CN104169438B - 非对称发夹靶标捕获低聚物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供改善的茎‑环靶标捕获低聚物以及使用方法。此类靶标捕获低聚物具有形成环的靶标结合片段，所述环在形成茎的茎片段的侧面。所述茎片段是不等长的。在不存在靶核酸但提供良好靶标灵敏度的情况下，此类探针显示出很少结合至或不结合至固定化探针。所述探针尤其可用于多种检测方法，其中存在检测多个靶核酸(例如，检测靶基因的多个多态性形式)的多个靶标捕获低聚物。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请是提交于2012年2月1日的61/593,829的正式申请，该专利申请出于所有目的全文以引用方式并入本文。
背景技术
样品中核酸的检测用于诊断、治疗、法庭、农业、食品科学应用和其他领域。一种用于纯化靶多核苷酸的技术通常用于诊断过程，其涉及将靶核酸捕获在固相载体上。固相载体在靶核酸纯化过程的一个或多个洗涤步骤期间保持靶核酸。捕获的靶核酸序列可通过各种方法分析。一种此类方法使用杂交至靶序列的核酸探针。探针可设计为检测不同靶序列，诸如具有微生物、病毒、人类基因、植物或动物基因和/或病原性病症特征的那些靶序列。得益于捕获的靶核酸的另外分析技术包括核酸的扩增测定、微阵列、测序测定、质谱测定。
靶核酸可使用同时杂交结合靶核酸和固定至固相载体的核酸的靶标捕获低聚物捕获。靶标捕获低聚物将靶核酸连接至固相载体，生成包含结合的靶核酸的复合物。标记探针可杂交至结合的靶标，未结合的标记探针可从固相载体洗掉(参见Stabinsky，美国专利No.4,751,177)。
靶标捕获低聚物的变型已有所描述，其中在靶标不存在的情况下捕获探针以茎-环结构存在，并且在靶核酸存在的情况下，靶核酸结合至环部分，打开茎并且使得环的一个臂能够结合固定化探针(参见US20060068417)。此类构造可用于在靶标捕获低聚物结合至其靶核酸之前降低靶标捕获低聚物杂交固定化探针的能力。
发明内容
本发明提供包含第一和第二茎片段的靶标捕获低聚物(TACO)，所述片段的长度差异为与靶核酸互补的靶标结合片段侧面的至少两个核碱基。在杂交条件下，在不存在靶核酸的情况下，靶标捕获低聚物形成茎-环，第一和第二茎片段的分子内杂交形成茎，并且靶标结合片段形成环；并且在存在靶核酸的情况下，靶标结合片段杂交至靶核酸，打断第一和第二茎片段的分子内杂交，产生能够杂交至互补的固定化探针的第一茎片段。在一些TACO中，第一茎片段包含至少15个核碱基单元，并且第二茎片段包含至少五个核碱基单元。在一些TACO中，第二茎片段的长度为第一茎片段的长度的39-61％。在一些TACO中，第一茎片段和第二茎片段的长度差异为至少5个核碱基单元。在一些TACO中，第一和第二茎片段的长度差异为至少9个核碱基单元。在一些TACO中，第一和第二茎片段的长度差异为5-15个核碱基单元。在一些TACO中，第一片段具有17-26个核碱基单元，并且第二片段具有7-16个核碱基单元。在一些TACO中，第一片段具有18-24个核碱基单元，第二片段具有7-15个核碱基单元，并且第一片段比第二片段长至少7个核碱基单元。在一些TACO中，第一和第二茎片段分别占据靶标捕获低聚物的5’和3’末端，并且第一茎片段与固定化探针互补。在一些TACO中，第一和第二茎片段包含polyA和polyT核碱基单元的互补片段。在一些TACO中，第一片段包含polyA片段，并且第二茎片段包含polyT片段。在一些TACO中，第一或第二茎片段包含T(0-5)A(10-40)。在一些TACO中，第一茎片段包含T(0-5)A(10-40)，并且第二茎片段包含A(0-5)T(10-40)，其中第一茎片段比第二茎片段长。在一些TACO中，第一茎片段的A(10-40)比第二茎片段的T(10-40)长5-15个核苷酸。在一些TACO中，第一茎片段包含A(15-40)，并且第二茎片段包含T(10-30)。在一些TACO中，靶标结合片段包含至少一个甲氧基核碱基。
本发明还提供包含上述定义的靶标捕获低聚物和固定化探针的试剂盒，所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与第一或第二发夹茎片段互补的片段。在一些试剂盒中，第一和第二发夹片段的较长者包含polyA，第一和第二发夹片段的较短者包含polyT，并且固定化探针片段包含polyT，polyT的长度在第一和第二发夹探针的polyA和polyT片段之间。
本发明还提供捕获靶核酸的方法。此类方法包括使被怀疑包含靶核酸的样品与靶标捕获低聚物和固定化探针接触；靶标捕获低聚物包含第一和第二发夹茎片段，所述片段的长度差异为与靶核酸互补的靶标结合片段侧面的至少两个核碱基单元，靶标捕获低聚物采取发夹茎-环的形式，茎通过第一和第二发夹茎片段的分子内杂交形成，并且靶标结合片段构成环；固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与第一或第二发夹茎片段互补的片段；其中如果样品包含靶核酸，则靶核酸杂交至靶标结合片段打断第一和第二发夹茎片段的分子内杂交，使得第一或第二发夹片段杂交至固定化探针上的互补片段，形成载体结合的捕获杂交体；并且如果样品不包含靶核酸，则第一和第二片段保持以茎进行分子内杂交。本专利申请中上述或别处公开的任何靶标捕获低聚物可以此类方法使用。
在一些方法中，靶标存在于样品中。一些方法还包括从样品分离载体结合的捕获杂交体。在一些方法中，接触在第一温度下然后在低于第一温度的第二温度下进行。在一些方法中，第一温度在第一和第二茎片段之间形成的双链以及靶标结合片段和靶核酸之间形成的双链的解链温度之间，并且第二温度低于第一和第二茎片段形成的双链以及第二茎片段和固定化探针之间形成的双链的解链温度。在一些方法中，分离在第二温度下进行。一些方法还包括从捕获杂交体释放靶核酸。一些方法还包括检测靶核酸。一些方法还包括对靶核酸测序。在一些方法中，靶标捕获低聚物是具有与不同靶标互补的不同靶标结合片段的多个靶标捕获低聚物中的一者。在一些方法中，所述多个靶标捕获低聚物包括至少十个靶标捕获低聚物。
本发明还提供包含任何前述权利要求定义的靶标捕获低聚物、固定化探针的反应混合物，所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与第一或第二发夹茎片段互补的片段和杂交至靶标捕获低聚物的靶标结合片段的靶核酸。
附图说明
图1示出了在捕获条件中和在不存在其杂交的靶核酸的情况下各种靶标捕获低聚物的构造。黑色圆圈以及方格突起分别表示捕获珠和固定化探针。在此类条件下非对称靶标捕获低聚物在发夹构造中示出，而线性靶标捕获低聚物保持线性构造。在这些条件下，线性靶标捕获低聚物的第一茎能够与固定化探针杂交；然而，非对称靶标捕获低聚物的第一茎不杂交。
图2示出了在捕获条件下和在存在其杂交的靶核酸的情况下非对称靶标捕获低聚物的各种构造。在该图示中，与靶核酸相比，存在过量的非对称靶标捕获低聚物。结合至靶核酸的非对称靶标捕获低聚物在打开(非发夹)构造中示出，从而暴露其与固定化探针结合的第一茎。闭合(发夹)构造中示出的非对称靶标捕获低聚物具有其第一茎结合的并且不结合固定化探针的第二茎。
图3示出了实例2中得到的结果的图解。
图4示出了实例1中得到的结果的图解。
定义
核酸是指包含核苷酸或类似物的多聚化合物，所述核苷酸或类似物具有连接在一起形成聚合物的含氮杂环碱基或碱基类似物，所述聚合物包括常规RNA、DNA、RNA-DNA混合物或其类似物。
含氮杂环碱基可称为核碱基单元。核碱基单元可以是常规DNA或RNA碱基(A、G、C、T、U)、碱基类似物如肌苷、5-硝基吲唑等等(The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,Adams et al.,ed.,11th ed.,1992(《核酸的生物化学》，第5-36页，Adams等人编辑，第11版，1992年)；van Aerschott et al.,1995,Nucl.Acids Res.23(21):4363-70(vanAerschott等人，1995年，《核酸研究》，第23卷，第21期，第4363-4370页))、咪唑-4-甲酰胺(Nair et al.,2001,Nucleosides Nucleotides Nucl.Acids,20(4-7):735-8(Nair等人，2001年，《核苷、核苷酸、核酸》，第20卷，第4-7期，第735-738页))、嘧啶或嘌呤衍生物例如改性嘧啶碱6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮(有时称为结合A或G的“P”碱基)和改性嘌呤碱N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤(有时称为结合C或T的“K”碱基)、次黄嘌呤(Hillet al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(8):4258-63(Hill等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第8期，第4258-4263页)；Lin and Brown,1992,Nucl.Acids Res.20(19):5149-52(Lin和Brown，1992年，《核酸研究》，第20卷，第19期，第5149-5152页))、2-氨基-7-脱氮杂-腺嘌呤(与C和T配对；Okamoto et al.,2002,Bioorg.Med.Chem.Lett.12(1):97-9(Okamoto等人，2002年，《生物有机和药物化学通讯》，第12卷，第1期，第97-99页))、N-4-甲基脱氧鸟苷、4-乙基-2'-脱氧胞苷(Nguyen et al.,1998,Nucl.Acids Res.26(18):4249-58(Nguyen等人，1998年，《核酸研究》，第26卷，第18期，第4249-4258页))、4,6-二氟苯并咪唑和2,4-二氟苯核苷类似物(Kiopffer&Engels,2005,Nucleosides NucleotidesNucl.Acids,24(5-7)651-4(Kiopffer和Engels，2005年，《核苷、核苷酸、核酸》，第24卷，第5-7期，第651-654页))、嵌二萘官能化LNA核苷类似物(Babu&Wengel,2001,Chem.Commun.