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CN104126013B - 通过脱氢酶的表达来改良脂肪酸合成的细胞系统和方法 - Google Patents

通过脱氢酶的表达来改良脂肪酸合成的细胞系统和方法 Download PDF

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CN104126013B CN201280070199.4A CN201280070199A CN104126013B CN 104126013 B CN104126013 B CN 104126013B CN 201280070199 A CN201280070199 A CN 201280070199A CN 104126013 B CN104126013 B CN 104126013B
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詹妮弗·科珀史密斯
普拉奇·普拉卡什
史利维迪亚·阿克拉
瑞卡·谢沙德利
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Abstract

本发明涉及在重组型宿主细胞中产生脂质(例如脂肪酸产物)的方法，所述重组型宿主细胞经工程改造以便表达编码脱氢酶的非原生基因。重组型微生物与不表达非原生脱氢酶基因的微生物相比能够以更高的速率增殖，并且经工程改造以便用于脂质产生并且表达非原生脱氢酶的微生物培养物与不包括非原生脱氢酶基因的对照微生物培养物相比产生更多的脂质。

Description

通过脱氢酶的表达来改良脂肪酸合成的细胞系统和方法
序列表的引用
本申请案含有对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，其已经作为2012年12月4日建立的档案大小84千字节(KB)的序列表文档“61037527_1.txt”一并提交。上述序列表依据37C.F.R.§1.52(e)(ii)以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
在一些实施例中，本发明涉及光合微生物中代谢途径的工程改造。特定说来，本发明涉及用于合成脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或脂质的工程改造途径。本发明还涉及用于在光合微生物中产生脂质，例如脂肪酸产物的方法、微生物和核酸分子，其可以用于多种产物，包括生物燃料。
背景技术
化石燃料是由腐败的植物和动物形成的有机材料的地下可燃性地质沉积物的通称，这些腐败的植物和动物已经通过在亿万年内暴露于地壳中的热和压力而转化成原油、煤、天然气或重油。化石燃料是有限的非再生性资源。
全球经济对能量的需求增加也造成烃成本的压力增加。除了能量以外，许多工业，包括塑料和化学制造商，极度依赖于烃作为其制造过程的原料。当前供应来源的成本有效性替代物可以帮助缓和能量和这些原材料成本的不断增加的压力。为此目的，主要努力集中于通过成本有效性巩固的生物工艺进行高能燃料的微生物生产。然而，一些化石燃料生产的替代性方法，例如用于产生可燃性产物的以发酵为基础的方法，依赖于使用大量富含碳水化合物的原料，例如甘蔗、稻、玉米等。使用此类资源生产燃料具有增加原料市场压力、抬高全球食品供应价格的不良后果。
脂肪酸由长烷基链组成并且代表天然石油，其是细胞用于化学和能量储存功能的初级代谢产物。现今将这些富含能量的分子从植物和动物油分离，以便用于从燃料到油脂化学物范围内的多样产物集。更加可缩放、可控制并且经济合算的获得这类重要化学物的途径将有利于可再生能源的开发。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种产生脂质的方法，其中所述方法包括提供重组型微生物的培养物，其包括编码脱氢酶的非原生基因，和允许微生物在表达非原生基因的条件下增殖，其中培养物产生至少一种脂质。优选地，与由对照微生物的对照培养物产生的脂质的量相比，所述培养物产生更大量的脂质，其中除了对照微生物不表达编码非原生脱氢酶的基因以外，其在所有方面都与表达非原生脱氢酶基因的重组型微生物相同。与不表达非原生脱氢酶基因的对照微生物相比，表达编码脱氢酶的非原生基因并且产生脂质的重组型微生物可以具有更高的增殖速率。由重组型微生物产生的脂质可以是任何脂质，并且可以优选地是脂肪酸产物，例如脂肪酸、脂肪酸衍生物或三酸甘油酯。另外，重组型微生物可以包括另一非原生基因，其编码参与脂质的生物合成的多肽。表达非原生脱氢酶基因的重组型微生物可以在合适培养基，例如支持重组型微生物生长和/或增殖的培养基中培养。所述方法可以进一步包括从培养物分离至少一种脂质。
在某些方面，本文中还提供一种改良微生物的繁殖和/或增殖速率的方法，所述微生物产生脂质，其中所述方法包括在产生脂质的微生物中表达编码脱氢酶的重组型核酸分子，和在支持微生物繁殖的条件下培养微生物，其中微生物的繁殖和/或增殖速率大于对照微生物的繁殖和/或增殖速率，所述对照微生物在相同条件下培养并且除了不表达编码脱氢酶的重组型核酸分子以外，其在所有方面都与重组型微生物相同。另外，微生物可以包括至少一种额外的非原生基因，其中所述额外的非原生基因编码一或多种参与脂质合成的多肽。
由非原生基因或重组型核酸分子编码的脱氢酶可以是在氧化反应中使用NADP的脱氢酶。另外或或者，非原生基因可以编码相对于宿主微生物异源(来源于不同物种)或同源(来源于相同物种)的脱氢酶，并且在某些方面，非原生基因可以是经工程改造以便用于宿主微生物中的过表达的内源基因。在各种实例中，脱氢酶可以是醛脱氢酶(包括例如甲基丙二酸半醛脱氢酶或非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.9))、D-2-羟基酸脱氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶或苹果酸酶。举例来说，重组型微生物可以包括编码醛脱氢酶的非原生基因，在一些实例中，其可以包括与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。或者或另外，重组型微生物可以包括编码甲基丙二酸半醛脱氢酶的非原生基因，并且在一些实例中，可以是包括与SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：19的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的甲基丙二酸半醛脱氢酶。或者或另外，脱氢酶可以是D-2-羟基酸脱氢酶，并且在一些实例中，可以是包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的D-2-羟基酸脱氢酶。或者或另外，重组型微生物可以包括编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非原生基因。在一些实例中，6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
包括非原生脱氢酶基因的微生物可以是真菌、细菌或异长鞭毛体，并且可以是例如光合微生物，例如微藻(microalga)或藻青菌(cyanobacterium)。举例来说，微生物可以是微藻，其是弯杆藻属(Achnanthes)、茧形藻属(Amphiprora)、双眉藻属(Amphora)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、星胞藻属(Asteromonas)、黄金色藻属(Boekelovia)、包特氏菌属(Borodinella)、葡萄藻属(Botryococcus)、淡水小荀球藻属(Bracteococcus)、角毛藻属(Chaetoceros)、卡特藻属(Carteria)、衣藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿梭藻属(Chlorogonium)、小球藻属(Chlorella)、蓝隐藻属(Chroomonas)、金球藻属(Chrysosphaera)、球钙板藻属(Cricosphaera)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、隐藻属(Cryptomonas)、小环藻属(Cyclotella)、杜氏藻属(Dunaliella)、椭圆藻属(Ellipsoidon)、球石藻属(Emiliania)、独球藻属(Eremosphaera)、Ernodesmius、眼虫藻属(Euglena)、被剌藻属(Franceia)、脆杆藻属(Fragilaria)、丽丝藻属(Gloeothamnion)、红球藻属(Haematococcus)、嗜盐古菌(Halocafeteria)、膜胞藻属(Hymenomonas)、等鞭金藻属(Isochrysis)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微芒藻属(Micractinium)、单针藻属(Monoraphidium)、微球藻属(Nannochloris)、微拟球藻属(Nannochloropsis)、舟形藻属(Navicula)、新绿藻属(Neochloris)、肾鞭藻属(Nephrochloris)、肾藻属(Nephroselmis)、菱形藻属(Nitzschia)、棕鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属(Oedogonium)、卵囊藻属(Oocystis)、蚝球藻属(Ostreococcus)、巴夫藻属(Pavlova)、拟小球藻属(Parachlorella)、帕氏藻属(Pascheria)、褐指藻属(Phaeodactylum)、噬菌体属(Phagus)、混营性微藻属(Picochlorum)、扁藻属(Platymonas)、颗石藻属(Pleurochrysis)、肋球藻属(Pleurococcus)、原壁菌属(Prototheca)、假小球藻属(Pseudochlorella)、假新绿藻属(Pseudoneochloris)、塔胞藻属(Pyramimonas)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、栅列藻属(Scenedesmus)、裂衣藻属(Schizochlamydella)、骨条藻属(Skeletonema)、螺旋藻属(Spyrogyra)、裂丝藻属(Stichococcus)、四小球藻(Tetrachorella)、四鞭藻属(Tetraselmis)、海链藻属(Thalassiosira)、小球藻微藻(Viridiella)或团藻属(Volvox)物种。或者，微生物可以是藻青菌，并且可以是阿格藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、组囊藻属(Anacystis)、束丝藻属(Aphanizomenon)、节旋藻属(Arthrospira)、星球藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、眉藻属(Calothrix)、管孢藻属(Chamaesiphon)、拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、发毛针藻属(Crinalium)、藻青菌属(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、蓝螺菌属(Cyanospira)、蓝丝菌属(Cyanothece)、拟筒孢藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、包皮藻属(Dermocarpella)、侧生藻属(Fischerella)、夫列藻属(Fremyella)、盖特勒氏菌属(Geitleria)、吉特勒氏线状蓝细菌属(Geitlerinema)、粘杆菌属(Gloeobacter)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、英加藻属(lyengariella)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、湖丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、微囊藻属(Microcystis)、粘囊藻属(Myxosarcina)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、拟珠藻属(Nostochopsis)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮丝藻属(Planktothrix)、宽球藻属(Pleurocapsa)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、原绿丝蓝细菌属(Prochlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、胶须藻属(Rivularia)、裂须藻属(Schizothrix)、伪枝藻属(Scytonema)、螺旋藻属(Spirulina)、斯塔尼尔氏菌属(Stanieria)、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、真枝藻属(Stigonema)、束藻属(Symploca)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、单歧藻属(Tolypothrix)、束毛藻属(Trichodesmium)、灰线蓝细菌属(Tychonema)和异球藻属(Xenococcus)物种。
本发明的光合宿主微生物可以按光合自养方式(photoautotrophically)培养，以便产生脂质，例如使用无机碳作为培养基中实质上唯一的碳来源。可以在培养基中向微生物提供无机碳，例如可以在培养期期间向培养物供应CO2和/或碳酸。
包含编码脱氢酶的非原生基因的重组型微生物(其可以是光合微生物)可以进一步包括编码多肽的第二非原生基因，所述多肽参与脂质(例如脂肪酸产物或三酸甘油酯)的产生。作为非限制性实例，参与脂质产生的多肽可以是乙酰CoA羧化酶、丙二酰CoA：ACP转酰酶、β-酮酰基ACP合成酶、酰基ACP硫酯酶、酰基CoA硫酯酶、羟基苯甲酰基硫酯酶、具有解脂活性的多肽、酰基CoA合成酶、酰基CoA还原酶、酰基ACP还原酶、羧酸还原酶、蜡合成酶、脱羧酶、脱羰酶、甘油磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、磷脂酸磷酸酶(PA)或二酰基甘油O-酰基转移酶(DGAT)。重组型微生物可以产生例如脂肪酸、脂肪酸衍生物，例如脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烷烃或烯烃，或者可以产生三酸甘油酯，在特定实例中，其中任一种都可以是在微生物未经参与脂质产生的基因转型时不会天然产生的脂质。举例来说，重组型微生物可以包括编码硫酯酶的第二非原生基因，并且可以产生脂肪酸产物，例如游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。脂肪酸产物可以包括至少一个C8-C14，例如C12-C24，例如C12-C18的酰基链。
包括编码脱氢酶的第一非原生基因和编码参与脂质产生的多肽的第二非原生基因的重组型微生物与对照微生物相比可以具有更高的增殖速率，所述对照微生物除了不包括编码脱氢酶的非原生基因以外，在所有方面都与重组型微生物相同。举例来说，包括非原生脱氢酶基因和编码用于脂质生物合成的多肽的非原生基因的重组型微生物在培养期期间可以具有更高的增殖速率，在所述培养期期间，脱氢酶基因被表达并且重组型微生物产生脂质。重组型微生物可以是光合微生物，并且在特定实例中，当在其中重组型微生物产生至少一种脂质的光合自养条件下培养时，与不包括或不表达非原生脱氢酶基因的对照微生物相比可以具有更高的增殖速率，所述至少一种脂质是例如脂肪酸产物，其在某些实例中可以是并非由光合微生物天然产生的脂肪酸产物。
本文中还提供一种培养物，其包含合适培养基中的重组型光合微生物，其中重组型光合微生物包括编码脱氢酶的非原生基因和编码参与脂质产生的多肽的非原生基因，其中与由除了缺乏编码脱氢酶的非原生基因以外，其它所有方面都相同的微生物的相同培养物产生的脂质相比，所述培养物产生更大量的脂质。另外或或者，与除了缺乏编码脱氢酶的非原生基因以外，其它所有方面都相同的微生物的相同培养物达到的培养物密度相比，包括非原生脱氢酶基因的微生物的培养物在培养三天、四天、五天或六天后可以达到更高的光密度。培养物可以是光合自养培养物，例如其中培养基含有无机碳作为实质上唯一的碳源。与除了包含缺乏第一非原生基因的重组型微生物以外，其它所有方面都相同的培养物相比，所述培养物产生的脂肪酸、脂肪酸衍生物或三酸甘油酯可以多至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少700％或至少800％。
本文中的任一种方法中使用的重组型微生物可以包括编码如本文中公开的任何脱氢酶的非原生基因，例如脱氢酶可以是醛脱氢酶、D-2-羟基酸脱氢酶、非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶或苹果酸酶。举例来说，脱氢酶可以是醛脱氢酶，并且在一些实例中，可以与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性。或者或另外，微生物可以包括编码甲基丙二酸半醛脱氢酶的非原生基因，并且在一些实例中，可以是与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的甲基丙二酸半醛脱氢酶。或者或另外，微生物可以包括编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因，并且在一些实例中，可以是与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的D-2-羟基酸脱氢酶。或者或另外，微生物可以包括编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非原生基因。在一些实例中，6-磷酸葡糖酸脱氢酶与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQID NO：13的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性。
所述方法可以进一步包括从培养物分离至少一种脂质。可以从细胞、培养基或全部培养物分离脂质。本文中还提供一种通过本文中提供的任一种方法或重组型微生物产生的脂质。脂质可以是脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烷烃、烯烃、磷脂、半乳糖脂或三酸甘油酯中的任一种或任何组合。脂质可以包含至少一个含有8到24个碳原子，例如12到24个碳原子，例如12到18个碳原子的酰基链。
在一些方面，本发明涉及一种包含第一重组型核酸分子的重组型光合微生物，所述第一重组型核酸分子包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17至少50％一致的第一核苷酸序列，其中所述核酸分子编码脱氢酶。重组型光合微生物可以经工程改造以用于产生脂肪酸产物，并且可以至少包括编码参与脂质合成的多肽的第二重组型核酸分子或核苷酸序列。举例来说，光合微生物可以包括编码多肽的重组型核苷酸序列，所述多肽参与并非由光合微生物(其可以是例如藻青菌)天然地产生的游离脂肪酸、脂肪酸衍生物或三酸甘油酯的合成。举例来说，光合微生物可以包括编码酰基ACP硫酯酶的重组型核苷酸序列并且可以产生游离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在说明性实例中，酰基ACP硫酯酶可以是高等植物酰基ACP硫酯酶或其变异体，例如SEQ IDNO：21的酰基ACP硫酯酶。
在其它实例中，本发明提供一种包含非原生第一核酸分子的重组型微生物，所述非原生第一核酸分子包含编码醛脱氢酶或D-2-羟基酸脱氢酶的核苷酸序列，其中与除了缺乏外源第一核酸分子以外其它方面都相同的微生物相比，光合微生物产生更多的脂肪酸、脂肪酸衍生物或脂质。在一些实施例中，生物体进一步表达至少一种第二非原生核酸分子，所述至少一种第二非原生核酸分子编码选自由以下组成的群组的酶：非原生酰基ACP硫酯酶、酰基CoA硫酯酶、羟基苯甲酰基硫酯酶、酰基ACP还原酶、酰基ACP还原酶、蜡合成酶、脱羰酶、脱羧酶、乙酰CoA羧化酶、丙二酰CoA：ACP转酰酶、β-酮脂酰ACP合成酶、甘油磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或二酰基甘油O-酰基转移酶(DGAT)。另外，微生物可以产生微生物不会在不存在第二非原生核酸分子情况下产生的脂肪酸、脂肪酸衍生物或甘油酯。重组型微生物可以是光合微生物，并且在光合自养条件下，与除了缺乏第一核酸以外其它方面都相同的微生物相比可以产生更多的脂肪酸、脂肪酸衍生物或甘油酯。在一些方面，本发明涉及一种产生脂肪酸产物的方法，其包含将本发明的重组型光合微生物培养足以产生脂肪酸产物的时间量，所述重组型光合微生物包括编码醛脱氢酶或D-2-羟基酸脱氢酶的第一非原生基因并且包括编码参与脂肪酸、脂肪酸衍生物或脂质生物合成的多肽的第二非原生基因。脂肪酸产物可以是并非由光合微生物天然产生的产物。
