CN104131022A

CN104131022A - 产气荚膜梭菌α、β1、β2、ε毒素共表达载体及其构建方法和表达方法

Info

Publication number: CN104131022A
Application number: CN201410378016.6A
Authority: CN
Inventors: 周继章; 韩广伟
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2014-11-05

Abstract

本发明公开了一种产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体，载体分别为在同一宿主菌中表达的pETDuet-1、pRSFDuet-1，载体上分别连接有产气荚膜梭菌α、ε毒素编码基因和产气荚膜梭菌β₁、β₂毒素编码基因。在此基础上本发明还公开了所述共表达载体的构建方法和表达方法。

Description

产气荚膜梭菌α、β1、β2、ε毒素共表达载体及其构建方法和表达方法

技术领域

本发明涉及一种利用基因技术得到的多毒素的共表达载体及其构建和表达方法，属于生物工程领域。

背景技术

多血清型动物传染病的防控是当前困扰兽医科学工作者的重要原因之一，寻找同时能表达多种蛋白，并且蛋白的免疫原性不受破坏和改变，同时对多种血清型起到防控作用的亚单位疫苗是目前本领域急需解决的技术问题。

产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)，革兰氏阳性产芽孢厌氧杆菌，广泛分布于自然界中，土壤、污水、食物、粪便等中均可见，同时它也是人类肠道菌群的正常组成部分。本菌的致病作用主要体现在它所产生的毒素方面，α、β、ε、ι是该菌产生的四种主要致病性毒素，以此为依据可将该菌分为A、B、C、D、E5型。产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病病原，可以引起人类的气性坏疽。此外还可以引起羊快疫、羊羔痢疾、羊肠毒血症、仔猪痢疾、犊牛肠毒血症等多种动物疾病，对畜牧业造成了巨大的经济损失。

现在该类疾病的免疫主要通过对产气荚膜梭菌培养过程中产生的毒素处理成类毒素而实现，中国发明专利申请200680021810.9发明了产气荚膜梭菌α类毒素疫苗，并且证明该疫苗能够诱导动物产生足够的保护性抗体。虽然类毒素疫苗能诱导动物产生保护性抗体，但是它存在安全性不高、稳定性差等缺点，这些缺点大大限制了其应用，基因工程疫苗因而成为了研究目标，基因工程疫苗只含有产生保护性免疫应答所必需的免疫成分，不含免疫所不要的成分，因而安全性、稳定性好，此外也减少和消除了常规疫苗难以避免的热原、变应原等反应原。

中国发明专利申请200310123697.3利用PCR技术构建了含有β1、β2融合基因的重组质粒，并且进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研制多价基因工程亚单位苗提供了理想基因材料，为解决困扰我国畜牧业的动物坏死性肠炎和肠毒血症提供了一条新的途径。但是该重组质粒是多个毒素基因的串联，最多能够同时表达三个毒素，在诱导表达时往往会出现表达量不足，导致免疫动物无法产生足够的免疫保护力。因而，急需构建能够同时表达多个毒素的重组质粒，为梭菌多价疫苗的制备提供一种有效的途径。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明公开了一种产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体，利用分子克隆的手段将α、β₁、β₂、ε四种毒素的编码基因分别与双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1连接，构建了共表达载体使其能够在同一菌株中同时表达产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε四个毒素蛋白，可作为多价产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗用来防控多血清型的动物传染病，以有效提高我国畜牧动物中梭菌病的防治技术水平，保证养殖业健康发展、提供农牧民收入、保证公共卫生和畜产品安全。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体，载体分别为在同一宿主菌中表达的pETDuet-1、pRSFDuet-1，载体上分别连接有产气荚膜梭菌α、ε毒素编码基因和产气荚膜梭菌β₁、β₂毒素编码基因。

本发明所用的载体pETDuet-1、pRSFDuet-1是双表达载体，每一个载体上有两个启动子，属于单一载体双启动子系统，每一个毒素基因都有独立的一个启动子，每个启动子独立驱动各个毒素蛋白的表达。

与传统的构建融合基因相比，本发明的双表达载体避免了基因之间的相互影响，保证了毒素蛋白稳定的表达量，克服了串联表达表达量不足的缺点。并且通过在同一宿主菌中表达的双质粒表达系统，pETDuet-1和pRSFDuet-1作为复制子相同不相容的两个质粒，在Amp和Kana两种抗生素存在的压力下子代菌能够有效存活，不会被抗生素杀死，从而可以同时转化进入同一宿主菌后有效的表达外源毒素基因。