(Camb.)20:2114-5(Babu和Wengel，2001年，《化学通讯(剑桥)》，第20卷，第2114-2115页)；Hrdlicka et al.,2005,J.Am.Chem.Soc.127(38):13293-9(Hrdlicka等人，2005年，《美国化学会志》，第127卷，第38期，第13293-13299页))、脱氮杂或氮杂改性嘌呤和嘧啶、5或6位具有取代基的嘧啶和2、6或8位具有取代基的嘌呤、2-氨基腺嘌呤(nA)、2-硫尿嘧啶(sU)、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O-6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O-4-烷基-嘧啶(美国专利No.5,378,825；WO 93/13121；Gamper et al.,2004,Biochem.43(31):10224-36(Gamper等人，2004年，《生物化学》，第43卷，第31期，第10224-10236页))以及形成无氢键的双链DNA的疏水核碱基单元(Berger et al.,2000,Nucl.Acids Res.28(15):2911-4(Berger等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第15期，第2911-2914页))。多种衍生化和改性核碱基单元或类似物可商购获得(例如，弗吉尼亚州斯特林Glen Research公司(Glen Research,Sterling,Va.))。
连接至糖的核碱基单元可称为核碱基单元或单体。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或类似化合物，例如具有2'甲氧基或2'卤化物取代。核苷酸和核苷是核碱基单元的例子。本文所述的任何方法和探针可用核苷酸实施。
核碱基单元可通过多种键或构象连接，包括磷酸二酯、硫代磷酸酯或甲基磷酸酯键、肽-核酸键(PNA；Nielsen et al.,1994,Bioconj.Chem.5(1):3-7(Nielsen等人，1994年，《生物缀合物化学》，第5卷，第1期，第3-7页)；PCT No.WO 95/32305)和锁核酸(LNA)构象，其中具有双环呋喃糖单元的核苷酸单体以RNA模拟糖构象锁定(Vester et al.,2004,Biochemistry 43(42):13233-41(Vester等人，2004年，《生物化学》，第43卷，第42期，第13233-13241页)；Hakansson&Wengel,2001,Bioorg.Med.Chem.Lett.11(7):935-8(Hakansson和Wengel，2001年，《生物有机和药物化学通讯》，第11卷，第7期，第935-938页))或核酸链中此类键的组合。核酸可包括一种或多种“非碱性”残基，即主链的一个或多个位置不包括含氮碱基(美国专利No.5,585,481)。
核酸可以仅包括常规RNA或DNA糖、碱基和键，或可包括常规组分和取代二者(例如，具有2'-O-甲基键的常规RNA碱基，或常规碱基和类似物的混合物)。包含PNA、2'-甲氧基或2'-氟代RNA或影响总电荷、电荷密度或杂交复合物包括包含带电键(例如，硫代磷酸酯)或中性基团(例如，甲基磷酸酯)的低聚物的空间结合的结构，可影响核酸形成的双链的稳定性。
核酸及其组分核苷酸可以D或L型存在。D-型是天然型。L-核酸是D-核酸的对映体形式。核酸残基中的立体异构来源是形成核酸的每个单体单元的糖部分。除每个单体单元糖部分的立体异构之外，D和L-核酸及它们的单体单元非常相似。因此例如L-核酸的糖部分可连接至天然DNA或RNA中存在的相同核碱基单元(即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)，或这些核碱基单元的任何多种已知类似物。L-核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖或类似化合物(例如，具有2'甲氧基或2'卤化物取代)。糖部分可通过D-核酸中的糖磷酸二酯键或通过任何用于D-核酸的类似键连接，诸如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯键或肽-核酸键。
掺杂至少常规核碱基单元(即，A、C、G、T和U)的L-核苷酸可以适于固相合成的亚磷酰胺形式商购获得(例如，美国怀俄明州ChemGenes公司(ChemGenes Corporation(Wilmington,USA)))。L-核酸可使用与D-核酸所用相同的固相合成过程从L-核苷酸合成(例如，ABI合成仪和标准合成方案)。L-核苷酸也可通过常规连接循环连接至D-核苷酸(参见Hauser et al.,Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.185101–5111(2006)(Hauser等人，《核酸研究》，2006年，第34卷，第18期，第5101–5111页，2006年))，从而允许合成一条为D-核酸形式片段而另一条为L-核酸形式片段的嵌合核酸。
L-核酸根据与D-核酸类似的原理彼此杂交(例如，形成Watson-Crick或Hoogstein键)，并且与D-核酸杂交体具有类似的稳定性。L-核酸形成的双链是左手螺旋，而D-核酸形成的则是右手螺旋。虽然L-核酸可彼此杂交，如实例中进一步示出，L-核酸尤其是polyA或polyT L-核酸不能与poly A或polyT D-核酸的互补片段杂交。
除非语境中另外指明，未详细指明D-型或L-型时提及核酸或核苷酸包括两种可能性中的任何一者或两者。然而，语境可表明仅意指D-核酸或核苷酸。例如，无论是否指明，天然存在的核酸可理解为仅包含D-核苷酸，通过此类核酸形成合适双链的探针的片段亦如此。
低聚物可包含称为一组低聚物的“随机聚合物”序列，所述低聚物的总长度和其他特性基本上相同，但其中至少一部分低聚物通过随机掺入不同碱基特定的长度而合成，例如DNA低聚物中所有四种标准碱基(A、T、G和C)的随机分选，或大低聚物预定部分几个碱基(U和G)的随机分选。所得的低聚物实际上为一组其成员的有限数量通过长度和组成随机部分(例如，一组包含使用2种不同碱基合成的6个核苷酸随机序列的低聚物中的2exp6低聚物)的碱基数量确定的低聚物。
核酸的互补性意指核酸的一个链中的核苷酸序列，由于其核碱基基团的取向，通过氢键结合至相对核酸链上的另一个序列。DNA中互补碱基通常为A与T和C与G，RNA中为C与G和U与A。互补性可为完美的或基本的/充分的。两条核酸之间的完美互补意指两条核酸可形成其中双链中的每个碱基通过Watson-Crick配对键合至互补碱基的双链。“基本”或“充分”互补意指一条链中的序列与相对链中的序列不完全和/或完美互补，但两条链上的碱基之间存在充分键合，在一组杂交条件下(例如，盐浓度和温度)形成稳定的杂交复合物。此类条件可使用序列和标准数学计算预测杂交链的Tm，或使用常规方法通过经验确定Tm来预测。Tm是指两条核酸链之间形成一组杂交复合物50％变性的温度。在低于Tm的温度下，杂交复合物的形成是优选的，而在高于Tm的温度下，杂交复合物中链的解链或分离是优选的。可通过使用例如Tm＝81.5+0.41(％G+C)估计溶于1M NaCl水溶液的已知G+C含量的核酸的Tm，但其他已知Tm计算考虑核酸结构特性。
“杂交条件”是指其中一条核酸链通过互补链相互作用和氢键键合至第二核酸链生成杂交复合物的累积环境。此类条件包括包含核酸的水或有机溶液的化学组分及它们的浓度(例如，盐、螯合剂、甲酰胺)，以及混合物的温度。其他因素诸如温育时间长度或反应室尺寸可有助于环境(例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2.sup.nd ed.,pp.1.90-1.91,9.47-9.51,11.47-11.57(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1.90-1.91、9.47-9.51、11.47-11.57页，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，1989年))。
靶标捕获低聚物与靶核或靶核酸特异性结合意指靶标捕获低聚物的第一片段中的单个确定序列和靶核酸上的完全或基本互补片段之间结合形成稳定双链。可检测到此类结合比缺乏单个确定靶标捕获低聚物序列完全或基本互补的片段的样品中其他核酸的结合更强(信号或解链温度更高)。靶标捕获低聚物与靶核酸的非特异性结合意指靶标捕获低聚物可结合不与单个确定靶标捕获低聚物序列完全或基本互补的片段共有的一组靶序列。这可通过例如使用捕获探针的第一片段中的随机序列实现。
