CN104144949A

CN104144949A - 双特异性t细胞活化剂抗体

Info

Publication number: CN104144949A
Application number: CN201280063059.4A
Authority: CN
Inventors: 徐悠深; 许寿山; 张铭一; 张铭传; 阮大同
Original assignee: Development Center for Biotechnology
Current assignee: Development Center for Biotechnology
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2032-12-19
Also published as: US20130165629A1; CN104144949B; HK1200839A1; WO2013096346A1; US8961971B2

Abstract

本发明涉及双特异性抗体，其具有连接子与铰链序列的组合，以形成具有生物学显著性的连接子-铰链界面域。此些连接子-铰链界面域使两个分子共价相连，维持所连分子的生物学活性(标靶结合)，稳定新分子的生物学特性(溶解性和4℃稳定性)，维持所连分子的化学、生物化学和物理性质(细胞毒性)，和调节所连分子的生物学特性(活化T淋巴细胞而无显著增殖迹象)。需要连接子(GGGGS)与铰链(CPPCP)序列两者来建立功能性连接子-铰链界面域，因为缺失任一组分均会引起T淋巴细胞介导的活性显著丧失。

Description

双特异性T细胞活化剂抗体

技术领域

本发明涉及制备双特异性或多特异性生物分子，例如双特异性抗体的方法，和其产物。特定来说，本发明是有关用于分子交联的新颖交联子和使用其的方法。

背景技术

组合具有不同功能的生物分子可产生具有所要或改良性质的新分子。举例来说，组合分子可具有双重功能并且可具有改良的稳定性。组合生物分子的常见方法为使用化学连接剂将这些分子交联。然而，当化学交联时，组合分子的生物学活性并不总是得以保存。因此，仍需要用于生物分子交联的更好方法。

发明内容

本发明涉及制备双特异性或多特异性生物分子，例如双特异性抗体(BsAb)的方法，和由此制得的产物。特定来说，本发明是有关用于连接生物分子的新颖连接子-铰链域，和使用其的方法。

本发明的一个方面涉及称为“连接子-铰链域”(LHD)的蛋白质域。根据本发明的一个实施例的LHD包括连接子序列和铰链序列，其中所述连接子序列包含甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGGGS)，并且所述铰链序列包含半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-脯氨酸(CPPCP)。LHD可包括两个或两个以上连接子序列。LHD域的实例可包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6的序列。

本发明的一个方面涉及具有上述LHD域的蛋白质。根据本发明的一个实施例的蛋白质可进一步包括一个N末端部分，其经肽键融合到蛋白质域的N末端；和/或一个C末端部分，其经肽键融合到蛋白质域的C末端。N末端部分和C末端部分可各独立地为肽、全长免疫球蛋白或抗体的单链可变区片段(ScFv)。举例来说，N末端部分和C末端部分的一者可包括T淋巴细胞活化域，所述T淋巴细胞活化域包含抗CD3抗体或抗CD3抗体的单链可变区片段(ScFv)，而N末端部分和C末端部分的另一者可包括肿瘤识别域，所述肿瘤识别域包含抗CD20抗体或抗CD20抗体的单链可变区片段(ScFv)。或者，N末端部分包含抗肿瘤特异性标记、发炎疾病标记、自体免疫性疾病标记或过敏症相关标记。

本发明的一个方面涉及生物分子，各生物分子包含上述蛋白质的二聚体，所述二聚体的铰链序列之间具有二硫键。生物分子维持T淋巴细胞活化能力，或生物分子维持抗体结合到抗原的能力。生物分子可具有改良的溶解性、稳定性和药物动力学。