还提供一种重组型光合微生物，其包含由异源启动子(即通常不调节磷酸葡糖酸脱氢酶基因的启动子)控制的同源磷酸葡糖酸脱氢酶基因。举例来说，磷酸葡糖酸脱氢酶基因可以可操作地连接于异源并且优选地可调节的启动子，并且可以整合于重组型微生物的基因组内的非原生基因座中。或者，可以将异源启动子插入宿主基因组中，变成可操作地连接于内源磷酸葡糖酸脱氢酶基因，使得内源磷酸葡糖酸脱氢酶可以在宿主微生物中过表达。在一些实施例中，细胞进一步表达包含第二核苷酸序列的第二核酸，所述第二核苷酸序列编码参与脂质(例如脂肪酸产物)产生的多肽，其中与除了不包括重组型磷酸葡糖酸脱氢酶基因以外其它方面都相同的微生物相比，磷酸葡糖酸脱氢酶基因的表达增加微生物的繁殖和/或增殖速率。
在一些实施例中，光合微生物是藻青菌。在一些实施例中，藻青菌选自由以下组成的群组：阿格藻属、鱼腥藻属、项圈藻属、组囊藻属、束丝藻属、节旋藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、藻青菌、蓝菌属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝丝菌属、拟筒孢藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、包皮藻属、侧生藻属、夫列藻属、盖特勒氏菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、粘杆菌属、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿藻属、原绿丝蓝细菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、伪枝藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔氏菌属、斯塔尔氏蓝细菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻属、单歧藻属、束毛藻属、灰线蓝细菌属和异球藻属。
本发明还提供一种通过光合微生物产生游离脂肪酸、脂肪酸衍生物或脂质的方法。所述方法可以包含在表达第一非原生核酸分子和第二核酸分子的条件下培养光合微生物以便产生至少一种脂肪酸或脂肪酸衍生物。任选地，光合微生物按光养方式培养。
通过过表达脱氢酶的微生物的培养物，与按相同方式培养的对照微生物的培养物的脂肪酸产物的产量相比，重组型微生物中编码脱氢酶的非原生基因的表达和编码用于脂质生物合成的多肽的基因的表达可以引起脂肪酸产物的产量增加，并且其中除了对照微生物缺乏非原生脱氢酶基因以外，其与非原生脱氢酶基因表达微生物实质上相同。在一些实施例中，由表达非原生脱氢酶基因和非原生脂质生物合成基因的微生物的培养物产生的游离脂肪酸、脂肪酸衍生物或甘油酯的量比由缺乏非原生脱氢酶基因的对照微生物的培养物产生的游离脂肪酸、脂肪酸衍生物或甘油酯多至少1％、至少5％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％或至少200％。微生物可以是光合微生物。
另外或或者，与除了缺乏非原生脱氢酶基因以外其它方面都相同的微生物中的NADPH与NADP+比率相比，重组型微生物中编码脱氢酶的非原生基因的表达和编码用于脂质生物合成的多肽的基因的表达可以提高NADPH与NADP+的细胞内比率。举例来说，在产生脂质的培养期期间，表达非原生脱氢酶基因和非原生脂质生物合成基因的细胞中的NADPH与NADP+比率可以比除了缺乏非原生脱氢酶基因以外其它方面都相同的对照微生物的NADPH与NADP+比率高至少1％、至少5％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％或至少200％。微生物可以是光合微生物。
此外，另外或或者，与除了缺乏非原生脱氢酶基因以外其它方面都相同的微生物的繁殖和/或增殖速率相比，重组型微生物中编码脱氢酶的非原生基因的表达和编码用于脂质生物合成的多肽的基因的表达可以增加经工程改造的微生物的繁殖速率和/或增殖速率。举例来说，所述繁殖速率或增殖速率可以比表达非原生脂质生物合成基因但不包括编码脱氢酶的非原生基因的对照微生物的繁殖速率和/或增殖速率高至少1％、至少5％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％或至少200％。举例来说，与除了不包括编码脱氢酶的非原生基因以外其它方面都相同的微生物的培养物所可以实现相比，包括编码脱氢酶的非原生基因和编码用于脂质生物合成的多肽的非原生基因的经工程改造的微生物的培养物在培养三天、四天、五天、六天或六天以上后可以实现更高的细胞密度。微生物可以是光合微生物。
由本发明的光合微生物产生的游离脂肪酸、脂肪酸衍生物或脂质的量可以是每升培养物至少290毫克、至少330毫克、至少370毫克、至少400毫克、至少500毫克、至少600毫克。另外，产生脂肪酸产物的方法可以进一步包含从光合微生物或生长培养基分离至少一种脂肪产物。
在另一方面，本发明提供一种经分离的核酸分子，其包含编码多肽序列的核酸序列，所述多肽序列包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29或其活性片段至少65％一致、至少75％一致、至少85％一致或至少95％一致的氨基酸序列。经编码的多肽可以具有脱氢酶活性，例如D-2-羟基酸脱氢酶活性。核酸分子可以进一步包含启动子，其可以相对于脱氢酶编码序列是异源，并且可以是可调节的，例如可诱导的。核酸分子可以在载体中提供。
附图说明
图1描绘由经工程改造的集胞藻属品系产生的全部游离脂肪酸。表达B10 ORF(“dehydrd”；SEQ ID NO：1)、NB8部分ORF片段(SEQ ID NO：5)、NB104 ORF(“6-P-de”；SEQ IDNO：9)和NB104 ORF完全contig片段(SEQ ID NO：8)以及CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因(SEQID NO：20)的集胞藻属品系与仅含有CclFatB1基因的对照品系相比产生更多量的游离脂肪酸。
图2描绘在六天生长结束时，经工程改造的集胞藻属PCC6803品系的光密度。用1mMIPTG诱导所有品系以便表达CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因和脱氢酶基因。黑色条柱表示仅表达酰基ACP硫酯酶的品系。图案化条柱表示含有识别为脱氢酶的经分离的基因以及酰基ACP硫酯酶基因的品系。
图3描绘野生型(WT)和经工程改造的集胞藻属品系的氧化还原状态。展示WT集胞藻属品系(“6803”)、酰基ACP硫酯酶表达品系(CclFatB1)以及共表达CclFatB1硫酯酶基因和脱氢酶基因的品系(CclFatB1+B10；CclFatB1+NB104)的NADPH/NADP+比率。D表示在培养物中的天数。
图4描绘产生展示6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因的NADPH的戊糖磷酸途径的一部分。
图5描绘诱导转基因的表达后六天，表达CcFatB1酰基ACP硫酯酶基因(黑色条柱)或共表达CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因和集胞藻属6-磷酸葡糖酸脱氢酶s110329基因(SEQID NO：12)(图案化条柱)的集胞藻属品系的游离脂肪酸(FFA)产生。在OD730＝5.0下诱导品系。
具体实施方式
光合生物体合成脂肪酸以便产生细胞膜并且使用来自CO2的固定碳以及也由光合作用产生的ATP和NADPH储存脂质。还可以通过脱氢酶的活性产生NADPH。本文中所用的术语“脱氢酶”是指通过将一或多种氢化物(H-)转移到受体(例如NAD+或NADP+)来催化底物氧化的酶。本发明提供重组型微生物，其表达至少一种编码脱氢酶的非原生基因并且产生一或多种脂质，例如一或多种脂肪酸、一或多种脂肪酸衍生物和/或一或多种甘油酯(例如一或多种三酸甘油酯)。在一些方面，重组型微生物与不表达编码脱氢酶的非原生基因的可比较微生物相比在产生脂质同时显示更好的增殖速率，并且此外，表达非原生脱氢酶基因的重组型微生物的培养物可以比对照微生物培养物产生更多的脂质，所述对照微生物除了不表达非原生脱氢酶基因以外，其它方面都与脱氢酶基因表达微生物相同。重组型微生物可以是重组型光合微生物。还提供通过提供包括至少一种编码脱氢酶的非原生基因的微生物的培养物来产生脂质的方法，其中所述培养物比除了微生物不包括编码脱氢酶的非原生基因以外其它方面都相同的培养物产生更多的脂质。微生物可以是光合微生物并且在一些实例中可以按光合自养方式培养。微生物可以另外包括一或多种编码参与脂质合成的多肽的非原生基因。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。在存在冲突的情况下，以本申请案(包括定义)为准。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。本文中提及的所有公开案、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入以用于所有用途，如同每一个别公开案或专利申请案特定地并且个别地指明以引用的方式并入一般。
下文中描述合适的方法和材料，但可以使用与本文中所描述类似或等效的方法和材料实践或测试本发明。材料、方法和实例仅为说明性并且不欲造成限制。本发明的其它特征和优点将由详细描述和权力要求书显而易见。
为了有助于对本发明的理解，下文定义多个术语和短语。
除非上下文另外明确指示，否则如本发明和权力要求书中所使用，单数形式“一”和“所述”包括复数形式。
当本文中使用语言“包含”描述实施例时，还提供根据“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其它类似实施例。
本文中如例如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。
术语“基因”广泛用于指编码多肽或经表达的RNA的核酸分子(典型地是DNA，但任选地是RNA)的任何区段。因此，基因包括编码经表达的RNA的序列(其可以包括多肽编码序列或例如功能性RNA，例如核糖体RNA、tRNA、反义RNA、微RNA、短发夹RNA、核糖酶等)。基因可以进一步包含其表达所需或影响其表达的调节序列，以及与其自然状态中的蛋白质或RNA编码序列相关联的序列，例如内含子序列、5′或3′非翻译序列等。基因可以从多种来源获得，包括从相关来源克隆或由已知或预测序列信息合成。
术语“核酸”或“核酸分子”是指DNA或RNA的区段(例如mRNA)，并且还包括具有经修饰的主链(例如肽核酸、经锁定的核酸)或经修饰或非天然存在的核碱基的核酸。核酸分子可以是双链或单链；包含基因或其一部分的单链核酸可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。
核酸分子可以“来源于”指定来源，其包括从指定来源分离(完全或部分)核酸区段。核酸分子还可以例如通过从指定聚核苷酸来源直接克隆、PCR扩增或人工合成，或者基于与指定聚核苷酸来源相关的序列而来源于指定来源。来源于特定来源或物种的基因或核酸分子还包括与源核酸分子相比具有序列修饰的基因或核酸分子。举例来说，来源于一种来源(例如特定参考基因)的基因或核酸分子与源基因或核酸分子相比可以包括一或多种非故意或故意引入的突变，并且如果一或多种突变(包括取代、缺失或插入)是故意引入的，那么可以通过细胞或核酸的随机或靶向突变、通过扩增或其它分子生物学技术或通过化学合成或其任何组合来引入序列变化。来源于编码功能性RNA或多肽的参考基因或核酸分子的基因或核酸分子可以编码与参考或源功能性RNA或多肽或其功能性片段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的功能性RNA或多肽。举例来说，来源于编码功能性RNA或多肽的参考基因或核酸分子的基因或核酸分子可以编码与参考或源功能性RNA或多肽或其功能性片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的功能性RNA或多肽。
如本文中所使用，“经分离”的核酸或蛋白质是从所述核酸或蛋白质在自然界中存在的天然背景或环境移出。举例来说，经分离的蛋白质或核酸分子是从与其原生或天然环境中相关的细胞或生物体移出。在一些情况下，经分离的核酸或蛋白质可以部分或实质上纯化，但无需特定纯化程度用于分离。因此，例如，经分离的核酸分子可以是从其在自然界中整合进入的染色体、基因组或游离基因体切除的核酸序列。
“经纯化”的核酸分子或核苷酸序列，或蛋白质或多肽序列实质上不含细胞物质和细胞组分。举例来说，经纯化的核酸分子或蛋白质可以不含除缓冲剂或溶剂以外的化学物质。“实质上不含”不欲指不可检测到除新颖核酸分子以外的其它组分。
术语“天然存在”和“野生型”是指在自然界中可见的形式。举例来说，天然存在或野生型核酸分子、核苷酸序列或蛋白质可以存在于天然来源中并且从其分离，并且未有意地通过人类操纵来修饰。
如本文中所使用，“衰减”意指数量、程度、强度或力度降低。衰减的基因表达可以指所述基因的转录或经编码的蛋白质的翻译、折叠或组装的量和/或速率显著减小。作为非限制性实例，衰减的基因可以是突变或分裂基因(例如通过部分或完全缺失或插入突变而分裂的基因)或具有由基因调节序列的变化而引起的表达降低。
“外源核酸分子”或“外源基因”是指已经引入(“转型”)到细胞中的核酸分子或基因。转型细胞可以称为重组型细胞，其中可以引入其它外源基因。如果经过核酸分子转型的细胞的后裔继承了外源核酸分子，那么其也称为“经转型”。与转型的细胞相比，外源基因可以来自不同物种(并且因此是“异源”)，或来自相同物种(并且因此是“同源”)。“内源”核酸分子、基因或蛋白质是原生核酸分子、基因或蛋白质，因为其存在于宿主中或由宿主天然产生。
本文中使用的术语“原生”是指天然存在于宿主中的核酸序列或氨基酸序列。本文中使用的术语“非原生”是指并非天然存在于宿主中的核酸序列或氨基酸序列。从细胞移出、经历实验室操纵和引入或再引入宿主细胞中的核酸序列或氨基酸序列视为“非原生”。引入宿主细胞中的合成或部分合成基因是“非原生”。非原生基因进一步包括可操作地连接于已经重组到宿主基因组中的一或多种异源调节序列的宿主微生物内源基因。
“重组型”或“经工程改造”的核酸分子是通过人类操纵改变的核酸分子。作为非限制性实例，重组型核酸分子包括任何满足以下条件的核酸分子：1)部分或完全体外合成或修饰，例如使用化学或酶促技术(例如使用化学核酸合成，或使用供核酸分子的复制、聚合、消化(外切核苷酸或内切核苷酸)、接合、反转录、转录、碱基修饰(包括例如甲基化)、整合或重组(包括同源和位点特异性重组)的酶)；2)包括并非在自然界中结合的经结合的核苷酸序列，3)使用分子克隆技术工程改造使得其与天然存在的核酸分子序列相比不含一或多种核苷酸，和/或4)使用分子克隆技术操纵使得其与天然存在的核酸分子序列相比具有一或多种序列变化或重排。作为非限制性实例，cDNA是重组型DNA分子，如通过体外聚合酶反应产生、连接有连接子或整合到载体(例如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。
如本文中所使用的术语“重组型蛋白质”是指通过遗传工程产生的蛋白质。
当应用于生物体时，术语重组型、工程改造或遗传工程改造是指通过将异源或外源重组型核酸序列引入生物体中来操纵，并且包括基因剔除、靶向突变和基因置换、启动子置换、缺失或插入，以及将转基因或合成基因引入生物体中。重组型或经遗传工程改造的生物体也可以是其中引入用于基因“阻断”的构筑体的生物体。此类构筑体包括(但不限于)RNAi、微RNA、shRNA、siRNA、反义物和核糖酶构筑体。还包括基因组通过大范围核酸酶或锌指核酸酶的活性改变的生物体。可以将外源或重组型核酸分子整合到重组型/经遗传工程改造的生物体基因组中，或在其它情况下不整合到重组型/经遗传工程改造的生物体基因组中。如本文中所使用，“重组型微生物”或“重组型宿主细胞”包括本发明的重组型微生物的子代或衍生物。因为子代或衍生物中可能由于突变或环境影响而存在某些修饰，因此事实上，所述后代可能与母细胞不相同，但仍属于如本文中使用的术语的范围内。
术语“启动子”是指能够结合细胞中的RNA聚合酶并且起始下游(3′方向)编码序列的转录的核酸序列。启动子包括以可检测的高于背景的程度起始转录所必需的最小数目的碱基或元件。启动子可以包括转录起始位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域(共同序列)。真核启动子通常(但不总是)含有“TATA”框和“CAT”框。原核启动子可以含有-10和-35原核启动子共同序列。所属领域中已熟知来自多种不同来源的大量启动子，包括组成性、可诱导和可抑制启动子。代表性来源包括例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且来自这些来源的合适启动子可以容易地获得，或者可以基于在线公共可用序列按合成方式产生，或例如来自保存中心(例如ATCC)以及其它商业或个人来源。启动子可以是单向(在一个方向起始转录)或双向(在任一方向起始转录)。启动子可以是组成性启动子、可抑制启动子或可诱导启动子。启动子的非限制性实例包括例如T7启动子、细胞巨大病毒(CMV)启动子、SV40启动子和RSV启动子。可诱导启动子的实例包括lac启动子、pBAD(araA)启动子、Tet启动子(美国专利第5,464,758号和第5,814,618号)和蜕皮激素启动子(诺(No)等人，国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(1996)93(8)：3346-3351)。
当关于聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶使用时，术语“异源”是指来自或来源于除宿主生物体物种以外的来源的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相反，本文中使用“同源”聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶表示来源于宿主生物体物种的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。当提及用于保持或操纵基因序列(例如启动子、5′非翻译区、3′非翻译区、多聚腺苷酸加成序列、内含子序列、剪接位点、核糖体结合位点、内部核糖体进入序列、基因组同源区、重组位点等)的基因调节序列或辅助核酸序列时，“异源”意指调节序列或辅助序列并非与如下基因天然相关，调节或辅助核酸序列与所述基因在构筑体、基因组、染色体或游离基因体中并置。因此，可操作地连接于在其自然状态下(即在未经遗传工程改造的生物体的基因组中)并非可操作地连接的基因的启动子在本文中称为“异源启动子”，纵使启动子可以与所连接的基因来源于相同物种(或在一些情况下，相同生物体)。
如本文中所使用，术语“蛋白质”或“多肽”意图涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指任何具有两个或两个以上氨基酸的链，并且并非指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其它用于指具有两个或两个以上氨基酸的链的术语都包括在“多肽”的定义内并且术语“多肽”可以替代任何这些术语或与其互换地使用。
本申请案通过由国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation；NCBI)维护的长期认可并且广泛参考的数据库中使用的标识来公开和指代核酸和多肽。寄存编号(本文中通常在基因或物种名称后的括号中提供)是由美国国家卫生研究院(the United States National Institutes of Health)维护的国家生物技术信息中心网站(ncbi.nlm.nih.gov)上公开可用的序列记录的唯一标识。“基因信息标识”(GI)序列识别号对核苷酸或氨基酸序列是特定的。如果序列按任何方式变化，那么将指定新的GI编号。可使用序列修订历史(Sequence Revision History)工具追踪特定GenBank记录中呈现的序列的各种GI编号、版本号和更新日期。例如细胞生物学、生物化学、分子生物学和分子遗传学领域中已熟知基于寄存编号和GI编号搜寻和获得核酸或基因序列或蛋白质序列。