缺乏核酸之间的结合可以不易与缺乏基本互补但与所考虑的核酸长度相同的随机选择的核酸对之间存在的非特异性结合区别的结合表示。
“分离”或“隔离”或“纯化”是指从复合混合物诸如样品移除一种或多种组分。优选地，分离、隔离或纯化步骤从其他样品组分移除至少70％、优选地至少90％以及更优选地约95％的靶核酸。分离、隔离或纯化步骤可任选地包括另外的洗涤步骤，以移除非靶标样品组分。至少X％是指在X％至100％的范围内，包括所有整数和小数(例如，70％、82.5％等)。
捕获杂交体的“释放”是指使捕获杂交体的一种或多种组分彼此分离，诸如从捕获探针分离靶核酸和/或从固定化探针分离靶标捕获低聚物。靶核酸链的释放从捕获杂交体的其他组分分离靶标，使靶标可结合检测探针。捕获杂交体的其他组分可保持结合，例如靶标捕获低聚物结合捕获载体上的固定化探针，而不影响靶标检测。
提及一系列值还包括范围内的整数和范围内整数定义的子范围。
转录介导扩增(TMA)是可在小于一小时的时间内扩增RNA或DNA靶标十亿倍的基于核酸的等温方法。TMA技术使用两个引物和两个酶：RNA聚合酶和逆转录酶。一个引物包含RNA聚合酶的启动子序列。在扩增的第一步骤中，该引物杂交至靶标RNA的预定位点。逆转录酶通过从启动子引物的3'末端延伸生成靶标rRNA的DNA拷贝。所得的RNA:DNA双链中的RNA被逆转录酶的RNase酶活性降解。然后，第二引物结合至DNA拷贝。DNA的新链通过逆转录酶从该引物的末端合成，生成双链DNA分子。RNA聚合酶识别DNA模板中的启动子序列并且启动转录。每个新合成的RNA扩增子再进入TMA过程并且作为新一轮复制的模板。
逆转录酶PCR(RT-PCR)包括三个主要步骤。第一步骤是逆转录(RT)，其中RNA使用逆转录酶逆转录为cDNA。RT步骤可在与PCR相同的管内进行(使用40℃和50℃之间的温度，取决于所用的逆转录酶的特性)。下一步涉及在为或约为95℃的温度下dsDNA的变性，使得两条链分离，并且引物可在低温下再次结合并开始新链反应。然后，降低温度直到其达到退火温度，所述退火温度可根据一组所用的引物、它们的浓度、探针及其浓度(如果使用)以及阳离子浓度而变化。通常使用比引物对的最低Tm低约5℃的退火温度(例如，为或约为60℃)。RT-PCR利用一对引物，它们分别与cDNA的两条链中的一条的序列互补。PCR扩增的最终步骤是使用DNA聚合酶，优选地热稳定taq聚合酶通常在为或约为72℃下从引物延伸DNA，该酶在该温度下的工作状态最佳。每个温度下的温育长度、温度改变和循环数通过可编程的热循环仪控制。
实时聚合酶链式反应也称为定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qPCR/qrt-PCR)或动力学聚合酶链式反应(KPCR)，是基于PCR的实验室技术，其用于扩增和同时定量靶标DNA分子。其允许DNA样品中一个或多个特异性序列的同时检测和定量(当归一化为DNA输入或另外的归一化基因时，为拷贝的绝对数或相对数)。
具体实施方式
I.概述
本专利申请提供改善的茎-环靶标捕获低聚物以及使用方法。如发明背景中所讨论，US20060068417中描述的茎-环靶标捕获低聚物具有减少空靶标捕获低聚物结合至固定化探针的优点。然而，此类探针由于在靶核酸可结合捕获探针之前打开茎-环结构的障碍，也可具有减少靶标检测的灵敏度的缺点。本发明的茎-环靶标捕获低聚物在不存在靶核酸但提供改善的靶标灵敏度的情况下，保持很少结合至或不结合至固定化探针的优点。所述改善源于靶标捕获低聚物的臂形成不等长的茎。虽然机制的理解对于本发明的实施不是必须的，但据信臂的不等长使探针的环部分更易于结合靶核酸，从而增加灵敏度。本发明的发夹环探针尤其可用于多种检测方法，其中存在检测多个靶核酸(例如，检测靶基因的多个多态性形式)的多个靶标捕获低聚物。
II.靶标捕获低聚物
本发明的靶标捕获低聚物可再分为至少三个片段，第一和第二茎片段侧面的核酸靶标结合片段。靶标结合片段被构造成特异性或非特异性结合至靶核酸(参见US 6,110,678和WO 2008/016988)。第一和第二茎片段被构造成彼此结合，并且茎片段中的一者可任意称为第一茎片段，其也被构造成结合至固定化探针。第一和第二茎片段通过分子内杂交形成茎-环结构来彼此结合，其中第一和第二茎片段形成茎，靶标结合片段形成环。茎-环结构有时也称为发夹环。在不存在靶的情况下，茎-环结构在低于其解链温度的杂交条件下形成，并且靶标捕获低聚物可称为失活的。当存在靶核酸时，其结合至靶标结合环片段，使茎片段分离或保持分离，从而通过允许第一片段杂交至固定化探针的互补片段来活化靶标捕获低聚物。靶标捕获低聚物可提供已经形成的茎-环结构，或提供分离的茎或分子的混合组，其中一些形成茎，但另一些不形成茎。在提供时无论靶标捕获低聚物的形式如何，当靶标捕获低聚物置于低于其解链温度的杂交条件下时，茎-环结构可在使用中形成。
靶标捕获低聚物可以如下构造表示：A-B-C，其中A和C为被构造为形成双链茎的不等长的第一和第二茎片段，并且B为被构造为形成单链环部分的靶标结合片段。在该式中，A或C中的任何一者可视为探针的5’末端。
在一些捕获探针中，第一茎片段包含至少15个核碱基单元，并且第二茎片段包含至少5个核碱基单元。在一些捕获探针中，第二茎片段为第一茎片段的长度的39-61％。在一些捕获探针中，第一和第二茎片段长度差异为至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基单元，例如差异为5-15个核碱基单元，并且优选地至少7个核碱基单元。在一些捕获探针中，第一茎片段具有17-26个核碱基单元，并且第二茎片段具有7-16个核碱基单元。在一些捕获探针中，第一茎片段具有17-25个核碱基单元，并且第二茎片段为7-15个核碱基单元，并且第一茎片段比第二茎片段长至少7个核碱基单元。形成靶标捕获低聚物的第一和第二茎片段的核碱基长度的一些具体例子包括(以第一片段的长度：第二片段的长度列出)：(a)18:7至18:11的长度范围；(b)21:9至21:12的长度范围；(c)20:10的长度；以及(d)24:10至24:15的长度范围。核碱基单元提供的范围包括构成该范围的所有整数；意指例如(a)为长度为18个核碱基单元的第一片段，以及长度为7个、8个、9个、10个或11个核碱基单元的第二片段。在一些探针中，第一茎片段具有15-40个核碱基单元，并且第二茎片段具有10-30个核碱基单元。优选地，此类捕获探针中的第一茎片段比第二茎片段长至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基单元，更优选地至少7个核碱基单元。
在一些捕获探针中，第一和第二茎片段的较长者占据靶标捕获低聚物的5’末端，并且被构造成结合至捕获探针上的互补片段。在其他捕获探针中，第一和第二茎片段的较长者占据探针的3’末端和/或第一和第二茎片段的较短者被构造成结合至固定化探针的互补片段。
靶标捕获反应期间存在的不同双链的相对解链温度的例子通过讨论茎双链和靶标结合片段：靶核酸双链示出。所述第一和第二茎片段之间形成的双链的解链温度优选地低于靶标结合片段和靶核酸之间形成的双链的解链温度。茎片段相对较低的解链温度可通过将第一和第二茎片段设计为包含polyA和polyT核碱基单元的互补片段，其中靶标结合片段和靶核酸双链包括至少一些G和C核苷酸来获得。换句话讲，如果第一茎片段包含polyA，则第二茎片段包含polyT，或反之亦然。优选地，被构造成结合至固定化探针上的互补片段的第一茎片段包含polyA，并且第二茎片段包含polyT。然后第一茎片段的polyA片段可杂交至固定化探针上的polyT片段。在一些探针中，第一片段包含A15-40(即，15至40个A的均聚物)，第二片段包含T10-30(即，10-30个T的均聚物)。在一些此类探针中，第一茎片段比第二茎片段长至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基单元，优选地长至少7个核碱基单元。其中T用于取代A以及反之亦然的反向构造也是可能的。
被构造成结合第二茎片段的第一茎片段也被构造成结合至固定化探针。第一茎片段包括与固定化探针中存在的核酸基本并且优选地完全互补的核酸。例如，如果第一片段包括polyA均聚物，则固定化探针的核酸包括polyT均聚物。第一茎片段和固定化探针之间形成的双链的解链温度优选地小于第一茎片段和第二茎片段之间所形成的解链温度。在其他条件都相同的情况下，第一和第二茎片段之间形成的双链的解链温度通常高于第二茎片段和固定化探针之间形成的双链的解链温度，因为前面的双链来自分子内杂交，后面的来自分子间杂交。不同的解链温度可另外地或作为另外一种选择通过例如使固定化探针中的polyT均聚物比第二茎片段中的短来实现。
任选地，固定化探针的第一和第二茎片段和固定化探针中第一茎片段的互补片段可以是L-核酸，如共同待审的专利申请PCT/US2011/052050中所描述。因为L-核酸仅杂交至其他L-核酸，L-核酸的使用还可增加所需靶核酸捕获的特异性。对于此类捕获探针，固定化探针还具有与捕获探针的第一片段互补的L-核酸片段。
靶标捕获低聚物的靶标结合片段通常设计为结合所关注的靶核酸序列。任选地，靶标结合片段具有2'-O-甲基键或增强结合的其他改性结构。在一些捕获探针中，靶标结合片段设计为结合至具体靶核酸中的片段，并且不结合至缺乏样品中存在的该片段的其他核酸(或至少基本上减小亲合力)。在其他捕获探针中，靶标结合片段设计为结合至一类靶核酸(例如，任何DNA分子)，并且不必基本上区分该类中单个靶核酸(例如，使用随机序列)。过量的靶标捕获低聚物构造成使得靶标结合片段不结合非靶标物质，从而活化靶标捕获低聚物。因此，非活性构造中过量的靶标捕获低聚物不与固定化探针形成双链，导致捕获污染的核酸和/或导致捕获效率下降。
