许多因素，例如，活性剂的比活性、所用的传递装置、药剂的物理特性、投药的目的、外加许多患者特异性考虑因素。但是，根据在本文中所阐明的本发明的理解，治疗有效量的确定在一般熟练的临床医生的技能之内。

如本文中所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“疗法”和“治疗性治疗”全部是指治愈性疗法、防治性疗法或预防性疗法。“预防性疗法”的实例是使所靶向疾病(例如，癌症或其它增生性疾病)或与其相关的病状的可能性减少至少5％，优选地至少10％，更优选地至少15％，并且甚至更优选地至少20％。需要治疗的那些包括已经患有疾病或病状的那些以及倾向于患有待预防的疾病或病状的那些。出于对抗疾病或相关病状的目的，如本文中所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“疗法”和“治疗性治疗”还描述了哺乳动物的管理和护理，并且包括投与组合物以缓解所述疾病、病状的症状、副作用或其它并发症。癌症的治疗性治疗包括(但不限于)手术、化学疗法、放射线疗法、基因疗法和免疫疗法。

如本文中所用，术语“效应物”、“药剂”或“药物”或“治疗剂”是指疑似具有治疗性或药物特性的化学试剂、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物，所述生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)细胞或组织。所述药剂或药物可以经纯化、实质上纯化或部分纯化。根据本发明的“药剂”还包括放射线疗法药剂或“化学治疗剂”(例如，小分子药物)。

如本文中所用，术语“诊断剂”是指允许通过任何合适方法(例如，免疫组织学或流动式细胞测量术)检测和/或定量CD20，例如血浆/循环中的CD20的药剂。

如本文中所用，术语“化学治疗剂”是指具有抵抗癌症、赘生性和/或增生性疾病的活性的化学试剂(例如，小分子药物)。

如本文中所用，术语“放射性治疗方案”或“放射线疗法”是指投与放射线以杀死癌细胞。放射线与细胞内的各种分子相互作用，但是导致细胞死亡的初始靶是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，放射线疗法通常也引起对细胞膜和核膜以及其它细胞器的损伤。DNA损伤通常涉及糖-磷酸骨架中的单股和双股断裂。此外，可以存在DNA和蛋白质的交联，其可以扰乱细胞功能。取决于放射线类型，DNA损伤的机制可以随相对生物有效性而变化。举例来说，重粒子(即，质子、中子)直接损伤DNA并且具有较大的相对生物有效性。然而，电磁辐射通过主要由细胞水的电离产生的短暂的羟基自由基起作用引起间接电离。放射线的临床应用由外射束放射线(来自外部来源)和近接疗法(使用植入或插入到患者中的放射线来源)组成。外射束放射线由X射线和/或γ射线组成，而近接疗法采用衰变并发射α粒子或β粒子以及γ射线的放射性核。

如本文中所用，术语“生物制品”、“生物制剂”、“生物药剂”、“替代性治疗方案”或“替代性疗法”是除手术、化学疗法(小分子药物)或放射线疗法以外的疗法，包括例如，受体酪氨酸激酶抑制剂(例如Iressa^TM(吉非替尼(gefitinib))、Tarceva^TM(埃罗替尼(erlotinib))、Erbitux^TM(西妥昔单抗(cetuximab))、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesilate)(Gleevec^TM))；蛋白体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib)(Velcade^TM))；VEGFR2抑制剂，例如PTK787(ZK222584)、极光激酶抑制剂(例如ZM447439)；哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin；mTOR)抑制剂、环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、雷帕霉素抑制剂(例如西罗莫司(sirolimus)、(Rapamune^TM))；法尼基转移酶抑制剂(farnesyltransferase inhibitor)(例如，替吡法尼(tipifarnib)(Zarnestra^TM))；基质金属蛋白酶抑制剂(例如BAY12-9566；硫酸化多糖替可加兰(tecogalan))；血管生成抑制剂(例如Avastin^TM(贝伐单抗(bevacizumab))；烟曲霉素(fumagillin)类似物，例如TNP-4；羧胺三唑；BB-94和BB-2516；沙利度胺(thalidomide)；介白素-12；利诺胺(linomide)；肽片段；和血管生长因子与血管生长因子受体的抗体；血小板源性生长因子受体抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、丝裂原活化激酶抑制剂、丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂、罗斯肉瘤(Rouse sarcoma)病毒转型致癌基因(SRC)抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、小缺氧诱导因子抑制剂、刺猬抑制剂(hedgehog inhibitor)、TGF-β信号传导抑制剂等。

与前述一致，免疫治疗剂也应视为替代性治疗方案。举例来说，含有预成型抗体的血清或γ球蛋白；非特异性免疫刺激佐剂；主动特异性免疫疗法；以及过继性免疫疗法。另外，替代性疗法可以包括其它基于生物学的化学实体，例如聚核苷酸，包括反义分子、多肽、抗体、基因疗法载体等。这些替代性治疗可以单独或与在本文中所述的其它治疗方案组合投与。在组合疗法中，用于替代性治疗方案(包括给药和投药方案)中的化学治疗剂和其它药剂的使用方法也将为本领域一般技术者所知。

如本文中所用，如本文中所用的术语“肿瘤定位”或“疾病定位”是指在注射到携带肿瘤的动物中之后，在表达CD20的肿瘤位点中或在所述位点处，抗CD20抗体聚集或浓缩的程度。肿瘤定位可以通过任何合适的方法测量，包括(但不限于)用荧光染料标记抗体，将所述荧光抗体注射到具有肿瘤的动物中并测定肿瘤荧光与来自皮肤或远离任何大体肿瘤的其它组织的荧光的比率，其中如果所述比率＞20，优选地＞10，更优选地＞5，那么存在定位。

如本文中所用，术语“载体”意指可以包含编码抗CD20抗体轻链或重链或其部分的序列(即，将“编码序列”克隆到载体中)并且可以用于细胞的转型(例如，通过DNA转染，因此所述聚核苷酸可以在所述细胞中复制并且例如，可以通过抗生素选择所述聚核苷酸的存在)的任何聚核苷酸。因此，如果载体包括可以指导克隆基因的转录的控制序列(例如，启动子、强化子，同时缺乏抑制因子)，那么所述载体可以称为“能够表达”被克隆到所述载体中的基因。如本文中所用，当谈到“表达是诱导型”时，这意指可以控制编码抗CD20抗体或其部分的载体序列的转录以使得可以开启或关闭所述转录。如果载体序列在细胞中维持有限的时间段(例如数天)，那么细胞可以称为经载体“短暂转型”；或者如果载体序列在细胞中无限地维持(尤其是如果选择如此)，那么细胞可以称为经“稳定转型”。

如本文中所用，术语“序列变化”意指氨基酸或核酸序列中的更改(即，“突变”)。

抗CD20抗体

一般来讲，抗体由两个轻链和两个重链分子构成；这些链形成大体的“Y”形状，其中轻链和重链两者形成Y的臂并且重链形成Y的基底。将轻链和重链分成具有结构和功能同源性的结构域。轻(“V_L”)链和重(“V_H”)链两者的可变结构域决定识别能力和特异性。轻(“C_L”)链和重(“C_H”)链的恒定区结构域赋予重要生物特性，例如，抗体链结合、分泌、经胎盘的流动性、Fc受体结合、补体锚定、调理、活化抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)等。导致免疫球蛋白基因在产生抗体的细胞中表达的一系列事件是复杂的。可变结构域区基因序列位于单独的种系基因片段中，所述基因片段称为“V_H”、“D_H”和“J_H”或“V_L”和“J_L”。这些基因片段通过DNA重组连接以形成分别在重链和轻链中表达的完整V区。重新排列连接的V片段(V_L-J_L和V_H-D_H-J_H)然后分别编码轻链和重链的完整可变区或抗原结合结构域。(如本文中所用，术语“免疫球蛋白重链和轻链”、“抗体重链和轻链”和“重链和轻链”是可互换的。)

如本文中所用，术语“抗CD20抗体”是特异性识别35,000道尔顿细胞表面非糖基化磷蛋白的抗体，所述磷蛋白通常表示为人类B淋巴细胞限制分化抗原Bp35，统称为“CD20”。如本文中所用，术语“野生型抗CD20抗体”意指具有免疫球蛋白轻链氨基酸序列SEQ ID NO：1和免疫球蛋白重链氨基酸序列SEQ ID NO：2或其等效物的CD20结合抗体，所述抗体呈Fv片段、单链可变区(ScFv)抗体、Fab抗体片段、Fab′抗体片段或Fab′2Fab抗体片段形式。

如本文中所用，术语“嵌合”是指抗体包含来自两种或两种以上不同物种(例如，小鼠和人类)的部分。具体来说，当关于抗CD20抗体使用时，所述术语涵盖最优选地使用重组脱氧核糖核酸技术产生并且包含人类(包括免疫“相关”物种，例如，黑猩猩)和非人类组分两者的抗体：嵌合抗体的恒定区实质上与天然人类抗体的恒定区一致；嵌合抗体的可变区来源于非人类来源并且具有对CD20细胞表面抗原具有特异性的所需抗原。

如本文中所用，短语“免疫活性”当关于嵌合抗CD20抗体使用时，意指抗体结合人类C1q、锚定补体、调理携带CD20的表面细胞、介导人类B淋巴细胞系的补体依赖性溶解(“CDC”)并且通过抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)溶解人类靶细胞。

利妥昔单抗是具有约145kD的分子量和约8.0nM的CD20结合亲和力的完全抗体分子。所述抗体结合亲和力可以通过一般技术者已知的任何合适方法测定。举例来说，抗体与其抗原结合的强度可以通过放射免疫分析(RIA)、ELISA或以柱载体形式结合来评定。通过增加变性条件或通过与相关抗原或冷抗原竞争进行解离。解离常数Kd可以通过斯卡查德图(Scatchard plot)测定(参见例如美国专利第5,843,439号和第8,057,793号)。

近来所描述的用于系统性提高蛋白质稳定性的方法已经揭示于美国专利申请第13/002,013号(专利申请公告第20110130324号)中，已经应用于抗体分子单链Fv(scFv)的稳定化。具体来说，使用此方法，可以在抗体轻链和重链中产生引起稳定化但不显著影响抗原结合的氨基酸序列变化。因为所述方法集中于抗体的构架区从而避免修改其结合特性，因此这是可能的。本发明第一次展示了此稳定化方法适用于全长治疗性单克隆抗体。此多肽稳定化技术利用专有方法来鉴别可能提高抗体稳定性而不影响其结合功能的氨基酸变化。一般来说，此蛋白质稳定化方法是基于(1)使用已经表征了热稳定性和热力学稳定性的抗体结构域变异体的专有数据库来评估靶序列和(2)鉴别功能蛋白质、同源蛋白质中发生的序列变异。

因此，本发明提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法与用途，其中(a)所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列或所述轻链氨基酸序列的等效物包含SEQID NO：1或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：1：S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F和A79P；(b)所述经分离稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列或所述重链氨基酸序列的等效物包含SEQ ID NO：2或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：2：V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L和V312I；(c)所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列或所述轻链氨基酸序列的所述等效物包含(a)中所列举的SEQ ID NO：1中的所述氨基酸序列变化中的至少一者，或者所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列或所述重链氨基酸序列的所述等效物包含(b)中所列举的SEQ ID NO：2中的所述氨基酸序列变化中的至少一者；和(d)所述经分离稳定的抗CD20抗体呈完全抗体、Fv片段、单链可变区(ScFv)抗体、单克隆抗体、Fab抗体片段、Fab′抗体片段或Fab′2 Fab抗体片段形式。“Fv片段”意指通过任何合适的方式保持在一起的缩短重链和轻链的任何组合，所述方式包括例如二硫键、氨基酸连接序列或偶联到两条链的非肽分子。