为了便于规模化生产，降低培养难度，优选的本发明所用的宿主菌为大肠杆菌，其培养简单，可以采用发酵罐实现规模化生产，从而有效控制质量，保证所生产疫苗的安全性和有效性。

常规的生物工程中所用的大肠杆菌均可用于本发明，包括但不限于大肠杆菌BL21，BL21(DE3)，和BL21(DE3)PLySs等。

本申请发明人在研发过程中充分研究了不同毒素蛋白的编码基因与表达载体之间连接关系的难易程度和准确性，优选的连接关系是pETDuet-1-α-ε和 pRSFDuet-1-β₁-β₂，即α、ε毒素编码基因插入双表达载体pETDuet-1，β₁、β₂毒素编码基因插入双表达载体pRSFDuet-1。

相应的，本发明公开了上述共表达载体的构建方法，通过分别将产气荚膜梭菌α和ε毒素编码基因、产气荚膜梭菌β₁和β₂毒素编码基因与双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1连接，构建共表达载体，具体的包括下述步骤：

1)利用产气荚膜梭菌菌株的DNA作为PCR模版扩增出α、β₁、β₂、ε毒素编码基因；

2)使用EcoRI、PstI分别双酶切两个载体pETDuet-1、pRSFDuet-1；

3)利用EcoRI、PstI分别双酶切α、β₂毒素基因，将其在T4DNA连接酶的作用下分别与双酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体连接得到表达载体；

4)利用BglII、XhoI双酶切步骤3)得到的表达载体，使用BglII、XhoI双酶切ε、β₁毒素编码基因，在T4DNA连接酶的作用下分别与双酶切后的表达载体连接得到共表达载体。

其中，步骤1)的α、β₁、β₂、ε毒素编码基因扩增所用引物设计如下：

产气荚膜梭菌α毒素编码基因的引物为CPA-F：CTCGAATTCATGGGATGGAAAGATTGATG，CPA-R：GGCCTGCAGCCACCAAAACCAATATT；

产气荚膜梭菌β₁毒素编码基因的引物为CPB1-F：CGCAGATCTCAATGATATAGGTAAAAC，CPB1-R：CCGCTCGAGATTAATAGCTGTTACTTTGTG；

产气荚膜梭菌β₂毒素编码基因的引物为CPB2-F：CATGAATTCAGTTAAAGCAAATGAAGTGA，CPB2-R：CGCCTGCAGTAATAACAATAACCCTCACC；

产气荚膜梭菌ε毒素编码基因的引物为ETX-F：CGCAGATCTCAAGGAAATATCTAATACAGTA，ETX-R：CCGCTCGAGTTCTAATAAATAATCTTATTTT。

上述PCR扩增反应采用常规的PCR反应条件即可，无特殊要求。

上述四种毒素蛋白编码基因序列均可从数据库中公开查到，也可以产气荚膜梭菌标准菌株的基因组为模板扩增得到，例如以产气荚膜梭菌C59-1的基因组为模板通过上述引物可扩增出α、β₁、β₂毒素的编码基因，以产气荚膜梭菌C60-2基因组为模板通过上述引物可以扩增出ε毒素的编码基因。

如上所述，优选的载体与毒素编码基因的连接关系为步骤3)分别构建 pETDuet-1-α和pRSFDuet-1-β₂载体，步骤4)分别构建pETDuet-1-α-ε和pRSFDuet-1-β₁-β₂载体。

本发明的构建方法，通过酶切、连接、转化的过程将α、ε毒素的编码基因插入双表达载体pETDuet-1，β₁、β₂毒素编码基因插入双表达载体pRSFDuet-1，从而能够用于在同一宿主菌中高效表达α、β₁、β₂、ε四种毒素蛋白，这四种毒素蛋白能够与同一动物体内的阳性血清发生反应，具有很好的免疫原性。

在上述基础上，本发明还公开了所述产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体的表达方法，是将上述的产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体转化到宿主菌，挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，摇菌过夜，转接到新的LB培养基中，采用IPTG诱导表达。

如前述，所用的宿主菌优选为大肠杆菌，包括但不限于大肠杆菌BL21，BL21(DE3)，和BL21(DE3)PLySs等。

上述表达方法，通过将携带四个毒素基因的两个载体转化进入同一个宿主菌，能够得到稳定、高效表达α、β₁、β₂、ε四种毒素蛋白的菌株，其所表达的四种毒素蛋白以包涵体形式存在，不具有毒素本身活性，并且具有很好的免疫原性并且能诱导动物机体产生较好的免疫保护力，抵御1×LD₁₀₀产气荚膜梭菌的攻击。