对于结合至所关注的具体靶核酸序列的靶标结合片段，靶标结合片段可设计为包括与靶核酸的对应片段基本上并且优选地完全互补的核酸。此类第一片段的核酸优选地包括至少6个、10个、15个或20个核碱基单元(例如，核苷酸)。例如，核酸可包含10-50个、10-40个、10-30个或15-25个与靶核酸中对应的核苷酸互补的核碱基单元(例如，核苷酸)。此处如本专利申请别处所述，邻接核酸序列的范围全部为整数，包括限定该范围的或在该范围内的所有整数。
对于捕获一组相关靶分子的靶标捕获低聚物(例如，患者样品中的病毒RNA组，其中分子由于存在突变而彼此不同)，靶标结合片段优选地设计为与该组不同成员中相对保守的靶片段互补。
对于非特异性结合至类别中的不同序列无必要的基本区别的核酸的靶标结合片段，靶标结合片段可包括所有四种标准DNA碱基(鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T))或所有四种标准RNA碱基(G、C、A和尿嘧啶(U))构成的随机聚合物序列(参见US2008/0286775)。随机序列还可包括一个或多个碱基类似物(例如，肌苷、5-硝基吲哚)或随机聚合物序列中的非碱性位置。此类随机聚合物序列可包含聚-(k)碱基的一个或多个序列，即G和U或T碱基的随机混合物(例如，参见WIPO Handbook on Industrial PropertyInformation and Documentation,Standard ST.25(1998)(《WIPO工业知识产权信息和文件手册》，标准ST.25，1998年)的表1)。可选择包括G和U/T碱基的序列的“摆动”特性，即U/T结合G或A，而G结合C或U/T。具有用随机聚合物序列合成的第一片段的靶标捕获低聚物实际上为包含随机部分合成期间包括的碱基构成的不同随机聚合物序列的有限组寡核苷酸。例如，一组包括G、C、A和T构成的15个核苷酸的随机聚合物序列的非特异性靶标捕获低聚物由415个成员组成。第一片段可设计为结合至DNA序列，优选地相对于RNA或反之亦然(参见US2008-0286775)。
如上所述，靶标结合片段和靶核酸形成的双链的解链温度优选地高于第一和第二茎片段之间形成的双链，继而优选地高于固定化探针及其互补茎片段之间的双链。作为另外一种选择，方法可在大约相等的解链温度(即，在3℃的范围内)或在这三条双链中的任何或所有的不同相对解链温度下进行。双链的解链温度可通过碱基组成和双链的长度与其解链温度关系的常规公式计算，如上所讨论。茎的解链温度计算也可考虑分子内杂交，如Markham et al.,Nucleic Acids Research,2005,Vol.33,Web Server issue W577–W58(Markham等人，《核酸研究》，2005年，第33卷，网络服务器发表W577–W58)所讨论；还可参见万维网mfold.rit.albany.edumfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form。靶标捕获低聚物和固定化探针的茎片段的polyA或polyT均聚物选择往往赋予低于靶标结合片段和核酸靶标之间形成的双链的解链温度，因为后一个双链通常还包含一些C-G配对，其赋予双链比A-T配对更大的稳定性。靶标结合片段和靶核酸之间更高的解链温度允许在其中靶标捕获低聚物首先杂交至靶核酸的高严格性和其中目前杂交至靶核酸的靶标捕获低聚物杂交至固定化探针的低严格性条件下进行杂交。当以该顺序进行时，它们在杂交以更快的动力学进行的条件下杂交时，靶标捕获低聚物和靶核酸二者溶于溶液中。
靶标捕获低聚物可以或不可以包括另外的片段以及第一和第二茎片段和靶标结合片段。例如，茎片段和靶标结合片段的核碱基单元可通过磷酸二酯键(或上述讨论的它们的任何类似物)直接连接，或可被短间隔物或连接基区域分离，该区域可包括核苷酸(D-或L-)或其他分子诸如连接基中常见的PEG。非核苷酸连接基的例子包括多糖，肽和多肽。(参见例如WO 89/02439和US 5,585,481)。可使用多个不同的非核苷酸连接基；一个例子是C(9)连接基。例如，靶标捕获低聚物可被构造成A-[C(9)连接基]-B-C、A-B-[C(9)连接基]-C或A-[C(9)连接基]-B-[C(9)连接基]-C。如果茎片段是polyA均聚物，则茎片段和靶标结合片段可通过一个或多个胸腺嘧啶残基连接。同样，如果茎片段是polyT均聚物，则茎片段和靶标结合片段可通过一个或多个腺嘌呤残基连接。因此，一些靶标捕获低聚物包含T(0-5)A(10-40)靶标结合片段和/或A(0-5)T(10-39)，其中第一片段比第二片段长。A(10-40)的命名意指10-40个腺嘌呤残基，同样T(0-5)表示0-5个胸腺嘧啶残基等等。如果此类构造(例如，A(0-5)和T(0-5))中较短的均聚物片段为互补的，从而可彼此杂交，则它们也可视为第一和第二茎片段的组分，并且在确定第一和第二茎片段形成的双链的解链温度时考虑。
多种不同的靶标捕获低聚物可在相同的反应中组合使用。在这种情况下，不同的靶标捕获低聚物通常具有与相同靶核酸和相同茎片段内的不同靶核酸或不同片段互补的靶标结合片段，因此它们可结合具有一条茎片段的互补序列的固定化探针。多种不同的靶标捕获低聚物也可用于捕获可存在于样品中的一组相关靶序列，例如序列和/或长度变体。例如，捕获其中成员由于存在突变而彼此不同的病毒RNA组时，可使用结合至病毒基因组中不同保守区的多种靶标捕获低聚物。不同靶标捕获低聚物的数量可为至少1、2、5、10、20、50或100，例如1-100或2-50或3-25，包括限定范围的或范围内的所有整数。
捕获靶标所需的靶标捕获低聚物的数量通常在2nM至20nM的范围内(参见例如美国专利No.6,534,273和例如美国专利No.6,534,273的实例部分)。在一些分析中，反应中靶标捕获低聚物的数量超过磁珠上可用固定化探针的数量。与固定化探针相比，过量的靶标捕获低聚物出于多种原因而发生。通常，过量的靶标捕获低聚物在大量不同靶标捕获低聚物加入反应结合样品中可以或不可以存在的多种靶核酸时发生。虽然杂交至其靶标的一些靶标捕获低聚物可结合至固定化探针，但无靶核酸的其他靶标捕获低聚物(空捕获探针)也可结合至固定化探针。靶核酸捕获的效率开始受到影响，因为固定化探针通过空捕获探针变饱和。因此，结合至核酸靶标的一些靶标捕获低聚物缺乏所杂交的可用固定化探针，并且有价值的样品未捕获并用于分析。
增加载体上固定化探针的密度或增加靶标捕获反应中载体的数量仅为有限解决方案。载体的表面积是有限的，使得固定化探针的密度有限。另外捕获反应中过高的载体浓度可抑制下游反应，诸如捕获的靶核酸的扩增。
本发明的通过靶核酸的存在活化但在不存在靶核酸的情况下保持失活的靶标捕获低聚物提供了解决方案。仅活化的靶标捕获低聚物被构造成杂交固定化探针成员。未活化的靶标捕获低聚物不处于杂交至固定化探针的构造，从而不通过空捕获探针使固定化探针饱和。结果是较多的固定化探针可用于形成捕获复合物，并且较少的不期望材料存在于任何捕获后反应或储存环境。因此捕获效率增加不依靠载体上对应的固定化探针密度和反应中载体的浓度增加。
当捕获的靶标随后受到实时检测时，靶标捕获所用的磁珠和靶标捕获低聚物的浓度通常小于受到终点检测的其他类似的捕获反应。例如，本发明方法中的靶标捕获低聚物的浓度可为5-20pmol/反应，并且反应体积为约200μL至1mL。不受任何理论的束缚，据信更高水平的磁珠和靶标捕获低聚物干扰实时检测的灵敏度比终点检测的灵敏度更多。
III.固定化探针
固定化探针包括直接或间接连接至载体的核酸。如捕获探针的描述所指出，核酸基本上或优选地与捕获探针中的核酸完全互补，但可以或不可以与捕获探针中核酸的长度(核碱基单元的数量)相同。固定化探针中的核酸优选地包含至少六个邻接核碱基单元，并且可包含例如10-45个或10-40个或10-30个或10-25个或14-25个，包括端值在内，任何范围均包括限定该范围的或在该范围内的所有整数。核酸优选地包括均聚物，并且更优选地腺嘌呤或胸腺嘧啶的均聚物。固定化探针的优选形式为或包括结合靶标捕获低聚物使用的14个胸腺嘧啶残基的均聚物，包括具有腺嘌呤残基的均聚物的第一茎片段。一些固定化探针包括具有少数错配的均聚物片段(例如，10-45个残基的片段中的至少95％的核碱基残基为T残基)。一个或少数错配的存在可用于降低固定化探针和第一茎片段之间的解链温度，低于靶标结合片段和靶核酸(如果在无错配的情况下未降低)。
固定化探针的核酸部分通常以单链形式提供，否则在使用之前或期间变性为单链形式。
可使用任何多种材料作为固定化探针的载体，如由硝化纤维、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯和磁吸引材料制成的基质或颗粒。单分散磁球是优选的载体，因为它们的粒度相对均一并且易于通过向反应容器、优选地自动化系统中施加磁力从溶液收回。固定化探针可以例如通过使用任何多种共价键、螯合或离子相互作用直接连接至捕获载体，或可通过连接至载体的一个或多个连接基间接连接。连接基可包括不旨在杂交至靶标捕获低聚物、但作为固定化探针的核酸及其载体之间的间隔物的一个或多个D或L-对映体形式核碱基。如上所述，当靶标捕获连接至实时检测而不是终点检测的情况时，结合固定化探针的磁载体和用于靶标捕获的靶标捕获低聚物的浓度通常较小，因为载体的高浓度可抑制实时检测灵敏度。对于结合固定化探针的磁珠，浓度优选地为15-25pg/mL，或约20pg/mL靶标捕获反应混合物。
IV.靶核酸
靶核酸是指作为或可存在于样品中的核酸分子或相关核酸分子组。靶核酸包括与靶标捕获低聚物上的靶标结合片段杂交，形成稳定双链的片段(靶片段)。靶片段的长度可与靶标捕获低聚物的靶标结合片段的核酸相同或基本上相同，并且与该核酸完全或基本上互补。靶片段可以仅为靶核酸总长度的小部分。例如，靶核酸的长度可为数千个核苷酸，并且靶片段可以仅为例如10-30个这些核苷酸。靶核酸可以不同形式，即单链、双链、三链或它们的混合物存在，诸如在部分双链发夹结构或部分双链结构中，并且靶片段可以结构的任何链(正义或反义)存在。靶核酸可以是RNA(例如，病毒RNA、微RNA、mRNA、cRNA、rRNA、hnRNA)或DNA(基因组或cDNA)等等。靶核酸可来自病原性微生物，诸如病毒、细菌或真菌，或可以是患者内源性的。靶核酸可以是合成的或天然存在的。靶核酸的长度可在至少约十个核苷酸至多于1000个核苷酸的范围内，或最多10,000个核苷酸或甚至大于10,000个核苷酸。具有25-10,000个核苷酸的靶核酸是常见的。
病毒核酸(例如，基因组、mRNA)形成病毒序列分析的可用靶标。可检测的病毒的一些例子包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV和埃-巴二氏病毒)、腺病毒、XMRV、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、MLV-相关病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒。
病毒核酸的分析尤其可用于分析耐药性。病毒迅速突变使得患者通常感染异质组病毒核酸，该核酸随时间推移而改变。异质组的一些突变分化物质可与治疗患者或将用于治疗患者的药物的耐药性相关。检测单个变体的组的重叠允许检测耐药性突变及其随时间推移的变化，从而允许自定义治疗方案考虑感染具体患者的菌株的耐药性。因为耐药性和其他突变可仅以小部分病毒核酸分子存在，病毒核酸组中大量分子的测序对于提供识别所有或至少所有耐药性突变的高度可能性可为必须的，其以总病毒核酸组的百分比超过阈值表示。当本发明的捕获或扩增靶核酸组的方法联合大规模平行测序技术时，可对靶核酸组的至少100,000个或1,000,000个成员测序。使用本发明的方法，可识别小于例如10％、1％或0.1％表述存在的突变。可获得例如至少100个、500个、1000个、2000个或5000个核苷酸的靶核酸阅读长度。
人类核酸用于诊断疾病或对疾病的易感性(例如，癌症基因融合、BRACA-1或BRAC-2、p53、CFTR、细胞色素P450)、用于基因分型(例如，法医鉴定、亲子鉴定、纯合时发挥作用的基因的杂合载体、HLA分型)、确定个体的药物功效(例如，伴随诊断)以及其他用途。
rRNA尤其可用于检测和/或病原性细菌分型。此类细菌的例子包括衣原体、立克次氏体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、连锁球菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌和淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、波特淋菌中毒、炭疽热、瘟疫、钩端螺旋体病、莱姆病菌、链球菌或奈瑟氏球菌。
本发明的方法尤其可用于检测小RNA。例如，小RNA(约17-27个核苷酸)诸如微RNA(miRNA)、小或短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和小核RNA(snRNA)难以从其他样品组分分离和/或使用已知方法检测。小RNA通常在生物样品中相对罕见，该样品有助于解决其检测困难。因为小RNA是通过RNA干扰(RNAi)调节或沉默基因表达的重要调控分子，它们可以是重要的疾病预防或治疗剂。因此，本发明的方法用于检测生物样品中小RNA的存在，以确定其在不需要大规模加工或核酸扩增的生物样品中的存在、稳定性、治疗功效或其他特性。
V.样品
“样品”或“生物样品”是指其中所关注的靶核酸可存在的任何组合物或混合物，包括植物或动物材料、废料、法医检定分析材料、环境样品等等。生物样品包括任何组织、细胞或来源于活或死生物体的提取物，其可包含靶核酸，例如外周血、骨髓、血浆、血清、包括淋巴结的活检组织、呼吸道组织或分泌物、胃肠组织、尿、粪便、精液或其他体液。特别要关注的样品是来自患有或怀疑患有疾病或病症，尤其是被病毒感染的人或动物的组织样品(包括体液)。其他所关注的样品包括例如用于水质检测、食品检测、污染控制等等的工业样品。
样品组分可包括靶核酸或非靶核酸，以及其他材料诸如盐、酸、碱、洗涤剂、蛋白质、碳水化合物、脂质以及其他有机或无机材料。样品与靶标捕获低聚物和固定化探针的组合可称为反应混合物。
样品可以或不可以是在下述靶标捕获测定进行之前加工纯化或扩增靶核酸的受试者。它不是例如进行核酸洗脱的柱结合所必需的。此类步骤浓缩和纯化核酸，但也可丧失大部分样品。进一步加工可包括使用裂解溶液将生物流体简单稀释至更多复合物(例如，Suet al.,J.Mol.Diagn.2004,6:101-107(Su等人，《分子诊断杂志》，2004年，第6卷，第101-107页)；Sambrook,J.et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.,pp.7.37-7.57(Sambrook,J.等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，第7.37-7.57页)；以及美国专利No.5,374,522、5,386,024、5,786,208、5,837,452和6,551,778)。病毒RNA样品通常通过用洗涤剂处理血浆或血清以从病毒释放RNA来制备。通常，加热包含靶核酸的样品使样品中的酶失活，并且使样品中的核酸成为单链(例如，90-100℃下进行2-10分钟，然后迅速冷却至0-5℃)。
VI.靶标捕获测定
靶标捕获测定使用一种或多种捕获探针、固定化探针、样品和合适的培养基进行，以允许靶标捕获低聚物与靶核酸以及靶标捕获低聚物与固定化探针杂交。可在进行测定之前加热靶样品(例如，加热至95℃)，使双链形式中的任何核酸变性。组分可以任何顺序混合。例如，靶标捕获低聚物可加入样品，并且在添加固定化探针前与样品中的靶核酸杂交。然而，对于自动化测定，在同时或基本上同时提供靶标捕获低聚物和固定化探针使添加步骤的数量最小化是优选的。在这种情况下，杂交的顺序可通过如下步骤控制：在其中双链可由靶标捕获低聚物和靶核酸之间形成，但超出捕获探针的第一和第二茎片段之间以及靶标捕获低聚物和固定化探针之间形成的双链的解链温度的条件下进行第一杂交，然后在降低严格性，优选地低于第一和第二茎片段之间以及靶标捕获低聚物和固定化探针之间形成的双链的解链温度的条件下进行第二杂交。严格性可通过降低测定混合物的温度来降低。在高温下，靶标结合位点与靶核酸形成双链。在低温下，不结合至靶核酸的捕获探针的第一和第二茎片段彼此形成双链，并且结合至靶核酸的捕获探针的第一茎片段与固定化探针形成双链。例如，高严格性杂交可在为或约为60℃下进行，并且低严格性杂交允许冷却至室温或25℃下。严格性也可通过减少盐浓度或加入或增加离液溶剂的浓度而降低。在一些方法中，所有步骤(可能例外的是高温下的初始变性步骤，使双链靶标变性)可等温进行。
在形成靶核酸：捕获探针：固定化探针后，使用任何多种已知方法例如离心、过滤或磁捕获载体的磁吸引通过物理分离捕获载体将杂交体(捕获杂交体复合物)从其他样品组分分离。分离优选地在低于靶标捕获低聚物形成的茎-环结构的解链温度的温度下进行，使空靶标捕获低聚物无变性可能，从而结合至捕获探针。在一些方法中，分离在低于茎-环结构的解链温度，但在10℃内的温度下(例如，在60℃下)进行，以保持杂交条件的严格性，以及随后区分匹配的和未匹配的靶核酸的能力。
为进一步促进靶核酸从非特异性结合至捕获杂交体的任何部分的其他样品组分分离，捕获杂交体可洗涤一次或多次，以稀释和移除其他样品组分。洗涤可通过在适当水溶液(例如，包含Tris和EDTA的溶液，参见例如US 6,110,678)中和适当条件(例如，高于组分Tm的温度)下使捕获杂交体解离为其单个组分，然后重新调整条件允许捕获杂交体重新形成来实现。然而，为易于处理和简化步骤，洗涤优选地使用保持捕获杂交体的条件冲洗连接至溶液中捕获载体的完整捕获杂交体。优选地，如果通过洗涤捕获靶核酸，则从其他样品组分移除至少70％，优选地至少90％，更优选地约95％的靶核酸。
然后靶核酸经历PCR扩增，就RNA样品而言为RT-PCR反应，优选地不从捕获复合物预先释放靶核酸。虽然在引发PCR或RT-PCR之前，不进行旨在从靶标捕获低聚物解离靶核酸的步骤，但在热循环的过程中，尤其是在为或约为95℃下进行的变性步骤中，靶核酸可从靶标捕获低聚物部分或完全解离。PCR反应可在与捕获步骤相同的容器(例如，微量离心管)中进行。PCR反应涉及解离的约95℃(例如，90-99℃)高温和退火的约60℃(例如，40-75℃或50-70℃或55-64℃)低温之间的热循环。通常，完整热循环的数量为至少10、20、30或40。PCR扩增使用一个或多个引物对进行。用于PCR扩增的引物对包括两个与希望测序的区域侧面的靶核酸的相对链互补的引物。对于大多数病毒基因组(例如，大于50％、75％或99％)测序，引物优选地靠近病毒基因组的末端。对于相关分子(例如，患者样品中存在的相同病毒的突变形式)的扩增，引物优选地与可能存在于大多数组成员中的靶核酸的保守区互补。PCR扩增在PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY,NY,1992)(《PCR技术：DNA扩增的原理和应用》，H.A.Erlich编辑，弗里曼出版社，纽约州纽约，1992年)；PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(eds.Innis,et al.,Academic Press,San Diego,CA,1990)(《PCR方案：方法和应用指导》，Innis等人编辑，学术出版社，加利福尼亚州圣迭戈，1990年)；Mattila et al.,Nucleic Acids Res.19,4967(1991)(Mattila等人，《核酸研究》，第19卷，第4967页，1991年)；Eckert et al.,PCR Methods and Applications 1,17(1991)(Eckert等人，《PCR方法和应用》，第1卷，第17页，1991年)；PCR(eds.McPherson et al.,IRLPress,Oxford)(《PCR》，McPherson等人编辑，IRL出版社，牛津)；以及美国专利4,683,202中有所描述。
在PCR扩增后，扩增靶标可任选地受到进一步加工，以纯化和/或修改为符合特定测序格式。如果需要纯化可在二氧化硅柱(例如，Qiagen重力流柱)上进行。靶核酸结合至柱，在其上洗涤然后洗脱。扩增靶DNA也可通过连接接头修改为一些测序格式。扩增DNA可通过如下步骤加尾：Klenow介导添加核苷酸(通常为均聚物)，然后退火至与所添加尾部互补的寡核苷酸并且连接。根据所用的测序平台，在测序前将特殊接头连接至模板。例如SMRT钟形接头连接至样品模板，用于通过Pacific Biosciences’PacBio RS测序仪测序(参见例如Travers et al.Nucl.Acids Res.(2010)38(15):e159(Travers等人，《核酸研究》，2010年，第38卷，第15期，第e159页))。
扩增靶核酸适于通过多种技术进行序列分析。靶核酸的捕获可关联多种不同的所谓下一代和第三代测序法的格式。此类方法可对数百万个靶模板平行测序。当靶核酸是变体的非均匀混合物时，此类方法特别有用，例如通常来自感染病毒诸如HIV的患者的样品的情况。在众多优点中，变体的平行测序提供样品中的耐药性突变曲线，即使药物突变在样品中以相对较小的比例存在。
一些下一代测序方法通过乳液PCR扩增。通过靶标捕获低聚物固定化至珠的靶核酸提供合适的乳液PCR起始物质。珠与PCR试剂和乳化油混合生成包含单个珠的单个微反应器(Margulies et al.,Nature 437,376-80(2005)(Margulies等人，《自然》，第437卷，第376-380页，2005年))。然后乳液破裂，并且对扩增DNA的单个珠测序。测序可以是例如使用Roche454GS FLX测序仪(454Life Sciences,Branford,CT 06405)进行的焦磷酸测序。或者，测序可以是例如使用ABI SOLiD测序系统(Life Technologies,Carlsbad,CA 92008)进行的连接/检测。在另一个变型中，靶核酸从靶标捕获低聚物洗脱，并且固定化至阵列(例如，HiScanSQ(Illumina,San Diego,CA92121))上的不同位置。在测定格式(Illumina)中，靶核酸通过桥式扩增来扩增，并且通过模板引导的标记核苷酸掺入来测序。在另一个方法中，靶核酸从靶标捕获低聚物洗脱，并且单分子通过聚合酶实时检测掺入核苷酸来分析(单分子实时测序或SMRT测序)。核苷酸可以是掺入时释放信号的标记核苷酸(例如，PacificBiosciences，Eid et al.,Sciences 323pp.133–138(2009)(Eid等人，《科学》，第323卷，第133-138页，2009年))或未标记核苷酸，其中该系统测量掺入的化学变化(例如，IonTorrent Personal Genome Machine(Guilform,CT 94080))。
虽然捕获的靶核酸可通过任何技术测序，但第三代、下一代或大规模平行方法可提供比Sanger和Maxam Gilbert测序更大的优势。若干小组描述了超高通量DNA测序过程(参见例如Cheeseman，美国专利No.5,302,509，Metzker et al.,Nucleic Acids Res.22:4259(1994)(Metzker等人，《核酸研究》，第22卷，第4259页，1994年))。目前通过合成进行的利用四种天然核苷酸(包括腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)碱基)和多种其他DNA测序酶的焦磷酸测序法广泛用于突变检测(Ronaghi,Science 281,363(1998)(Ronaghi，《科学》，第281卷，第363页，1998年)；Binladin et al.,PLoS ONE,issue 2,e197(February 2007)(Binladin等人，《PLoS ONE》，第2期，第e197页，2007年2月)；Rehman etal.,American Journal of Human Genetics,86,378(March 2010)(Rehman等人，《美国人类遗传学杂志》，第86卷，第378页，2010年3月)；Lind et al.,Next GenerationSequencing:The solution for high-resolution,unambiguous human leukocyteantigen typing,Hum.Immunol.(2010),doi 10.1016/jhumimm.2010.06.016(in press)(Lind等人，“下一代测序：高分辨率、人类白细胞抗原明确分型方案”，《人类免疫学》，2010年，doi 10.1016/jhumimm.2010.06.016，发表中)；Shafer et al.,J Infect Dis.1；199(5):610(2009)(Shafer等人，《传染病杂志》，第199卷，第5期，第610页，2009年))。在该方法中，检测基于DNA聚合酶反应期间释放的焦磷酸(PPi)，焦磷酸通过硫酸化酶定量转化为腺苷三磷酸(ATP)以及随后通过萤火虫荧光素酶产生可见光。最近的工作通过合成法进行DNA测序，主要关注连接至荧光染料的光裂解化学部分给脱氧核苷三磷酸(dNTP)的3'-OH基加帽(Welch et al.Nucleosides and Nucleotides 18,197(1999)(Welch等人，《核苷和核苷酸》，第18卷，第197页，1999年)和European Journal,5:951-960(1999)(《欧洲杂志》，第5卷，第951-960页，1999年)；Xu等人，美国专利No.7,777,013；Williams等人，美国专利No.7,645,596；Kao等人，美国专利No.6,399,335；Nelson等人，美国专利No.7,052,839和7,033,762；Kumar等人，美国专利No.7,041,812；Sood等人，美国专利申请No.2004-0152119；Eidet al.,Science 323,133(2009)(Eid等人，《科学》，第323卷，第133页，2009年))。在通过合成方法进行的测序中，DNA序列通过测量DNA/聚合酶复合物测试时的焦磷酸释放来推导，其中每个脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)分别以及按顺序释放。参见Ronaghi et al.,Science281:363365(1998)(Ronaghi等人，《科学》，第281卷，第363-365页，1998年)；Hyman,Anal.Biochem.174,423(1988)(Hyman，《分析生物化学》，第174卷，第423页，1988年)；Harris，美国专利No.7,767,400。
测序平台还从多个靶核酸读至单分子测序系统的那些移除。扩增甚至对于单分子测序方案是所期望的，因为靶核酸可用于制备测序的模板。早期系统批量分析靶核酸。意思是例如通过Sanger测序，在终止ddNTP存在的情况下扩增多个靶核酸。总之，凝胶上读取的每个终止位置表示均在相同核碱基位置终止的多个扩增产物。单分子测序系统使用纳米结构，其中从单个模板合成核酸的互补链得以进行。这些纳米结构通常被构造成进行多个单链核酸的读取。每个单链将序列信息提供给序列分析系统。参见Hardin等人，US7,329,492；Odera，US 2003-0190647。
一些测序技术的另外综述，参见Cheng,Biochem.Biophys.22:223 227(1995)(Cheng，《生物化学和生物物理学》，第22卷，第223-227页，1995年)；Mardis,Annual Reviewof Genomics and Human Genetics 9:387–402(2008)&Genome Medicine 1(4):40(2009)(Mardis，《基因组学和人类遗传学年评》，第9卷，第387-402页，2008年和《基因组医学》，第1卷，第4期，第40页，2009年)；Eid et al.,Science 323,133(2009)(Eid等人，《科学》，第323卷，第133页，2009年)；Craighead等人，美国专利No.7,316,796；Lipshutz,et al.,Curr.Opinion in Structural Biology.,4:376(1994)(Lipshutz等人，《结构生物学当代观点》，第4卷，第376页，1994年)；Kapranov et al.,Science 296,916(2002)(Kapranov等人，《科学》，第296卷，第916页，2002年)；Levene等人，美国专利No.6,917,726，Korlach等人，美国专利No.7,056,661；Levene et al.Science 299,682(2003)(Levene等人，《科学》，第299卷，第682页，2003年)；Flusberg et al.,Nature Methods v.7,no.6,p.461(June2010)(Flusberg等人，《自然方法》，第7卷，第6期，第461页，2010年6月)；Macevicz，美国专利No.6,306,597和7,598,065；Balasubramanian等人，美国专利No.7,232,656；Lapidus等人，美国专利No.7,169,560；Rosenthal等人，美国专利No.6,087,095；Lasken,Curr.Opin.Microbiol.10(5):510(2007)(Lasken，《微生物学当代观点》，第10卷，第5期，第510页，2007年)；Ronaghi et al.,Pharmacogenomics.Volume 8,1437-41(2007)(Ronaghi等人，《药学基因组学》，第8卷，第1437-1441页，2007年)；Keating et al.,PLoS One 3(10):e3583(2008)(Keating等人，《PLoS One》，第3卷，第10期，第e3583页，2008年)；Peaseet al.,PNAS USA 91(11):5022(1994)(Pease等人，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第11期，第5022页，1994年)；Lockhart,et al.,Nat.Biotechnol.14(13):1675(1996)(Lockhart等人，《自然生物技术》，第14卷，第13期，第1675页，1996年)；Shendure et al.,Science309,1728(2005)(Shendure等人，《科学》，第309卷，第1728页，2005年)；Kim et al.,Science 316,1481(2007)(Kim等人，《科学》，第316卷，第1481页，2007年)；Valouev etal.Genome Research 18(7):1051(2008)(Valouev等人，《基因组研究》，第18卷，第7期，第1051页，2008年)；Cloonan et al.,Nature Methods 5(7):613(2008)(Cloonan等人，《自然方法》，第5卷，第7期，第613页，2008年)；Tang et al.Nature Methods 6(5):377(2009)(Tang等人，《自然方法》，第6卷，第5期，第377页，2009年)；McKernan et al.GenomeResearch 19(9):1527(2009)(McKernan等人，《基因组研究》，第19卷，第9期，第1527页，2009年)；Ecker et al.,Nature Reviews Microbiology 6,553(2008)(Ecker等人，《自然评论微生物学》，第6卷，第553页，2008年)。
VII.试剂盒
本发明还提供进行捕获和扩增靶标方法的试剂盒。试剂盒包含至少一种捕获探针、至少一种固定化探针、以及至少一种PCR扩增的引物对中的一些并且通常它们中的所有，如上所述。在优选的试剂盒中，固定化探针固定化至磁化颗粒优选地顺磁珠，与其连接的均聚低聚物(例如，polyA、polyT、polyC或polyG)与试剂盒中的靶标捕获低聚物的均聚物部分互补。试剂盒还可包括用于形成捕获杂交体和/或检测杂交体的化学化合物，诸如盐、缓冲剂、螯合剂以及其他无机或有机化合物。试剂盒还可包括用于进行RT-PCR的逆转录酶和DNA聚合酶。试剂盒还可包括制备用于本发明方法的样品的化学品，可包括用于分裂组织或细胞材料并保持核酸完整性的裂解剂的单个组分或混合物。此类组合物包括酶、洗涤剂、离液剂、螯合剂、盐、缓冲剂以及其他无机或有机化合物。试剂盒可包括上述捕获探针、固定探针和引物对组分的任何组合，它们可作为混合物或在单个容器中彼此结合封装。试剂盒还可包括进行上述捕获方法的说明。
虽然出于理解清晰的目的详细描述了本发明，但可在所附权利要求的范围内进行某些修改。所有公开包括登录号、网站等等以及本专利申请引用的专利文件全文据此出于所有目的以引用方式并入本文，在相同程度上如同每个文件单独表述。在序列的差异版本的程度上，网站或其他参考文献可出现不同的时间，意指实际申请日期参考文献相关的版本。实际申请日期意指未决登录号公开的最早优先日期。除非语境中显而易见，本发明的任何元素、实施例、步骤、特征或方面可结合任何其他进行。
实例
材料和方法
核酸合成、杂交和标记检测的方法和试剂基本上如本文下面所述使用，但其他常规方法和标准试剂也可用于实现等同的结果。寡核苷酸使用标准亚磷酰胺化学方法合成(Caruthers et al.,1987,Methods in Enzymol.,154:287(Caruthers等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第287页))，使用常规色谱法(例如，HPLC)纯化，并且通常存储在室温至-80℃下的10mM Tris、1mM EDTA(pH 7.5)溶液中。传输介质通常包含150mM HEPES游离酸、294mM或8％月桂基硫酸锂、100mM硫酸铵，并且pH使用氢氧化锂一水合物调整至7.5。在实例中示出的靶标捕获步骤中，磁性颗粒用作捕获载体。靶核酸使用靶标捕获低聚物和固定化探针杂交至捕获载体。靶标捕获试剂通常由250mM HEPES游离酸、1.88M氯化锂、100mM EDTA游离酸制成，并且pH使用氢氧化锂一水合物调整至6.4。结合至靶核酸的捕获载体通过将磁场施加至测定容器的外部从可溶相分离，但本领域的技术人员将会知道可使用其他分离方式。移除包含可溶性组分的上清液，并且洗涤结合至颗粒的杂交复合物(一至三次，洗涤溶液具有足够的离子强度，保持捕获的杂交体在洗涤温度通常约25℃下结合至磁性颗粒)。洗涤通常在室温下将颗粒悬浮于洗涤溶液中，分离颗粒并且移除上清液进行，并且每次洗涤重复那些步骤。扩增和实时荧光检测在捕获的靶标上进行，如实例中所述。
检测测定通常设计为其中样品中多个不同的靶标被捕获和扩增。在实施过程中，通常样品中仅存在多个不同靶标中的一个或几个，和/或样品中仅存在少数一些靶标。因此，样品中的过量未杂交靶标捕获低聚物可干扰该样品中其他靶标的捕获效率。导致干扰捕获效率的一个问题是用于捕获样品中每个所需靶核酸物质的靶标捕获低聚物的浓度导致捕获低聚物的总浓度升高。然后未捕获的靶核酸的靶标捕获低聚物可使固相载体饱和，限制从样品捕获靶核酸。所提出的关于为什么这些未杂交的靶标捕获低聚物干扰另一个物质的捕获效率的机制或理论并非限制本发明。
实例1：通过未杂交的靶标捕获低聚物干扰靶标捕获效率
为示出未杂交的靶标捕获低聚物干扰靶标捕获反应的效率，反应设置为在存在线性对称发夹和非对称发夹靶标捕获低聚物的情况下捕获HPV靶核酸，该低聚物设计为捕获α-甲基酰基-Co-A消旋酶(AMACR)靶核酸。样品仅包括HPV靶核酸，不包括AMACR靶核酸。因此，线性非对称发夹和对称发夹靶标捕获低聚物在靶标捕获反应中作为未杂交的靶标捕获低聚物。该实例还示出未杂交的非对称发夹靶标捕获低聚物干扰捕获效率小于未杂交的线性捕获探针。
在该实例中，靶核酸为HPV 35E6/E7体外转录物(SEQ ID NO:14)。制备多种靶标捕获试剂混合物，每种包含如下靶标捕获低聚物组合中的一者：SEQ ID NO:1和2、1和3或1和4或仅包含SEQ ID NO:1，其中每个均在表2中有所描述。靶标捕获试剂混合物中还包括T7引物(SEQ ID NO:5)。多种样品混合物制备为包含200微升水和样品传输介质的1:1混合物(Gen-Probe Incorporated,USA,Cat#301032)中的604个、4846个或38867个靶核酸拷贝(SEQ ID NO:14)。靶标捕获反应通过将上面刚刚描述的50微升每个靶标捕获试剂混合物添加至单独的样品混合物来进行；各种反应条件在表1中示出。靶标捕获反应通常如下所述进行：在60℃下温育30分钟，然后在25℃下温育30分钟，然后使用500μL洗涤缓冲液在25℃下进行第一次洗涤，然后使用175μL洗涤缓冲液在25℃下进行第二次洗涤。
然后扩增捕获的核酸，以实时通用转录介导的扩增反应法检测(参见例如，US2011-0003305A1)。捕获的靶核酸各自添加至无引物扩增试剂(Gen-Probe Incorporated,USA,Cat#301032)，并且在42℃下温育15分钟。在温育后，将引物、探针(SEQ ID NO:6-9)和酶试剂(Gen-Probe,Cat#301032)添加至每个反应。然后一系列单独的扩增反应在每个靶标捕获条件下进行，反应在42℃下进行80分钟。检测实时进行(参见例如，美国专利No.7,713,697所讨论使用分子炬进行实时检测)。分子炬SEQ ID NO:6包括2’-O-甲基核糖核苷酸、9-碳连接基、Cy5荧光染料和黑洞淬灭剂(Glen Research,USA,Cat#s 205932.01和105915-10)。
表1：反应条件和结果。
表2：实例1的序列。
出现时间在表1和图4中示出。未杂交的线性靶标捕获低聚物(SEQ ID NO:2)的存在延长扩增和检测SEQ ID NO:14的出现时间(即，对于604个拷贝样品从29.9至32.3秒)。与仅具有SEQ ID NO:1的反应相比，出现时间增加表示少量SEQ ID NO:14在具有SEQ ID NO:1和2的反应中捕获。与单独SEQ ID NO:1相比，非对称或对称发夹靶标捕获低聚物(分别为SEQ ID NO:3和4)以及SEQ ID NO:1的存在干扰SEQ ID NO:14的出现时间较少或不干扰。这些结果显示与线性未杂交靶标捕获探针相比，非对称发夹靶标捕获低聚物和对称靶标捕获低聚物二者用于通过未杂交的探针减少靶标捕获效率的干扰。
实例2：标准线性TCO与对称和非对称发夹TCO的比较显示IVT的靶标捕获效率
该实例的目的是比较非对称发夹靶标捕获低聚物、线性靶标捕获低聚物和对称发夹靶标捕获低聚物的灵敏度。靶核酸为AMACR体外转录物(SEQ ID NO:15)。线性靶标捕获低聚物(SEQ ID NO:2)、对称发夹靶标捕获低聚物(SEQ ID NO:4)和非对称发夹靶标捕获低聚物的靶标杂交序列被构造成与SEQ ID NO:15杂交。反应条件在表3中示出。
靶标捕获、扩增和检测反应通常如上面实例1所述进行，不同的是扩增反应为实时逆转录介导的扩增反应(参见例如美国专利No.7,374,885)。扩增和检测低聚物在表4中示出。
表3：实例2的反应条件和结果。
表4：实例2的序列。
平均出现时间在表3和图3中提供。在100个靶核酸拷贝(SEQ ID NO:15)时，非对称发夹靶标捕获低聚物(SEQ ID NO:3)具有约17分钟的平均出现时间，而线性靶标捕获低聚物(SEQ ID NO:2)和对称发夹靶标捕获低聚物(SEQ ID NO:4)分别具有约18分钟和28分钟的平均出现时间。因此，非对称发夹靶标捕获低聚物的捕获灵敏度至少等于线性发夹捕获探针的灵敏度，以及比对称捕获探针的灵敏度好得多。
表5：用于实例的体外转录物
Claims (30)
1.一种捕获靶核酸的方法，所述方法包括：
使被怀疑包含所述靶核酸的样品与靶标捕获低聚物和固定化探针接触；
所述靶标捕获低聚物包含第一和第二发夹茎片段，所述第一发夹茎为至少15个核碱基单元且所述第二发夹茎为至少五个核碱基单元，所述第一和第二发夹茎片段的长度差异为与靶核酸互补的靶标结合片段侧面的至少五个核碱基单元，所述靶标捕获低聚物采取发夹茎-环的形式，所述茎通过所述第一和第二发夹茎片段的分子内杂交形成，并且所述靶标结合片段构成所述环；
所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与所述第一或第二发夹茎片段互补的片段；
其中如果所述样品包含所述靶核酸，则所述靶核酸杂交至所述靶标结合片段，打断所述第一和第二发夹茎片段的所述分子内杂交，使得所述第一或第二发夹片段杂交至所述固定化探针上的所述互补片段，形成载体结合的捕获杂交体；并且如果所述样品不包含所述靶核酸，则所述第一和第二片段保持以茎进行分子内杂交。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标存在于所述样品中。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述样品分离所述载体结合的捕获杂交体。
4.根据权利要求2所述的方法，还包括从所述样品分离所述载体结合的捕获杂交体。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述接触在第一温度下，然后是低于所述第一温度的第二温度下进行，其中所述第一温度在所述第一和第二茎片段之间形成的双链以及所述靶标结合片段和所述靶核酸之间形成的双链的所述解链温度之间，并且所述第二温度低于所述第一和第二茎片段形成的所述双链以及所述第二茎片段和所述固定化探针之间形成的双链的所述解链温度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分离在所述第二温度下进行。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括从所述捕获杂交体释放所述靶核酸。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括检测所述靶核酸。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括对所述靶核酸测序。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述靶标捕获低聚物是具有与不同的靶标互补的不同靶标结合片段的多个靶标捕获低聚物中的一者。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多个靶标捕获低聚物包含至少十个靶标捕获低聚物。
12.一种包含第一和第二茎片段的靶标捕获低聚物，所述第一茎片段为至少15个核碱基单元且所述第二茎片段为至少五个核碱基单元，所述第一和第二茎片段的长度差异为与靶核酸互补的靶标结合片段侧面的至少五个核碱基，其中在杂交条件下：
在不存在所述靶核酸情况下，所述靶标捕获低聚物形成茎-环，所述第一和第二茎片段的分子内杂交形成所述茎，并且所述靶标结合片段形成所述环；以及
在存在所述靶核酸的情况下，所述靶标结合片段杂交至所述靶核酸，打断所述第一和第二茎片段的所述分子内杂交，产生能够杂交至互补的固定化探针的所述第一茎片段。
13.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第二茎片段的长度为所述第一茎片段长度的39-61％。
14.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段的长度差异为至少9个核碱基单元。
15.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段的长度差异为5-15个核碱基单元。
16.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一片段具有17-26个核碱基单元，并且所述第二片段具有7-16个核碱基单元。
17.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一片段具有18-24个核碱基单元，并且所述第二片段具有7-15个核碱基单元，并且所述第一片段比所述第二片段长至少7个核碱基单元。
18.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段分别占据所述靶标捕获低聚物的所述5’和3’末端，并且所述第一茎片段与所述固定化探针互补。
19.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段包括polyA和polyT核碱基单元的互补片段。
20.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一片段包含polyA片段，并且所述第二茎片段包含polyT片段。
21.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一或第二茎片段包含T(0-5)A(10-40)。
22.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段包含T(0-5)A(10-40)，并且所述第二茎片段包含A(0-5)T(10-40)，其中所述第一茎片段比所述第二茎片段长。
23.根据权利要求13所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段的所述A(10-40)比所述第二茎片段的所述T(10-40)长5-15个核苷酸。
24.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段包含A(15-40)，并且所述第二茎片段包含T(10-30)。
25.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述靶标结合片段和靶核酸之间形成的双链的所述解链温度大于所述第一和第二茎片段之间形成的双链的解链温度，其大于所述第一茎片段和所述固定化探针之间形成的双链的所述解链温度。
26.根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述靶标结合片段包含至少一个甲氧基核碱基。
27.一种根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述靶标捕获低聚物是权利要求12-26定义的任何所述靶标捕获低聚物。
28.一种包含任何前述权利要求定义的靶标捕获低聚物和固定化探针的试剂盒，所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与所述第一或第二发夹茎片段互补的片段。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述第一和第二发夹片段的较长者包含polyA，所述第一和第二发夹片段的较短者包含polyT，并且所述固定化探针片段包含polyT，所述polyT的长度在所述第一和第二发夹探针的所述polyA和polyT片段之间。
30.一种包含任一项前述权利要求定义的靶标捕获低聚物、固定化探针和靶核酸的反应混合物，所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与所述第一或第二发夹茎片段互补的片段，并且所述靶核酸杂交至所述靶标捕获低聚物的所述靶标结合片段。
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