如本文中所使用，关于核酸或多肽序列的术语“一致性百分比”或“同源性”定义成在比对序列以达到最大一致性百分比和视需要引入空隙以获得最大同源性百分比后，候选序列中与已知多肽相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。N末端或C末端插入或缺失不应视为影响同源性，并且多肽序列中内部缺失和/或插入少于约30个、少于约20个或少于约10个氨基酸残基不应视为影响同源性。
可以使用由经改编以用于序列相似性搜寻的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用的演算法，通过基本局部比对搜寻工具(Basic Local AlignmentSearch Tool；BLAST)分析来测定核苷酸或氨基酸序列程度上的同源性或一致性(阿特休尔(Altschul)(1997)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25，3389-3402，和卡林(Karlin)(1990)，美国国家科学院院刊87，2264-2268)。由BLAST程序使用的方法首先考虑查询序列与数据库序列之间的类似区段(具有或不具有空隙)，接着评估所识别的所有匹配物的统计显著性，和最终仅概述满足预定显著性临限值的那些匹配物。关于序列数据库的相似性搜寻中的基本问题的论述，参见阿特休尔(1994)，自然遗传学(Nature Genetics)6，119-129。直方图、说明、比对、预期(即用于报道针对数据库序列的匹配物的统计显著性临限值)、截止、矩阵和过滤器(低复杂性)的搜寻参数可以是默认设置值。由blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认计分矩阵是BLOSUM62矩阵(赫尼科夫(Henikoff)(1992)，美国国家科学院院刊89，10915-10919)，推荐用于长度超过85(核苷酸碱基或氨基酸)的查询序列。
对于经设计以用于比较核苷酸序列的blastn，通过M(即一对匹配残基的得分)与N(即错配残基的罚分)的比率来设定计分矩阵，其中M和N的默认值可以分别是+5和-4。四个blastn参数可以调节如下：Q＝10(空隙产生罚分)；R＝10(空隙延伸罚分)；wink＝1(沿查询在每个winkth位置产生字命中)；和gapw＝16(设定其中产生空隙比对的窗口宽度)。用于氨基酸序列比较的等效Blastp参数设定可以是：Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。可以在GCG套装10.0版中进行的序列之间的Bestfit比较可以使用DNA参数GAP＝50(空隙产生罚分)和LEN＝3(空隙延伸罚分)，并且蛋白质比较中的等效设定可以是GAP＝8和LEN＝2。
因此，当提及本发明的多肽或核酸序列时，包括与全长多肽或核酸序列或其片段(包含整个蛋白质的至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个或150个以上氨基酸残基的连续序列)；此类序列的变异体(例如其中至少一个氨基酸残基插入到含有插入和取代的所公开序列的N末端和/或C末端和/或内部)具有至少65％、70％、75％、80％或85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列一致性的序列标识。所涵盖的变异体可以另外或或者包括含有通过例如同源重组或定点或PCR诱变引起的预定突变的变异体，以及其它物种的相应多肽或核酸，包括(但不限于)本文中所描述的多肽或核酸、含有插入和取代的多肽或核酸家族的等位基因或其它天然存在的变异体；和/或其中多肽由含有插入和取代的除天然存在氨基酸以外的部分(例如可检测部分，例如酶)通过取代、化学、酶促或其它合适手段共价修饰的衍生物。
如本文中所使用，短语“保守性氨基酸取代”或“保守性突变”是指一个氨基酸由另一个具有共同性质的氨基酸置换。定义个别氨基酸之间的共同性质的功能性方式是分析同源生物体的相应蛋白质之间的氨基酸变化的经校正的频率(舒尔兹(Schulz)(1979)蛋白质结构原理(Principles of Protein Structure)，施普林格出版社(Springer-Verlag))。根据此类分析，可以定义氨基酸群，其中群内的氨基酸优先彼此交换，并且因此在其对整体蛋白质结构的影响方面彼此类似性最大(舒尔兹(1979)蛋白质结构原理，施普林格出版社)。以此方式定义的氨基酸群的实例包括：“带电/极性群”，包括Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His；“芳香族或环状群”，包括Pro、Phe、Tyr和Trp；以及“脂肪族群”，包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys。在每个群内，还可以识别子群。举例来说，带电/极性氨基酸群可以再划分成子群，包括：“带正电子群”，包含Lys、Arg和His；“带负电子群”，包含Glu和Asp；和“极性子群”，包含Asn和Gln。在另一个实例中，芳香族或环状群可以再划分成子群，包括：“氮环子群”，包含Pro、His和Trp；和“苯基子群”，包含Phe和Tyr。在另一个实例中，脂肪族群可以再划分成子群，包括：“大型脂肪族非极性子群”，包含Val、Leu和Ile；“脂肪族轻微极性子群”，包含Met、Ser、Thr和Cys；和“小型残基子群”，包含Gly和Ala。保守性突变的实例包括以上子群内氨基酸的氨基酸取代，例如(但不限于)：Lys取代Arg或反之亦然，使得可以保持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，使得可以保持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，使得可以保持游离-OH；以及Gln取代Asn或反之亦然，使得可以保持游离-NH2。“保守性变异体”是一种多肽，其包括一或多个经具有共同性质的氨基酸(例如属于上述相同氨基酸群或子群)取代以置换参考多肽(例如具有公开案或序列数据库中公开的序列或具有通过核酸定序测定的序列的多肽)中的一或多个氨基酸的氨基酸。
如本文中所使用，“表达”包括至少在RNA产生程度上的基因表达，并且“表达产物”包括经表达的基因的所得产物，例如多肽或功能性RNA(例如核糖体RNA、tRNA、反义RNA、微RNA、shRNA、核糖酶等)。术语“表达增加”包括有助于mRNA产生增加和/或多肽表达增加的基因表达变化。“产量增加”包括与多肽的原生产量或酶活性相比，多肽表达量增加、多肽的酶活性水平增加或两者的组合。
术语“分泌”包括通过本发明的重组型微生物或方法产生的多肽或脂肪酸产物移动到周质间隙或细胞外环境。“分泌增加”包括分泌超过天然存在的分泌量，例如与天然存在的分泌水平相比高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，或至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或1000％以上。
本文中包括工程改造微生物(其中在微生物或宿主细胞内“插入”，例如添加、整合、并入或引入某些核酸分子或特定聚核苷酸序列)以便影响微生物中基因的表达的方面。举例来说，可以通过定点同源重组对相关微生物进行工程改造，以便将特定相关基因(具有或不具有表达控制序列，例如启动子)插入特定基因组基因座中，或将启动子插入宿主微生物的基因座中，从而影响基因座处特定基因或基因集的表达。
本发明的其它方面包括特定聚核苷酸序列的表达的部分、实质或完全缺失、沉默、失活或下调。可以使基因部分、实质上或完全删除、沉默、失活，或可以下调其表达，以便影响其编码的多肽的活性，例如酶的活性。可以通过插入核酸序列来使基因部分、实质上或完全删除、沉默、失活或下调，所述核酸序列中断基因的功能和/或表达(例如病毒插入、转位子诱变、大范围核酸酶工程改造、同源重组或所属领域中已知的其它方法)。术语“消除(eliminate/elimination)”和“剔除”可以与术语“缺失”、“部分缺失”、“实质上缺失”或“完全缺失”互换使用。在某些实施例中，可以通过定点同源重组以剔除特定的相关基因来对相关微生物进行工程改造。在其它实施例中，可以使用RNAi或反义DNA(asDNA)构筑体来使特定的相关基因部分、实质上或完全沉默、失活或下调。
某些核酸分子或特定聚核苷酸序列的这些插入、缺失或其它修饰可以理解成涵盖“遗传修饰”或“转型”，使得微生物或宿主细胞的所得品系可以理解成“经遗传修饰”或“经转型”。
如本文中所使用，“上调(up-regulated/up-regulation)”包括相关基因或核酸分子的表达或酶活性的增加，例如与除了未上调外其它方面都相同的基因或酶的表达或活性相比，基因表达或酶活性增加。
如本文中所使用，“下调(down-regulated/down-regulation)”包括相关基因或核酸分子的表达或酶活性的降低，例如与除了未下调外其它方面都相同的基因或酶的表达或活性相比，基因表达或酶活性降低。
术语“Pfam”是指由Pfam财团维护并且可以在若干个受赞助的万维网站获得的蛋白质结构域和蛋白质家族的大型集合，所述网站包括：pfam.sanger.ac.uk/(韦尔科姆信托(Welcome Trust)，桑格研究院(Sanger Institute))；pfam.sbc.su.se/(斯德哥尔摩生物信息中心(Stockholm Bioinformatics Center))；pfam.janelia.org/(珍利亚农场(Janelia Farm)，霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute))；pfam.jouy.inra.fr/(国家农业研究所(Institut national de la RechercheAgronomique))；和pfam.ccbb.re.kr。Pfam的最新版本是以UniProt蛋白质数据库15.6版、Swiss-Prot 57.6版与TrEMBL 40.6版的组合为基础的Pfam 26.0(2011年11月)。Pfam结构域和家族使用多重序列比对和隐马尔可夫模型(hidden Markov model；HMM)来识别。Pfam-A家族或结构域分配是使用蛋白质家族的代表性成员和以种子比对为基础的剖面隐马尔可夫模型通过人工注解的种子比对产生的高质量分配。(除非另有说明，否则查询蛋白质与Pfam结构域或家族的匹配是Pfam-A匹配。)接着使用属于家族的所有识别序列自动产生家族的完全比对(索哈默(Sonnhammer)(1998)核酸研究(Nucleic Acids Research)26，320-322；贝特曼(Bateman)(2000)核酸研究26，263-266；贝特曼(2004)核酸研究32，数据库问题(Database Issue)，D138-D141；菲恩(Finn)(2006)核酸研究数据库问题34，D247-251；菲恩(2010)核酸研究数据库问题38，D211-222)。通过例如使用任一种上述参考网站读取Pfam数据库，可以使用HMMER同源性搜寻软件(例如HMMER2、HMMER3或更高版本，hmmer.janelia.org/)针对HMM查询蛋白质序列。将所查询的蛋白质识别为属于pfam家族(或具有特定Pfam结构域)的显著匹配是其中二进制分数大于或等于Pfam结构域的采集临限值的匹配。还可以使用期望值(e值)作为Pfam中是否包含查询的蛋白质的准则或用于测定查询的蛋白质是否具有特定Pfam结构域，其中低e值(远小于1.0，例如小于0.1，或小于或等于0.01)表示匹配归因于偶然性的机率较低。
如本文中所使用，“长链长度”脂肪酸或酰基ACP是具有多于14个碳的链长的脂肪酸或酰基ACP，并且“中链长度”脂肪酸或酰基ACP是具有8到14个碳的链长的脂肪酸或酰基ACP。
“底物偏好”是指酶作用活性最高的底物。举例来说，对于从ACP裂解特定长度的脂肪酸，不同酰基ACP硫酯酶可以具有不同程度的链长特异性，有时称为酶“偏好”，并且硫酯酶典型地在裂解一种特定链长脂肪酸方面活性最大，而在裂解一或多种其它链长脂肪酸方面活性较低。
如本文中所使用，术语“脂肪酸产物”包括游离脂肪酸；单酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯；脂肪醛；脂肪醇；脂肪酸酯(包括(但不限于)蜡酯)；和烃(包括(但不限于)烷烃和烯烃)。
本文中可互换使用的“繁殖速率”或“复制速率”通常在微生物中通过测量既定培养物的倍增时间来测量。用于测量微生物的繁殖速率的方法在所属领域中是熟知的。举例来说，可以在时间周期内获取光密度(OD)测量值以便测量繁殖(细胞数目增加)或增殖(细胞数目增加以及细胞尺寸和/或细胞内含物增加)速率。或者，可以使用血球计或类似装置测定悬浮液中微生物的浓度，以便测定既定体积培养物中的细胞浓度。通过在多个时间获取多个数据点，可以评估培养物中细胞的繁殖或复制速率。一段时期内培养物密度增加(例如通过OD测量)表示繁殖和/或增殖。
用于产生脂肪酸产物的代谢途径
由本文中公开的重组型微生物产生的脂质可以是脂肪酸产物，包括游离脂肪酸；和来源于脂肪酸和/或并有由细胞产生的脂肪酸的酰基链的产物，包括(但不限于)：单酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯；脂肪醛；脂肪醇；脂肪酸酯(包括(但不限于)蜡酯)；和烃(包括(但不限于)烷烃和烯烃)。脂肪酸生物合成途径(在原核生物以及真核藻类和高等植物的叶绿体中是高保守性)从中心代谢物乙酰CoA开始。脂肪酸生物合成通过由乙酰CoA羧化酶(ACC酶)催化的乙酰CoA向丙二酰CoA的转化起始。接着通过丙二酰CoA-ACP转酰酶(大肠杆菌(E.coli)中的FabD)催化，丙二酰CoA转化成丙二酰ACP。接着通过酶复合物脂肪酸合成酶(FAS)催化，丙二酰ACP转化成酰基ACP。脂肪酸合成酶复合物通过首先使丙二酰ACP与乙酰ACP缩合(由β-酮脂酰ACP合成酶III(例如大肠杆菌的FabH)催化)来起始延长循环。由FabH反应形成的β-酮脂酰ACP(3-酮脂酰ACP)由3-酮脂酰ACP还原酶(例如FabG)还原成β-羟基酰基ACP(3-羟基酰基ACP)。接着β-羟基酰基ACP受到β-羟基酰基ACP脱水酶(例如FabA、FabZ)作用以形成反-2-烯酰基ACP，其又由烯酰基ACP还原酶(例如FabI、FabK、FabL)还原以形成延长2个碳的酰基ACP产物。后续循环由催化丙二酰ACP与酰基ACP的缩合的β-酮脂酰ACP合成酶I或II(例如FabB或FabF)起始。重复缩合、还原、脱水和还原的循环，其中每个循环添加两个来自丙二酰ACP的碳，直到酰基链通过转酰酶转移到另一个分子(例如3-磷酸甘油)或通过硫酯酶(例如叶绿体中的FatA或FatB)从ACP裂解，以便形成游离脂肪酸。
与植物叶绿体不同，蓝藻细菌不产生游离脂肪酸，并且与大肠杆菌和其它异养细菌不同，蓝藻细菌不产生酰基CoA(卡兹马克(Kaczmarzyk)和弗尔达(Fulda)(2010)植物生理学(Plant Physiol.)152：1598-1610)。在脂肪酸延长(其中酰基链共价结合于酰基载体蛋白质)后，蓝藻细菌的酰基转移酶将酰基链转移到甘油主结构以产生膜脂质。
为了在微生物(例如(但不限于)藻青菌)中产生游离脂肪酸，可以在微生物中表达外源或重组型硫酯酶基因，例如(但不限于)编码酰基ACP硫酯酶的基因、编码酰基CoA硫酯酶的基因或编码羟基苯甲酰基硫酯酶的基因。为了在微生物中产生脂肪酸衍生物，例如脂肪醇、脂肪醛、蜡酯、烷烃或烯烃，可以将一或多种酶引入宿主细胞中，所述一或多种酶将酰基-硫酯中间物(例如酰基CoA或酰基ACP)转化成所需最终产物(例如醇、醛、烷烃、烯烃或蜡酯)，任选地与编码硫酯酶的外源或重组型基因和任选地编码酰基CoA合成酶的外源基因组合。举例来说，如果脂肪醛和/或烷烃是所需最终产物，那么可以引入编码形成醛的脂肪醛还原酶(例如形成醛的酰基CoA还原酶，1.2.1.42或1.2.1.50；也参见美国专利第6,143,538号)的基因以将酰基CoA还原成脂肪醛；另外或或者，可以引入形成醛的酰基ACP还原酶(例如WO 2009/140696或WO 2011/066137中公开)或羧酸还原酶基因(参见例如WO 2010/135624和WO 2010/042664)以将游离脂肪酸还原成脂肪醛。或者或另外，可以引入编码脂肪醇氧化酶(例如1.1.3.20)或脂肪醇脱氢酶(例如1.1.1.164)的基因以将脂肪醇转化成脂肪醛。可以任选地通过引入编码脂肪醛脱羰酶(例如4.1.99.5)的基因将脂肪醛进一步加工成烷烃。如果脂肪醇、烯烃和/或蜡酯是所需最终产物，那么可以将编码形成醇的脂肪酰基还原酶(例如形成醇的酰基CoA还原酶，1.2.1.50)的基因引入宿主细胞中。此外，可以引入脂肪醛还原酶基因以将脂肪醛还原成脂肪醇。可以通过引入一或多种编码脂肪醇脱水酶的基因将脂肪醇进一步加工成烯烃。可以通过引入编码多肽的基因来形成脂肪酸酯，包括蜡酯，所述多肽催化醇与脂肪酰基硫酯的缩合(例如酰基转移酶和蜡合成酶)。
在一些实例中，酰基ACP向脂肪醇的转化可以通过脂肪醛的合成进行，其中宿主细胞中表达的酰基还原酶(例如形成醛的酰基CoA还原酶或形成醛的酰基ACP还原酶)首先将酰基ACP还原成脂肪醛。举例来说，在某些实施例中，宿主细胞可以工程改造以过表达形成内源脂肪醛的还原酶(例如通过在形成脂肪醛的还原酶基因附近插入启动子和/或增强子转录控制元件)。在其它实施例中，宿主细胞可以经工程改造以表达形成外源脂肪醛的还原酶。宿主细胞可以进一步包括编码脂肪醛还原酶或乙醇脱氢酶的外源基因，所述脂肪醛还原酶或乙醇脱氢酶将脂肪醛还原成脂肪醇。
可以通过引入编码蜡酯合成酶的基因以催化脂肪醇与脂肪酰基硫酯的缩合来形成蜡酯。蜡酯合成酶可以是例如EC 2.3.1.26(长链醇O-脂肪酰基转移酶)、EC 2.3.1.20(二酰基甘油酰基转移酶)、EC 2.3.1.51(酰基转移酶)或2.3.1.75(蜡酯合成酶/酰基CoA二酰基甘油酰基转移酶)类别的酶。
对于产生甘油酯，例如单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯(“TAG”)，本文中公开的包括编码脱氢酶的非原生基因的重组型微生物可以进一步包括编码酶的非原生基因，所述酶参与甘油酯的产生，包括(但不限于)甘油磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或二酰基甘油O-酰基转移酶(DGAT)。
脱氢酶
本发明提供一种重组型微生物，其包括编码脱氢酶的非原生基因并且产生至少一种脂肪酸产物。举例来说，本文中公开的重组型微生物可以用包含编码脱氢酶的核酸序列的经分离的核酸分子转型。或者或另外，重组型微生物可以包括编码脱氢酶的内源核酸序列，其中将至少一个调节序列插入微生物的基因组中以调节内源脱氢酶基因的表达。另外，微生物可以用一或多种外源基因转型，和/或可以经工程改造以过表达一或多种内源基因，所述一或多种内源基因参与脂质(例如脂肪酸产物)的产生。
可以在本文中公开的重组型微生物中表达的脱氢酶包括(但不限于)醛脱氢酶(包括醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)、丁二酸-半醛脱氢酶(EC 1.2.1.16)、甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC1.2.1.27)、乳醛脱氢酶(EC 1.2.1.22)、苯甲醛脱氢酶(EC 1.2.1.28)、非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.9)、NADP依赖性(磷酸化)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.13)、δ-1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(EC 1.5.1.12)、乙醛脱氢酶(EC：1.5.1.10)和谷氨酸半醛脱氢酶(EC：1.5.1.41))、2-羟基酸脱氢酶(例如异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丁二酸脱氢酶、α酮戊二酸脱氢酶)、D-2-羟基酸脱氢酶(例如D-2-羟基异己酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、D-甘油酸脱氢酶、万古霉素(vancomycin)抗性蛋白质H、D-2-磷酸甘油酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶(1.1.1.28))、苹果酸酶(1.1.1.40)、葡糖-6-磷酸脱氢酶(1.1.1.49)、6-磷酸葡糖酸脱氢酶(1.1.1.43、1.1.1.44)、谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶。在多种实例中，由本发明的微生物中引入或过表达的非原生基因编码的脱氢酶不是醇脱氢酶。在其它实例中，由本发明的微生物中引入或过表达的非原生基因编码的脱氢酶可能不是丙酮酸脱氢酶或磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.12)。用于脱氢酶活性的分析法在所属领域中是熟知的(例如薇妮(Wynn)等人(1997)脂质(Lipids)32：605-610；葛劳纳(Graupner)等人(2000)细菌学杂志(J.Bacteriol.)182：3688-3692；贝瑞斯-瑞夫纳(Berrios-Rivera)等人(2002)代谢工程(Metabolic Engineering)4：217-229；信田(Shinoda)等人(2005)生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)280：17068-17075；多梅内克(Domenech)和费热(Ferrer)(2006)生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)1760：1667-1674；骆(Lo)和陈(Chen)(2010)分子生物技术(Mol.Biotechnol)46：157-167)。