由于具有上述特性，本发明还公开了一种多价产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗，包含含有共表达载体pETDuet-1-α-ε和pRSFDuet-1-β₁-β₂的宿主菌，由于该疫苗所用抗原是蛋白质，与其他疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现基因重组问题，因此不存在生物安全性问题，适合大批量生物使用。

附图说明

图1为α、β₁、β₂、ε毒素基因扩增电泳图，其中M是2000bp Marker，1-4分别是α、ε、β₁、β₂毒素编码基因；

图2显示了α、ε、β₁、β₂毒素基因双酶切鉴定图，其中，A是α、ε毒素基因双酶切鉴定图，其中M是2000bp Marker，1是共表达载体pETDuet-1-α-ε经过EcoRI和PstI双酶切结果，2是共表达载体pETDuet-1-α-ε经过BglII和XhoI双酶切结果；B是β₁、β₂毒素基因双酶切鉴定图，其中M是2000bp Marker，1是共表达载体pRSFDuet-1-β₁-β₂经过EcoRI和PstI双酶切结果，2是共表达载体pRSFDuet-1-β₁-β₂经过BglII和XhoI双酶切结果；

图3是α、ε、β₁、β₂四个毒素蛋白表达的SDS-PAGE图，其中M是蛋白Marker，1是同时转入空质粒pETDuet-1和pRSFDuet-1的BL21(DE3)全细胞裂解物；2是同时转入pETDuet-1-α-ε和pRSFDuet-1-β₁-β₂共表达载体未加IPTG诱导的BL21(DE3)全细胞裂解物；3是共表达载体pETDuet-1-α-ε和pRSFDuet-1-β₁-β₂同时转入BL21(DE3)中经0.8mM IPTG诱导表达四个毒素蛋白4小时后的SDS-PAGE图。

图4是α、ε、β₁、β₂四个毒素的免疫印迹鉴定，其中A-2是使用D型产气荚膜梭菌阳性血清对共表达的α、ε毒素Western blotting鉴定，B-2是使用B型产气荚膜梭菌阳性血清对共表达的α、ε、β₁、β₂毒素的Western blotting鉴定。

具体实施方式

在本发明中所使用的主要材料均可从相关生物制品公司购买，下面给出了实施里中所用材料的购买来源，仅为示意。

产气荚膜梭菌菌株：C59-1、C60-2购自中国兽医药品监察所；

pETDuet-1和pRSFDuet-1双表达载体购自Novagen公司；

表达菌：

BL21(DE3)是四个毒素蛋白的表达宿主菌，购自北京全式金生物技术有限公司。

所用引物由上海生工生物工程有限公司合成；

所用酶和试剂：限制性内切酶BglII、EcoRI、PstI、XhoI，T4DNA连接酶和2×Power Taq PCR MasterMix均购自大连宝生物有限公司；IPTG、SDS(十二烷基磺酸钠)、2000DNA Marker、Agarose DNA extraction kit、DNA快速纯化回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司；细菌基因组提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司合成；琼脂糖购自Invitrogen公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司。

实施例1：产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体的构建和表达

1.α、ε、β₁、β₂毒素编码基因的扩增

将购买来的保存冻干的产气荚膜梭菌标准菌株C59-1和C60-2接种新鲜配置的厌气肝汤培养基中过夜培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时无菌收集厌气肝汤培养液，利用细菌基因组提取试剂盒提取C59-1和C60-2基因组DNA作为PCR模版扩增出各个毒素基因。

PCR反应体系：50μL MasterMix，上下游引物各2μL，模版16μL，去离子水30μL；DNA胶回收试剂盒回收四个毒素编码基因；

2.pETDuet-1-α和pRSFDuet-1-β₂载体的构建

将pETDuet-1、pRSFDuet-1两个载体进行EcoRI、PstI双酶切，40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL，载体24μL，去离子水8μL，酶切产物1％琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收；

EcoRI、PstI双酶切的α、β₂毒素基因，40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL，目的基因24μL，去离子水8μL，酶切产物1％琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收，然后分别与双酶切的pETDuet-1、pRSFDuet-1的载体连接，构建两个连接体系：10×T4DNA Ligase Buffer2.5μL，，α毒素编码基因胶回收产物14μL，pETDuet-12μL，T4DNA Ligase1μL，去离子水5.5μL；10×T4DNA Ligase Buffer2.5μL，，β₂毒素编码基因胶回收产物14μL，pRSFDuet-1 2μL，T4DNA Ligase1μL，去离子水5.5μL。16℃连接过夜，分别转化Trans109态细胞，挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定、菌液测序确定α、β₂分别连接到pETDuet-1-α和pRSFDuet-1-β₂载体上；