本发明的其它方面和优点由以下实施方式和随附权利要求书将显而易见。

附图说明

图1A到1E显示示意图，其说明根据本发明实施例的各种双特异性抗体(BsAb)的构筑体。

图2A和2B显示电泳结果，说明IgG-FLΔH BsAb的聚集。

图3显示各种BsAb在长期储存后的稳定性。

图4显示LHD中无铰链的BsAb和根据本发明实施例的具有各种连接子长度的BsAb的结合亲和力。

图5A到5C显示根据本发明实施例的各种BsAb的细胞毒性。

图6显示根据本发明实施例的BsAb诱导PBMC增殖。

图7显示根据本发明的一个实施例的LHD融合BsAb的药物动力学(PK)分析。

具体实施方式

本发明的实施例涉及制备双特异性或多特异性生物分子，例如双特异性抗体的方法，和其产物。本发明的一些实施例是有关用于分子交联的新颖交联子和使用其的方法。本发明的交联子可包含连接子域和铰链域。因此，这些交联子可称为“连接子-铰链域”或LHD。

根据本发明的实施例，连接子域可具有甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGGS)的序列，并且铰链域可具有半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-脯氨酸(CPPCP)的序列。一些交联剂可包含一个或多个连接子序列。铰链序列可使含有这些序列的分子的二聚体之间形成二硫键。

根据本发明的实施例，这些LHD可用于构建双特异性或多特异性生物分子。所述生物分子可为抗体，也就是，双特异性或多特异性抗体。在本说明书中，双特异性抗体可称为“BsAb”。

根据本发明实施例的双特异性抗体可包含LHD，其经由肽键连接到免疫球蛋白(IgG)的恒定区片段(Fc)，也就是，融合蛋白IgG-Fc-LHD。两个特异性配位体结合部分可连接到此融合蛋白的N末端和C末端，而产生双特异性生物分子。位于LHD-IgG Fc的N末端或C末端的特异性配位体结合部分可为蛋白质或肽。这些部分的实例可包括抗体的单链可变区(称为“ScFv”)或结合特异性配位体(包括抗原)的肽。

本发明的双特异性生物分子可具有抗体样结构并且称为“双特异性抗体”或BsAb。下文将描述一些实例以说明本发明的实施例。虽然仅描述有限数目个实例，但所属领域的技术人员会了解，这些实例可具有其它变型或变化形式而不悖离本发明的范畴。

实例

构建靶向CD20的双特异性抗体(具有LHD的BsAb)

为改良多特异性分子的生物学功能性，构建包含连接子-铰链界面域(LHD)的双特异性抗体(BsAb)并且测试其功能。如本文所述，“连接子-铰链”界面域(“LHD”)包括构建一个或多个甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGGGS或G4S连接子)连接子序列和单一的半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-脯氨酸(CPPCP铰链)铰链序列。(表1)。

表1

连接子-铰链域序列的清单

编码	LHD序列	SEQ ID No.
			15H	GGGGSGGGGSGGGGSCPPCP	1
10H	GGGGSGGGGSCPPCP	2
			5H	GGGGSCPPCP	3
10H5	GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS	4
			5H10	GGGGSCPPCPGGGGSGGGGS	5
5H5	GGGGSCPPCPGGGGS	6
			ΔH	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	7
ΔL	CPPCP	8

本发明的实施例使用这些LHD实际地将多个功能性生物分子(包括肽和蛋白质)连接。这些经连接的生物分子具有一种或多种优点，包括维持所连接分子/域的生物学活性、稳定新分子的生物学特性、维持化学、生物化学和物理性质、调节生物学特性等。

为说明LHD在构建多特异性分子中的益处，构建若干具有LHD形式的BsAb，所述BsAb可识别分别作为肿瘤标记和T淋巴细胞活化分子的CD20和CD3。这些BsAb构筑体，包括抗CD20/ScFv-IgG/Fc-CH2-CH3-LHD-抗CD3/ScFv(ScFv-IgG BsAb)、抗CD20(完整mAb)-LHD-抗CD3/ScFv(IgG-FL BsAb)，和抗CD20(完整mAb)-LHD/ΔCPPCP-抗CD3/ScFv(IgG-FLΔH)(图1A-1E)。

图1A说明产生双特异性抗体(BsAb)的一实例，所述抗体含有包含抗CD20单株抗体(mAb)的单链可变区片段(ScFv)的肿瘤识别域(TRD)和包含抗CD3mAb的单链可变区片段(ScFv)的T细胞活化域(TAD)。在此实例中，构建肿瘤识别分子(TRM)，缩写为ScFv-IgG，其包含两部分：肿瘤识别域(TRD)和IgG重链恒定域。肿瘤识别域(TRD)包含抗CD20mAb的ScFv。IgG重链恒定域包含免疫球蛋白G1恒定区片段(IgG1Fc)的CH2和CH3域。

接着，使TRM连接到LHD(连接子铰链域)，所述LHD包含表1中所列的LHD序列中的任一LHD序列(除SEQ No.7外)。LHD共价融合到TRM的CH3域的C末端。最后，使T淋巴细胞活化域(TAD)(也称为单链抗CD3单株抗体域)融合到LHD的C末端。换言之，此重组蛋白包含(从N末端到C末端)：TRD(抗CD20ScFv)、IgG1Fc、LHD和TAD(抗CD3ScFv)。

如同一般抗体，此ScFv-IgG双特异性抗体(BsAb)的生物学活性形式将形成同型二聚体。二聚作用中，单体ScFv-IgG BsAb的LHD域中的CPPCP序列可与另一个单体ScFv-IgG的另一个LHD域中的CPPCP序列形成二硫键，如图1A中所示。所得分子为抗体样分子，其恒定链(也就是IgG1Fc)的两端(C末端和N末端)具有两个不同可变域。因此，所得分子可称为双特异性抗体(BsAb)。

图1B说明形成双特异性抗体(BsAb)的另一种方法，所述抗体具有的双特异性(也就是抗CD20和抗CD3)与图1A中所示的双特异性相同。除了TRM使用全长抗CD20mAb代替单链抗CD20抗体的外，此BsAb类似于图1A中所示的BsAb。全长mAb包括全长IgG1重链恒定域(IgG1Fc)，也就是，重链恒定域包括CH1、CH2和CH3域。

如上所述ScFv-IgG BsAb(图1A)中，LHD融合到TRM(也就是全长抗CD20mAb)的C末端，也就是融合到TRM的CH3域的C末端。LHD序列可为表1中的任一序列，除SEQ No.8外。接着，使TAD(也就是抗CD3ScFv)融合到LHD序列的C末端。如同图1A所示的ScFv-IgG BsAb，此构筑体将形成二聚体。二聚作用中，单体IgG-FL BsAb的LHD中的CPPCP序列可与另一单体IgG-FL的LHD形成二硫键，如图1B中所示。此分子的双特异性与图1A中所示分子的双特异性相同。

图1C说明图1A中所示的双特异性抗体(BsAb)的变异体。其具有相同TRM和TAD。然而，此变异体中的LHD域具有序列SEQ ID NO：8(表1)，也就是，不含GGGGS连接子序列。此变异体称为ScFv-IgGΔL BsAb。如同母体形式，ScFv-IgGΔL BsAb的LHD内的二硫键是在单体ScFv-IgGΔL BsAb二聚之后产生，如图1C中所示。

图1D显示图1A中所示的双特异性抗体的另一变异体。在此变异体中，LHD具有序列SEQ ID NO：7(表1)，其缺乏CPPCP铰链序列。此变异体称为IgG-FLΔH BsAb。因为LHD缺乏用于形成二硫键的半胱氨酸残基，所以IgG-FLΔH BsAb不含介于两个LHD之间的二硫键。

图1E显示图1A的BsAb的类似物。在此类似物中，TRD与TAD域对换，也就是，TAD位于IgG1Fc的N末端，而TRD位于LHD的C末端。此类似物(称为“N末端TADBsAb”)具有的双特异性与图1A中所示的BsAb的双特异性相同。

上述BsAb具有改良的性质，例如生产产量和稳定性，同时保留其结合特异性和效力，如下文所说明。

如下文所说明，上述BsAb具有改良的性质(生产产量和稳定性)，同时保留其结合特异性和效力。

具有LHD的BsAb提供产能的改良

在以蛋白质为基础的治疗剂的商业化中，产量扮演着关键的角色。根据本发明的实施例，蛋白质中包含LHD可改良多特异性分子的产量。为证明根据本发明实施例的LHD的效用，将ScFv-IgG、IgG-FL和IgG-FLΔH BsAb克隆、表达，并且用FS293哺乳动物细胞来测试，评估其产量和稳定性。

这些测试的结果显示，不论LHD中的连接子序列的重复数为何，所有BsAb形式在短暂转染生产下皆具有相似的产率(≥1μg/ml)。尽管IgG-FLΔH BsAb的粗物质产量与IgG-FL或ScFv-IgG BsAb形式的产量类似，但注意到IgG-FLΔH BsAb纯化之后的回收率不良(表2)。

表2

具有LHD的BsAb构筑体在纯化之后的回收率

SEQ ID NO	标记	回收率
			1	15H	≥90％
2	10H	≥90％
			3	5H	≥90％
4	10H5	≥90％
			5	5H10	≥90％
6	5H5	≥90％
			7	ΔH	≤45％
8	ΔL	≥90％

进一步分析显示大量聚集物形成，下沉集结于IgG-FLΔH BsAb的纯化装置的底部。随后SDS分析显示，BsAb为这些团块的主要组分(图2)。

以液态储存的蛋白质药物在4℃的稳定性在蛋白质工程中已成问题，尤其含有连接子的蛋白质(参见美国专利申请公开案第2009/0175867A1号)。本文所述的实例显示，具有一到两个连接子重复的BsAb被观测到发生轻度的蛋白水解分裂，而其它LHD构筑体发生的蛋白水解分裂则很少(图3)。

具有LHD的BsAb的抗原结合能力未减小

为使BsAb获得T细胞介导的细胞毒性，CD3与T细胞表面的结合为必需的。CD3分子为T细胞受体(TCR)的共受体并且负责MHC与抗原复合物刺激之后的信号传导。抗CD3ScFv直接融合到ScFv-IgG、IgG-FL和IgG-FLΔH BsAb的C末端会对这些分子的CD3结合能力产生一些负面影响，如表3中所示。

表3

LHD融合BsAb对CD20和CD3的结合常数分析

在这些BsAb中，IgG-FLΔH BsAb与CD3的结合最显著的降低(表3和图4A)。此未预测到的结果凸显了LHD在BsAb的生物学上有效性的必要性。然而，改变LHD内的连接子序列的长度并不足以完全恢复CD3与BsAb的结合能力(表3和图4B)。相较于亲本全长抗CD3抗体，ScFv-IgG与IgG-FL BsAb对配位体(CD3)的亲和力均观测到降低的现象(表3)。另一方面，三种BsAb(ScFv-IgG、IgG-FL和IgG-FLΔH)对表达CD20的淋巴瘤的结合常数则不受影响(表3)。

具有LHD的BsAb可将B淋巴瘤的细胞毒性增强

由T细胞所介导，针对肿瘤的细胞毒性被视为BsAb疗法中的圣品。以下实例显示LHD有助于BsAb增强T淋巴细胞介导的肿瘤消除。如同化学结合的BsAb，IgG-FL与ScFv-IgG BsAb均能够在低浓度下消除CD20⁺B细胞淋巴瘤(图5A)。从LHD(也就是ScFv-IgGΔL BsAb)移除连接子序列(GGGGS)也会消除T淋巴细胞介导的细胞毒性(图5A)。

除了IgG-FLΔH BsAb因缺乏CPPCP序列而不能在二聚之后形成LHD相关的二硫键的外，IgG-FLΔH BsAb与IgG-FL BsAb具有高度的结构相似性。在缺乏LHD相关的二硫键下，会导致T淋巴细胞介导的细胞毒性显著降低(图5C)。

尽管TRM与TAD之间具有LHD的BsAb可提供改良的肿瘤特异性细胞毒性，但改良程度对于表1中所列的LHD序列并非普遍适用。已发现ScFv-IgG BsAb的最佳细胞毒性与SEQ ID4、5或6相关(表1，图5A)。然而，当使用全套抗CD20mAb作为IgG-FL形式中的TRM时，肿瘤特异性细胞毒性的变化会显得难以分辨(图5B)。(一种抗CD20mAb)已显示可经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)介导B细胞消耗。实验证明，相较于，包含LHD的BsAb(例如IgG-FL和ScFv-IgG形式)能经由ADCC更有效地消除B淋巴瘤(图5A、5B和表4)。先前结果显示，诱导的ADCC需要较高的效应剂：目标比率(E∶T比率为40∶1或高于40∶1)和较高的效价(μg/ml)以保持30-50％的最大细胞毒性。然而，所选LHD的IgG-FL BsAb形式不仅改良肿瘤消除能力(高达80％)，而且将E∶T比率降低到10∶1(表4)。

表4

LHD融合BsAb介导针对肿瘤细胞的细胞毒性

相较于亲本抗CD3单株抗体，具有LHD的ScFv-IgG BsAb和具有LHD的IgG-FLBsAb可轻度诱导PBMC的增殖

全长单株抗CD3抗体为熟知的用于非特异性T细胞活化的促有丝分裂诱导剂。已有人提出，在单株抗CD3抗体治疗之后，此促有丝分裂性会引起较大的不良反应，例如流感样症状和细胞激素释放症候群(CRS)。申请人已发现，如同N末端TAD BsAb(图1E)，亲本抗CD3mAb可显著诱导新鲜培养的周边血液单核细胞(PBMC)增殖(图6)。相较于单独抗CD3mAb，通过抗CD20mAb与抗CD3mAb化学结合而制备的BsAb显示会稍微将低促有丝分裂的潜力。然而IgG-FL/15H BsAb仅在高浓度下展现促有丝分裂效应(图6)。

具有LHD的BsAb使T细胞活化标记增强

增殖分析为测量T淋巴细胞活化的“标准”，不论活化后是否产生异质细胞。申请人已发现IgG-FL BsAb可增强对B淋巴瘤的细胞毒性效应，不论其是否会降低增殖概况(图5和图6)。为合理地说明这些观测结果，将T淋巴细胞活化标记CD69与CD25均染色，并且在各种刺激之后通过FACS来显示(表5)。实例显示，含有LHD的IgG-FL BsAb在增强CD69与CD25表达方面，比抗CD3mAb更有效。N末端TAD BsAb的活化概况与含有LHD的IgG-FL BsAb的活化概况也相似。ScFv-IgG与LHD/ΔL融合不能有效消除肿瘤细胞(图5A)，此生物功能丧失也可由活化T淋巴细胞的能力的丧失来反映(表5)。

表5

具有LHD的IgG-FL BsAb增强CD69和CD25的表达

这些结果进一步证明功能性LHD域需要连接子与铰链。这些实例证明本发明LHD(表1)可维持所连分子/域的生物学活性和调节所要的生物学特性。

具有LHD的IgG-FLBsAb显示可改良药物动力学性质

PK(药物动力学)为药物成功的主要指标，因为扩大的PK不仅转化稳定性更好，可减少给药频率，并且患者和临床医师更易接受。IgG-FL对小鼠的PK显示约96个小时的T^1/2(图7)。

构建双特异性抗体

限制酶购自各个供应商，DNA聚合酶、T4DNA连接酶克列诺酶(Klenow enzyme)和T4DNA聚合酶购自英杰公司(Invitrogen)(纽约州格兰德岛市(Grand Island，NY))。所有酶根据制造商的建议使用。

用于PCR扩增的所有引子皆购自各个供应商。DNA扩增是在制造商的PCR机器中使用预变性步骤、随后执行预定循环(含有变性步骤、粘接步骤和扩增步骤，各30分钟)来执行。

所有表达模块示意性显示于图1A-1E中。

将抗CD20轻链和截断的重链克隆于载体A和载体B中。将抗CD20VH和VL的单链片段克隆于载体C中，并且用于随后的抗CD20ScFv。

细胞株制备

本发明所用的Raji细胞为B淋巴瘤肿瘤细胞株，其获自生物资源保存和研究中心(Biorescouce Collection and Research Center，BCRC)，所述中心为中华民国(R.O.C)台湾食品工业研究发展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)的一个部门。Jurkat细胞为获自ATCC的T淋巴瘤细胞株。Raji细胞与Jurkat细胞均在补充有10％胎牛血清(海康公司(Hyclone))、0.03％L-谷氨酰胺和0.4mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基(英国佩斯利GibcoBRL生物技术公司(GibcoBRL Life Technologies，Paisly,UK))中培养。在含有5％C0₂的37℃增湿恒温箱中培育后，将细胞在无菌缓冲液中继代培养或洗涤用于测试。

制备周边血液单核细胞(PBMC)

使用Ficoll-Paque PLUS，通过密度离心从正常健康成人供者的全血分离周边血液单核细胞(PBMC)。分离之后，PBMC在补充有10ng/ml抗CD3mAb、75IU/ml介白素-2(IL-2)和10％FBS的RPMI-1640培养基中培养并且活化6到14天。

细胞毒性分析(钙黄绿素AM细胞毒性)

目标细胞(Raji)在补充有5％FBS的无酚红RPMl1640培养基中、在37℃用10μM钙黄绿素标记30分钟。在钙黄绿素培育结束时，细胞用具有5％FBS的无酚红RPMI1640培养基洗涤两次并且用具有5％FBS的无酚红RPMI1640将细胞密度调节到3×10⁵个细胞/毫升。作为反应混合物，将含有3×10⁴个细胞的100μl培养基放置于96孔培养盘的各孔中。计算效应细胞(PBMC)培养物的细胞密度并且用具有5％FBS的无酚红RPMI1640培养基调节到3×10⁶个细胞/毫升。对于细胞毒性反应，将不同量的不同BsAb和100μl(3×10⁵个细胞)效应细胞添加到96孔培养盘的Raji预加料中并且在37℃5％CO₂富集恒温箱中培育4小时。在培育结束时，培养盘以700g离心5分钟，接着从各反应孔个别地转移130μl上清液到新盘中并且用Fusion alpha微盘读取器定量所释放的染料。根据下式计算细胞毒性百分比：

[荧光(样品)-荧光(对照)]/[荧光(总溶胞)-荧光(对照)]*100。

总溶胞定义为经0.9％Triton处理10分钟的目标细胞。

流式细胞术分析

对肿瘤目标(B-淋巴瘤)的结合亲和力

Raji细胞(1×10⁶个细胞/反应)用不同浓度的不同BsAb在室温下处理30分钟。在培育结束时，所有反应物用补充有2％FBS的PBS洗涤两次。洗涤之后，细胞与1μl结合FITC的亲和力纯化F(ab′)2片段(山羊抗人类IgG(Fab′)2片段)特异性抗体，在室温下再培育30分钟。培育之后，细胞用补充有2％FBS的冰冷PBS洗涤两次并且通过FACS装置监测。

Jurkat细胞(1×10⁶个细胞/反应)用不同浓度的不同BsAb在室温下处理30分钟。在培育结束时，所有反应物用补充有2％FBS的PBS洗涤两次。洗涤之后，细胞与1μl结合FITC的亲和力纯化F(ab′)2片段(山羊抗人类IgG(Fab′)2片段)特异性抗体在室温下再培育30分钟。培育之后，细胞用补充有2％FBS的冰冷PBS洗涤两次并且通过FACS装置监测。

T淋巴细胞活化标记分析

除了将所分离的PMBC活化2或4天的外，如“制备周边血液单核细胞(PBMC)”章节中所述分离周边血液单核细胞(PBMC)。除了所用目标细胞为活化PBMC的外，如“对肿瘤目标的结合亲和力”章节中所述，用抗人类CD25和CD69标记对PMBC进行免疫荧光染色。简言之，1×10⁶个细胞/反应用不同浓度的荧光结合抗人类CD25或CD69单株抗体在室温下处理30分钟。在培育结束时，所有反应物用补充有2％FBS的PBS洗涤两次。洗涤之后，通过FACS装置监测细胞。

对包含LHD融合双特异性抗体的融合蛋白的PK分析

向Balb/c小鼠(n＝4)注射3mg/kg抗CD20IgG-LHD-抗CD3/ScFcBsAb，并且在多个时间点收集血液样品。经由离心收集所集中的动物血清，并且经由ELISA测量BsAb浓度。简言之，将连续稀释的小鼠血清，在预涂有抗人类Fab抗体(杰克逊实验室(JacksonLab))的ELISA盘中培育1小时。培育之后，将微量滴定盘用PBST缓冲液洗涤若干次，并且通过5％脱脂乳阻断1小时。在阻断结束时，将微量滴定盘用PBST再次洗涤，并且与结合HRP的抗人类Fc抗体再培育1小时。此培育之后，再次洗涤微量滴定盘并且根据制造商建议加以显色和侦测。

虽然例示了双特异性生物分子，但所属领域的技术人员了解也可利用此方法制备多特异性生物分子。类似地，此处例示使用GGGGS的连接子序列并且例示使用CPPCP的铰链序列。然而，所属领域的技术人员了解可使用其它类似序列。连接子序列是为不同域提供适当空间，而铰链域是为同型二聚体中的二硫键形成提供残基。

虽然本发明已结合有限数目个实施例加以描述，但受益于本发明的所属领域的技术人员将了解，可构想不悖离如本文揭示的本发明范畴的其它实施例。因此，本发明范畴应仅由随附权利要求书限定。

Claims

1.一种包含连接子序列和铰链序列的蛋白质域(LHD)，其中所述连接子序列包含甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸，且所述铰链序列包含半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-脯氨酸。

2.根据权利要求1所述的蛋白质域，其中所述蛋白质域包含两个或两个以上连接子序列。

3.根据权利要求1所述的蛋白质域，其中所述蛋白质域包含SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的序列。

4.一种包含根据权利要求1所述的蛋白质域的蛋白质，其进一步包含经由肽键融合到所述蛋白质域的N末端的N末端部分和经由肽键融合到所述蛋白质域的C末端的C末端部分。

5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中所述N末端部分和所述C末端部分各自独立地为全长免疫球蛋白或抗体的单链可变区片段(ScFv)。

6.根据权利要求4所述的蛋白质，其中所述N末端部分和所述C末端部分中的一者包含含有抗CD3抗体或抗CD3抗体的单链可变区片段(ScFv)的T淋巴细胞活化域，而所述N末端部分和所述C末端部分的另一者包含含有抗CD20抗体或抗CD20抗体的单链可变区片段(ScFv)的肿瘤识别域。

7.根据权利要求4所述的蛋白质，其中所述N末端部分包含抗肿瘤特异性标记、发炎疾病标记、自体免疫性疾病标记或过敏症相关标记。

8.一种包含根据权利要求4-7中任一权利要求所述的蛋白质的二聚体的生物分子，其包含介于所述二聚体的铰链序列之间的二硫键。

9.根据权利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子维持T淋巴细胞活化能力。

10.根据权利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子维持抗体结合到抗原的能力。

11.根据权利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子在表达、产生或纯化期间维持溶解性。

12.根据权利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子的促有丝分裂性低于抗CD3单株抗体的促有丝分裂性。

13.根据权利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子能够在不低于抗CD3单株抗体诱导的水准的水准下诱导CD69和CD25表达。