分别通过SEQ ID NO：1和2阐明的轻链或重链氨基酸序列的“所述等效物”意指基于局部序列比对并且鉴于其卡巴特(Kabat)或EU残基编号(参见表1-3)，在所讨论的Fv片段、单链可变区(ScFv)抗体、Fab抗体片段、Fab′抗体片段或Fab′2 Fab抗体片段的序列中的氨基酸残基对应于基于如本文中所揭示的SEQ ID NO：1或2的氨基酸变化。

本发明提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法与用途，其中所述轻链氨基酸序列包含具有W46L氨基酸变化的SEQ ID NO：1，以及经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有以下序列变化中的一者的SEQ ID NO：2：M20L、M20I、M81L、A92G、N109D或V263L。

本发明还提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法与用途，其中所述轻链氨基酸序列包含具有或不具有W46L或W46I氨基酸变化的SEQ ID NO：1并且所述重链氨基酸序列包含具有M20L、M20I、M81L、A92G、N109D或V263L氨基酸变化的SEQID NO：2；所述重链氨基酸序列包含具有M20L、M20I、M81L、A92G和N109D氨基酸变化的SEQ ID NO：2；以及所述重链氨基酸序列包含具有M20L、M20I、M81L和A92G氨基酸变化的SEQ ID NO：2。

本发明进一步提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法与用途，其中当如通过一般技术者已知的任何合适方法测量，所述抗体的重链或轻链具有优于野生型抗CD20抗体的相应重链或轻链的热稳定性时，其视为稳定的，所述方法包括例如差示扫描热量测定(DSC)、圆二色性(CD)光谱法、荧光发射光谱法、核磁共振(NMR)光谱法、尺寸排阻色谱或热挑战分析。

在其它实施例中，本发明提供稳定的抗CD20抗体和其制造方法与用途，其中由于氨基酸序列变化产生了当与相同数量的野生型抗CD20抗体相比时，具有增强的抗原结合活性、存放期、血清半衰期、AUC或C_max的抗CD20抗体。

本发明提供编码本文中所述的稳定的抗CD20抗体的轻链或重链的经分离核酸，包括例如，其中所述核酸是RNA或DNA。本发明还提供指导所述核酸中的任何一或多者的表达的经分离载体(即，单、双或多顺反子载体)，包括例如，其中所述表达是诱导型。因此，本发明提供包含这些载体中的一或多者的原核和真核细胞，包括例如，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。所述细胞可以经所述载体稳定或短暂转型并且抗CD20轻链和重链的表达可以是组成型或诱导型。

本发明提供经分离抗CD20抗体和其制造方法与用途，其中所述抗CD20抗体轻链或重链氨基酸序列具有其它氨基酸序列变化，所述变化增强抗体结合到CD20分子、锚定补体、调理CD-20表达细胞、活化抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、活化抗体依赖性程序性细胞死亡、活化巨噬细胞依赖性抗CD20免疫反应、携带CD20的细胞对化学疗法的敏感性的能力，或者降低抗CD20抗体锚定补体的能力以及其组合(参见例如美国专利第8,084,582号)。

本发明提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法与用途，其中所述抗CD20抗体偶联到效应物，包括例如，其中所述效应物是放射性同位素、化学治疗剂、毒素、生物反应调节剂或第二抗体。本发明的经分离抗CD20抗体还包括偶联到PEG、白蛋白或多唾液酸的抗CD20抗体和其制造方法与用途。因此，本发明提供药物组合物，其包含本文中所述的稳定的抗CD20抗体中的任一者和药学上可接受的载剂。

为了避免免疫原性和免疫反应，通常优选使用人类化CD20结合抗体或合适的片段，例如Fab′、Fab或Fab2。人类化抗体或其片段可以通过任何合适的方法产生，包括例如：1)可以使用人类IgG骨架，用抗CD20的抗体的可变CDR区替换所述可变CDR区来构造人类化抗体，其中重链和轻链在单独的启动子下独立地表达或在具有IRES序列的一个启动子下共表达；2)可以使用经工程改造具有人类免疫系统的小鼠产生抗CD20的人类化单克隆抗体；3)可以使用噬菌粒(M13，λ大肠杆菌噬菌体，或能够表面呈现的任何噬菌体系统)产生抗CD20的人类化抗体。可以通过所述重链和轻链在例如CHO或293细胞等哺乳动物细胞中共表达来实现完全抗体的表达。类似地，Fab′、Fab或Fab2片段和单链抗体可以使用一般技术者已知的任何合适的方法制备。

使单克隆抗体人类化存在四个通用步骤。这些步骤是：(1)测定起始抗体轻和重可变结构域的核苷酸和所预测的氨基酸序列；(2)设计人类化抗体，即，决定在人类化工艺期间使用何种抗体构架区；(3)实际的人类化方法/技术；以及(4)人类化抗体的转染和表达。参见例如美国专利第4,816,567号；第5,807,715号；第5,866,692号；第6,331,415号；第5,530,101号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,585,089号；第6,180,370号；以及第6,548,640号(其特此以引用的方式并入)。举例来说，如果所述抗体用于人类的临床试验和治疗中，那么可以使所述恒定区工程改造以更类似于人类恒定区，从而避免免疫反应。参见例如美国专利第5,997,867号和第5,866,692号(其特此以引用的方式并入)。

或者，可以通过噬菌体呈现技术重组地筛选并制造抗体。参见例如美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号和第6,265,150号(其特此以引用的方式并入)。或者，可以使用噬菌体呈现技术(麦卡弗蒂(McCafferty)等人，《自然》(Nature)348：552-553(1990))来体外制造人类抗体和抗体片段。

稳定的抗CD20抗体的产生

通过“定点突变诱发”产生由本发明提供的稳定的抗CD20抗体。定点突变诱发是允许DNA序列在特异位点变化以产生预定新序列的已建立的重组DNA技术。可以根据本发明使用任何合适的定点突变诱发技术。一种例示性合适的定点突变诱发技术是寡核苷酸错配突变诱发。此技术使用体外DNA合成以将预定单核苷酸变化引入克隆基因中。通用方法涉及将所述基因或cDNA克隆到M13或准许恢复单股重组DNA的噬菌粒载体中。然后设计突变诱发寡核苷酸，其序列与待突变区域中的基因序列互补，但具有单核苷酸差异，既定突变位点。突变诱发寡核苷酸起作用为新DNA合成做准备，产生含有所需突变的互补全长序列。允许突变体和野生型序列退火形成异双螺旋。这些异双螺旋用于使细胞转型，并且所需突变体基因可以通过筛选突变加以鉴别。

通过PCR进行的定点突变诱发对于一般技术者是众所周知的并且存在许多实现碱基取代、缺失和插入的合适策略。一种此类合适的定点突变诱发PCR技术采用含有所需序列变化的经修饰PCR引物。PCR引物序列简单地替换原始序列(只要变化小到足以使引物退火到既定靶即可)(参见例如门胁H(Kadowaki H)等人：“使用通过Taq DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应进行位点特异性突变诱发(Use of polymerase chain reactioncatalysed by Taq DNA Polymerase for site-specific mutagenesis)”，《基因》(Gene)(1989)76(1)：161-166)。

“重叠延伸PCR”是另一种合适的并且例示性的定点突变诱发技术，使用巢式PCR引物使靶区域突变。使用互补PCR引物和聚合酶链式反应来产生两个具有重叠末端的DNA片段。这些片段在后续‘融合’反应中合并，其中重叠末端退火，允许每一股的3′重叠充当互补股的3′延伸的引物。所得融合产物通过PCR进一步扩增。可以通过将核苷酸变化并入重叠引物中而在核苷酸序列中引入特异性更改。(参见例如Ho SN等人：“通过使用聚合酶链式反应重叠延伸的定点突变诱发(Site-directed mutagenesis byoverlap extension using the polymerase chain reaction)”，《基因》(1989)77(1)：51-59。)

又另一种合适的并且例示性的定点突变诱发技术使用“反向PCR”。此技术用于使质粒突变。其采用两个背靠背引物来扩增整个质粒并且然后将线性产物接合回到环状形式。可以通过更改引物序列含有所需突变来改变引物结合区。(参见例如赫姆斯利A(Hemsley A)等人：“使用聚合酶链式反应进行定点突变诱发的简单方法(A simple methodfor site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction)”，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)(1989)17(16)：6545-6551。)

可以使用具有编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或2或者SEQ ID NO：1或2的部分的多肽的核酸序列的任何合适的聚核苷酸作为根据本发明定点突变诱发的起始物质。美国专利第5,843,439号(其特此以引用的方式如同其在本文中整体阐述般并入)中所揭示的具有编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或2或者SEQ ID NO：1或2的部分的多肽的核酸序列的聚核苷酸非常适合作为根据本发明定点突变诱发的起始物质。

评估热稳定性

热稳定性可以通过使用任何合适的技术测量本发明组合物的解链温度(Tm)进行评估。解链温度是热转化曲线中点的温度，其中50％的组合物分子呈折叠状态。

热稳定性可以通过热量测定加以评估。一种例示性量热方法是差示扫描热量测定(DSC)。DSC采用对伴随大部分蛋白质或蛋白质结构域的去折叠发生的吸热敏感的量热计(参见例如桑切斯·鲁伊斯(Sanchez-Ruiz)等人，《生物化学》(Biochemistry)，27：1648-52，1988，其特此以引用的方式引用并入)。为了测定蛋白质的热稳定性，将具有所述蛋白质的样品插入到量热计中并升高温度直到抗体轻链或重链去折叠为止。蛋白质去折叠时的温度指示整体蛋白质稳定性。

热稳定性可以通过分析光谱法评估。一种例示性分析光谱方法是圆二色性(CD)光谱法。CD光谱法测量组合物的光学活性随温度增加的变化。圆二色性(CD)光谱法测量由于结构不对称性而出现的左旋偏振光对比右旋偏振光的吸收差异。无序或去折叠结构产生极不同于有序或折叠结构的CD光谱。CD光谱反映了蛋白质对增加温度的变性作用的敏感性并且因此指示蛋白质的热稳定性(参见例如范·米尔洛(van Mierlo)和斯滕斯玛(Steemsma)，《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)，79(3)：281-98，2000)。

用于测量热稳定性的另一种例示性分析光谱方法是荧光发射光谱法。用于评估热稳定性的基于荧光的方法监控固有荧光团(例如色氨酸和酪氨酸氨基酸)或外源性荧光团(例如ANS或SYPRO橙染)在热去折叠之后的荧光变化。(参见例如，尼森F.H.、伯格伦德H.和维达迪M.：使用差示扫描荧光测定来检测促进蛋白质稳定性的配体相互作用.《自然实验手册》2007，2：2212-21。)用于测量抗体轻链或重链热稳定性的又另一种例示性分析光谱方法是核磁共振(NMR)光谱法(参见例如范·米尔洛和斯滕斯玛，《生物技术杂志》，79(3)：281-98，2000)。

组合物的热稳定性还可以生化方式测量。用于评定热稳定性的一种例示性生化方法是热挑战分析。在“热挑战分析”中，使本发明的组合物经历一系列高温，持续所设定的时间段。举例来说，可以使测试抗体、轻链或重链分子、scFv分子或包含scFv分子的分子经历一系列逐渐增加的温度，例如持续0.1-1.5小时。然后通过相关生化分析来分析蛋白质的活性。举例来说，如果蛋白质是结合蛋白(例如，结合到蛋白质A)，那么所述结合蛋白的结合活性可以通过功能分析或定量ELISA测定。

另外，此类分析可以一种高通量形式完成。举例来说，此类实施例，可以使用本领域中已知的方法产生scFv变异体的文库。可以诱导scFv表达并且可以使scFvs经历热挑战。可以分析受挑战的测试样品的结合并且那些稳定的scFv可以按比例扩大并进一步表征。

在相关技术中，通过使用分析量热技术(例如DSC)测量本发明组合物的比热或热容(Cp)来评估热稳定性。组合物的比热是1mol水的温度升高1℃所需的能量(例如，以kcal/mol为单位)。由于大Cp是变性或失活蛋白质组合物的特点。通过在组合物热转化之前和之后测定其比热来测量组合物的热容变化(δCp)。在其它实施例中，热稳定性可以通过测量或测定其它热力学稳定性参数来评估，所述参数包括去折叠的吉布斯自由能(δG)、去折叠的焓(δH)或去折叠的熵(δS)。

制造稳定的抗CD20抗体

由本发明提供的稳定的抗CD20抗体可以使用一般技术者众所周知的技术合成、检测、定量和纯化。举例来说，表达构成稳定的抗CD20抗体的轻链和重链的多肽的细胞可以通过一般技术者众所周知的方法，通过在强启动子/翻译起始信号的控制下，将经转染或转型的载体中的cDNA放到合适的原核或真核细胞中以驱动构成稳定的抗CD20抗体的轻链和重链的多肽的表达而产生。

或者，构成稳定的抗CD20抗体的轻链和重链的多肽可以通过一般技术者众所周知的方法以化学方式制成。构成稳定的抗CD20抗体的轻链和重链的多肽可以通过标准固相合成制备。正如一般技术者通常所已知，具有必需长度的肽可以使用可商购的设备和试剂，遵循制造商的说明书阻断干扰基团，保护待反应的氨基酸，偶联，脱除保护基以及对未反应残基进行封端来制备。举例来说，轻链和重链肽可以使用标准自动化固相合成方案，采用具有恰当的侧链保护的叔丁氧羰基-α-氨基酸合成。从固相载体移出所完成的肽，同时使用标准的氟化氢方法脱除侧链保护基。通过半制备型逆相HPLC(Vydac C18)，使用在0.1％三氟乙酸(TFA)中的乙腈梯度进一步纯化粗肽。使所述肽真空干燥以去除乙腈并从0.1％TFA于水中的溶液冻干。可以通过分析型RP-HPLC检验纯度。可以冻干所述肽并且然后将其按重量计以1-2mg/mL的浓度溶解在水或0.01M乙酸中。合适的设备可以例如从加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司(AppliedBioSystems，Foster City，CA)或加利福尼亚州圣拉菲尔(San Raphael，CA)的生物谷猎头公司(Biosearch Corporation)获得。

本发明还提供重组载体，其包含控制聚核苷酸序列的表达的元件，所述聚核苷酸序列编码构成稳定的抗CD20抗体的轻链和重链的多肽中的一者或两者。另外，本发明提供包含编码此类多肽的核酸的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。微生物和组织培养的方法对熟练技术人员是众所周知的(参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)和拉塞尔(Russell)，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，纽约(2001)，第16.1页到第16.54页)。本发明因此提供制造构成稳定的抗CD20抗体的轻链和重链的多肽的方法，其包含：(a)用编码稳定的抗CD20抗体的轻链和/或重链多肽的核酸使细胞转型；(b)诱导转型细胞表达这些多肽；(c)纯化多肽；以及(d)组装功能抗体。

多肽表达取决于RNA转录水平，RNA转录水平又通过DNA信号调节。类似地，mRNA的翻译起码需要AUG起始密码子，其通常位于编码序列的5′末端的10到100个核苷酸内。已经显示侧接AUG起始密码子的序列影响其识别。举例来说，关于通过真核核糖体识别，包埋在与完美的“克扎克共有(Kozak consensus)”序列一致的序列中的AUG起始密码子产生最佳翻译(参见例如克扎克，《分子生物学杂志》(J.Molec.Biol.)196：947-950(1987))。此外，外源核酸在细胞中的成功表达可能需要所得蛋白质的翻译后修饰。

本文中所述的核酸分子优选地包含可操作地连接到合适启动子、例如在真核细胞中起作用的启动子的编码区域。可以在本发明中使用病毒启动子，例如(不限于)RSV启动子和腺病毒主要晚期启动子。合适的非病毒启动子包括(但不限于)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和延伸因子1α启动子。非病毒启动子宜来源于宿主细胞物种。其它合适的遗传元件(其中许多是本领域中已知的)也可以连接到或插入到本发明核酸和构造体中以提供其它功能、表达水平或表达模式。

另外，本文中所述的核酸分子可以可操作地连接到强化子以促进转录。强化子是刺激相邻基因转录的DNA的顺式作用元件。在来自许多物种的多个不同细胞类型中赋予连接基因高转录水平的强化子实例包括(不限于)来自SV40的强化子和RSV-LTR。这些强化子可以与具有细胞类型特异性效应的其它强化子组合，或可以单独使用任何强化子。

为了优化蛋白质在真核细胞中的产生，本发明核酸分子可以进一步包含在核酸分子的编码区域之后的聚腺苷酸化位点。如果需要，还可以将外源核酸并入剪接位点(即，剪接受体和剪接供体位点)以促进mRNA产生同时维持框内全长转录物。另外，本发明核酸分子可以进一步包含用于加工、分泌、细胞内定位等的恰当序列。

可以将核酸分子插入到任何合适载体中。合适载体包括(不限于)病毒载体。合适的病毒载体包括(但不限于)反转录病毒载体、α病毒、牛痘、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒载体。载体优选地具有天然或工程改造能力以使例如CHO-K1细胞等真核细胞转型。另外，适用于本发明情况下的载体可以是“裸”核酸载体，例如质粒或游离基因体，或所述载体可以与其它分子复合。可以适当地与本发明核酸组合的其它分子包括(不限于)病毒衣、阳离子脂质、脂质体、多元胺、金粒子和靶向部分(例如配体、受体)，或靶向细胞分子的抗体。

本文中所述的核酸分子可以经转型到任何合适的细胞中，通常是真核细胞，例如CHO、HEK293或BHK，合乎需要地引起轻链或重链多肽的表达，所述多肽例如包含如在此所述的SEQ ID NO：1或2或其变异体或同源物的多肽。可以培养所述细胞以提供核酸分子的表达。

因此，本发明提供经本文中所述的本发明核酸分子转型或转染的细胞。用外源DNA分子使细胞转型或转染的方式在本领域中是众所周知的。举例来说(但不限于)，使用在本领域中众所周知的标准转型或转染技术将DNA分子引入到细胞中，所述技术例如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、裸细胞融合、电穿孔、脂质体、阳离子脂质和直接显微注射(参见例如萨姆布鲁克和拉塞尔，《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室出版社，纽约(2001)，第1.1页到第1.162页，第15.1页到第15.53页，第16.1页到第16.54页)。

转型方法的另一实例是原生质体融合方法，将来源于携带大量相关质粒的拷贝的细菌的原生质体与培养的哺乳动物细胞直接混合。在细胞膜(通常与聚乙二醇)融合之后，细菌的内容物传递到哺乳动物细胞的细胞质中，并且质粒DNA转移到细胞核。

电穿孔将短暂的高压电脉冲施加到各种哺乳动物和植物细胞，促使在质膜中形成纳米级孔。DNA穿过这些孔或由于伴随所述孔的闭合发生的膜组分重新分布而被直接带到细胞质中。电穿孔可以是极其有效的并且可以用于克隆基因的短暂表达和建立携带相关基因的整合拷贝的细胞系两者。

这些技术可以用于真核细胞的稳定和短暂转型两者。稳定转型细胞的分离需要引入可选择标记以及用相关基因转型。这些可选择标记包括赋予针对新霉素的抗性的基因以及HPRT阴性细胞中的HPRT基因。或者，可以使用含有DHFR的载体在例如CHO-DG44等DHFR阴性细胞中制造稳定转化株。选择可能需要在选择培养基中长期培养，至少持续约2-7天，优选持续至少约1-5周(参见例如萨姆布鲁克和拉塞尔，《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室出版社，纽约(2001)，第16.1页到第16.54页)。可以使用依赖于将抗体构造体插入到转录活性区域或系统中的表达系统获得具有高抗体产率的真核细胞系，所述转录活性区域或系统将抗体基因连接到可扩增基因(例如DHFR)。

稳定的抗CD20抗体多肽的轻链或重链可以从重组宿主细胞表达和纯化。重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括(但不限于)细菌，例如大肠杆菌(E.coli)；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，包括(但不限于)源于果蝇和蚕的细胞系；以及哺乳动物细胞和细胞系。

关于原核生物中的最佳多肽表达必须考虑的问题包括所用表达系统、宿主菌株的选择、mRNA稳定性、密码子偏倚、包涵体形成和预防、融合蛋白和位点特异性蛋白水解、区室定向分泌。(参见例如索伦森(Sorensen)等人，《生物技术杂志》(Journal ofBiotechnology)115(2005)113-128，其特此以引用的方式并入)。

通常从由系统相容遗传背景所持有的质粒诱导表达。表达质粒的遗传元件包括复制来源(ori)、抗生素抗性标记、转录启动子、翻译起始区(TIR)以及转录和翻译终止子。

可以使用任何合适的表达系统，例如大肠杆菌有助于通过其相对简单性、高密度培养、众所周知的遗传学和可用于多肽表达的大量相容工具进行蛋白质表达，所述工具包括各种可获得的质粒、重组融合搭配物和突变体菌株。用于重组表达的大肠杆菌菌株或遗传背景是非常重要的。表达菌株在大部分有害的天然蛋白酶中应该是缺乏的，稳定地维持表达质粒并且赋予表达系统相关的遗传元件(例如DE3)。

质粒拷贝数量通过优选地以放松的方式复制的复制来源加以控制。存在于现代表达质粒中的ColE1复制子来源于pBR322(拷贝数量15-20)或pUC(拷贝数量500-700)质粒家族，然而p15A复制子来源于pACYC184(拷贝数量10-12)。重组表达质粒中最常见的药物抗性标记赋予针对氨苄西林(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、氯霉素(chloramphenicol)或四环素(tetracycline)的抗性。

合适的大肠杆菌表达系统包括(但不限于)通用pUC载体、基于T7的pET表达系统(新泽西州吉布斯镇的EMD化学药品公司(EMD Chemicals Inc.，Gibbstown，NJ)；特拉华州威明顿的安捷伦技术公司(Agilent Technologies，Inc.，Wilmington，DE))、λPL启动子/cI抑制因子(例如，pLEX(纽约格兰德岛的生命技术(Life Technologies，Grand Island，NY)))、Trc启动子(例如，pTrc(新泽西州皮斯卡塔韦的通用电气医疗集团生物科学(GEHealthcare Biosciences，Piscataway，NJ)))、Tac启动子(例如，pGEX(新泽西州皮斯卡塔韦的通用电气医疗集团生物科学))和混合1ac/T5(例如，pQE(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰(Qiagen，Valencia，CA)))和BAD启动子(例如，pBAD(纽约格兰德岛的生命技术))。

从所转录的信使RNA的翻译起始区(TIR)起始的翻译需要核糖体结合位点(RBS)，其包括夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno；SD)序列和翻译起始密码子。夏因-达尔加诺序列位于起始密码子上游7±2个核苷酸处，所述起始密码子是有效重组表达系统中的典型AUG。最佳翻译起始从具有SD序列UAAGGAGG的mRNA获得。

大肠杆菌中的密码子使用由细胞质中可获得的同源氨基酰化tRNA的水平反映。主密码子出现在高度表达基因中而次密码子或罕用密码子倾向于在以低水平表达的基因中。大肠杆菌中罕用的密码子通常在来自例如真核细胞、古菌和具有不同密码子频率偏好的其它远亲生物体等来源的异源基因中是丰富的。含有罕用密码子的基因的表达会由于核糖体在需要并入偶联到次密码子tRNA的氨基酸的位置处停止而导致翻译误差。当转录物含有成簇的罕用密码子，例如大量双联体和三联体累积时，密码子偏倚问题在重组表达系统中变得非常普遍。当在非人类细胞中表达稳定的抗CD20抗体多肽的轻链或重链时，无论体外或体内，可以针对给定细胞类型(即物种)优化针对编码所述肽的这些聚核苷酸所选择的密码子。许多密码子优化技术是本领域中已知的(参见例如贾亚拉杰(Jayaraj)等人，《核酸研究》33(9)：3011-6(2005)；福格桑(Fuglsang)等人，《蛋白质表达与纯化》(Protein Expr.Purif.)31(2)：247-9(2003))。

蛋白质活性需要折叠成精确的三维结构。例如热休克等应激情况削弱体内折叠并且折叠中间体倾向于结合成称为包涵体的非晶蛋白质颗粒。

包涵体是一组结构上复杂的聚集体，通常在高速表达重组蛋白质时作为应激反应发生而被察觉到。大肠杆菌细胞质中200-300mg/ml浓度的蛋白质的大分子拥挤表明高度不利的蛋白质折叠环境，尤其在重组高水平表达期间。包涵体是否是通过去折叠链上的暴露斑点之间的疏水性相互相用或通过特定的成簇机制发生的消极事件形成的尚未知晓。经纯化聚集体可以使用如脲和胍盐酸盐等清洁剂溶解。功能蛋白可以通过稀释、透析或柱上再折叠方法，通过从溶解的包涵体体外再折叠制备。再折叠策略可以通过包含分子伴随蛋白加以改良。然而，针对指定蛋白质优化再折叠程序耗时费力并且并不总是有助于高产品产量。防止包涵体形成的可能策略是分子伴随蛋白的共过度表达。

为了简化重组蛋白质的纯化和表达，已经研发了各种蛋白质融合搭配物。融合蛋白或嵌合蛋白通常包括通过特异性蛋白酶的识别位点连接于乘客蛋白或靶蛋白的伴侣或“标签”。大部分融合搭配物用于特异性亲和纯化策略。融合搭配物在体内也是有利的，其中所述融合搭配物可以保护乘客免遭细胞内蛋白水解，增强溶解度或用作特异性表达报导子。高表达水平通常可以从N端融合搭配物转移到不良表达乘客，最有可能是由于mRNA稳定化。常见亲和力标签是多组氨酸标签(His-tag)，其可与固定化金属亲和色谱(IMAC)和用于在基于谷胱甘肽的树脂上纯化的谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签相容。存在若干其它亲和力标签并已进行广泛地综述。

重组表达蛋白原则上可以针对三个不同位置，即细胞质、周质或培养基。各种优点和缺点与重组蛋白朝向特异性细胞区室的方向有关。在细胞质中表达通常是优选的，因为产物产量高。二硫键形成在大肠杆菌中被隔离并且在周质中通过Dsb系统有效地催化。或者，可以使用trxB和gor菌株。半胱氨酸在细胞质中的还原通过硫氧还蛋白和谷氧还蛋白实现。硫氧还蛋白通过硫氧还蛋白还原酶保持还原并且谷氧还蛋白通过谷胱甘肽保持还原。低分子量谷胱甘肽分子通过谷胱甘肽还原酶还原。编码两种还原酶的trxB和gor基因的破坏允许在大肠杆菌细胞质中形成二硫键。

已经关于许多不同的原核和真核系统描述了用于体外基因表达和蛋白质合成的无细胞系统(参见例如远藤(Endo)和泽崎(Sawasaki)《生物技术新见》(Current Opinion inBiotechnology)2006，17：373-380)。从含有用于体外转录RNA模板的翻译所需的所有组分的粗提取物制备例如兔网织红细胞裂解物和小麦胚芽提取物等无真核细胞系统。无真核细胞系统使用体内或体外合成的经分离RNA作为翻译反应的模板(例如，兔网织红细胞裂解物系统或小麦胚芽提取物系统)。偶联无真核细胞系统将原核噬菌体RNA聚合酶与真核提取物组合，并使用外源DNA或PCR产生的模板与噬菌体启动子用于体外蛋白质合成(例如，偶联网织红细胞裂解物)。

稳定的抗CD20抗体多肽的经纯化轻链或重链的溶解度可以通过本领域中已知的方法加以改良。举例来说，为了增加所表达蛋白质(例如，在大肠杆菌中)的溶解度，可以通过以下各者降低蛋白质合成速率：降低生长温度、使用较弱启动子、使用较少拷贝数量的质粒、降低诱导物浓度、改变生长培养基，如乔治乌(Georgiou)和瓦拉(Valax)，《生物技术新见》(Current Opinion Biotechnol.)7：190-197(1996)中所述。这降低蛋白质合成速率并且通常获得可溶性更大的蛋白质。还可以添加用于恰当折叠或用于蛋白质稳定性所必需的辅基或辅因子，或添加缓冲液以在生长期间控制培养基中的pH波动，或添加1％葡萄糖以抑制lac启动子被乳糖诱导，所述乳糖存在于大部分丰富培养基(例如LB、2xYT)中。还可以向培养基中添加多元醇(例如，山梨糖醇)和蔗糖，因为通过这些添加所引起的渗透压增加促使渗透保护剂在细胞中积累，其稳定天然蛋白质结构。可以添加乙醇、低分子量硫醇和二硫化物以及NaCl。另外，伴随蛋白和/或折叠酶可以与所需多肽共表达。分子伴随蛋白通过与折叠中间体短暂地相互作用而促进恰当异构化和细胞靶向。大肠杆菌伴随蛋白系统包括(但不限于)：GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE、CIpB、FkpA、Skp。周质肽基-脯氨酰基顺式，反式-异构酶FkpA是尤其合适的。

折叠酶沿着折叠路径加快了速率限制步骤。三种类型的折叠酶起重要作用：肽基脯氨酰基顺式/反式异构酶(PPI′s)(FkpA)、二硫键氧化还原酶(DsbA)和二硫键异构酶(DsbC)，蛋白质二硫键异构酶(PDI)是一种真核蛋白质，其催化蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化两者。这些蛋白质中的一或多者与靶蛋白的共表达可以产生较高水平的可溶性靶蛋白。

稳定的抗CD20抗体多肽的轻链或重链能够以融合蛋白形式产生以便改善其溶解度和产量。融合蛋白包含稳定的抗CD20抗体多肽和一起融合在框内的第二多肽的轻链或重链。第二多肽可以是本领域中已知的用于提高与其融合的多肽的溶解度的融合搭配物，例如NusA、细菌铁蛋白(BFR)、GrpE、硫氧还蛋白(TRX)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。诺瓦根公司(Novagen Inc.)(威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))提供pET43.1载体系列，其允许形成NusA-靶融合。DsbA和DsbC在用作融合搭配物时也已经显示出对表达水平的正效应，因此可以用于与肽配体结构域融合以实现较高溶解度。

在这些融合蛋白的一个方面，稳定的抗CD20抗体多肽的表达轻链或重链包括连接子多肽，所述连接子多肽包含蛋白酶裂解位点，所述蛋白酶裂解位点包含可通过蛋白酶水解的肽键。因此，多肽中的肽配体结构域可以在表达之后通过蛋白水解与多肽的其余部分分离。连接子可以包含在还结合有蛋白酶的催化位点的键的任一侧上的一或多个其它氨基酸(参见例如谢克特(Schecter)和伯杰(Berger)，《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)27，157-62(1967))。或者，连接子的裂解位点可以与蛋白酶的识别位点隔开并且两个裂解位点和识别位点可以通过一或多个(例如两个到四个)氨基酸隔开。在一个方面，所述连接子包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、约10、约20、约30、约40、约50或50个以上氨基酸。更优选地，所述连接子的长度是约5到约25个氨基酸，并且最优选地，所述连接子的长度是约8到约15个氨基酸。

举例来说，通常与细菌产生的融合蛋白一起使用的合适的蛋白酶包括烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、因子Xa蛋白酶、凝血酶和肠激酶。可用于本发明的一些蛋白酶在以下参考文献中有所讨论：胡珀(Hooper)等人，《生物化学杂志》(Biochem.J.)321：265-279(1997)；韦布(Werb)，《细胞》91：439-442(1997)；沃尔夫斯贝格(Wolfsberg)等人，《细胞生物学杂志》(J.Cell Biol.)131：275-278(1995)；穆拉卡米(Murakami)和埃特林格(Etlinger)，《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Comm.)146：1249-1259(1987)。细胞表面蛋白酶也可以与根据本发明的可裂解连接子一起使用并且包括(但不限于)：氨基肽酶N；嘌呤霉素敏感性氨基肽酶；血管收缩素转化酶；焦谷氨酰肽酶II；二肽基肽酶IV；N-精氨酸二碱转化酶；内肽酶24.15；内肽酶24.16；类淀粉前驱蛋白分泌酶α、β和γ；血管收缩素转化酶分泌酶；TGFα分泌酶；TNFα分泌酶；FAS配体分泌酶；TNF受体-I和TNF受体-II分泌酶；CD30分泌酶；KL1和KL2分泌酶；IL6受体分泌酶；CD43、CD44分泌酶；CD16-I和CD16-II分泌酶；L-选择素分泌酶；叶酸受体分泌酶；MMP1、2、3、7、8、9、10、11、12、13、14和15；尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂；组织纤维蛋白溶酶原活化剂；纤维蛋白溶酶；凝血酶；BMP-1(原胶原C-肽酶)；ADAM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11；以及颗粒酶A、B、C、D、E、F、G和H。

依赖于细胞相关蛋白酶的替代方案是使用自裂解连接子。举例来说，可以使用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白酶作为连接子。这是具有17个氨基酸的短多肽，其在2A/2B接合点裂解FMDV的多蛋白。FMDV2A前肽的序列是NFDLLKLAGDVESNPGP。裂解发生在最终甘氨酸-脯氨酸氨基酸对处肽的C端并且与其它FMDV序列的存在无关，并且甚至在异源序列存在下裂解。

亲和色谱法可以单独或与离子交换、分子筛分或HPLC色谱技术结合用于纯化构成稳定的抗CD20抗体的轻链和重链的多肽。这些色谱方法可以使用管柱或以分批形式进行。这些色谱纯化方法在本领域中是众所周知的。

抗CD20抗体的大规模生产

存在两种主要类型的生物产物的重组表述，一种是如最常在中国仓鼠卵巢细胞的使用过程中所看到，通过细胞分泌到营养培养基中的生物产物的可溶性形式；并且另一种是如最常在使用大肠杆菌进行表达的情况下所看到，生物产物保持在细胞内形成包涵体。遗传工程方面的新进展已经能够编码将分泌可溶性蛋白质而不是将其保持在内部作为包涵体的细菌的基因。这是为了避免细胞溶解和包涵体溶解的繁琐工艺。

可以使用任何合适的方法来大规模制备抗CD20抗体。举例来说，多年来已经研发出各种器皿和方法以工业规模来实施微生物、尤其是细菌和酵母的发酵。数十万升的不锈钢发酵器皿并不罕见，并且发酵方法包括分批、分批进料、连续或半连续灌注。细胞在这些器皿内宜保持在悬浮液中，通常通过旋转位于所述器皿内的搅拌桨叶，并且通过将空气、氧气或二氧化碳注射到所述器皿中促进气体交换。

另外，一般技术者还已知抛弃式发酵器。这些抛弃式发酵器的实例是基于波搅动的系统。(参见例如美国专利第6,544,788号；PCT公告WO 00/66706。)可以使用此类型发酵器在单一抛弃式容器中培养相对敏感性细胞，例如CHO细胞(例如，皮尔斯(Pierce)，《生物加工杂志》(Bioprocessing J.)3：51-56(2004))；杂交瘤细胞(例如，凌(Ling)等人，《生物技术进展》(Biotech.Prog.)，19：158-162(2003))；昆虫细胞(例如韦伯(Weber)等人，《细胞技术学》(Cytotech.)38：77-85(2002))和锚着依赖性细胞(例如，辛格(Singh)，《细胞技术学》30：149-158(1999))。这些抛弃式单元相对便宜，由于其单次使用而降低感染风险并且不需要内部搅拌部件，因为这些容器所处的摇动平台在使用期间在内部液体中诱导有助于气体交换的波状形式。

另一种合适的方法在一个方面提供适用于制备各种生物产物的生物反应器(参见例如美国专利申请公告第20110117538号)。此生物反应器适用于容纳预定体积的包含营养培养基和生物培养物的液体并且包含：(a)具有至少一个内壁的容器；(b)至少一个入口；(c)至少一个出口；(d)至少一个气体入口；(e)至少一个气体出口；以及(f)至少一个连接到所述至少一个气体入口的圆柱形喷洒过滤器，其中所述喷洒过滤器沿着其轴包含多个孔，其允许气体从所述喷洒过滤器径向发射到所述液体中，其中所述多个孔的直径不超过约50μm，并且其中所述至少一个喷洒过滤器在所述容器内的定位为所述多个孔浸没在所述液体内并且所发射的气体实质上均匀分布在所述液体中做准备。

这些生物反应器系统的相关方面揭示于美国专利申请公告第20110117538号中，其提供一种用于从预定体积的包含营养培养基和生物培养物的液体产生生物产物的方法，其包含(a)提供生物反应器；(b)将营养培养基和生物培养物引入所述容器中；(c)使气体穿过喷洒过滤器并进入所述液体中；(d)以预定时间间隔检测所述液体中的细胞密度；以及(e)当所述容器内的液体中的细胞密度达到预定值时从所述容器移出所述液体和由此产生的任何生物产物。

另一种合适的方法提供一种生物反应器，例如美国专利申请公告第20110198286号中所揭示的生物反应器。此系统利用许多能够大量结合生物产物的树脂的新近可用性。大部分现代树脂结合每毫升树脂20-125mg之间的生物产物。这些树脂中的多数对生物产物具有高度特异性并且其中多数可以合并以通过简单的物理化学结合工艺从溶液中移出任何类型和数量的生物产物，所述结合工艺强到足以在从所述生物反应器去除培养基的同时保持所述生物产物与所述树脂连接。生物产物纯化领域其中现在具有以下能力：通过调节洗脱缓冲液的pH、离子强度或其它特征以破坏树脂与生物产物之间的结合，从树脂洗脱这些结合的生物产物。这允许以高度浓缩的溶液形式从生物反应器移出生物产物，所述高度浓缩的溶液已准备好进一步纯化并且在一些情况下其甚至可以是供使用的最终产物。

偶联的抗CD20抗体组合物

本发明提供包含本文中所揭示的本发明抗CD20抗体的组合物。在优选实施例中，所述组合物是包含抗CD20抗体和药学上可接受的载剂的药学上可接受的组合物。

抗体可以通过若干效应机制起作用去除癌细胞。关于完全人类或嵌合的抗体，所述分子的Fc部分可以有效地活化人类免疫系统并与其相互作用。通过此方法，细胞可以被免疫系统(补体)的可溶性组分或ADCC介导的细胞杀伤破坏。另外，抗体与靶抗原的结合可以引发可以引起细胞凋亡的生物反应。此外，抗体分子可以用作用于输送治疗性部分的传递运载工具，所述治疗性部分例如药物、放射性同位素、毒素或酶。

本发明的组合物可以进一步包含活性剂。在一些实施例中，所述活性剂是药学上活性治疗剂或能够直接施加其药理作用的“效应物”。在其它实施例中，所述活性剂是诊断剂。应该了解，一些活性剂适用作诊断剂和治疗剂两者，并且因此这些术语不是相互排斥的。在优选实施例中，所述活性剂是与抗CD20抗体结合或偶联的诊断性或治疗性活性剂。

用于将合适的治疗剂、化学治疗剂、放射性核素等偶联或结合到抗体或其片段的方法充分描述在本领域中。举例来说(但不限于)，蛋白质中的游离氨基(例如赖氨酸的ε-氨基)可以与例如碳化二亚胺或异双官能剂等试剂结合。或者，例如，可以使用巯基进行结合。另外，可以氧化结合到糖蛋白(包括抗体)的糖部分以形成适用于本领域中已知的多个偶联程序的醛基团。根据本发明形成的结合物可以是体内稳定或不稳定的，例如酶可降解四肽键联或酸不稳定顺式-乌头酰基或腙键联。另外，本发明提供抗CD20抗体融合蛋白，包括例如(但不限于)其中重链或轻链编码序列(或其编码片段，例如Fab、Fv、Fab′和Fab′2片段)在诊断上有用的蛋白结构域(例如半抗原、GFP)、免疫活性蛋白结构域(例如，TF或TNF)或毒素结构域的上游或下游融合。

相对于传递单独活性剂，本发明组合物可以用于增强将活性剂传递到疾病部位。在优选实施例中，偶联到抗CD20抗体使疾病部位处的活性水平相比于在所述疾病部位处通过未偶联实现的活性水平增加了至少10％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍。

如本文中所用，短语“间接标记”和“间接标记方法”两者意指螯合剂共价连接到抗体并且将至少一种放射性核素插入到螯合剂中。合适的螯合剂和放射性核素在斯瑞瓦加塔瓦，S.C.(Srivagtava，S.C.)和米斯，R.C.(Mease，R.C.)，“关于用于标记单克隆抗体的配体、核素和技术的研究进展(Progress in Research on Ligands，Nuclides andTechniques for Labeling Monoclonal Antibodies)”，《核医学与生物学》(Nucl.Med.Bio.)18/6：589-603(1991)中有所阐述，所述文献以引用的方式并入本文中。尤其优选的螯合剂是1-异硫氰酸苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(“MX-DTPA”)；用于间接标记的尤其优选的放射性核素包括铟-111和钇-90。如本文中所用，短语“直接标记”和“直接标记方法”两者意指放射性核素直接共价连接到抗体(通常通过氨基酸残基)。合适的放射性核素提供在斯瑞瓦加塔瓦中；或引用用于直接标记的尤其优选的放射性核素是通过酪氨酸残基共价连接的碘-131。间接标记方法尤其优选。

用于偶联抗CD20抗体的试剂可以是任何合适的治疗剂(或“效应物”)或诊断剂，例如化学治疗剂或抗癌剂。合适的诊断剂包括荧光染料、放射性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声波造影剂和PET造影剂。适用于本发明的合适的化学治疗剂或其它抗癌剂包括(但不限于)酪氨酸激酶抑制剂(染料木素)、生物活性剂(TNF、tTF)、放射性核素(¹³¹I、⁹⁰Y、¹¹¹In、²¹¹At、³²P和其它已知治疗性放射性核素)、阿霉素(adriamycin)、袢霉素抗生素(ansamycin antibiotics)、天冬酰胺酶、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulphan)、顺铂、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、卡培他滨(capecitabine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、埃博霉素(epothilones)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(lomustine)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美法仑(meplhalan)、甲氨蝶呤(methotrexate)、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))和衍生物、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝基脲(nitrosurea)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸盐(pamidronate)、喷司他汀(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、利妥昔单抗、链佐星(streptozocin)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(taxol)、考布他汀(combretastatins)、迪斯德莫来(discodermolides)和反铂(transplatinum)。

根据本发明适用的其它合适的化学治疗剂包括(但不限于)抗代谢物(例如，天冬酰胺酶)、抗有丝分裂剂(例如，长春花属生物碱)、DNA损伤剂(例如，顺铂)、促凋亡剂(诱导程序性细胞死亡或细胞凋亡的试剂)(例如，表鬼臼毒素(epipodophylotoxin))、分化诱导剂(例如，类视黄素)、抗生素(例如，博莱霉素)和激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、己烯雌酚)。此外，根据本发明适用的合适的化学治疗剂包括抗血管生成剂(血管生成抑制剂)，例如IFN-α、烟曲霉素、血管生长抑素、内皮生长抑素、沙利度胺等。

另外，药学活性剂可以是siRNA。在优选实施例中，所述siRNA分子抑制与肿瘤相关的基因的表达，例如c-Sis和其它生长因子、EGFR、PDGFR、VEGFR、HER2、其它受体酪氨酸激酶、Src家族基因、Syk-ZAP-70家族基因、BTK家族基因、其它细胞质酪氨酸激酶、Raf激酶、周期素依赖性激酶、其它细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶、Ras蛋白和其它调节GTP酶。

抗CD20抗体还可以结合到聚乙二醇(PEG)。PEG结合可以增加蛋白质的循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性和抗原性，并提高生物活性。可以使用任何合适的结合方法，包括(但不限于)例如，使甲氧基-PEG与CD20结合抗体的可获得氨基或例如组氨酸或半胱氨酸等其它反应位点反应。另外，可以使用重组DNA方法以将具有PEG反应性基团的氨基酸添加到本发明CD20结合抗体。可以在PEG与CD20结合抗体反应之前对其进行处理，例如可以向所述PEG中添加连接基团。此外，根据本发明可以使用可释放和混合式PEG化策略，例如使CD20结合抗体PEG化以使得添加到CD20结合抗体中的某些位点的PEG分子在体内释放。这些PEG结合方法在本领域中是已知的(参见例如格林沃尔德(Greenwald)等人，《药物传递进展综述》(Adv.Drug Delivery Rev.)55：217-250(2003))。

抗CD20抗体调配物

本发明组合物通常以含载剂(例如药学上可接受的载剂)的调配物形式提供。通常，所述载剂将是液体，并且可以是固体，或液体与固体组分的组合。所述载剂合乎需要地是生理学上可接受(例如，药学上或药理学上可接受)的载剂(例如，赋形剂或稀释剂)。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、重量摩尔渗透浓度调节剂、缓冲液和pH调节剂。合适的添加剂包括生理学上生物相容性缓冲液、添加螯合剂或钙螯合剂络合物，或任选地添加钙盐或钠盐。可以将药物组合物包装呈液体形式以供使用，或可以冻干。优选的生理学上可接受的载剂介质是水、缓冲水、生理盐水、0.4％生理食盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。生理学上可接受的载剂是众所周知的并且可容易获得。载剂的选择将至少部分由靶组织和/或细胞的位置和用于投与组合物的特定方法所决定。

可以调配组合物用于通过以下途径投与：包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、硬膜外、皮下、经粘膜(包括，例如经肺)。组合物还可以包含附加组分，例如稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂和pH调节剂等。

适用于可注射投与的调配物包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和致使所述调配物与既定受体的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、冻干保护剂和防腐剂。所述调配物可以单位剂量或多剂量形式存在于密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在经冷冻干燥的(冻干)的条件下，仅需要在即将使用之前添加无菌液体载剂，例如注射用水。可以从无菌散剂、颗粒剂或片剂制备即用型注射溶液和悬浮液。

无菌可注射溶液可以通过如下方法来制备：视需要将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一者或组合并入适当溶剂中，接着过滤灭菌。优选地，注射用溶液不含内毒素。通常，通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到活性成分加上来自其先前经无菌过滤的溶液的任何其它所需成分的散剂。在所有情况下，所述调配物必须是无菌的并且流动性必须达到存在流畅注射能力的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须保护其免遭例如细菌和真菌等微生物的污染作用。可以在适当地与例如羟基纤维素等表面活性剂混合的水中制备呈游离碱或药学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液。还可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。

在优选实施例中，可以将活性成分包覆在所制备的微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或在粗乳液中。合适的技术揭示于雷茨勒(Rezler)等人，《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)129(16)：4961-72(2007)；萨马德(Samad)等人，《当代药物传递》(Curr.Drug Deliv.)4(4)：297-305(2007)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号中。具有增强的循环时间的脂质体揭示于美国专利第5,013,556号中。

尤其有用的脂质体可以通过例如逆相蒸发法用脂质组合物产生，所述脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。

药物组合物可以使用药物传递系统传递。这些传递系统包括胶原蛋白片段的透明质酸溶液或悬浮液。所述药物可以调配成用恰当的聚合材料设计用于控制释放的微胶囊，所述聚合材料例如聚乳酸、乙羟纤维素、聚己酸内酯、聚己酸内酯二醇、聚赖氨酸、聚乙醇酸、聚顺丁烯二酸、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]等。使用药物传递系统的特定调配物可以呈液体悬浮液、软膏、绷带复合物、胶原蛋白罩等形式。

所述组合物可以进一步包含任何其它合适的组分，尤其是用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途的组分。因此，存在本发明组合物的各种合适的调配物。

由本发明提供的组合物可以包括例如约0.5mL到约4mL水性或有机液体，其中活性剂偶联到CD20结合抗体，并且活性剂的浓度是约10mg/mL到约100mg/mL，优选地约1mg/mL到约10mg/mL，更优选地约0.1mg/mL到约1mg/mL。

用抗CD20抗体治疗和诊断的方法

本发明提供一种用于通过投与诊断或治疗有效量的包含抗CD20抗体的组合物来诊断或治疗动物中的疾病的方法。具体来说，本发明提供治疗患者中的疾病的方法，包含向所述动物投与治疗有效量的抗CD20抗体。

免疫活性嵌合抗CD20抗体的优选有效剂量(即，治疗有效量)介于每千克体重约0.001到约30mg，更优选地每千克体重约0.01到约25mg，并且甚至更优选地每千克体重约0.4到约20.0mg范围内。或者，优选有效剂量可以描述为约250mg/m²到约500mg/m²，更优选地为约375mg/m²。

然而，其它剂量是可行的；影响剂量的因素包括(但不限于)所述疾病的严重程度；先前治疗方法；患者的整体健康状况；所存在的其它疾病等。熟练技术人员能够容易地评定特定患者并确定落在所述范围内或必要时在所述范围外的合适剂量。

因此，根据本发明可以使用抗CD20抗体的任何合适剂量水平，例如大约每投与每千克体重约1μg到100mg的剂量水平适用于治疗疾病。关于合适的剂量，抗体可以在以下单位剂量下投与：每千克体重小于约75mg，或每千克体重小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg；并且每千克体重小于200nmol抗体，或每千克体重小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmol抗体。举例来说，可以通过注射(例如静脉内或肌内、鞘内或直接进入器官中)、吸入或局部施用来投与单位剂量。

类似地，本发明进一步提供用一或多种抗癌剂和抗CD20抗体来治疗动物中的肿瘤的方法，包含：从所述动物分离生物样品(样本)，检测CD20蛋白质或RNA在生物样品中的表达，或对生物样品中的CD20蛋白质或RNA的量进行定量，并且如果生物样品中的CD20蛋白质或RNA高于临界水平存在，那么投与治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的抗CD20抗体。

样品中所存在的CD20蛋白质的水平通常使用抗CD20抗体在印迹法或ELISA分析中检测。然而，在一些实施例中，CD20蛋白质的表达可以使用抗体的仅一部分，使用不是抗体的CD20结合分子或使用不需要抗体或CD20结合分子来检测CD20表达的一些其它方法(例如质谱法)来测定。CD20RNA水平可以通过任何合适的方法获得，包括例如Northern印迹、狭缝印迹、微阵列分析、定量PCR、定量TMA和定量侵入法。

本发明还提供一种使用合适的中和抗CD20抗体抑制CD20活性的方法。此类中和抗体可以例如具有阻断抗CD20与可溶性或细胞表面配体的相互相用或预防信号转导所需的CD20构形变化的能力。

在其它实施例中，本发明方法包含向哺乳动物投与治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含脂质体结合或白蛋白结合的化学治疗剂，其中所述脂质体或白蛋白偶联到靶向合适疾病的抗CD20抗体。化学治疗剂可以使用任何合适的方法偶联到抗CD20抗体。优选地，化学治疗剂通过共价键(包括例如二硫键)以化学方式偶联到化合物。

一或多个剂量的一或多种化学治疗剂(例如上文所述的那些)还可以根据本发明方法投与。本发明方法中所用的化学治疗剂的类型和数量将取决于针对特定肿瘤类型的标准化学治疗方案。换句话说，一种特定癌症可以常规地用单一化学治疗剂治疗，而另一种特定癌症可以常规地用化学治疗剂的组合治疗。以下实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

根据本发明的方法包括例如组合疗法，其中动物还经历了一或多种选自由以下组成的群组的癌症疗法：手术、化学疗法、放射线疗法、温热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法。术语“共投与”和“组合疗法”是指向个体投与两种或两种以上治疗活性剂。所述药剂可以包含在单一药物组合物中并且同时投与个体，或所述药剂可以包含在单独的调配物中并且连续投与个体。只要可以在个体中同时检测到两种药剂，就称为共投与所述两种药剂。

在本发明中所涵盖的组合疗法包括(但不限于)污染物抗体投与、疫苗投与、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物反应调节剂的投与。可一起或依次使用两种或两种以上组合化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化剂、抗代谢物、天然产物、激素和拮抗剂以及杂类药剂。烷基化剂的实例包括氮芥，例如二氯甲二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylmelamine)，例如六甲蜜胺(hexamethylmelamine)和噻替派；磺酸烷基酯，例如白消安；亚硝基脲，例如卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)和链佐星(链佐霉素(streptozotocin))；DNA合成拮抗剂，例如磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)；以及三嗪，例如达卡巴嗪(DTIC，二甲基-三氮烯基咪唑甲酰胺)和替莫唑胺(temozolomide)。抗代谢物的实例包括叶酸类似物，例如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤(amethopterin))；嘧啶类似物，例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶、5-FU、5FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)和吉西他滨；嘌呤类似物，例如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤、6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤、TG)和喷司他汀(2′-脱氧助间型霉素、脱氧助间型霉素)、克拉屈滨(cladribine)和氟达拉滨；以及拓扑异构酶抑制剂，例如安吖啶(amsacrine)。天然产物的实例包括长春花属生物碱，例如长春碱(VLB)和长春新碱；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇和多西他赛表鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷；喜树碱，例如托泊替康(topotecan)和伊立替康；抗生素，例如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素、红比霉素)、多柔比星、博莱霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊达比星、表柔比星(epirubicin)；酶，例如L-天冬酰胺酶；以及生物反应调节剂，例如干扰素α和白介素2。激素和拮抗剂的实例包括黄体生成素释放激素激动剂，例如布舍瑞林(buserelin)；肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松(prednisone)和相关制剂；孕酮，例如己酸羟基孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和乙炔雌二醇和相关制剂；雌激素拮抗剂，例如他莫昔芬和阿那曲唑(anastrozole)；雄激素，例如丙酸睾酮和氟羟甲基睾酮和相关制剂；雄激素拮抗剂，例如氟他胺(flutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；以及促性腺激素释放激素类似物，例如亮丙瑞林(leuprolide)。杂类药剂的实例包括沙利度胺；铂配位络合物，例如顺铂(czs-DDP)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂；蒽二酮，例如米托蒽醌；被取代的脲，例如羟基脲；甲肼衍生物，例如丙卡巴肼(N-甲肼、MIH)；肾上腺皮质抑制剂，例如米托坦(o，p′-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；RXR激动剂，例如贝瑟罗汀(bexarotene)；以及酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼。

在本发明方法中起重要作用的组合物可以单次剂量或多次剂量投与。当通过输注投与抗体时，所述输注可以单次持续剂量或可以通过多次输液传递。可以将药剂直接注射到在异常靶基因表达位点处或附近的组织中。可以将药剂多次注射到在所述位点处或附近的组织中。

本领域一般技术者还可以容易地确定向指定个体投与本发明抗体的恰当给药方案。举例来说，可以单次注射或沉积形式在CD20表达位点处或附近向个体投与抗CD20抗体组合物一次。本发明组合物可以每天、每半周、每周、每两周、每半月、每月、每两月或根据临床医生的判断投与。在一些实施例中，所述组合物每天向个体投与一次或两次，持续约三到约二十八天，更优选地约七到约十天时间。在其它实施例中，比一天一次更不频繁地投与单位剂量，例如，小于每2、4、8或30天一次。在其它实施例中，不按频率(例如不是常规频率)投与单位剂量。

当给药方案包含多次投药时，应了解向个体投与的抗CD20抗体组合物的有效性可以包括经整个给药方案投与的抗体的总量。本领域一般技术者将了解，可以取决于各种因素略微调整准确单独剂量，所述因素包括要投与的特异性抗CD20抗体组合物、投药时间、投药途径、调配物的性质、排泄速率、要治疗的特定病症、所述病症的严重程度、寡核苷酸药剂的药效动力学和患者的年龄、性别、体重与一般健康状况。鉴于各种投药途径的不同效率，所需剂量水平的大幅变化是可预期的。

视需要或在特定情况下视为恰当的，可以单次剂量或者两次或两次以上剂量投与有效剂量。如果需要促进重复或频繁输液，植入传递装置可以是可取的，所述传递装置例如泵、半永久性支架(例如静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储集器。在成功治疗之后，可能需要使患者经历维持疗法以预防疾病病况的复发。抗体组合物的浓度是足以有效治疗或预防病症或调节人内生理条件的量。所投与的抗体的浓度或量将取决于针对药剂和投药方法所确定的参数。

某些因素可以影响有效地治疗个体所需的剂量，包括(但不限于)疾病或病症的严重程度、先前治疗、个体的一般健康状况和/或年龄以及所存在的其它疾病。还应了解，用于治疗的抗体的有效剂量可以在特定治疗过程中增加或减少。剂量变化可以由诊断分析的结果产生并变得显而易见。举例来说，可以在投与抗体组合物之后监测个体。基于来自监测的信息，可以投与额外量的抗体组合物。一般技术者可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复速率。

以下实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实例1

此实例展示了可以通过定点突变诱发制造具有改变的氨基酸序列的一系列变异体抗CD20抗体轻链和重链。

使用一般技术者众所周知的各种方案完成所克隆的抗CD20轻链和重链编码序列的位点特异性突变，所述方案包括MORPH位点特异性质粒DNA突变诱发试剂盒(5Prime to 3 Prime公司)、QuikChange定点突变诱发试剂盒、QuikChange多定点突变诱发试剂盒和QuikChange快速多定点突变诱发试剂盒(所有都是来自加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦技术公司(Agilent Technologies，Santa Clara，CA))。具体来说，QuikChange方法使用互补错配引物对和引物延伸，使用非股置换聚合酶(Pfu)。在转型之前，亲本模板(从使大肠杆菌菌株甲基化制备)经DpnI(对甲基化DNA具有特异性并且不消化新合成的双螺旋DNA)消化。通过双脱氧测序检验所有突变。如(威尔金斯·斯提芬斯(Wilkins Stevens)等人：从合成基因产生的重组免疫球蛋白可变结构域提供用于体外表征轻链类淀粉蛋白质的系统(Recombinant immunoglobulin variable domains generatedfrom synthetic genes provide a system for in vitro characterization of light chain amyloidproteins)，《蛋白质科学》(Protein Sci.)4：421-432(1995))所述完成所得轻链和重链多肽的表达和纯化。抗体V_H和V_L结构域在大肠杆菌宿主菌株BL26中表达。使用小规模(30mL)振荡培养物来制备用于评估热稳定性的足量蛋白质。通过与Ni-NTA琼脂糖(凯杰)或Ni琼脂糖凝胶(新泽西州皮斯卡塔韦的通用电气医疗集团(GE Healthcare，Piscataway，NJ))一起培育，从大肠杆菌周质部分中分离His标记蛋白质。在96孔过滤板上收集亲和树脂并洗涤。用含有500mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。

表1到表3分别呈现了野生型抗CD20抗体轻链和重链，其残基如根据卡巴特E.A.(Kabat E.A.)、吴T.T.(Wu T.T.)、佩里H.M.(Perry H.M.)、戈特斯曼K.S.(GottesmanK.S.)和弗勒C.(Foeller C.)(1991)：《免疫相关的蛋白质序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)(卡巴特编)，第1卷，第5版.美国卫生和公众服务部(USDepartment of Health and Human Services)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(MD).(1991)(V_L和V_H序列)或EU编号(C_H2序列)和参看SEQ ID NO：1和2所定义进行编号。(除非另外说明，否则在此所用的所有氨基酸序列编号都是参考/基于SEQ ID NO：1和2。)

表1.野生型抗CD20轻链可变结构域氨基酸序列编号系统

表2.野生型抗CD20重链可变结构域氨基酸序列编号系统

表3.野生型抗CD20重链恒定结构域2氨基酸序列编号系统

产生以下抗CD20抗体轻链，其中每一者通过其氨基酸序列变化(根据SEQ ID NO：1编号)加以鉴别：Q1D、S5T、A9S、A9L、I10L、I10F、I10S、I10T、A13V、P15A、P15L、P15V、K18Q、K18R、K18E、M21I、M21L、S27Q、S27K、I32L、H33N、F35Y、P39S、S41A、S41T、S41Q、S42A、S42P、P45L、P45R、W46L、W46I、A49D、S55P、V59A、V59D、F61T、S69D、S69N、S69T、Y70F、S71T、A79P、A82L、A82V、A82F、Q88L和G99Q。

产生以下抗CD20抗体重链，其中每一者通过其氨基酸序列变化(根据SEQ ID NO：2编号)加以鉴别：

i.V37L、M20L和以下中的一者：Q5V、P7S、A9G、A9L、E10G、K13Q、T28S、T30S、K67R、K67R：A68F、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、Y80F、M81L、S84N、A92G、W106S、F108A、N109D和A113Q；

ii.M20L、A92G和以下中的一者：V18L、K19R、K19S、K19T、M20I、M20V、S25T、Y27F、Y32F、Y32S、P41H、G44E、L45R；以及

iii.V244L、L246I、V263L、V267A、V267I、V267L、V270L、V270S、V270F、V270I、V277I、F279I、F279L、V306T、V312I、V312L、V327A、V327L、I340A、I340L、T254E、M256L、M256Y、T260E、T260F和T260K。

另外，产生具有多个氨基酸序列变化的抗CD20抗体重链(参见表4)。

表4.具有多个氨基酸序列变化的抗CD20抗体重链

样品编号	重链序列变化
		RW004	野生型(WT)
RW005	M20I/M81L/A92G/N109D/V263L
		RW006	M20I/M81L/A92G/N109D/V263L
RW007	M20L/M81L/A92G/N109D
		RW008	M20L/M81L/A92G/N109D
RW009	M20L/M81L/A92G

然后针对增强的稳定性筛选这些变异体抗CD20轻链和重链。

实例2

此实例表明可以使用定点突变诱发来产生基于差示扫描荧光测定(DSF)筛选分析具有增强的稳定性的抗CD20抗体重轻链和重链多肽。

差示扫描荧光测定监测蛋白质在荧光染料存在下的热去折叠并且通常通过使用实时PCR仪器进行。DSF可以应用于各种蛋白质，包括抗体轻链和重链。可以用于DSF的荧光染料在非极性环境，例如去折叠蛋白质上的疏水性位点中具有高荧光，与荧光被淬灭的水溶液相比。已经使用的各种染料就其光学特性来说，尤其是在通过结合到变性蛋白质所引起的荧光量子产率方面有所不同。当使用DSF进行蛋白质稳定性分析时，绘制随温度而变的荧光强度，产生可以通过双态过渡描述的S形曲线。使用简单方程式，例如波耳兹曼方程(Boltzmann equation)计算过渡曲线的拐点(T_m)(参见例如尼森F.H.、伯格伦德H.和维达迪M.：使用差示扫描荧光测定来检测促进蛋白质稳定性的配体相互作用.《自然实验手册》2：2212-21(2007))。

在蛋白质染料SYPRO橙染存在下，通过DSF单独地分析V_L和V_H结构域的相对稳定性(也参见同上文献)。简单来说，在MX4000 qPCR系统(Stratagene，加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦技术公司)中，在492nm下激发并在580nm下发射，使在PBS中并且含有5×SYPRO橙染的40μl10-20μM蛋白质样品以1℃增量从25℃加热到90℃。在染料SYPRO橙染(加利福尼亚州卡尔斯巴德的茵维特罗根公司(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA))与变性蛋白质的结合之后，以荧光增加形式检测蛋白质去折叠。通过使用程序Prism4(加利福尼亚州拉荷亚的GraphPad软件(GraphPad Software，La Jolla，CA))，使所述数据与波耳兹曼方程进行非线性最小平方曲线拟合来测定过渡中点(也参见尼森F.H.、伯格伦德H.和维达迪M.：使用差示扫描荧光测定来检测促进蛋白质稳定性的配体相互作用.《自然实验手册》2：2212-21(2007))。V_H变异体经测试为具有V37L/M20L或M20L/A92G氨基酸变化的“表达优化的”结构域。这些组合并不都在全长抗体中测试。抗体片段经his标记并使用IMAC纯化。(完全抗CD20抗体经蛋白质A树脂纯化。)

表中所列举的T_m变化(或Δ)通过从突变体蛋白质的Tm中扣除野生型蛋白质的Tm来计算。(在V_H变异体的情况下，野生型V_H不表达，因此测定相对于包含用于改善表达的稳定化残基的两种不同V_H结构域的ΔT_m)。0.3℃或0.3℃以上的任何ΔT_m视为稳定性增强。结果再次示出在表4到表6中。

表5.利妥昔单抗V_L结构域的氨基酸修饰和热稳定性.

V_L突变	ΔT_m(℃)	V_L突变	ΔT_m(℃)
				Q1D	弱信号	S41T	弱信号
S5T	弱信号	S41A	-2.91
				A9S	-3.50	S42A	-1.38
A9L	-6.04	S42P	1.82.
				I10L	NA^b	P45L	-10.07
I10F	弱信号	P45R	弱信号
				I10S	-5.70	W46L	5.57
I10T	-3.62	W46I	6.73
				A13V	-0.72	A49D	-1.59
P15A	-2.66	S55P	2.26
				P15L	NA	V59A	0.67
P15V	NA	V59D	2.38
				K18Q	-2.80	F61T	-15.07
K18R	NA	S69D	0.47
				K18E	-2.97	S69N	0.70
M211	-3.49	S69T	NA
				M21L	-4.74	Y70F	0.76
S27Q	3.90	S71T	-1.56
				S27K	-2.51	A79P	1.21
I32L	-8.52	A82L	弱信号
				H33N	弱信号	A82V	-7.21
F35Y	-0.77	A82F	-8.45
				P39S	-4.16	Q88L	-0.12
S41Q	0.31	G99Q	-1.82

^a由于基于荧光的热稳定性分析中信号不良而无法获得T_m

^b未获得突变或蛋白质表达不充分

表6.利妥昔单抗V_H结构域的氨基酸修饰和热稳定性.

^a野生型利妥昔单抗V_H结构域表达不良。工程改造V_H结构域的变异体以改善表达。这些变异体充当突变诱发的构架。所示的ΔT_m值与相应构架成比例。

^b不是明确测量的外推得到的构架突变的ΔT_m值如下：V37L(1.0℃)，M20L(4.5℃)。

表7.利妥昔单抗C_H2结构域的氨基酸修饰和热稳定性.

C_H2突变	ΔTm(℃)	C_H2突变	ΔTm(℃)
				V244L	-4.13	V306T	-4.66
L246L	-1.75	V3121	0.88
				V263L	2.41	V312L	-4.91
V267A	-6.32	V327A	-6.25
				V267I	-4.12	V327L	-11.03
V267L	-6.20	I340A	-8.49
				V270L	-1.34	I340L	-6.29
V270S	-5.58	T254E	-2.34
				V270F	-5.34	M256L	·2.98
V270I	-0.86	M256Y	-2.85
				V277I	3.84	T260E	-1.06
F279I	-3.35	T260F	-2.94
				F279L	0.18	T260K	-0.29

实例3

此实例通过使用毛细管差示扫描热量测定(cDSC)进一步证实由本发明提供的一些抗CD20抗体变异体的增强的稳定性。

根据DSF研究，选择一系列变异体抗体通过cDSC进行稳定性分析。通过重链和轻链载体的共转染产生双股抗体用于在CHO-S(适合于悬浮液培养物的中国仓鼠卵巢)细胞系中短暂表达。

使用FreeStyle MAX CHO表达系统(茵维特罗根)进行抗CD20抗体的短暂表达。在补充有L-谷氨酰胺的FreeStyle CHO表达培养基中培养CHO-S细胞。为了转染，将细胞稀释到1×10⁶/ml并且用每毫升培养物1μg DNA进行转染。如制造商所述，用OptiPro无血清培养基稀释重链∶轻链的比率为1∶1的质粒并使其与FreeStyle MAX转染试剂混合。培育混合物10分钟以形成脂质-DNA复合物并将其添加到CHO-S细胞。在37℃，8％C02下，在以135rpm旋转的定轨振荡器平台上培育培养物。在4-7天之后收集培养基，并且通过蛋白质A亲和色谱法纯化抗CD20抗体。

通过cDSC来表征一组具有氨基酸序列变化的抗CD20抗体变异体，所述氨基酸序列变化在DSF上产生了有前景的结果。所述结果和其可能的含义呈现在表8中。

表8.单氨基酸变化的可能含义.

第二组具有多个氨基酸序列变化的抗CD20抗体变异体通过cDSC来表征。野生型抗CD20抗体认定为样品“RW004”。样品“RW005-009”是稳定变异体。氨基酸序列变化示出在表4中。6种稳定化氨基酸变化(选自表5到表7)的组合将抗CD20 Fab结构域(抗体包含结合功能的那一部分)的解链温度(T_m)提高到最高86.5℃。这代表比野生型蛋白质提高最多11.1℃。

结果和其含义呈现在图5和表9中。

表9.具有多个氨基酸序列变化的抗CD20抗体变异体的cDSC结果

样品编号	轻链	重链	T_max(℃)
				RW004	WT	野生型(WT)	75.36
RW005	W46L	M20I/M81L/A92G/N109D/V263L	86.53
				RW006	WT	M20I/M81L/A92G/N109D/V263L	85.63
RW007	W46L	M20L/M81L/A92G/N109D	84.61
				RW008	WT	M20L/M81L/A92G/N109D	84.60
RW009	WT	M20L/M81L/A92G	83.24

实例4

此实例使用热挑战分析来进一步证明由本发明提供的一组具有多个氨基酸序列变化的抗CD20抗体变异体的增强稳定性。

在指定温度下加热野生型和稳定的抗CD20抗体变异体的等分试样10分钟并且然后迅速地在冰上冷却。使样品离心以去除任何沉淀物质。在Octet生物传感器(加利福尼亚州门洛帕克的ForteBio公司(ForteBio，Inc.，Menlo Park，CA))上，使用蛋白质A传感器试剂盒对保持蛋白质A结合活性的抗体进行定量。因为蛋白质A结合到抗体的Fc部分(尤其是C_H2结构域，这是最不稳定的结构域)，所以数据表明可变结构域的稳定化已经提高了抗体分子的整体稳定性。副本表示从不同短暂表达实验纯化的抗体。

结果描绘在图6中，其示出了变异体对比野生型的清楚的增强稳定性。

本文中所引用的所有参考文献，包括公告、专利申请和专利特此以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同每一个参考文献单独地并且特定地以引用的方式并入并全文阐述于本文中一般。

除非本文中另外指出或明显与内容相矛盾，否则在描述本发明的情况下(尤其在所附权利要求书的情况下)使用术语“一(a/an)”和“所述”以及类似指示物应理解为涵盖单数与复数。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语(即，意指“包括(但不限于)”)。除非本文中另有说明，否则本文中的值范围的叙述仅打算充当单独地提及属于所述范围的每一个单独的值的速记方法，并且每一个单独的值并入本说明书中，如同在本文中单独地叙述一般。除非本文中另有说明或另外明显与内容相矛盾，否则本文中所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。除非另外主张，否则本文中所提供的任何和所有实例或例示性语言(例如，“例如”)的使用仅打算更好地阐明本发明并且不对本发明的范围施加限制。本说明书中的任何语言都不应该理解为指示实施本发明所必需的任何未主张要素。

本发明的优选实施例描述于本文中，包括本发明人已知的进行本发明的最佳模式。在阅读前文描述之后，那些优选实施例的变化对于一般技术者可变得显而易见。本发明人期望熟练的业内人士适当时采用这些变化，并且本发明人打算以不同于本文中特定描述的其它方式来实施本发明。因此，本发明包括可适用法律所允许的随附权利要求书中所引述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文中另有说明或另外明显与内容相矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合。

Claims

1.一种经分离稳定的抗CD20抗体，其中

a.所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：1：S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F和A79P；

b.所述经分离稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含SEQ ID NO：2或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：2：V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L和V312I；以及

c.所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含(a)中所列举的SEQ IDNO：1中的所述氨基酸序列变化中的至少一者或所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含(b)中所列举的SEQ ID NO：2中的所述氨基酸序列变化中的至少一者。

2.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述轻链氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述轻链氨基酸序列包含具有W46I氨基酸序列变化的SEQ ID NO：1。

4.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有以下氨基酸序列序列变化中的一者的SEQ ID NO：2：M20L、M20I、M81L、A92G、N109D或V263L。

5.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有M20L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

6.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有M20I氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

7.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有M81L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

8.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有A92G氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

9.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有N109D氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

10.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述重链氨基酸序列包含具有V263L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

11.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中

a.所述轻链氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：1；并且

b.所述重链氨基酸序列包含具有M20I、M81L、A92G、N109D和V263L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

12.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中

a.所述轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1；并且

13.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中

b.所述重链氨基酸序列包含具有M20L、M81L、A92G和N109D氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

14.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中

a.所述轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1；并且

15.根据权利要求1所述的经分离抗CD20抗体，其中

a.所述轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1；并且

b.所述重链氨基酸序列包含具有M20L、M81L和A92G氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

16.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中当如通过以下所测量，所述抗CD20抗体的重链或轻链具有优于野生型抗CD20抗体的相应重链或轻链的热稳定性时，其视为稳定的：差示扫描热量测定DSC、圆二色性CD光谱法、荧光发射光谱法、核磁共振NMR光谱法、尺寸排阻色谱法或热挑战分析。

17.根据权利要求1所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中当与相同数量的野生型抗CD20抗体相比时，所述抗CD20抗体具有增强的抗原结合活性、存放期、血清半衰期、AUC或C_max。

18.一种经分离稳定的抗CD20抗体，其中

a.所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列或所述轻链氨基酸序列的等效物包含SEQ ID NO：1或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：1：S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F和A79P；

b.所述经分离稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列或所述重链氨基酸序列的等效物包含SEQ ID NO：2或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：2：V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L和V312I；

c.所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列或所述轻链氨基酸序列的所述等效物包含(a)中所列举的SEQ ID NO：1中的所述氨基酸序列变化中的至少一者，或者所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列或所述重链氨基酸序列的所述等效物包含(b)中所列举的SEQ ID NO：2中的所述氨基酸序列变化中的至少一者；以及

d.所述经分离稳定的抗CD20抗体呈完全抗体、Fv片段、单链可变区ScFv抗体、单克隆抗体、Fab抗体片段、Fab′抗体片段或Fab′2 Fab抗体片段形式。

19.一种经分离核酸，其编码根据权利要求18所述的稳定的抗CD20抗体的单一轻链或重链。

20.根据权利要求19所述的经分离核酸，其中所述核酸是RNA或DNA。

21.一种经分离载体，其指导根据权利要求19所述的核酸中的任一者的表达。

22.根据权利要求21所述的经分离载体，其中所述表达是诱导型的。

23.一种经分离细胞，其包含根据权利要求19所述的载体中的一或多者。

24.根据权利要求23所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。

25.根据权利要求23所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。

26.根据权利要求25所述的真核细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

27.根据权利要求23所述的细胞，其中所述细胞经所述载体中的一或多者短暂转型。

28.根据权利要求22所述的细胞，其中所述细胞经所述载体中的一或多者稳定转型。

29.根据权利要求1所述的经分离抗CD20抗体，其中所述抗CD20抗体轻链或重链氨基酸序列具有如下其它氨基酸序列变化

a.增强所述抗CD20抗体的以下能力：结合到所述CD20分子、锚定补体、调理CD-20表达细胞、活化抗体依赖性细胞毒性ADCC、活化抗体依赖性程序性细胞死亡、活化巨噬细胞依赖性抗CD20免疫反应、携带CD20的细胞对化学疗法的敏感性；

b.降低所述抗CD20抗体锚定补体的能力；以及

c.(a)和(b)的所述其它氨基酸序列变化的组合。

30.根据权利要求1中任一权利要求所述的经分离稳定的抗CD20抗体，其中所述抗CD20抗体偶联到效应物。

31.根据权利要求30所述的经分离抗CD20抗体，其中所述效应物是放射性同位素、化学治疗剂、毒素、生物反应调节剂或第二抗体。

32.根据权利要求1所述的经分离抗CD20抗体，其中所述抗CD20抗体偶联到PEG、白蛋白或多唾液酸。

32.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗CD20抗体和药学上可接受的载剂。

34.一种治疗患者中的疾病的方法，其包含向所述患者投与在药学上可接受的载剂中的治疗有效量的稳定的抗CD20抗体，其中

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：1。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含具有W46I氨基酸序列变化的SEQ ID NO：1。

37.根据权利要求34所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有以下氨基酸序列变化中的一者的SEQ ID NO：2：M20L、M20I、M81L、A92G、N109D或V263L。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有M20L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有M20I氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有M81L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

41.根据权利要求37所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有A92G氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

42.根据权利要求37所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有N109D氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

43.根据权利要求37所述的方法，其中所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有V263L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

44.根据权利要求34所述的方法，其中：

a.所述稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：1；并且

b.所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有M20I、M81L、A92G、N109D和V263L氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

45.根据权利要求34所述的方法，其中：

a.所述稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1；并且

46.根据权利要求34所述的方法，其中：

b.所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有M20L、M81L、A92G和N109D氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

46.根据权利要求34所述的方法，其中：

a.所述稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1；并且

48.根据权利要求34所述的方法，其中：

a.所述稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1；并且

b.所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含具有M20L、M81L和A92G氨基酸序列变化的SEQ ID NO：2。

49.根据权利要求34所述的方法，其中当如通过以下所测量，所述抗CD20抗体的重链或轻链具有优于野生型抗CD20抗体的相应重链或轻链的热稳定性时，其视为稳定的：差示扫描热量测定DSC、圆二色性CD光谱法、荧光发射光谱法、核磁共振NMR光谱法、尺寸排阻色谱法或热挑战分析。

50.根据权利要求34所述的方法，其中当与相同数量的野生型抗CD20抗体相比时，所述稳定的抗CD20抗体具有增强的抗原结合活性、存放期、血清半衰期、AUC或C_max。

51.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗体轻链或重链氨基酸序列具有其它氨基酸变化，所述氨基酸变化增强所述抗体结合到所述CD20分子、锚定补体、调理CD-20表达细胞、活化抗体依赖性细胞毒性ADCC、活化抗体依赖性程序性细胞死亡、活化巨噬细胞依赖性抗CD20免疫反应、携带CD20的细胞对化学疗法的敏感性的能力，或者降低所述抗CD20抗体锚定补体的能力以及其组合。

52.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗体偶联到效应物。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述效应物是放射性同位素、化学治疗剂、毒素、生物反应调节剂或第二抗体。

54.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗体偶联到PEG、白蛋白或多唾液酸。

55.根据权利要求34所述的方法，其中所述疾病是非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、类风湿性关节炎、韦格纳氏肉芽肿病或显微镜下多血管炎。

56.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗体呈完全抗体、单链可变区ScFv抗体、单克隆抗体、Fab抗体片段、Fab′抗体片段或Fab′2抗体片段形式。

57.一种定量检测患者中的CD20多肽的方法，其包含向所述患者投与在药学上可接受的载剂中的诊断有效量的稳定的抗CD20抗体，其中

58.一种定量检测生物样本中的CD20多肽的方法，其包含使诊断量的稳定的抗CD20抗体与所述生物样本接触，其中

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述抗CD20抗体用于ELISA分析、蛋白质印迹、狭缝印迹、抗原捕捉分析或微阵列分析中。

60.一种经分离抗CD20抗体，其中

a.所述抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：1：Q1D、S5T、A9S、A9L、I10L、I10F、I10S、I10T、A13V、P15A、P15L、P15V、K18Q、K18R、K18E、M21I、M21L、S27Q、S27K、I32L、H33N、F35Y、P39S、S41A、S41T、S41Q、S42A、S42P、P45L、P45R、W46L、W46I、A49D、S55P、V59A、V59D、F61T、S69D、S69N、S69T、Y70F、S71T、A79P、A82L、A82V、A82F、Q88L和G99Q；

b.所述抗CD20抗体重链氨基酸序列包含SEQ ID NO：2或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：2：

i.V37L、M20L和以下一或多者：Q5V、P7S、A9G、A9L、E10G、K13Q、T28S、T30S、K67R、K67R、A68F、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、Y80F、M81L、S84N、A92G、W106S、F108A、N109D和A113Q；

ii.M20L、A92G和以下一或多者：V18L、K19R、K19S、K19T、M20I、M20V、S25T、Y27F、Y32F、Y32S、P41H、G44E、L45R；以及

iii.V244L、L246I、V263L、V267A、V267I、V267L、V270L、V270S、V270F、V270I、V277I、F279I、F279L、V306T、V312I、V312L、V327A、V327L、I340A、I340L、T254E、M256L、M256Y、T260E、T260F和T260K；以及

c.其中所述抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含(a)中所列举的SEQ ID NO：1中的至少一种氨基酸变化，或者所述抗CD20抗体重链氨基酸序列包含(b)中所列举的SEQ ID NO：2中的所述氨基酸变化中的至少一者。