尤其关注产生NADPH的脱氢酶，但也考虑将产生NADH的脱氢酶用于本发明的方法和微生物中。举例来说，可以通过NADPH：NAD+氧化还原酶(B特异性)(有时称为NADPH-NAD+转氢酶)在细胞中将NADH转化成NADPH(参见例如US 2005/0196866)，所述NADPH：NAD+氧化还原酶可以对宿主细胞是原生性，或可以将编码NADPH-NAD+转氢酶的基因引入宿主微生物中。
苹果酸酶(EC 1.1.1.40)(也称为苹果酸脱氢酶(草酰乙酸脱羧)(NADP(+))或NADP-苹果酸酶，其催化苹果酸向丙酮酸的不可逆脱羧作用，同时将NADP+还原成NADPH)是可以通过非原生基因的表达在重组型宿主细胞中产生的脱氢酶的实例。编码苹果酸酶的非原生基因可以来源于任何生物体，并且可以对于宿主微生物是异源或同源的。可以由本文中公开的微生物中的非原生基因编码的苹果酸酶的非限制性实例包括募集到PfamPF00390(苹果酸酶，N末端结构域)的多肽，其二进制分数大于采集截止19.2，和/或募集到Pfam PF03949(苹果酸酶NAD结合域)的多肽，其二进制分数高于采集截止23.5。苹果酸酶的晶体结构已由杨(Yang)等人(蛋白质科学(Protein Sci.)11：332-341(2002))报道。苹果酸酶的非限制性实例包括来自卷枝毛霉(Mucor circinelloides)(ABM45933、AAO26053.1)、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)(XP_002290550)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)(XP_002177890)、绿色鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus)(XP_001420849)、蓖麻(Ricinus communis)(XP_002526507)、稻(Oryza sativa)(NP_001064998)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AEE36294)、变异小球藻(Chlorellavariabilis)(EFN53662)、智人(Homo sapiens)(NP_002386)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)(XP_001696240)、集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC 6803(BAA16663)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)(YP_001655800)和‘厚壁孢子念珠藻(Nostocazollae)’(YP_003720944)的酶。不构成限制，由本文中提供的微生物中的非原生基因编码的苹果酸酶可以是具有苹果酸酶活性的多肽，其与这些苹果酸酶或序列数据库中列举的其它序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性；其保守性变异体；以及其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。举例来说，本文中提供的重组型微生物可以包括编码多肽的非原生基因，所述多肽包括与识别为苹果酸酶的多肽或其活性片段具有至少95％一致性的氨基酸序列。
葡糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)是通过戊糖磷酸途径产生NADPH的酶，其可以通过本文中提供的微生物中非原生基因的表达来产生。编码葡糖-6-磷酸的基因可以来源于植物、动物或微生物，包括真菌、异长鞭毛体、海藻、细菌或藻青菌。举例来说，脱氢酶可以是募集到Pfam PF00479“葡糖-6-磷酸脱氢酶，NAD结合域”的多肽，其二进制分数大于采集截止21.7，和/或可以募集到Pfam PF02781“葡糖-6-磷酸脱氢酶，C末端结构域”，其二进制分数大于采集截止19.5。可以由本文中提供的微生物表达的葡糖-6-磷酸脱氢酶的非限制性实例包括集胞藻属PCC 6803(BAA17451)、聚球藻属BL107(ZP_01468297)、海洋原绿球藻品系(Prochlorococcus marinus str.)AS9601(YP_001009571)、鞘丝藻属(Lyngbya sp.)PCC 8106(ZP_01620414)、假微型海链藻CCMP1335(EED92550)、微单胞藻属(Micromonassp.)RCC299(XP_002508505)；金牛贩球菌(Ostreococcus tauri)(XP_003079573)、大豆(Glycine max)(XP_003533032)、葡萄(Vitis vinifera)(XP_002266930)、日本粳稻(Oryzasativa Japonica Group)(AAQ02671)、小家鼠(Mus musculus)(NP_000393；NP_032088)和智人(NP_000393)的葡糖-6-磷酸脱氢酶。不构成限制，可以由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因表达的葡糖-6-磷酸脱氢酶可以是具有葡糖-6-磷酸脱氢酶活性的多肽，其与这些葡糖-6-磷酸脱氢酶或序列数据库中列举的其它序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性，包括其保守性变异体，并且可以是其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。举例来说，本文中提供的重组型微生物可以包括编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的非原生基因，所述葡糖-6-磷酸脱氢酶与识别为葡糖-6-磷酸脱氢酶的多肽或其活性片段具有至少95％一致性。
另一种通过戊糖磷酸途径产生NADPH的酶是6-磷酸葡糖酸脱氢酶。如本文中所使用的“磷酸葡糖酸脱氢酶”或“6-磷酸葡糖酸脱氢酶”(EC 1.1.1.43或EC 1.1.1.44)是指催化6-磷酸葡糖酸在NADP+存在下脱羧还原成核酮糖-5-磷酸的酶。作为催化结果，NADP+还原成NADPH。本发明包括重组型微生物，其包括编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非原生基因和优选地至少另一种编码用于产生脂质的蛋白质的基因。由本发明的重组型微生物表达的6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以来自植物、动物或微生物，包括真菌、异长鞭毛体、海藻、细菌或藻青菌。如本文中所公开，编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非原生基因的表达可以增强宿主微生物的脂肪酸生物合成。可以适用于本文中公开的微生物和方法中的磷酸葡糖酸脱氢酶包括募集到Pfam PF03446“6-磷酸葡糖酸脱氢酶的NAD结合域”(采集截止值21.0)并且优选地募集到Pfam PF00393“6-磷酸葡糖酸脱氢酶，C末端结构域”(采集截止值20.4)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶。6-磷酸葡糖酸脱氢酶的晶体结构已经公开(例如亚当(Adams)等人(1994)结构(Structure)2：651-658)。可以由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因编码的磷酸葡糖酸脱氢酶的实例包括(但不限于)集胞藻属PCC6803(BAA10105)、蓝丝菌属(Cyanothece sp.)PCC 7822(ADN14972)、厚壁孢子念珠藻0708(ADI63566)、聚球藻属PCC7002(YP_001733490)、拟南芥(AED94705)、大豆(BAA22812)、欧洲赤松(Pinus sylvestris)(ADP03060)、家蚕(Bombyx mori)(gb DAA21283)、温带牛(Bos taurus)(DAA21283)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(AAA53637)、土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624(EAU33612)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)SP-BS293(EFL69841)、大肠杆菌(AAG35237)和其变异体的6-磷酸葡糖酸脱氢酶。另外或或者，本文中公开的微生物可以包括编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非原生基因，所述酶包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。具有与SEQ ID NO：10的多肽具有同源性的氨基酸序列的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非限制性实例包括肉食杆菌属(Carnobacterium sp.)AT7(ZP_02185894)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶、阴道厌氧球菌(Anaerococcus vaginalis)ATCC 51170(ZP_05473398)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)(ZP_05646912)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052(YP_001309315)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶样蛋白质。具有与SEQ ID NO：13的多肽具有同源性的氨基酸序列的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非限制性实例包括蓝丝菌属PCC 8801(YP_002372435)、铜绿微囊藻NIES-843(YP_001656536)、聚球藻属PCC 7002(YP_001733490)、钝顶节旋藻品系(Arthrospira platensis str.)Paraca(ZP_06383632)、念珠藻属PCC 7120(NP_489315)、颤藻属PCC 6506(ZP_07110168)和细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-1(NP_681366)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶。不构成限制，可以由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因表达的6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以是具有磷酸葡糖酸脱氢酶活性的多肽，其与上述磷酸葡糖酸脱氢酶或公开案或序列数据库中列举的其它序列(包括所识别的磷酸葡糖酸脱氢酶的保守性变异体)具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性，并且包括N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。在一些情况下，适用于本发明的核酸分子可以编码与本文中提供的或在序列数据库中识别的6-磷酸葡糖酸脱氢酶具有至少95％序列一致性的6-磷酸葡糖酸脱氢酶或其N末端和/或C末端截短型变异体(例如缺乏参考酶的叶绿体运输肽或者具有参考酶中不存在的附加叶绿体运输肽的6-磷酸葡糖酸脱氢酶)、其保守性变异体或其修饰性变异体。
如实例中证明，编码醛脱氢酶的非原生基因也可以在本发明的重组型微生物中表达以改良重组型微生物的脂质产生。“醛脱氢酶”在本文中是指催化醛氧化成羧酸的酶。适用于本文中公开的微生物和方法中的醛脱氢酶包括募集到Pfam PF00171“醛脱氢酶家族”(采集截止值23.0)的醛脱氢酶，并且包括EC 1.2.1.3的醛脱氢酶、丁二酸半醛脱氢酶(EC1.2.1.16)、甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)、乳醛脱氢酶(EC 1.2.1.22)、苯甲醛脱氢酶(EC 1.2.1.28)、非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.9)、NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.13)、δ-1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(EC 1.5.1.12)、乙醛脱氢酶(EC：1.5.1.10)和谷氨酸半醛脱氢酶(EC：1.5.1.41)。醛底物可以是例如乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、异戊醛、苯甲醛、甘油醛-3-磷酸或另一种醛。醛脱氢酶的晶体结构的实例提供于迪科斯坦佐(Di Costanzo)等人(2007)分子生物学366：481-493中。适用于本发明的微生物和方法中的醛脱氢酶可以是能够使用NADP+作为辅因子的醛脱氢酶(参见例如骆和陈(2010)分子生物技术46：157-167)。醛脱氢酶的非限制性实例包括地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(YP_089937)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)SIC1(YP_688823)、大肠杆菌(NP_287888)、酿酒酵母(NP_015264)、智人(NP_000680)、小家鼠(AAB32754)的醛脱氢酶，和变异链球菌(Streptococcus mutans)(Q59931)、玉米(Zeamays)(NP_001105589)和豌豆(Pisum sativum)(P81406)的NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。另外或或者，本文中公开的包括编码醛脱氢酶的非原生基因的微生物可以编码多肽，所述多肽包括与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有同源性的醛脱氢酶的实例包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)物种的醛脱氢酶，包括(但不限于)苏云金芽孢杆菌柏林亚种(Bacillus thuringiensis serovar berliner)(ZP_041101108)；苏云金芽孢杆菌IBL 200(ZP_04070879)；苏云金芽孢杆菌IBL 4222(ZP_04064201)；苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(servovar kurstaki)(ZP_04113863)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10876(ZP_04316482)、苏云金芽孢杆菌华中亚种(serovarhuazhongensis)(ZP_04083445)、蜡样芽孢杆菌(ZP_03228808)、蜡样芽孢杆菌172560W(ZP_04305164)、细胞毒素芽孢杆菌(Bacillus cytotoxicus)NVH 391-98(YP_001374327)；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WSH-002(AEN89990)；蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)Rock3-17(ZP_04156127)、蜡样芽孢杆菌AH621(ZP_04293977)和苏云金芽孢杆菌品系Al Hakam(YP_894009)的醛脱氢酶。不构成限制，可以由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因表达的醛脱氢酶可以是具有醛脱氢酶活性的多肽，其包括与任一种上述醛脱氢酶或公开案或序列数据库中列举的其它序列或其活性片段具有至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，包括所识别的醛脱氢酶的保守性变异体，并且包括N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。在一些情况下，适用于本发明中的核酸分子可以编码醛脱氢酶，所述醛脱氢酶与本文中提供或序列数据库中识别的醛脱氢酶具有至少95％序列一致性；或其N末端和/或C末端截短型变异体。
在一些情况下，由宿主微生物中引入或过表达的基因编码的醛脱氢酶可以是甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)。甲基丙二酸半醛脱氢酶的晶体结构见于杜伯格(Dubourg)等人(2004)晶体学报D生物晶体(Acta Crystallogr D.Biol.Crystallogr.)60：1435-1437。甲基丙二酸半醛脱氢酶的非限制性实例包括褐家鼠(Rattus norvegicus)(AAA41638)；绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(AAA25891)；智人(CAB76468)；热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)C56-YS93(YP_004588333)；弹尾属(Hanseniella sp.)‘Han2’(ACY45298)；蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(XP_003608372)；拟南芥(AEC06286)；鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)6014059(ZP_08442960)；和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)PR4(BAH34663)的甲基丙二酸半醛脱氢酶。或者或另外，本文中公开的包括编码醛脱氢酶的非原生基因的微生物可以编码甲基丙二酸半醛脱氢酶，所述甲基丙二酸半醛脱氢酶包含与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。与SEQ ID NO：18或SEQID NO：19具有同源性的甲基丙二酸半醛脱氢酶的非限制性实例包括萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)1942(YP_003975426；ADP34495)、地衣芽孢杆菌ATCC 14580(YP_081323；AAU25685)、树枝形类芽孢杆菌(Paenibacillus dendritiformis)C454(ZP_09676636)、土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)HPL-003(YP_005075546；AET59323)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16(YP_173925；BAD62964)、单核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)FSL F2-208(EFR85827)、李斯特菌(Listeria marthii)FSLS4-120(ZP_07869657；EFR88847)和酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)LAA1(ZP_03495181；EED06125)的甲基丙二酸半醛脱氢酶。不构成限制，由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因编码的醛脱氢酶可以是具有甲基丙二酸半醛脱氢酶活性的多肽，其与这些甲基丙二酸半醛脱氢酶中的任一种或序列数据库中列举的其它序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性；其保守性变异体；以及其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。举例来说，适用于本发明中的核酸分子可以编码甲基丙二酸半醛脱氢酶，所述甲基丙二酸半醛脱氢酶与本文中引用的多肽或公开案或序列数据库中识别的另一种醛脱氢酶或其活性片段具有至少95％序列一致性。