3.pETDuet-1-α-ε和pRSFDuet-1-β₁-β₂载体的构建

pETDuet-1-α和pRSFDuet-1-β₂进行BglII、XhoI双酶切，40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL，载体24μL，去离子水8μL，酶切产物1％琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。

BglII、XhoI双酶切的ε、β₁毒素编码基因，40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL，目的基因24μL，去离子水8μL，酶切产物1％琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收，然后构建两个链接体系：10×T4DNA Ligase Buffer2.5μL，，ε毒素编码基因胶回收产物14μL，pETDuet-1-α2μL，T4DNA Ligase1μL，去离子水5.5μL；10×T4DNA Ligase Buffer2.5 μL，，β₁毒素编码基因胶回收产物14μL，pRSFDuet-1-β₂2μL，T4DNA Ligase1μL，去离子水5.5μL。16℃连接过夜，分别转化Trans109态细胞，挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定、菌液测序确定ε、β₁分别连接到pETDuet-1-α和pRSFDuet-1-β₂载体上；

4.α、ε、β₁、β₂四个毒素的共表达

pETDuet-1-α和pRSFDuet-1-β₂各0.5μL质粒同时转化BL21(DE3)宿主菌，挑取单克隆菌落接种于新鲜10ml LB培养基中，摇菌过夜，按1∶100比例转接新鲜10mlLB培养基中，OD₆₀₀值达0.6-0.8时取1ml菌液作为未诱导样品，然后加入终浓度0.8mM的10μL IPTG诱导表达四小时收取1ml菌液样品。

实施例2：α、ε、β₁、β₂四个毒素的共表达结果检测

1 SDS-PAGE溶液的配制：

Tris-甘氨酸缓冲液：25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(pH8.0)、0.1％SDS。

2×SDS上样buffer：100mmol/L Tris.C1(pH8.0)、200m mol/L巯基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油。

考马斯亮蓝染色液：45ml甲醇、45ml水、10ml冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R250。

脱色液：30％甲醇、10％冰乙酸，蒸馏水补体积至100ml。

2 SDS-PAGE实验

(1)洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0％琼脂糖封边。按分子克隆的配方配制15％的分离胶5ml，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖1ml双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入2ml 5％的浓缩胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。

(2)小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。

(3)收集的菌液12000rpm离心2min，用50μl pH7.4的PBS悬浮，加入等体积的2×SDS上样buffer，混匀，水浴煮沸10min，用微量进样器上样10μl，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。

(4)染色：取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放在脱色摇床上室温染色3h。

(5)脱色：用30％甲醇、10％冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换染色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。

Claims

1.产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体，其特征在于载体分别为在同一宿主菌中表达的pETDuet-1、pRSFDuet-1，载体上分别连接有产气荚膜梭菌α、ε毒素编码基因和产气荚膜梭菌β₁、β₂毒素编码基因。

2.根据权利要求1所述的共表达载体，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的共表达载体，其特征在于连接关系为pETDuet-1-α-ε和pRSFDuet-1-β₁-β₂。

4.产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体的构建方法，其特征在于分别将产气荚膜梭菌α和ε毒素编码基因、产气荚膜梭菌β₁和β₂毒素编码基因与双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1连接，构建共表达载体。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于包括下述步骤：1)利用产气荚膜梭菌菌株的DNA作为PCR模版扩增出α、β₁、β₂、ε毒素编码基因；2)使用EcoRI、PstI分别双酶切两个载体pETDuet-1、pRSFDuet-1；3)利用EcoRI、PstI分别双酶切α、β₂毒素基因，将其在T4DNA连接酶的作用下分别与双酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体连接得到表达载体；4)利用BglII、XhoI双酶切步骤3)得到的表达载体，使用BglII、XhoI双酶切ε、β₁毒素编码基因，在T4DNA连接酶的作用下分别与双酶切后的表达载体连接得到共表达载体。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于步骤1)扩增所用引物分别为：

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于载体与毒素编码基因的连接关系为步骤3)分别构建pETDuet-1-α和pRSFDuet-1-β₂载体，步骤4)分别构建pETDuet-1-α-ε和pRSFDuet-1-β₁-β₂载体。

8.产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体的表达方法，其特征在于将权利要求1的产气荚膜梭菌α、β₁、β₂、ε毒素共表达载体转化到宿主菌，挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，摇菌过夜，转接到新的LB培养基中，采用IPTG诱导表达。

9.根据权利要求8所述的表达方法，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌。