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CN104160017A - 测定致畸风险的方法 - Google Patents

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CN104160017A CN201380012437.0A CN201380012437A CN104160017A CN 104160017 A CN104160017 A CN 104160017A CN 201380012437 A CN201380012437 A CN 201380012437A CN 104160017 A CN104160017 A CN 104160017A
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Abstract

本发明涉及用多潜能干细胞测定药物诱导的致畸性的风险的方法。

Description

测定致畸风险的方法
技术领域
本发明涉及用人多潜能干细胞测定药物诱导的致畸性的风险的方法。
背景技术
制药和生物技术产业需要改进的用于预测药物诱导的毒性的体外系统来减少晚期药物损耗。具体而言，存在预测性高通量体外模型的需要，所述模型利用人细胞且可以减少我们对动物研究的依赖。
可以发生的最具破坏性的药物有害效应之一是致畸性。不幸的是，预测药物在人类中是否具有引起胎儿危害的潜能极其困难，且主要依赖于妊娠动物模型的使用。目前，由于缺乏稳健的备选方法，FDA要求进行若干期动物研究来评估生殖危害的风险(Bailey,G.P.,L.D.Wise,等人，(2009),"Pre-and postnatal developmental toxicity study design forpharmaceuticals."Birth Defects Research Part B:Developmental andReproductive Toxicology 86(6):437-445)。但是，对动物系统的依赖冒着不能鉴定出危害人类胎儿发育而不危害其他动物物种(如啮齿类动物)的致畸原(如沙利度胺)的风险(Shuey,D.和J.H.Kim(2011),"Overview:developmental toxicology-new directions."Birth Defects Research Part B:Developmental and Reproductive Toxicology,92(5):381-383)。
多潜能干细胞(PSC)可以在平皿中无限培养，同时保持“空白”或“未分化”的干细胞状态。然后，通过改变生长条件，细胞可以定向“分化”为人体的所有组织。在“分化”过程中，细胞受控制胎儿发育的正常遗传程序调节。用多潜能小鼠胚胎干细胞(ES)表征化合物的致畸风险的方法已由Hans Spielman的实验室创立(Spielmann,H.,I.Pohl等人(1997),"Theembryonic stem cell test(EST),an in vitro embryotoxicity test using twopermanent mouse cell lines:3T3fibroblasts and embryonic stem cells."Invitro Toxicology 10:119-127)。此方法(称为胚胎干细胞测试或EST)涉及使小鼠ES细胞分化十天，直至可以观察到搏动的心肌细胞。通过使用生物统计预测模型来评估致畸风险，该模型比较药物浓度，其显示小鼠ES细胞和小鼠分化的成纤维细胞系的50％抑制分化和50％细胞毒性(Seiler,A.E.和H.Spielmann(2011),"The validated embryonic stem cell test topredict embryotoxicity in vitro."Nat Protoc 6(7):961-78)。但是，此方法具有许多局限性，如相对长的测定时间、分化细胞是需要劳动密集的方法、评价“搏动”心肌细胞的定性性质和生物统计预测模型的中等准确性(Marx-Stoelting,P.E.Adriaens等人(2009),"A review of theimplementation of the embryonic stem cell test(EST).The report andrecommendations of an ECVAM/ReProTect Workshop."Altern Lab Anim37(3):313-28)。此外，小鼠EST未能准确地检测到已知的人类致畸原，如沙利度胺。
由于这些局限性，许多独立实验室试图发展改进的用于评估致畸风险的体外方法。基于只有更复杂的体外系统才可提供体内妊娠的巨大生物复杂性的足够预测的假设，这些努力大多数旨在提高测定复杂性。例如，改进小鼠EST的尝试包括利用毒理基因组学分析来标准化心肌细胞分化方案(Hewitt,M.,C.M.Ellison等人(2010),“Integrating(Q)SAR models,expert systems and read-across approaches for the prediction ofdevelopmental toxicity."Reproductive Toxicology 30(1):147-160；vanDartel,D.A.M.,J.L.A.Pennings等人(2010),"MonitoringDevelopmental Toxicity in the Embryonic Stem Cell Test UsingDifferential Gene Expression of Differentiation-Related Genes."Toxicological Sciences 116(1):130-139；Pennings,J.L.A.,D.A.M.vanDartel等人(2011),"Gene set assembly for quantitative prediction ofdevelopmental toxicity in the embryonic stem cell test."Toxicology284(1-3):63-71；van Dartel,D.A.M.和A.H.Piersma(2011)."Theembryonic stem cell test combined with toxicogenomics as an alternativetesting model for the assessment of developmental toxicity."ReproductiveToxicology 32(2):235-244)；向测定中加入其他分化细胞类型，如内皮细胞或骨细胞(Festag,M.,B.Viertel等(2007),"An in vitro embryotoxicityassay based on the disturbance of the differentiation of murine embryonicstem cells into endothelial cells.II.Testing of compounds."Toxicology inVitro 21(8):1631-1640；Buesen,R.,E.Genschow等人(2009),"Embryonicstem cell test remastered:comparison between the validated EST and thenew molecular FACS-EST for assessing developmental toxicity in vitro."Toxicol Sci 108(2):389-400；zur Nieden,N.I.,L.A.Davis等人(2010),"Comparing three novel endpoints for developmental osteotoxicity in theembryonic stem cell test."Toxicology and Applied Pharmacology 247(2):91-97)；或评估干细胞分化过程中分泌入培养基的代谢物的变化(West,P.R.,A.M.Weir等人(2010),"Predicting human developmental toxicity ofpharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics."Toxicology and Applied Pharmacology 247(1):18-27)。虽然这些方法中的一些已导致预测性的提高，但这通常是以牺牲测定处理量为代价。
与上述努力不同，本文所述的新方法利用看起来似乎反直觉的方法：将干细胞分化缩短至2.5天，检查中内胚层谱系标记并作为唯一端点。因此，此新方法考察胚胎发育的更早、更短暂的阶段。使用人多潜能干细胞，我们证明，与现有方法相比，此方法达到了更优的处理量和预测性。
发明概述
本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)通过测量一个或多个发育调节标记，如Sox17、EOMES或T-brachyury的表达来检测胚胎发育的进程；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致该一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险。
附图简述
图1.在体内证明是致畸原或非致畸原的已知化合物。
图2.显示本方法中所述的H9人胚胎干细胞分化3天的时程。在所示的每一天，固定细胞并用对Sox17、EOMES或T-brachyury特异的抗体染色。用DNA染色剂DAPI作为复染剂来标记细胞核。
图3.图A：实验设计图示用于本发明的3天分化方案。图B：致畸原处理的实例证明Sox17染色的剂量依赖性减少。
图4.细胞谱系标记Sox17、EOMES(中内胚层标记)和OCT4(多潜能细胞和神经谱系的标记)的共表达。图A显示分化3天后Sox17和EOMES的重叠表达，标记了中内胚层谱系。图B显示Sox17和OCT4的核染色大量地相互排斥。图C和D说明致畸原诱导的Sox17的相对减少和OCT4染色的增加，表明除Sox17或EOMES以外的细胞谱系标记的相对表达可以用作致畸风险的测量。
图5.用于测试未知化合物的致畸风险的96孔板布局实例。框中的数字指某浓度的化合物。例如，1.1＝浓度为1的化合物1，2.1＝浓度为1的化合物2。此外，P＝阳性对照(已知的致畸原)，D＝DMSO(阴性对照)。
图6.该表格显示通过实验测定的已知在体内具有致畸性或无致畸性的75种化合物的Sox17抑制IC50。使用这些数据，我们能够确定20uM的IC50截断值，其可以以92％的准确度区分非致畸性化合物与致畸性化合物。
图7.表格显示根据5uM或20uM的IC50值从表6中的结果计算的预测值。个体所用的精确的IC50截断值应根据它们对预测的假阳性与假阴性的比率的耐受性来选择。
发明详述
如本说明书中所使用，无论在连接词中还是在权利要求主体中，术语“包括”和“包含”都将解释为具有开放的含义。就是说，该术语与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。在方法的背景中使用时，术语“包括”意指该方法至少包括所引述的步骤，但也可以包括其他步骤。在化合物或组合物的背景中使用时，术语“包含”意指该化合物或组合物至少包含所引述的特征或成分，但也可以包含其他特征或成分。
本文所用的术语“可选地”意指随后描述的事件或状况可以但无需发生，且该描述包括该事件或状况发生的情况和该事件或状况不发生的情况。
本文用术语“约”来指“大约”、“在…区间内”、“大致”或“左右”。在将术语“约”与数字范围结合使用时，它通过在所示数值以上和以下延伸界限来修饰该范围。一般而言，本文用术语“约”来修饰在所示值以上和以下偏差20％的数字范围。
本文所用的术语“多潜能干细胞(pluripotent stem cell)”意指和包括细胞分化为全部三种谱系或胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞类型的能力。术语多能具有本领域所理解的含义，且包括细胞分化为多种细胞类型的能力。应理解，多能细胞(multipotent cell)可以在其分化能力上比多潜能细胞(pluripotent cell)更受限。本文所用的术语诱导干细胞(“iSC”)指诱导的多潜能干细胞(“iPSC”)或诱导的多能干细胞(“iMSC”)。有时可以用术语“iPS”或“iPS细胞”代替“iPSC”；类似地，有时可以用术语“iMS”或“iMS细胞”代替“iMSC”。本文所述的适用于iPSC的方法和组合物也适用于iSC和iMSC。
术语“测量蛋白质表达”意指测定所产生的蛋白质的量(例如，在细胞孔中通过诸如抗体染色并定量该抗体所染色的细胞的特定荧光的直接方法，或间接地通过测量编码该蛋白质的mRNA的量)。
本文所用的术语“IC50”意指测试化合物导致所测量的分化标记相对于未处理的对照被抑制50％时的浓度。
术语“发育调节标记”意指其表达在发育过程中改变的基因。
术语“中内胚层标记”意指已确定发现其表达在中胚层细胞谱系中的基因。用于本发明的中内胚层标记的实例是Sox 17、EOMES和T-brachyury。
术语“致畸风险”意指计算的化合物在体内具有致畸性的风险或概率。类似地，术语“无致畸性风险”意指计算的化合物在体内无致畸性的风险或概率。
术语“Sox17”指由SRY-盒17编码的基因或基因产物(SOX17，基因ID 64321，人同源物的基因产物在SEQ ID NO:1中示例)。
术语“EOMES”指由eomesodermin编码的基因或基因产物(EOMES，基因ID 8320，人同源物的基因产物在SEQ ID NO:2中示例)。
术语“T-brachyury”指由T brachyury同源物(小鼠)编码的基因或基因产物(T，基因ID 6862，人同源物的基因产物在SEQ ID NO:3中示例)。
术语“OCT4”指由POU5F1POU 5类同源框1编码的基因或基因产物(POU5F1，基因ID 5460，人同源物的基因产物在SEQ ID NO:4中示例)。
本文所用的术语“高通量”意指允许同时容易地筛选多个样品的测定设计，包括机器人操作的能力。高通量测定的另一希望的特征是这样的测定设计，将其优化来减少试剂使用或最少化操作数从而实现所希望的分析。测定形式的实例包括96孔或384孔板。本领域公知，由于塑料模具的小型化和液体操作装置的进步，或由于设计了改进的测定装置，可以用本发明的设计处理更大数目的样品。在一个实施方案中，在包含多个孔的微量滴定板(如96孔板或384孔板)中培养和分析细胞。
除非另有说明，本文所用的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。本文参考本领域技术人员已知的多种方法和材料。阐述药理学的一般原理的标准参考著作包括Goodman和Gilman'sThe Pharmacological Basis of Therapeutics,10th Ed.,McGraw HillCompanies Inc.,New York(2001)。技术人员已知的任意适宜的材料和/或方法都可以用于实施本发明。然而，描述了优选的材料和方法。除非另有说明，以下描述和实施例中涉及的材料、试剂等可从商业来源获得。
本发明提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)通过测量一个或多个发育调节标记的蛋白质表达来检测胚胎发育的进程；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致该一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险。
在特定实施方案中，测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达。
在更特定实施方案中，测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox 17、EOMES和T-brachyury。
在更特定实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致该一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险。
在特定实施方案中，所测量的至少一个中内胚层标记的蛋白质表达是Sox 17；更具体而言，SOX17的蛋白质表达是所测量的唯一的中内胚层标记。
在其他特定实施方案中，所测量的至少一个中内胚层标记的蛋白质表达是EOMES；更特别地，EOMES的蛋白质表达是所测量的唯一的中内胚层标记。
在其他特定实施方案中，所测量的至少一个中内胚层标记的蛋白质表达是T-brachyury；更具体而言，T-brachyury的蛋白质表达是所测量的唯一的中内胚层标记。
在其他特定实施方案中，SOX17和EOMES的蛋白质表达是所测量的仅有的中内胚层标记。
在其他特定实施方案中，SOX17和T-brachyury的蛋白质表达是所测量的仅有的中内胚层标记。
在特定实施方案中，该多潜能干细胞是灵长类来源。
在特定实施方案中，该多潜能干细胞是胚胎干细胞来源。
在其他特定实施方案中，该多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞来源。
在特定实施方案中，通过免疫组织化学定量标记的蛋白质表达的改变来评估致畸风险。
在其他特定实施方案中，通过流式细胞术定量标记的蛋白质表达的改变来评估致畸风险。
在其他特定实施方案中，通过荧光显微镜检术定量标记的蛋白质表达的改变来评估致畸风险。
在其他特定实施方案中，通过定量编码蛋白质标记的mRNA水平的改变来定量该标记的蛋白质表达的改变，来评估致畸风险。
在特定实施方案中，在40-60％的多潜能干细胞分化为中内胚层之后进行本发明的方法的步骤(1)。
在特定实施方案中，步骤(4)中的一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自图1中所列的已知致畸原。
在其他特定实施方案中，步骤(4)中的一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自图6中所列的已知致畸原。
在特定实施方案中，步骤(4)中的一种或多种已知无致畸风险的化合物选自图1中所列的已知致畸原。
在其他特定实施方案中，步骤(4)中的一种或多种已知无致畸风险的化合物选自图6中所列的已知致畸原。
在更特定实施方案中，步骤(4)中的该一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自放线菌素D、维甲酸、阿糖胞苷、诺考达唑、鱼藤酮、维甲酸、异维甲酸、溴脱氧尿苷、阿霉素、dorsomorphin、沙利度胺、5-氟尿嘧啶、达沙替尼、索拉非尼、丙戊酸、舒尼替尼、齐拉西酮、米安色林、凡德他尼、己烯雌酚、6-氨基-烟酰胺、利坦色林和吉非替尼。
在其他特定实施方案中，步骤(4)中的该一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自沙利度胺、米安色林和利坦色林。
在特定实施方案中，步骤(4)中的该一种或多种已知无致畸风险的化合物选自埃索美拉唑(esomeprazole)、叶酸、儿茶素、稠环乙脲、烟酸、阿司匹林、布洛芬、阿昔洛韦、酮舍林(ketanserine)、链霉素、甲基多巴、糖精、咖啡因、青霉素和替加色罗。
在更特定实施方案中，步骤(4)中的该一种或多种已知无致畸风险的化合物选自叶酸和甲基多巴。
在更特定实施方案中，步骤(4)中的该一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自沙利度胺、米安色林和利坦色林，且该一种或多种已知无致畸风险的化合物选自叶酸和甲基多巴。
在一个实施方案中，该方法是体外方法。
在一个实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险。
在一个实施方案中，该多潜能干细胞是灵长类来源。
在一个实施方案中，该多潜能干细胞是胚胎干细胞。
在一个实施方案中，该多潜能干细胞是H9人胚胎干细胞。
在一个实施方案中，该多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞。
在一个实施方案中，该中内胚层标记中的至少一个是SOX17。
在一个实施方案中，该中内胚层标记中的至少一个是EOMES。
在一个实施方案中，该中内胚层标记中的至少一个是T-brachyury。
在一个实施方案中，SOX17的蛋白质表达是所测量的唯一的中内胚层标记。
在一个实施方案中，SOX17和EOMES的蛋白质表达是所测量的仅有的中内胚层标记。
在一个实施方案中，SOX17和T-brachyury的蛋白质表达是所测量的仅有的中内胚层标记。
在一个实施方案中，通过免疫组织化学测量该蛋白质表达。
在一个实施方案中，通过流式细胞术测量该蛋白质表达。
在一个实施方案中，通过荧光显微镜检术测量该蛋白质表达。
在一个实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险；
其中在40-60％的所述多潜能干细胞分化为中内胚层之后进行步骤(1)。
在一个实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险；
其中的该一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自放线菌素D、维甲酸、阿糖胞苷、诺考达唑、鱼藤酮、维甲酸、异维甲酸、溴脱氧尿苷、阿霉素、dorsomorphin、沙利度胺、5-氟尿嘧啶、达沙替尼、索拉非尼、丙戊酸、舒尼替尼、齐拉西酮、米安色林、凡德他尼、己烯雌酚、6-氨基-烟酰胺、利坦色林和吉非替尼。
在一个实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险；
其中步骤(4)中的该一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自沙利度胺、米安色林和利坦色林。
在一个实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险；
其中步骤(4)中的该一种或多种已知无致畸风险的化合物选自埃索美拉唑、叶酸、儿茶素、稠环乙脲、烟酸、阿司匹林、布洛芬、阿昔洛韦、酮舍林、链霉素、甲基多巴、糖精、咖啡因、青霉素和替加色罗。
在一个实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险；
其中步骤(4)中的该一种或多种已知无致畸风险的化合物选自叶酸、甲基多巴。
在一个实施方案中，本申请提供评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使该化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定该化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险；
其中步骤(4)中的该一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自沙利度胺、米安色林和利坦色林；且
该一种或多种已知无致畸风险的化合物选自叶酸和甲基多巴。
实施例
测定致畸风险的一般方法
本发明的方法通过比较处于定向分化的经处理的多潜能干细胞和对照多潜能干细胞中的中内胚层形成水平来评估药物诱导的致畸性的风险。因此，首先必须确定指导人多潜能干细胞向中内胚层分化的最佳条件。作为观点证明，使用本文实施例中所述的方案，用H9人胚胎干细胞系进行了最初的验证。
优化基线分化
首先，鉴定了在3天的分化中可重复地达到40-60％中内胚层形成的最佳初始细胞接种密度和生长因子浓度(见图2)。对生长因子处理的理想浓度和持续时间进行较少的方案优化来产生中内胚层，本领域技术人员可以将此方法适用于大多数人多潜能干细胞。虽然选择40-60％分化作为这些研究的起点，但由于该方法取决于比较经药物处理的样品与对照样品中的中内胚层形成的比例，确切的中内胚层细胞的百分比应不是关键的，只要效率在孔与孔之间一致。
在最初的验证实验过程中，检查了多种谱系标记、抗体和定量方法。显示共表达的中内胚层谱系标记Sox17、T-brachyury和EOMES的那些实验对于监测发育破坏是有益的。还可以预测，标记Sox17/EOMES/T-brachyury阴性细胞的其他标记(如图4中所示的OCT4)的定量类似地可以用来定量指导定向分化的信号转导途径的破坏。
确定体外/体内相关性的阈值浓度
优化定向分化的条件后，确定了允许从已知不引起胎儿危害的化合物到已知的致畸化合物之间的分层的剂量反应关系。对于最初的研究，我们使用了具有已知的体内效应的30种市售化合物和40种专利化合物的系列。在第1天和第2天处理包含正在向中内胚层分化的细胞的单孔(见图3)。在单块平板上，将递增浓度的各化合物加至单孔。此外，每块平板包含用已知具有致畸性的化合物处理的孔(作为阳性对照)，以及仅用溶剂处理的孔(作为阴性对照)(见图5中的示例性平板图)。
在定向分化结束时，定量中内胚层谱系标记的水平。为了证明本文所述研究的原理，通过免疫染色，然后通过流式细胞术分析、荧光显微镜检术或使用酶标仪来定量，在蛋白质水平测量了细胞中谱系标记的表达。从这些值，针对每种测试化合物计算了每种测试化合物相对于DMSO对照导致所测量的分化标记的50％抑制的浓度(IC50)。检查已知在体内具有致畸性或无致畸性的化合物的IC50值允许确定将非致畸性化合物与致畸性化合物区分开来的IC50值。对于在验证过程中检查(下文)的H9细胞系，发现20uM的浓度为预测致畸性的风险提供了>90％准确性(见图6和7中的表格)。
将该测定用于高通量筛选
一旦用目的多潜能细胞系确定了希望得到的用于测量致畸风险的阈值，即可以用该测定进行更高通量的风险评估。可以以与可接受的预测性水平相关的单个浓度三次重复来测试化合物。
用于所测试的化合物的具体方案和方法
基本试剂
试剂
16％甲醛溶液，10x10ml安瓿，Thermo，#28908
来自牛血清的30％白蛋白溶液，Sigma，目录#A9576-50ML
100ml驴血清，Millipore，#S30-100ML
人SOX17NL557亲和纯化的多克隆Ab，用于免疫组织化学的山羊IgG，R&D systems,Inc.#NL1924R
hESC级基质胶，5ml*LDEV-Free，BD Bioscience，#354277，胞外基质
重组人类/小鼠/大鼠激活蛋白A，R&D Systems,Inc.#338-AC-005
重组人类Wnt-3a，R&D Systems,Inc.#5036-WN-010
ES细胞级胎牛血清，500ml，Millipore，#ES009B(ES-009-B)
ACCUTASETM细胞分离液，Stemcell Technologies，#07920，100mL
1，StemCell Technologies，#058501试剂盒，确定成分的人多潜能干细胞液体培养基
Y-27632二盐酸一水合((R)-(+)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷咪唑羧酰胺二盐酸，Tocris
高级RPMI培养基1640(1X)，液体，无谷氨酰胺、酚红，500ml，Invitrogen，#12633-012，basel细胞生长培养基
来自Invitrogen的谷氨酰胺100x#25030-081
Image-iTTMFX信号增强剂(Enhancer)，Invitrogen，#I36933(可选)，荧光染料信号增强剂
Triton X-100，Sigma，#T8787
含DAPI的Gold抗褪色剂，Invitrogen，#S36938荧光染料信号保护剂(preservative)
二甲基亚砜(DMSO)，#494429-Sigma
DE分化培养基(diff medium)-I(在同一天重新配制)：
高级RPMI培养基1640
谷氨酰胺(1x，现加)
人类激活蛋白A 100ng/ml
人类Wnt3a 25ng/ml.
DE分化培养基-II(在同一天重新配制)：
高级RPMI培养基1640
谷氨酰胺(1x，现加)
人类激活蛋白A 100ng/ml
0.1％胎牛血清(FBS)
组织培养板的基质胶包被：
用1:80稀释度的基质胶包被96孔板。
方案的方法
多潜能干细胞制备：
细胞培养。在含10uM Y-27632的mTeSR培养基中解冻H9人ES细胞(来自WiCell)。在用ES细胞级基质胶(BD Biosciences)预包被的两个100mm组织培养级平皿中接种3百万个细胞。Y-27632仅在接种期间需要，应在接种后24小时内将它去除。每天更换mTeSR培养基。细胞应在3-4天内接近铺满。
在96孔板上ACCUTASE和接种
在细胞达到约50％铺满时，去除培养基，用PBS漂洗，然后每个100mm平皿加入2ml accutase。细胞应在3分钟内分离。立即加入8ml含10uM Y-27632的mTeSR，转移20ml(来自2x 100mm平皿)至50ml管中。400xg离心6分钟。弃上清液。加入10ml含Y-27632的mTeSR。上下吹吸悬浮细胞沉淀。计数活细胞的数目，并重悬至1百万个细胞/ml。按5000-50,000个细胞/96孔之间接种细胞。取决于具体细胞系和细胞的批次，可以改变此数目，以获得最佳细胞密度。对于这些实验，接种15,000个细胞/孔。每天更换mTESR培养基，更换2-5天。
多潜能干细胞定向分化和分析
第0天。用含药物的分化培养基-I开始分化
细胞应均匀地分布在96孔板中。细胞在96孔板的孔中约35％铺满时(2-5天后)开始分化。去除培养基，用高级RPMI洗涤它4-5次。彻底洗去mTESR很重要，因为它包含非常高浓度的维持细胞处于未分化状态的多种因子。加入含有或不含测试化合物的DE分化培养基-I。500rpm涡旋平板3分钟。静置平板24小时。
第1天。更换为含药物的分化培养基-II
迅速用高级RPMI洗涤平板3次(～10分钟)。加入含有或不含化合物的DE分化培养基-II。500rpm涡旋平板3分钟。静置平板48小时。注意，细胞用药物处理了总计72小时。
第3天。终止和固定细胞
1.从96孔板去除培养基。用DPBS GENTLY洗涤孔三次，以去除顶部的碎片或死细胞。加入在37℃预热的新鲜配制的含3％甲醛的PBS。将此溶液加在细胞上15分钟。长时间固定可以引起高背景或抗原改变。用PBS洗涤三次来去除PBS。
2.用含0.1％TritonX-100的PBS透化细胞15分钟。
3.每个96孔加入30ul ImageIT-FX溶液。700rpm涡旋1分钟。室温温育30分钟。
4.用封闭缓冲液(含10％驴血清、0.3％Triton X-100、1％BSA的PBS)洗涤一次，然后加入封闭缓冲液，放置20分钟。
5.加入含Sox17抗体(1:10稀释)的封闭缓冲液。室温温育3小时。
6.用含1％BSA的PBS洗涤四次。
7.加入含DAPI或Hoechst 33242(二者终浓度都是5ug/ml)的PBS(含1％BSA)5分钟。如果随后使用含DAPI的SlowFade，则无需此步骤。
8.向96孔中的每一个加入30ul含DAPI的SlowFade。
数据分析
通过Envision酶标仪在557nm测量荧光强度。
方案和性能标准
前述实施例为示例说明，将本发明应用于人胚胎干细胞H9(WisconsinAlumi Research Foundation,WARF)。在将该方法应用于其他多潜能干细胞系时，必须确定影响细胞系依赖性分化效率的通常变量，如初始细胞接种密度、培养基中生长因子的浓度和分化持续时间。在上文所述的此优化方法中，我们监测了中内胚层形成的效率以及沙利度胺介导的药物效应来鉴定用于预测致畸风险的最佳条件。
为了清楚和理解的目的，以说明和实例的方式非常详细地描述了前述发明。因此，应理解，以上描述旨在说明，而不是限制。为了所有目的将本申请中引用的所有专利、专利申请和出版物以其整体并入本文作为参考。

Claims (21)

1.评估化合物的致畸风险的方法，其包括：
(1)使所述化合物与正在向中内胚层分化的多潜能干细胞接触；
(2)测量一个或多个中内胚层标记的蛋白质表达，所述中内胚层标记选自Sox17、EOMES和T-brachyury；
(3)测定所述化合物的IC50浓度，其导致所述一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；和
(4)将所述步骤(3)中测定的IC50浓度与(a)一种或多种已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和(b)一种或多种已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险。
2.权利要求1的方法，其中所述多潜能干细胞是灵长类来源。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述多潜能干细胞是胚胎干细胞。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述多潜能干细胞是H9人胚胎干细胞。
5.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述中内胚层标记中的至少一个是SOX17。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述中内胚层标记中的至少一个是EOMES。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述中内胚层标记中的至少一个是T-brachyury。
9.权利要求1-5中任一项的方法，其中SOX17的蛋白质表达是所测量的唯一的所述中内胚层标记。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其中SOX17和EOMES的蛋白质表达是所测量的仅有的所述中内胚层标记。
11.权利要求1-5中任一项的方法，其中SOX17和T-brachyury的蛋白质表达是所测量的仅有的所述中内胚层标记。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中通过免疫组织化学测量所述蛋白质表达。
13.权利要求1-11中任一项的方法，其中通过流式细胞术测量所述蛋白质表达。
14.权利要求1-11中任一项的方法，其中通过荧光显微镜检术测量所述蛋白质表达。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述步骤(1)在40-60％的所述多潜能干细胞分化为中内胚层之后进行。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中步骤(4)中的所述一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自放线菌素D、维甲酸、阿糖胞苷、诺考达唑、鱼藤酮、异维甲酸、溴脱氧尿苷、阿霉素、dorsomorphin、沙利度胺、5-氟尿嘧啶、达沙替尼、索拉非尼、丙戊酸、舒尼替尼、齐拉西酮、米安色林、凡德他尼、己烯雌酚、6-氨基-烟酰胺、利坦色林和吉非替尼。
17.权利要求1-15中任一项的方法，其中步骤(4)中的所述一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自沙利度胺、米安色林和利坦色林。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中步骤(4)中的所述一种或多种已知无致畸风险的化合物选自埃索美拉唑、叶酸、儿茶素、稠环乙脲、烟酸、阿司匹林、布洛芬、阿昔洛韦、酮舍林、链霉素、甲基多巴、糖精、咖啡因、青霉素和替加色罗。
19.权利要求1-17中任一项的方法，其中步骤(4)中的所述一种或多种已知无致畸风险的化合物选自叶酸和甲基多巴。
20.权利要求1-15中任一项的方法，其中步骤(4)中的所述一种或多种已知具有致畸风险的化合物选自沙利度胺、米安色林和利坦色林；且所述一种或多种已知无致畸风险的化合物选自叶酸和甲基多巴。
21.前文所述的发明。
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