或者或另外，本文中公开的微生物可以包括编码醛脱氢酶的非原生基因，所述醛脱氢酶是非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(E.C.1.2.1.9)，也称为NADP+需求型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(非磷酸化)。非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶的晶体结构提供于洛伦岑(Lorentzen)等人(2004)分子生物杂志(J.Mol.Biol.)341：815-828中。可以由本文中提供的微生物中的重组型核酸分子编码的非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶的非限制性实例包括来源于拟南芥(NP_180004)、变异小球藻(EFN50637)、大豆(XP_003549550)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)(XP_003574540)、双色高粱(Sorghum bicolor)(XP_002444416)、玉米(ACF84575)、莱茵衣藻(XP_001753784)、绿色鞭毛藻(XP_001418445)、蜡样芽孢杆菌(ZP_04196022.1)和江南卷柏(Selaginella moellendorffii)(XP_002981587.1)的非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶。不构成限制，由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因编码的非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶可以是具有非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的多肽，其与这些非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶中的任一种或序列数据库中列举的其它序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性，包括其保守性变异体并且包括其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。举例来说，适用于本发明中的核酸分子可以编码非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶，所述非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶与本文中提供的多肽或N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体或序列表或数据库中识别的另一种非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其活性片段具有至少85％或至少90％序列一致性。在一些情况下，适用于本发明中的核酸分子可以编码醛脱氢酶，所述醛脱氢酶与本文中提供或序列表或数据库中识别的多肽具有至少95％序列一致性。
可以通过本文中提供的重组型微生物中的非原生基因的表达产生的另一种脱氢酶是D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶(D-2-羟基酸脱氢酶)，例如D-2-羟基异己酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、D-甘油酸脱氢酶、万古霉素抗性蛋白质H、D-2-磷酸甘油酸脱氢酶或D-乳酸脱氢酶。如本文中所使用的“D-2-羟基酸脱氢酶”是指催化α-羟基羧酸氧化成α-酮羧酸(例如乳酸酯化合物氧化成丙酮酸酯化合物)的酶。在所述过程中。NAD(P)+经还原产生NAD(P)H。尽管许多D-2-羟基酸脱氢酶偏好NAD+作为辅因子，但发现其它D-2-羟基酸脱氢酶使用NADP+作为辅因子(多梅内克和费热(2006)生物化学与生物物理学报1760：1667-1674)。D-2-羟基酸脱氢酶的晶体结构的实例可见于登格勒(Dengler)等人(1997)分子生物杂志267：640-660。适用于本文中公开的微生物和方法中的D-2-羟基酸脱氢酶包括募集到Pfam PF02826“D-2-羟基酸脱氢酶家族”(采集截止值25.1)的D-2-羟基酸脱氢酶。D-2-羟基酸脱氢酶的非限制性实例包括地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)(ABB30004)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(AAB05626)、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)ATCC43049(AAV47467)、芽孢杆菌属2 A 57 CT2(ZP_08008412)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS2096(ABF36015.1)、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)NC8(EHS81987.1)、金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcusaureus subsp.aureus)S0385(CAQ50990.1)、豌豆根瘤菌三叶草生物型(Rhizobiumleguminosarum bv.trifolii)WSM2304(ACI57766.1)、点形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATCC 29133(YP_001869125)、微单胞藻属RCC299(ACO70365)、三角褐指藻CCAP 1055/1(XP_002183675)、金牛贩球菌(XP_003081992)和埃及伊蚊(Aedes aegypti)(EAT43121)的D-2-羟基酸脱氢酶，以及粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(CAC1825)的甲酸脱氢酶。或者或另外，本文中公开的包括编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因的微生物可以包括编码多肽的非原生基因，所述多肽包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。举例来说，本文中提供一种包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码具有脱氢酶活性的多肽，所述多肽包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：2或SEQID NO：29具有至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。或者，本文中提供的核酸分子可以包括编码具有脱氢酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包括与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29具有同源性的D-2-羟基酸脱氢酶的非限制性实例包括多型浅黄SL003B-26A1(Polymorphum gilvum SL003B-26A1)(YP_004302702)、丛集斯塔普氏菌(Stappia aggregata)IAM 12614(ZP_01545666；EAV45595)、海单胞菌属(Marinomonas sp.)MWYL1(YP_001342133、ABR72198)、亚历山大拉布伦茨氏菌(Labrenziaalexandrii)DFL-11(ZP_05115584、EEE46183)；食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)SPH-1(YP_001566649、ABX38264)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)CCGE1001(YP_004230861；ADX57801)、类球红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)ATCC 17029(YP_001044959；ABN78187)、类球红杆菌ATCC 17025(YP_001168251；ABP70946)、类球红杆菌WS8N(ZP_08415419；EGJ20215)、类球红杆菌KD131(YP_002520541；ACM03468)和伯克氏菌属Ch1-1(ZP_06839743；EFG72573)的D-2-羟基酸脱氢酶。不构成限制，由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因编码的D-2-羟基酸脱氢酶可以是具有D-2-羟基酸脱氢酶活性的多肽，其与这些非磷酸化D-2-羟基酸脱氢酶中的任一种或序列数据库中列举的其它序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性，包括其保守性变异体并且包括其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。举例来说，适用于本发明中的核酸分子可以编码D-2-羟基酸脱氢酶，所述D-2-羟基酸脱氢酶包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29或本文中引用的多肽具有至少85％或至少90％序列一致性，或与公开案或序列数据库中识别的另一种D-2-羟基酸脱氢酶或其活性片段具有至少85％或至少90％序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下，适用于本发明中的核酸分子可以编码D-2-羟基酸脱氢酶，所述D-2-羟基酸脱氢酶与本文中提供或序列数据库中识别的多肽具有至少95％序列一致性。在一些情况下，适用于本发明中的核酸分子可以编码D-2-羟基酸脱氢酶，所述D-2-羟基酸脱氢酶包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
其它适用于本文中的重组型微生物和方法中的D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶包括与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有同源性的D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶，例如(但不限于)拜氏梭菌NCIMB 8052(YP_001309316)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)EG2(ZP_05648199)；酪黄肠球菌ATCC 12755(ZP_08145011)；肉食杆菌属AT7(ZP_02185893)；和屎肠球菌(Enterococcus faecium)E1636(ZP_06695345)的D-2-羟基酸脱氢酶。不构成限制，由本文中提供的经工程改造的微生物中的非原生基因编码的D-2-羟基酸脱氢酶可以是具有D-2-羟基酸脱氢酶活性的多肽，其与这些非磷酸化D-2-羟基酸脱氢酶中的任一种或公开案或序列数据库中列举的其它序列具有至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性，包括其保守性变异体并且包括其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。举例来说，适用于本发明中的核酸分子可以编码D-2-羟基酸脱氢酶，所述D-2-羟基酸脱氢酶包括与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或序列表或数据库中识别的另一种D-2-羟基酸脱氢酶或其活性片段具有至少85％或至少90％序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下，适用于本发明中的核酸分子可以编码D-2-羟基酸脱氢酶，所述D-2-羟基酸脱氢酶与本文中提供或序列数据库中识别的多肽具有至少95％序列一致性。在一些情况下，适用于本发明中的核酸分子可以编码D-2-羟基酸脱氢酶，所述D-2-羟基酸脱氢酶包括与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
或者或另外，本文中提供的重组型微生物中可以表达异柠檬酸脱氢酶基因。可以由本发明的微生物表达的异柠檬酸脱氢酶的实例包括(但不限于)昆虫雷基拉菌候选种(Candidatus Regiella insecticola)LSR1(EFL92794)；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)CDC1551(AAK47786)；蟑螂杆状体属(Blattabacterium sp.)(点刻隐尾蠊(Cryptocercus punctulatus))品系Cpu(AEU09317)；固氮滋养密螺旋体(Treponemaazotonutricium)ZAS-9(AEF80142)；伪中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)ED99(ADX76379)；多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)E681(ADM69426)；大肠杆菌IHE3034(ADE91794)；嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)ATCC 23270(ACK80956)；贝纳特氏立克次体(Coxiella burnetii)RSA 331(ABX78669)；类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)1106a(ABO05966)；鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)NCTC 10247(ABO05966)；鼻疽伯克氏菌NCTC 10229(ABN02935)；鼻疽伯克氏菌SAVP1(ABM52803)；鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)104(ABK66771)；和嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila)ATCC7966(ABK38368)的异柠檬酸脱氢酶。在一些情况下，适用于本发明中的核酸分子可以编码异柠檬酸脱氢酶，所述异柠檬酸脱氢酶与本文中提供或序列数据库中识别的多肽具有至少85％、至少90％或至少95％序列一致性，包括其保守性变异体和其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。
作为非限制性实例，可以由非原生核酸分子编码的谷氨酸脱氢酶可以包括头带冰鱼(Chaenocephalus aceratus)(P82264)、温带牛(NP 872593)、拟南芥(NP_197318)、蒺藜苜蓿(XP_003618972)、变异小球藻(EFN57943)、莱茵衣藻(XP_001702270)、波罗的海红小梨形菌(Rhodopirellula baltica)SH 1(NP_867538)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacterracemifer)DSM 44963(ZP_06967738)或玫瑰弯菌属(Roseiflexus sp.)RS-1(YP_001276062)的谷氨酸脱氢酶，或与本文中提供或序列数据库中识别的多肽具有至少85％、90％或95％序列一致性的谷氨酸脱氢酶，包括其保守性变异体和/或其N末端和/或C末端截短型或修饰型变异体。
微生物和宿主细胞
本发明提供一种重组型微生物，其表达编码脱氢酶的非原生基因，其中重组型微生物产生脂质，其中表达脱氢酶的重组型微生物的培养物与对照培养物相比产生更大量的脂质，所述对照培养物除了其微生物不包括编码脱氢酶的非原生基因以外与表达脱氢酶的微生物的培养物相同。重组型微生物可以进一步包括至少另一种用于产生脂质的非原生基因，例如编码用于产生脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或甘油酯的酶的非原生基因。在一些实例中，包括编码脱氢酶的非原生基因和编码参与脂质合成的多肽的非原生基因的微生物与对照微生物相比具有更高的繁殖和/或增殖速率，除对照微生物不包括编码脱氢酶的非原生基因以外，其与表达非原生脱氢酶基因和编码参与脂质产生的多肽的非原生基因的微生物在所有方面都相同。举例来说，与对照微生物实现的细胞密度相比，本文中公开的包括编码脱氢酶的非原生基因和编码用于脂质(例如脂肪酸产物)合成产生的多肽的非原生基因的重组型微生物的培养物在培养三天、四天、五天、六天或六天以上后可以实现更高的细胞密度，除对照微生物不包括编码脱氢酶的非原生基因以外，其与表达非原生脱氢酶基因和编码参与脂质产生的多肽的非原生基因的微生物在所有方面都相同。举例来说，表达非原生脱氢酶基因和编码参与脂质产生的多肽的非原生基因的重组型微生物的培养物与缺乏非原生脱氢酶基因的对照微生物培养物相比，在产生脂质(例如脂肪酸产物)的培养条件下可以实现更高的细胞密度。脂肪酸产物可以是不由宿主微生物天然产生的脂质(即，不由缺乏参与脂质产生的非原生基因的宿主微生物产生)。
本发明的重组型微生物或宿主细胞可以是原核或真核起源，包括(但不限于)真菌、异长鞭毛体、藻类、真细菌、太古细菌、绿色非硫细菌、紫色非硫细菌或蓝藻细菌。重组型宿主细胞可以是(但不限于)光合生物。光合生物包括高等植物(即维管束植物)、苔藓植物、藻类和光合细菌。术语“藻类”包括蓝藻细菌(蓝藻纲(Cyanophyceae))、绿藻类(greenalgae)(绿藻纲(Chlorophyceae))、黄绿藻类(yellow-green algae)(黄藻纲(Xanthophyceae))、金色藻类(golden algae)(金藻纲(Chrysophyceae))、褐藻类(brownalgae)(褐藻纲(Phaeophyceae))、红藻类(red algae)(红藻纲(Rhodophyceae))、硅藻属(diatoms)(硅藻纲(Bacillariophyceae))和“微微型浮游生物(pico-plankton)”(真绿藻纲(Prasinophyceae)和真眼点藻纲(Eustigmatophyceae))。术语藻类中还包括分类学甲藻纲(Dinophyceae)、隐藻纲(Cryptophyceae)、裸藻纲(Euglenophyceae)、灰色藻纲(Glaucophyceae)和普林藻纲(Prymnesiophyceae)的成员。微藻类是只有在显微镜的帮助下才能看到的呈单一生物体形式的单细胞或群落藻类。微藻类包括真核生物和原核生物藻类(例如蓝藻细菌)。
用于本发明的藻类包括(但不限于)微藻类，例如(但不限于)弯杆藻属、茧形藻属、双眉藻属、纤维藻属、星胞藻属、黄金色藻属、包特氏菌属、葡萄藻属、淡水小荀球藻属、角毛藻属、卡特藻属、衣藻属、绿球藻属、绿梭藻属、小球藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐甲藻属、隐藻属、小环藻属、杜氏藻属、椭圆藻属、球石藻属、独球藻属、Ernodesmius、眼虫藻属、被剌藻属、脆杆藻属、丽丝藻属、红球藻属、嗜盐古菌、膜胞藻属、等鞭金藻属、鳞孔藻属、微芒藻属、单针藻属、微球藻属、微拟球藻属、舟形藻属、新绿藻属、肾鞭藻属、肾藻属、菱形藻属、棕鞭藻属、鞘藻属、卵囊藻属、蚝球藻属、巴夫藻属、拟小球藻属、帕氏藻属、褐指藻属、噬菌体属、混营性微藻属、扁藻属、颗石藻属、肋球藻属、原壁菌属、假小球藻属、假新绿藻属、塔胞藻属、桑椹藻属、栅列藻属、裂衣藻属、骨条藻属、螺旋藻属、裂丝藻属、四小球藻、四鞭藻属、海链藻属、小球藻微藻或团藻属物种。举例来说，宿主微生物可以是硅藻属，并且可以选自由双眉藻属、角毛藻属、小环藻属、脆杆藻属、舟形藻属、褐指藻属或海链藻属组成的群组的属。或者，在一些实例中，宿主品系可以是微绿球藻(eustigmatophyte)，例如微拟球藻属或椭圆藻属或绿藻的物种，例如(但不限于)小球藻属、绿梭藻属、假小球藻属、栅列藻属或四鞭藻属的物种。
或者，重组型微生物可以是蓝藻细菌物种。迄今已将超过三十种藻青菌基因组完全定序，包括例如各种蓝藻菌(Acaryochloris)、节旋藻属、藻青菌属、蓝丝菌属、粘杆菌属、微囊藻属、念珠藻属、原绿球藻属、聚球藻属、集胞藻属和嗜热聚球藻属物种的基因组，并且使用分子生物技术操纵许多藻青菌物种，包括例如藻青菌瘦鞘丝藻属品系BL0902、鱼腥藻属(念珠藻属)PCC 7120、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)ATCC 29413、点形念珠藻ATCC29133、念珠藻属PCC 7422、集胞藻属PCC 6803、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942、细长聚球藻PCC 7002等(他顿(Taton)等人(2012)PLoS One第7卷，第1期e30910；罗芬(Ruffing)(2011)生物工程微生物(Bioengineered Bugs)2：136-149)。作为非限制性实例，本文中提供的重组型微生物可以是以下蓝藻细菌属中的任一种：阿格藻属、鱼腥藻属、项圈藻属、组囊藻属、束丝藻属、节旋藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、藻青菌属、蓝菌属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝丝菌属、拟筒孢藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、包皮藻属、侧生藻属、夫列藻属、盖特勒氏菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、粘杆菌属、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球菌属、原绿藻属、原绿丝蓝细菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、伪枝藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔氏菌属、斯塔尔氏蓝细菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻属、单歧藻属、束毛藻属、灰线蓝细菌属和异球藻属物种。举例来说，重组型光合微生物可以是聚球藻属、集胞藻属或嗜热聚球藻属物种。或者，重组型光合微生物可以是蓝菌属、蓝丝菌属或藻青菌物种，或者，重组型光合微生物可以是粘杆菌属、鞘丝藻属或瘦鞘丝藻属物种。
重组型微生物可以包括编码本文中公开的任何脱氢酶的非原生基因。在一些实例中，微生物表达编码产生NADPH的脱氢酶的非原生基因，所述酶例如NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(非磷酸化)(EC 1.2.1.9)、苹果酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶或6-磷酸葡糖酸脱氢酶。或者或另外，重组型微生物可以表达编码醛脱氢酶、甲基丙二酸半醛脱氢酶或D-2-羟基酸脱氢酶的基因。在特定实例中，本文中提供的重组型微生物可以包括非原生核酸分子，其包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列一致性的氨基酸序列，其可操作地连接于异源启动子。
举例来说，重组型微生物可以包括编码戊糖磷酸途径的脱氢酶(例如葡糖-6-磷酸脱氢酶或6-磷酸葡糖酸脱氢酶，例如本文中公开的任何脱氢酶)的非原生基因。6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以来源于任何原核或真核的生物体，并且可以例如来自与宿主微生物相同的物种，其中非原生基因可以是通过对可操作地连接于内源6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因的启动子进行遗传工程改造而过表达的引入的基因或内源基因。或者或另外，6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或其活性片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的氨基酸序列。或者或另外，6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以包括与SEQID NO：13或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：13或其活性片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的氨基酸序列。除编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非原生基因之外，宿主微生物可以进一步包括至少另一种非原生基因，其编码参与脂质生物合成(例如脂肪酸产物合成)的多肽。包括非原生6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因和非原生脂质生物合成基因的重组型宿主微生物的培养物与对照微生物的培养物所产生相比可以产生更高量的脂肪酸产物，所述对照微生物除不包括非原生6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因以外在所有方面都与重组型宿主微生物相同。另外，与对照微生物相比，重组型宿主微生物在产生脂肪酸产物的培养条件下可以具有更高的繁殖和/或增殖速率和/或可以实现更高的细胞密度，所述重组型微生物包括编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的非原生基因和编码参与脂肪酸产物合成的多肽的非原生基因。在特定实例中，由重组型微生物的培养物产生的更高量的脂质是脂肪酸产物，其不会由微生物在不存在用于脂质产生的非原生基因的表达的情况下产生。
在其它实例中，重组型微生物可以包括编码醛脱氢酶(包括(但不限于)本文中公开的任一者)的非原生基因。醛脱氢酶可以来源于任何原核或真核的生物体，并且可以例如来自与宿主微生物相同的物种，其中非原生基因可以是通过对可操作地连接于内源醛脱氢酶基因的启动子进行遗传工程改造而过表达的引入的基因或内源基因。在各种说明性实例中，醛脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，醛脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：4、SEQID NO：6或SEQ ID NO：7具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的氨基酸序列。包括编码醛脱氢酶的非原生基因的宿主微生物可以进一步包括另一种非原生基因，其编码参与脂质生物合成(例如脂肪酸产物合成)的多肽。包括非原生醛脱氢酶基因和非原生脂质生物合成基因的重组型宿主微生物的培养物与对照微生物的培养物所产生相比可以产生更高量的脂肪酸产物，所述对照微生物除不包括非原生醛脱氢酶基因以外在所有方面都与重组型宿主微生物相同。另外，与对照微生物相比，重组型宿主微生物在产生脂肪酸产物的培养条件下可以具有更高的繁殖和/或增殖速率和/或可以实现更高的细胞密度，所述重组型微生物包括编码醛脱氢酶的非原生基因和编码参与脂肪酸产物合成的多肽的非原生基因。在特定实例中，由重组型微生物产生的更高量的脂质是脂肪酸产物，其不会由微生物在不存在编码用于脂质产生的多肽的非原生基因的表达的情况下产生。
举例来说，醛脱氢酶可以是甲基丙二酸半醛脱氢酶，并且宿主微生物可以包括编码甲基丙二酸半醛脱氢酶(例如(但不限于)本文中公开的任一者)的非原生基因。举例来说，甲基丙二酸半醛脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性的氨基酸序列。在一些实例中，宿主微生物可以包括编码甲基丙二酸半醛脱氢酶的非原生基因，所述甲基丙二酸半醛脱氢酶与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
在其它实例中，重组型微生物可以包括编码D-2-羟基酸脱氢酶(例如(但不限于)本文中公开的任一者)的非原生基因。D-2-羟基酸脱氢酶可以来源于任何原核或真核的生物体，并且可以来自与宿主微生物相同的物种，其中非原生基因可以是例如通过对可操作地连接于内源D-2-羟基酸脱氢酶基因的启动子进行遗传工程改造而过表达的引入的基因或内源基因。在各种实例中，微生物包括编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因，所述D-2-羟基酸脱氢酶包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，D-2-羟基酸脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29具有至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在其它实例中，微生物包括编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因，所述D-2-羟基酸脱氢酶包括与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，D-2-羟基酸脱氢酶可以包括与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的氨基酸序列。包括编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因的宿主微生物可以进一步包括另一种非原生基因，其编码参与脂质生物合成(例如脂肪酸产物合成)的多肽。包括非原生D-2-羟基酸脱氢酶基因和非原生脂质生物合成基因的重组型宿主微生物的培养物与对照微生物的培养物所产生相比可以产生更高量的脂肪酸产物，所述对照微生物除不包括非原生D-2-羟基酸脱氢酶基因以外在所有方面都与重组型宿主微生物相同。另外，与对照微生物相比，包括编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因和编码参与脂肪酸产物合成的多肽的非原生基因的重组型宿主微生物在产生脂肪酸产物的培养条件下可以具有更高的繁殖和/或增殖速率和/或可以实现更高的细胞密度。在一些实例中，由重组型微生物产生的更高量的脂质可以是脂肪酸产物，其不会由微生物在不存在编码用于脂质产生的多肽的非原生基因的表达的情况下产生。
在特定的非限制性实例中，包含编码脱氢酶的非原生基因和另一种非原生基因的重组型微生物可以是重组型光合微生物，所述另一种非原生基因编码参与通常不由微生物产生(例如在未用编码参与脂肪酸产物产生的多肽的非原生基因转型时，不由用作宿主微生物的微生物的物种或品系产生)的脂肪酸产物的产生的多肽，其中重组型光合微生物的培养物与对照培养物所产生相比产生更大量的脂肪酸产物，对照培养物除其重组型光合微生物不包括或不表达编码脱氢酶的非原生基因以外，其与重组型光合微生物的培养物在所有方面都相同。举例来说，宿主微生物可以是无法天然产生例如游离脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯(例如脂肪酸烷基酯)或蜡酯的真核微藻类物种，其中经过脱氢酶基因和用于产生脂肪酸产物的基因转型的重组型宿主微生物能够产生游离脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、烷烃、烯烃、脂肪酸酯或蜡酯中的一或多者。或者，宿主微生物可以是无法天然产生例如游离脂肪酸、脂肪醇、烷烃、烯烃、脂肪酸酯、蜡酯或三酸甘油酯的蓝藻细菌物种，其中经过脱氢酶基因和用于产生脂肪酸产物的基因转型的重组型宿主微生物能够产生游离脂肪酸、脂肪醛、烷烃、烯烃、脂肪酸酯、蜡酯或三酸甘油酯中的一或多者。
包括编码脱氢酶的非原生基因和编码参与脂质产生的多肽的非原生基因的光合微生物的培养物与除了缺乏编码脱氢酶的非原生基因以外其它方面都相同的光合微生物的培养物相比，优选地产生更大量的脂肪酸产物。举例来说，包括编码脱氢酶的非原生基因和编码参与脂质产生的多肽的非原生基因的光合微生物的光合自养培养物与除了缺乏编码脱氢酶的非原生基因以外其它方面都相同的光合微生物的光合自养培养物相比，优选地可以产生更大量的脂肪酸产物。另外或或者，重组型光合微生物的培养物可以在光合自养条件下实现更高的细胞密度，同时产生脂质，例如使用无机(未还原)碳作为碳源用于产生脂肪酸产物。
用于产生脂肪酸产物的遗传修饰
本文中提供的重组型微生物可以经工程改造以产生脂质，例如脂肪酸、脂肪酸衍生物(例如脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烷烃或烯烃)或甘油酯(例如三酸甘油酯)。举例来说，重组型微生物可以包括至少一种非原生基因，其编码以下各者中的一或多者：酰基ACP硫酯酶、酰基CoA硫酯酶、羟基苯甲酰基硫酯酶、具有解脂活性的多肽、酰基ACP还原酶、酰基CoA还原酶、羧酸还原酶、蜡合成酶、脱羰酶、脱羧酶、甘油磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(脱氢酶)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或二酰基甘油O-酰基转移酶(DGAT)。
在各种非限制性和说明性实例中，包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物可以包括例如酰基ACP硫酯酶、酰基CoA硫酯酶、羟基苯甲酰基硫酯酶和具有解脂活性的多肽中的一或多者，以用于产生游离脂肪酸或用于从脂肪酸产生脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烷烃或烯烃。重组型微生物可以包括例如编码酰基ACP硫酯酶(例如本文中公开的任何硫酯酶，例如高等植物FatB硫酯酶)的非原生基因。在一说明性实例中，微生物可以包括编码萼距花属(Cuphea)酰基ACP硫酯酶或其变异体(例如SEQ ID NO：21的酰基ACP硫酯酶)的非原生基因。重组型微生物可以是微藻，例如藻青菌。
或者或另外，包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物可以包括用于产生脂肪醛的非原生酰基还原酶基因，以及任选地将脂肪醛转化成烷烃的脱羰酶。形成醛的酰基还原酶可以是酰基ACP还原酶或酰基CoA还原酶。此外，或者或另外，包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物可以包括用于产生脂肪醇的酰基还原酶基因，以及任选地将脂肪醇转化成蜡酯的蜡合成酶。形成醇的酰基还原酶可以是酰基ACP还原酶或酰基CoA还原酶。蜡合成酶可以任选地是能够使用酰基ACP作为底物的蜡合成酶。重组型微生物可以进一步包括酰基CoA合成酶，或在其中酶(例如酰基还原酶和/或蜡合成酶或酰基转移酶)能够使用酰基ACP作为底物的实例中，可以不包括编码酰基CoA合成酶的非原生基因。在特定实例中，用于产生脂肪酸衍生物的重组型微生物是藻青菌物种，其不天然地包括编码酰基CoA合成酶或酰基ACP硫酯酶中的任一者的基因并且此外不包括编码酰基CoA合成酶或酰基ACP硫酯酶中的任一者或其两者的外源(即引入的)基因。
或者或另外，包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物可以包括编码酰基转移酶(例如(但不限于)DGAT、LPAAT或GPAT)的非原生基因，并且可以任选地另外或或者包括编码PAP的非原生基因。
对于在本文中公开的构筑体和微生物中使用，特定地包括核酸序列，其编码与既定类别的已知或疑似酶具有至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性的多肽，包括(但不限于)以下实例，其中经编码的多肽具有酶类别的活性。举例来说，编码适用于本文中提供的微生物和方法中的硫酯酶、脂肪酶、酰基CoA合成酶、形成醛的还原酶、形成醇的还原酶、羧酸还原酶、脱羰酶、脱羧酶、蜡合成酶、酰基转移酶或转运体的核酸序列可以与已识别的硫酯酶、脂肪酶、酰基CoA合成酶、形成醛的还原酶、形成醇的还原酶、羧酸还原酶、脱羰酶、脱羧酶、蜡合成酶或酰基转移酶(例如数据库中注释的序列，包括(但不限于)本文中公开的序列)具有至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性。
硫酯酶
例如，除用于一或多种编码脱氢酶的重组型基因的表达系统之外，宿主微生物可以包括编码硫酯酶的非原生基因。如本文中所使用，术语“硫酯酶”意图包括能够作用于硫酯键以释放脂肪酸的水解酶。宿主微生物可以产生游离脂肪酸或者可以将硫酯酶释放的脂肪酸转化成其它产物，例如脂肪醇或蜡酯。硫酯酶可以对应于例如酶学委员编号(EnzymeCommission Number)3.1.2.2、3.1.2.14、3.1.2.18、3.1.2.19、3.2.1.20、3.1.2.22、3.1.2.23或3.1.2.27。宿主微生物中表达的外源硫酯酶可以是例如酰基ACP硫酯酶、酰基CoA硫酯酶或羟基苯甲酰基硫酯酶。例如，在一些实施例中，用于产生游离脂肪酸的微生物可以用编码外源酰基ACP硫酯酶的基因转型，例如编码多肽的基因，其在针对Pfam数据库查询时，提供与Pfam PF01643的匹配，其中二进制值小于或等于20.3(PF01643的采集截止值)。外源酰基ACP硫酯酶基因可以编码来自高等植物物种的酰基ACP硫酯酶。编码来源于高等植物的酰基ACP硫酯酶的基因可以包括(但不限于)编码来自克非亚草属物种(例如克非亚草(Cuphea carthagenensis)、赖特萼距花(Cuphea wrightii)(例如GenBank寄存号AAC49784)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)(例如GenBank寄存编号CAA54060)、湿地萼距花(Cuphea palustris)(例如GenBank寄存编号AAC49783；AAC49179)；萼距花(Cupheahookeriana)(例如GenBank寄存编号AAC72882；AAC49269；AAC72881；AAC72883)、美叶萼距花(Cuphea calophylla)(例如GenBank寄存编号ABB71580)的酰基ACP硫酯酶的基因，或美国专利申请公开案US 2011/0020883(以引用的方式并入本文中)中揭示的各种克非亚草属物种的基因，或来自其它高等植物物种的基因。在其它实例中，本文中公开的方法和培养物中使用的微生物可以包括编码酰基ACP硫酯酶的基因，所述酰基ACP硫酯酶是来自例如(但不限于)以下物种：芥菜属(例如GenBank寄存编号XP_002885681；NP_172327)；花生(Arachis hypogaea)(例如GenBank寄存编号ABO38556)；甘蓝田(Brassica)物种(例如GenBank寄存编号CAA52069.1)、油茶(Camellia oleifera)(例如GenBank寄存编号ACQ57189)；樟脑(Cinnamonum camphorum)(例如GenBank寄存编号AAC49151)；椰子树(Cocos nucifera)(例如GenBank寄存编号AEM72519；AEM72520；AEM72521)；大豆(例如GenBank寄存编号ABD91726)；倒捻子(Garcinia mangostana)(例如GenBank寄存编号AAB51525)；陆地棉(Gossypium hirsutum)(例如GenBank寄存编号AAD01982)；向日葵(Helianthus annuus)(例如GenBank寄存编号AAQ08226)；麻风树(Jatropha curcas)(例如GenBank 寄存编号ABU96744)；四叶澳洲坚果(Macadamia tetraphylla)(例如GenBank寄存编号ADA79524)；美洲油棕(Elaeis oleifera)(例如GenBank寄存编号AAM09524)；油棕(Elaeis guineensis)(例如GenBank寄存编号AAD42220)；稻(例如GenBank寄存编号BAA83582)；大叶杨(Populus tomentosa)(例如GenBank寄存编号ABC47311)；加州桂(Umbellularia californica)(例如GenBank寄存编号AAC49001)；美国榆(UlmusAmericana)(例如GenBank寄存编号AAB71731)；和玉米(例如GenBank寄存编号ACG41291)，或者美国专利第5,455,167号；美国专利第5,654,495号；和美国专利第5,455,167号；以及美国专利申请公开案第2009/0298143号和第2011/0020883号中揭示的任一种；其均以全文引用的方式并入本文中。更包括来自苔藓(苔藓植物门(Bryophyta))，例如小立碗藓(Physcomitrella patens)(例如GenBank寄存编号XP 001770108)的酰基ACP硫酯酶。上述实例不对可使用的酰基ACP硫酯酶的类型或特定实例造成限制。
更包括来自原核生物的酰基ACP硫酯酶基因。可由适用于本文中提供的方法和培养物中的微生物表达的原核生物酰基ACP硫酯酶的说明性实例包括(但不限于)来自去磺弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)(例如Q312L1)；微小亚历山大藻(Elusimicrobiumminutum)(例如ACC98705)；氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)(例如YP_359670)；热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(例如YP_001039461)；热乙酸菌(Moorella thermoacetica)(例如YP_431036)；地杆菌(Geobacter metallireducens)(例如YP_384688)；嗜盐菌(Salinibacter ruber)(例如YP_444210)；海洋微颤菌(Microscillamarina)(例如EAY28464)；吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)(例如YP_001303423)；粪肠球菌(例如ZP_03949391)；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(例如YP_003062170)；肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(例如YP_817783)；酒酒球菌(Oenococcus oeni)(例如ZP_01544069)；耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(例如ABK74560)；范巴伦分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)(例如ABM11638)；红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)(例如ZP_04385507)；不透明红球菌(Rhodococcus opacus)(例如YP_002778825)的酰基ACP硫酯酶，或2011年12月13日申请的共同待决的、共同转让的题为“用于在经基因工程改造的微生物中产生脂肪酸的原核酰基ACP硫酯酶(ProkaryoticAcyl-ACP Thioesterases for Producing Fatty Acids in Genetically EngineeredMicroorganisms)”的专利申请案第13/324,623号中公开的任一种，其以全文引用的方式并入本文中。
在其它实例中，可以将编码酰基CoA硫酯酶的基因引入宿主微生物中，所述宿主微生物包括编码脱氢酶的外源核酸分子。转型至微生物中用于产生游离脂肪酸或脂肪酸衍生物的酰基CoA硫酯酶基因可以来自植物、动物或微生物来源。例如，可以将编码大肠杆菌的TesA或TesB硫酯酶或其变异体(例如酰基CoA硫酯酶，例如(但不限于)WO 2010/075483中揭示的变异体)的基因引入微生物中。还包括基因编码蛋白质，其在针对蛋白质家族的Pfam数据库查询时识别成Pfam PF02551的成员(酰基CoA硫酯酶)，其中二进制分数等于或大于采集截止值(20.7)。
或者或另外，微生物可以包括一或多种编码外源羟基苯甲酰基硫酯酶(例如外源4-羟基苯甲酰基硫酯酶或4-氯苯甲酸酯硫酯酶)的基因。可以适用于在微生物中产生游离脂肪酸的编码羟基苯甲酰基硫酯酶的基因可以包括例如2011年12月13日申请的共同待决的、共同转让的题为“包含4-羟基苯甲酰CoA硫酯酶的经基因工程改造的微生物和使用其产生游离脂肪酸和脂肪酸盐生物的方法(Genetically Engineered MicroorganismsComprising 4-Hydroxybenzoyl-CoA Thioesterases and Methods of Using Same forProducing Free Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives)”专利申请案第13/324,607号中公开的硫酯酶，并且其以全文引用的方式并入本文中，来自芽胞杆菌属物种和土芽孢杆菌(Geobacillus)物种的4-羟基苯甲酰基硫酯酶，以及嗜酸菌属(Acidiphilium)、巴尔通氏体属(Bartonella)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、趋磁螺菌属(Magnetospirillum)、伯克氏菌(Burkholderia)、乙酸细菌(Granulibacter)、根瘤菌(Rhizobium)和拉布伦茨氏菌(Labrenzia)物种或其类似物的4-羟基苯甲酰基硫酯酶或其组合。
酰基ACP硫酯酶典型地可以在某种程度上对具有多种不同酰基链长度的酰基ACP底物有效，但与其它链长度底物相比，可以对一或多种具有特定酰基链长度的酰基ACP底物具有更高的活性(例如对一或多种具有特定酰基链长度的酰基ACP底物具有底物偏好)。例如，酰基ACP硫酯酶可以对具有8、10、12、14、16、18、20、22和/或24个碳的酰基链长度的一或多种酰基ACP底物具有底物偏好。或者或另外，酰基ACP硫酯酶可以使一或多种具有8到18个碳，例如12到16个碳的酰基链长度的酰基ACP底物水解。
具有解脂活性的多肽
或者或除编码硫酯酶的非原生基因之外，本发明的重组型微生物或宿主细胞可以包括一或多种非原生基因，其编码一或多种具有解脂活性的多肽，其中具有解脂活性的多肽能够从膜脂或贮存脂质(例如磷脂、甘油三酯、二酰基甘油、单酰基甘油或其类似物或其组合)产生游离脂肪酸。具有解脂活性的多肽可以是例如脂肪酶、酯酶、角质酶或酰氨酶。脂肪酶是催化甘油酯(包括(但不限于)单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油以及其组合)中酯键水解以释放游离脂肪酸和醇的酶。
微生物中编码具有解脂活性的多肽的基因用于产生游离脂肪酸的用途公开于共同转让的2011年12月13日申请的题为“通过表达具有解脂活性的多肽的重组型微生物产生游离脂肪酸和脂肪酸衍生物(Production of Free Fatty Acids and Fatty AcidDerivatives by Recombinant Microorganisms Expressing Polypeptides HavingLipolytic Activity)”的美国专利申请案第13/324,653号中，并且其以全文引用的方式并入本文中。具有解脂活性的多肽可以是例如从甘油酯(包括单酸甘油酯、双酸甘油酯、三酸甘油酯、磷脂、半乳糖脂等)释放脂肪酸的脂肪酶，或者可以是酰氨酶。例如，重组型微生物可以包括编码脂肪酶的非原生基因，例如(但不限于)作为Pfam中的成员的脂肪酶，其属于AB水解酶Pfam族(CL0028)。例如，编码具有解脂活性的多肽的非原生基因可以编码包括LipA结构域或包括在蛋白质家族Pfam PF01674(脂肪酶2)中的脂肪酶，所述LipA结构域识别为保守性蛋白质结构域COG1075；编码包括脂肪酶3结构域或包括在蛋白质家族PfamPF01764(脂肪酶3)中的脂肪酶，所述脂肪酶3结构域识别为保守性蛋白质结构域COG3675；编码包括在蛋白质家族Pfam PF07819(PGAP1)中的脂肪酶的非原生核酸分子；或编码以下蛋白质家族中的任一者中所包括的多肽的非原生核酸分子：Pfam PF03583、Pfam PF00151(脂肪酶)、Pfam PF00561(Ab水解酶1)、Pfam PF02230(Ab水解酶2)、Pfam PF07859(Ab水解酶3)、Pfam PF08386(Ab水解酶4)、Pfam PF12695(Ab水解酶5)、Pfam PF12697(Ab水解酶6)、Pfam PF12715(Ab水解酶7)、Pfam PF04083(Ab氢脂肪酶)。另外，重组型微生物可以包括编码具有解脂活性的酰氨酶的非原生基因，例如(但不限于)募集到Pfam PF01425(酰氨酶)的酰氨酶，其二进制分数大于采集截止值20.1并且可以催化脂肪酸从脂质释放。
或者或另外涵盖经工程改造以包括基因调节序列的重组型微生物，所述基因调节序列诱导或增加内源脂肪酶基因的表达。例如，微生物可以经工程改造使得将异源启动子插入内源脂肪酶基因的编码区域的上游。异源启动子可以置换内源启动子和/或可以插入调节内源脂肪酶基因的表达的内源启动子的上游或下游，例如使用同源重组或位点特异性重组。异源启动子可以是增加内源脂肪酶基因的表达的组成性启动子或可诱导启动子。
另外但任选地，经工程改造以包括编码用于产生脂肪酸或脂肪酸衍生物的硫酯酶的外源基因的重组型微生物可以更包括编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的外源基因，其中与硫酯酶的酰基ACP底物偏好相比，LPAAT具有不同的酰基ACP底物偏好。或者，经遗传工程改造的微生物(其可以是经遗传工程改造的藻青菌)可以过表达内源LPAAT基因，其具有与外源硫酯酶基因的底物偏好相比不同的底物偏好。通过LPAAT基因的表达对微生物(例如蓝藻细菌)进行工程改造以增加脂肪酸产生公开于共同待决并且共同转让的2012年2月24日申请的题为“重组型微生物中增强的脂肪酸和脂肪酸衍生物产生(EnhancedProduction of Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by RecombinantMicroorganisms)”的美国专利申请案13/404,7171中，并且以全文引用的方式并入本文中。
酰基CoA合成酶
用于本发明的微生物和方法的重组型或经分离的核酸分子可以任选地包含编码酰基CoA合成酶的核酸序列，其中酰基CoA合成酶可以将硫酯酶或脂肪酶产生的游离脂肪酸偶合到辅酶A以提供酰基CoA，其是可以使用酰基CoA底物产生醛、醇、蜡酯和甘油酯的多种还原酶、蜡合成酶和酰基转移酶的底物。酰基CoA合成酶可以是例如原核酰基CoA合成酶，例如大肠杆菌的FadD(NP_416319)或FadK(NP_416216)，或其于其它细菌物种中的同系物，包括(作为非限制性实例)灿烂弧菌(Vibrio splendidus)(EGU44230)或海洋细菌(Marinobacter adhaerens)HP15(ADP96803)的酰基CoA合成酶。已知具有或疑似具有酰基CoA合成酶活性的原核蛋白质的其它非限制性实例包括(但不限于)不动杆菌属(Acinetobacter sp.)ADP1 fadD(YP_045024)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)RdKW20 fadD(NP_438551)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125 BH3103(NP_243969)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)yhFl(NP_388908)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pfo-1 Pfl-4354(YP_350082)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)KF-1 EAV15023(ZP_01520072)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)fadD1(NP_251989)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeurginosa)PAO1 fadD2(NP_251990)、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)CFN42 fadD(YP_468026)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)Bis B18 RPC_4074(YP_533919)、青枯雷尔氏菌(RasltoniaSolanacearum)GM1 1000 fadD1(NP_520978)、结核分枝杆菌H37Rv fadDD35(NP_217021)、结核分枝杆菌H37Rv fadDD22(NP_217464)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomon asMaltophilia)R551-3 PRK0059(ZP_01644857)。
在其它实例中，编码酰基CoA合成酶的核酸序列可以编码来源于真菌物种的酰基CoA合成酶，例如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)酰基CoA合成酶(例如中链脂肪酰基CoA合成酶Faa2p(NP_010931)或SCRG_04483酰基CoA合成酶(EDV08843)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)酰基CoA合成酶(例如CAG77892))。可以用于本文中所公开的构筑体和微生物中的其它酰基CoA合成酶基因包括植物的酰基CoA合成酶，例如甘蓝型油菜(Brassica napus)(CAC19877)的长链酰基CoA合成酶或拟南芥(AEE74324)的长链酰基CoA合成酶或大豆(XP_003524920)的Yng-I样酰基CoA合成酶，和藻类物种的酰基CoA合成酶，例如莱茵衣藻(XP_001693692)的长链酰基CoA合成酶或眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)(例如ADP09391)或变异小球藻(例如EFN56588)的酰基CoA合成酶。另外考虑的是动物物种的酰基CoA合成酶，包括昆虫(例如意蜂(Apis mellifera)，例如酰基CoA合成酶家族成员2，粒线体前驱体、NP_001193902)和哺乳动物，例如小家鼠(例如“MACS”酰基CoA合成酶EDL17174)。
中提供的重组型微生物可以不包括编码酰基CoA合成酶、硫酯酶和/或脂肪酶的外源外源或过表达基因。举例来说，本文中提供的重组型微生物可以在不利用或产生酰基CoA底物的情况下产生脂肪醛、脂肪醇、烷、烯或蜡酯中的一或多种。举例来说，使用非酰基CoA底物产生脂肪醇和蜡酯的方法提供于2012年9月27日申请的题为“脂肪酸和脂肪酸衍生物的产生和分泌酰基ACP(Production and Secretion ofFattyAcids and Fatty AcidDerivatives)”的共同待决的、共同转让的美国专利案申请第13/860,417号(以全文引用的方式并入本文中)和2012年3月6日申请的题为“酰基ACP蜡酯合成酶(Acyl-ACP Wax EsterSynthases)”的共同待决的、共同转让的美国专利申请第13/413,426号(也以全文引用的方式并入本文中)中。
产生醛的还原酶
为了产生可以任选地进一步转化成如脂肪醇、蜡酯或烷的产物的脂肪醛，本文中提供的转基因微生物可包括编码形成醛的还原酶，例如形成醛的酰基CoA还原酶、形成醛的酰基ACP还原酶或羧酸还原酶的外源外源基因。GenBank和其它基因数据库中所列以及预测编码与产生脂肪醛的已知酰基CoA还原酶(在本文中称为“产生醛的脂肪酰基CoA还原酶”)同源的蛋白质的基因或基因部分可以引入到各种微生物中以测试由其产生的特定脂肪醛或脂肪醇的产生。产生脂肪醛的酰基CoA还原酶的非限制性实例包括贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)(AAC45217.1)的Acr1基因、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)M-1(YP 001086217)的AcrM-1基因和各种光致发光细菌，例如交替单胞菌(Altermonas)、发光杆菌(Photobacterium)、希瓦氏菌(Shewanella)、弧菌(Vibrio)或致病杆菌(Xenorhabdus)物种的luxC和luxE基因。可以测试由例如通过序列同源性或蛋白质结构域鉴别的这些和其它基因编码的酶，以便使用在所属领域中已知的分析法测定其底物和产物。
在一些实例中，宿主细胞可以包括编码形成醛的酰基ACP还原酶的外源外源基因，例如(但不限于)公开于US 2010/0221798(WO 2009/140696)(以全文引用的方式并入本文中)中的外源基因中的任一种。举例来说，重组型宿主细胞可以包含与形成醛的还原酶具有至少60％、70％、80％、90％或95％序列一致性的形成醛的酰基ACP还原酶，例如如WO 2009/140696或WO 2011/066137中所公开，如具有以下寄存编号的还原酶中的任一种：AAM82647；AAM82647；BAD78241；ABA22149；BAB76983；ZP_03763674；ACL42791；ZP_01628095；ZP_01619574；YP_001865324；YP_721978；NP_682102；YP_001518341；YP_002371106；ZP_05027136；ZP_03273554；NP_442146；ZP_01728620；ZP_05039135；YP_001802846；NP_926091；YP_001660322；ZP_00516920；CAO90781；ZP_01085337；YP_001227841；ABD96327；NP_897828；YP_001224378；ABD96480；ZP_01123215；ABB92249；ZP_01079773；YP_377636；NP_874926；NP_895058；ABD96274；ABD96442；ZP_01469469；ZP_05045052；YP_001014416；YP_001010913；YP_381056；YP_001550421；NP_892651；YP_001090783；ZP_01472595；YP_293055；ZP_05138243；YP_731192；YP_001483815；YP_001008982；YP_473896；YP_478638；或YP_397030。在一些实例中，重组型宿主细胞包括编码形成醛的酰基ACP还原酶的外源基因，其中形成醛的酰基ACP还原酶可以来自蓝藻物种，并且可以与宿主微生物来自相同物种，或可以来自不同物种。或者，可以对蓝藻宿主进行工程改造以过表达内源酰基ACP还原酶基因。
编码可以用于本发明中的羧酸还原酶的基因的非限制性实例包括诺卡菌属(Nocardia)CAR基因(AY495697)和其同系物，其中的一些公开于US2010/0105963中，其以全文引用的方式并入本文中。
形成醇的脂肪酰基还原酶
为了产生脂肪醇(其可以任选地通过蜡酯合成酶用作底物)，本文中提供的核酸分子可以另外对可以将酰基CoA还原成脂肪醇的形成脂肪醇的酰基还原酶或“FAR”进行序列编码。已在例如眼虫藻(参见例如Teerawanichpan等人，脂质(Lipids)45：263-273(2010))、芥菜属(参见例如罗兰(Rowland)等人，植物生理学(Plant Physiol.)142：866-877(2006)、多恩(Doan)等人，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)166：787-796(2009)和多默格(Domergue)等人，植物生理学153：1539-1554(2010))、蒿属(参见例如梅斯(Maes)等人，新植物学家(New Phytol.)189：176-189(2011))、荷荷芭(jojoba)(参见例如梅茨(Metz)等人，植物生理学122：635-644(2000))、蛾(参见例如利纳尔(Lienard)等人，国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)107：10955-10960(2010))、蜜蜂(参见例如特瓦克潘(Teerawanichpan)等人，昆虫生物化学和分子生物学(Insect Biochemistry andMolecular Biology)40：641-649(2010))和哺乳动物(参见例如本昌(Honsho)等人，生物化学杂志285：8537-8542(2010))中鉴别FAR。适用于本发明的微生物和方法的形成醇的脂肪酰基还原酶可以是任何在宿主微生物中具有活性的形成醇的还原酶。
可以使用的其它形成醇的脂肪酰基还原酶的非限制性实例包括(但不限于)来自家蚕的bfar(BAC79426)、来自荷荷巴油(Simmondsia chinensis)的jjfar(AAD38039)、来自小麦(Triticum aestivum)的酰基CoA还原酶(CAD30694或CAD30692)、来自小家鼠的mfarl(NP_081655)、来自小家鼠的mfar2(NP_848912)、来自智人(H.sapiens)的hfar(NP_115604)、来自紫秆野螟(Ostrinia scapulalis)的FARXIII(ACJ06520)、来自玉米的MS2(NP_001151388或EU970865)或来自拟南芥的MS2(NP_187805)、FAR4(NP_001030809或NP_190040)、FAR6(67633703)、CER4(NP_567936)或Ath(NP567936)、来自稠李巢蛾(Yponomeutaevonymellus)的Yev-pgFAR(GQ907231-GQ907233)、来自卫矛巢蛾(Yponomeuta rorellus)的Yro-pgFAR(GQ907234)、来自苹果巢蛾(Yponomeuta padellus)的Ypa-pgFAR(GQ907235)、来自欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的OnuE(FJ807735)、来自智人的Has(AAT42129)等。
对适用于本发明的微生物和方法的形成醇的脂肪酰基还原酶也可以或替代地是原核的形成醇的酰基CoA还原酶，例如油水海杆菌(Marinobacter aquaeolei)VT8Maqu_2220(YP_959486)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)DG893(ZP_01892457)；哈赫拉菌(Hahella chejuensis)KCTC 2396 HCH_05075(YP_436183)；海洋杆菌属(Oceanobactersp.)RED65(ZP_01305629)或埃氏海杆菌(Marinobacter aquaeoli)VT8 2220Maqu_2507基因(ABM19582)。
能够使用酰基ACP作为底物(并且可以用于在缺乏外源和/或内源酰基CoA合成酶基因的重组型微生物中产生脂肪醇和蜡酯)的形成醇的还原酶公开于2012年9月27日申请的题为“脂肪酸和脂肪酸衍生物的产生和分泌(Production and Secretion of FattyAcids and Fatty Acid Derivatives)”的共同转让的、共同待决的美国专利申请案13/860,417(其以全文引用的方式并入本文中)和2012年3月6日申请的题为“酰基ACP蜡酯合成酶(Acyl-ACP Wax Ester Synthases)”的共同待决的、共同转让的美国专利申请案13/413,426(也以全文引用的方式并入本文中)中。
蜡酯合成酶
蜡酯是通过蜡酯合成酶催化的脂肪酰基硫酯底物与脂肪醇之间的缩合反应的产物。具有蜡酯合成酶活性的多肽可以是鉴别为蜡合成酶、O-酰基转移酶(包括膜结合O-酰基转移酶(MBOAT)、二酰基甘油O-酰基转移酶(例如EC 2.3.1.20)、醇酰基转移酶(AAT，EC2.3.1.84))、长链醇O-脂肪酰基转移酶(例如2.3.1.75)或醇合成酶/酰基CoA：二酰基甘油酰基转移酶的多肽。可以发现一些鉴别为二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的多肽具有蜡酯合成酶活性。蜡酯合成酶已鉴别于例如不动杆菌属(石毛(Ishige)等人，环境微生物学应用(Appl.Environ.Microbiol.)68：1192-1195(2002)；卡尔朔伊尔(Kalscheuer)和施泰因布希尔(Steinbuchel)，生物化学杂志278：8075-8082(2003)；卡尔朔伊尔等人，环境微生物学应用72：1373-1379(2006))、海杆菌属(Marinobacter)(霍尔特萨普尔(Holtzapple)和施密特丹纳特(Schmidt-Dannert)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)189：3804-3812(2007))、芥菜属(李(Li)等人，植物生理学148：97-107(2008))、矮牵牛(petunia)(金氏(King)等人，植物学(Planta)226：381-394(2007))、荷荷芭(蓝迪莎芭(Lardizabal)等人，植物生理学122：645-655(2000)和哺乳动物物种(郑(Cheng)和拉塞尔(Russell)，生物化学杂志279：37798-37807(2004)；严(Yen)等人，脂质研究杂志46：2388-2397(2005))中。
可以使用所属领域中已知的方法基于结构域或与一组已知蜡酯合成酶/DGAT序列的序列相似性鉴别蜡酯合成酶。作为非限制性实例，可以选择编码以大于20.6的采集截止值和0.01或0.01以下的E值的二进位分数募集到Pfam PF03007(蜡酯合成酶样酰基CoA酰基转移酶结构域)或以大于25.0的采集截止值和0.01或0.01以下的E值的二进位分数募集到Pfam PF13813(“MBOAT_2”)的多肽的基因以用于本文提供的核酸分子和微生物中。
通过由本文提供的核酸分子编码的蜡酯合成蛋白质可以包括(但不限于)：酰基转移酶或蜡合成酶、脂肪酰基转移酶、二酰基甘油酰基转移酶、酰基CoA蜡醇酰基转移酶和双功能性蜡酯合成酶/酰基1-CoA：二酰基甘油酰基转移酶，其选自来自荷荷巴油、不动杆菌属菌株ADP1(先前是乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus；ADPl))、绿脓假单胞菌、亚德海床杆菌(Fundibacter jadensis)(食烷菌属(Alcanivorax))、拟南芥或真氧产碱杆菌的多酶复合物。蜡合成酶也可以来自多酶复合物，所述多酶络合物来自真氧产碱杆菌和文献中已知的其它生物，从而产生蜡和脂肪酸酯。
考虑用于本文中提供的核酸分子和转殖基因微生物中的已知或疑似具有蜡酯合成酶活性的蛋白质包括来自原核物种的蜡合成酶，例如(但不限于)除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)WS1(ABO21020)、烃海杆菌(M.hydrocarbonoclasticus)DSM 8798 WS2(ABO21021)、海杆菌属ELB 17(GenBank寄存号EBA00388)、油水海杆菌(M.aquaeolei)Maqu_0168 WS(YP_957462)、粘着海杆菌(M.adhaerens)HP15 WS(ADP99639)、哈赫拉菌(Hahella chejuensis)KCTC 2396(YP_432512)、鲍氏不动杆菌蜡酯合成酶(EGJ63408)、乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)WS/DGAT(ZP_06058985)、贝氏不动杆菌ADP1蜡酯合成酶(AAO17391或Q8GGG1)、慢性大豆根瘤菌USDA 110(NP_769520)、海滨赤杆菌(Erythrobacter litorali)HTCC 2594(YP_457389)、不透明红球菌蜡酯合成酶(BAH53702)、结核杆菌蜡酯合成酶(NP_334638)、耻垢分枝杆菌蜡酯合成酶(ABK74273)、食烷菌属物种(CAL17252；EDX90960；EDX89052；ZP_05043539；ZP_05041631)的“WS/DGAT/MGAT”子族蛋白质、来自皮疽诺卡菌IFM 10152(YP_117375)的wsadpl、深海嗜压菌SS9(YP_130413)、嗜甜微生物(Rhodoferax ferrireducens)DSM 15236(ZP_00691704)和红色噬盐菌(Salinibacter ruber)DSM 13855(YP_446603)。
可以用作蜡合成酶的真核多肽的实例包括(但不限于)荷荷芭蜡酯合成酶JjWS(AF149919)、超微眼虫藻蜡酯合成酶(ADI60058)、拟南芥WSD1 O-酰基转移酶(NP_568547)、拟南芥GPAT酰基转移酶(NP_174499)、拟南芥(NP_200346)九里香(Murraya koenigii)蜡酯合成酶的假定长链醇O-脂肪-酰基转移酶4、来自智人(NP_001002254)的酰基CoA蜡醇酰基转移酶2、来自小家鼠(Q6E1M8)的mWS、来自草莓托斯卡纳(Fragaria xananas)(AAG13130)的SAAT、玉米(NP_001131179)的膜结合O-酰基转移酶(MBOAT)、来自苹果(AAS79797)的mdAAT2以及昆虫蜡酯合成酶等。
能够使用酰基ACP作为底物并且可以(例如)用于在缺乏编码酰基CoA合成酶或硫酯酶的外源或内源基因中的任一者或两者的重组型微生物中产生蜡酯的蜡酯合成酶包括公开于2012年3月6日申请的题为“酰基ACP蜡酯合成酶”的共同转让、共同待决的美国专利案第13/413,426号中的那些蜡酯合成酶，所述专利以全文引用的方式并入本文中。能够使用酰基ACP作为底物的蜡酯合成酶也可以具有DGAT活性并且可以对在重组型微生物，例如(但不限于)缺乏酰基CoA的蓝藻细菌和/或缺乏编码酰基CoA合成酶或硫酯酶的外源或内源基因中的任一者或两者的微生物中产生三酸甘油酯有用。
或者或除以上外源基因中的任一个以外，本发明的重组型微生物可包含至少一个编码外源脂肪酸脱羧酶或外源脂肪醛脱羧酶的核酸分子，并且另外但任选地包含至少一个编码外源酰基CoA还原酶、羧酸还原酶或酰基ACP还原酶的外源核酸分子，并且可以产生烷和/或烯。举例来说，本文提供的重组型微生物可以包括编码脱羧酶，例如拟南芥的CER1(NP_171723)或另一物种的直系同源物或其衍生物，或公开于US 20110124071(WO 2011/062987)(全文并入本文中)中的脱羧酶中的任一者的外源核酸分子，其可以与编码形成醛的酰基还原酶(如上文公开的任一种)的外源基因一起表达。或者，本文提供的重组型微生物可包括编码用于产生烯(olefin/alkene)的基因的外源基因，如(但不限于)公开于US20100235934或US 8,110,093中的任一者，其均以全文引用的方式并入本文中。通过本发明的重组型微生物或宿主细胞产生的烷烃和烯烃可以(例如)具有7、9、11、13、15、17、19、21和/或23个碳的链长度，包括(例如)7、9、11、13、15和/或17个碳的链长度或7、9、11、13和/或15个碳的链长度或11、13和/或15个碳的链长度。
为了对产生三酸甘油酯(TAG)的微生物进行工程改造，可以将编码丙三醇-3-磷酸酰基转移酶(在下文中也称为“GPAT”；EC 2.3.1.15)、“溶血磷脂酸酰基转移酶”或“LPAAT”、EC 2.3.1.51、磷脂酸磷酸酶(PAP，3-sn-磷脂酸磷酸水解酶)或二酰基甘油酰基转移酶(DGAT，E.C.2.3.1.20)中的一或多者的外源基因引入到微生物中。基因可以来自任何原核或真核来源。属于所有这些类别的酶的基因是所属领域中已知的，并且对于具有这些活性的基因的参考可以发现于例如美国专利申请公开案2007/0184538、US 2010/0159110和20100255551以及2012年2月24日申请的题为“通过重组型微生物增强地产生脂肪酸和脂肪酸衍生物(Enhanced Production of Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives byRecombinant Microorganisms)”的共同转让、共同待决的美国专利申请13/404,7171中，所有所述专利均以全文引用的方式并入本文中。
或者或除以上修饰中的任一者以外，本发明的重组型微生物可以任选地包括编码影响脂肪酸产生的酶的外源或重组核酸分子。举例来说，本文提供的重组型微生物可包括一或多个编码参与脂肪酸合成的多肽的外源核酸分子，包括(但不限于)乙酰CoA羧化酶丙二酸单酰CoA：ACP转酰酶或β-酮脂酰ACP合成酶，或可以经工程改造以过表达编码用于产生脂肪酸或脂质的多肽的内源基因。
另外，可以任选地对重组宿主细胞工程改造以表达外源跨膜转运体以促进一或多种脂肪酸产物的分泌。举例来说，重组宿主细胞可包括编码ATP结合盒(ABC)转运体或RND泵的外源基因。在一些实施例中，转运体与通过芥菜属基因CER5、WBC11、AtMRPS、AmiS2和AtPGP1或来自酵母菌属、果蝇、分支杆菌物种或哺乳动物物种的脂肪酸转运体(FATP)基因编码的转运体蛋白质具有至少80％序列一致性。
上述重组宿主细胞可以用于产生如本文中所述的脂肪酸产物的任一种方法中。
对用于FFA产生的其它修饰
重组微生物重组型微生物可以另外包含编码例如酰基CoA合成酶、酰基ACP合成酶、酰基CoA脱氢酶、丙三醇-3-磷酸脱氢酶、乙醛CoA脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸激酶等和其组合的内源核酸分子的修饰。在某些实施例中，修饰下调内源核酸并且包括核酸或其调节元件的部分、实质或完全缺失、沉默或失活。
在一些实例中，宿主微生物(其可以例如为蓝藻菌)可以使编码参与将脂肪酸再循环为脂质的酰基ACP合成酶的内源基因的表达减弱。内源酰基ACP合成酶基因可以例如通过启动子的缺失或突变下调，或基因的蛋白质编码可以例如通过插入突变诱发而内部缺失或破坏。或者，整个酰基ACP合成酶基因可以例如通过同源重组或其它基因体修饰技术缺失。在其它替代方案中，可以将基因阻断构筑体，如(但不限于)核糖核酸酶、反义物或RNAi构筑体引入到宿主细胞中以使内源酰基ACP合成酶基因的表达减弱。
或者或另外，可以修饰本发明的重组型微生物(例如重组藻青菌)使得编码贮存碳水化合物和/或聚羟基烷酸酯(PHA)生物合成路径酶的一或多种基因不活化或下调，和/或使得在这些路径上有效的酶本身被抑制。实例包括(但不限于)与肝糖、淀粉或金藻色素(chrysolaminarin)合成有关的酶，包括葡聚糖合成酶和/或分支酶。其它实例包括与PHA生物合成有关的酶，如乙酰乙酰CoA合成酶和PHA合成酶。
可以特定地通过反义序列的破坏、缺失、产生、核酶的产生、RNAi、大范围核酸酶基因体修饰和/或其它重组方法靶向基因。可以另外或替代地通过随机突变技术，如暴露于UV和/或化学诱变剂实现基因的失活，并且可以筛选所得基因和/或酶以用于具有所需活性的突变体。可以通过细胞内产生适当抗体、细胞内产生肽抑制剂等或一些其组合抑制蛋白质本身。
核酸分子
本文中所描述的核酸分子和经编码的多肽可以在本发明的任一种方法中进行使用，并且可以包括在本发明的任一种构筑体、载体或重组型微生物中。提供包含编码脱氢酶的序列的核酸分子以用于宿主微生物和用于产生脂肪酸产物的方法中，所述脂肪酸产物包括游离脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烷、烯和/或甘油脂质，例如三酸甘油酯。本文中公开的核酸分子可以经分离和/或经纯化。
本发明提供经分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码脱氢酶的核酸序列，例如本文中所公开的任何核酸序列或其任何活性片段。举例来说，，本文中所提供的核酸分子可以包括编码醛脱氢酶、2-羟基酸脱氢酶、D-2-羟基酸脱氢酶、甘油酯-3-磷酸脱氢酶(非磷酸化)、苹果酸酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶或山梨醇脱氢酶。
如本文中所描述编码脱氢酶的重组型核酸分子序列在宿主微生物(例如表达编码参与脂质合成的多肽的非原生基因的重组型微生物)中的表达可以导致宿主微生物培养物的脂肪酸产物产生量比对照微生物培养物的产生量更高，其中对照微生物在相同条件下培养，并且对照微生物除了不表达编码脱氢酶的非原生核酸序列以外，在所有方面中与表达编码脱氢酶的核酸序列的微生物实质上一致。另外，包括如本文中所提供编码脱氢酶的重组型核酸分子或序列的重组型宿主微生物可以具有比对照微生物更高的繁殖和/或增殖速率，所述对照微生物除了不包括编码脱氢酶的非原生核酸分子或序列以外，在所有方面中与包含编码脱氢酶的非原生核酸分子的宿主微生物实质上一致。包括本文中所提供的包括编码脱氢酶的序列的重组型核酸分子的重组型宿主微生物在其中重组型微生物产生脂质的培养期期间可以具有比对照微生物更高的繁殖和/或增殖速率，所述对照微生物缺乏编码脱氢酶的非原生核酸分子。重组型微生物可以是例如光合微生物。
在特定实例中，本文中所提供的重组型核酸分子可以编码脱氢酶，所述脱氢酶包括与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：13的氨基酸序列或其活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性或100％一致性的氨基酸序列。
举例来说，本发明提供一种包含编码多肽的核酸序列的经分离或重组型核酸分子，所述多肽具有与SEQ ID NO：29的氨基酸序列或其一部分、例如SEQ ID NO：29的多肽的功能性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，本文中所提供的核酸分子可以编码多肽，所述多肽包括与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少85％序列一致性、或与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少90％序列一致性、或例如与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，并且所述核酸分子可以包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
本发明进一步提供一种编码脱氢酶的经分离或重组型核酸分子，可以包含编码具有脱氢酶活性的多肽的核酸序列，所述多肽包括与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其一部分、例如多肽的功能性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，编码具有脱氢酶活性的多肽的核酸序列可以包括与SEQID NO：2的氨基酸序列或其功能性片段具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，或可以包括与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其功能性片段具有至少90％序列一致性的氨基酸序列，或例如可以包括与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其功能性片段具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，并且可以包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列的全部或活性片段一致的氨基酸序列。
本发明涵盖本发明核苷酸序列的变型，例如编码本文中所描述多肽的功能性片段或变异体的那些变型。此类变异体可以是天然存在或非天然存在的，例如通过各种突变和诱变方法诱导的那些变异体。变型包括(但不限于)一或多种核苷酸的加成、缺失和取代，所述加成、缺失和取代可以导致保守或非保守的氨基酸变化或氨基酸加成和缺失。既定核酸序列可以例如通过核酸分子或其部分的化学合成、引入随机或定向突变的DNA扩增法、标准化学或幅射突变诱发和/或人工演进(选择)或结构域交换法来进行修饰，产生经修饰的序列。其它脱氢酶ORF可以来源于转录物的集合，例如cDNA库，并且转录物的序列可以是未知的。例如通过施特默尔(Stemmer)(1994)自然(Nature)370，389-391和施特默尔(1994)美国国家科学协会公报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，10747-10751来描述加速演进法。突变包括(但不限于)增进转基因物种(例如藻类或藻青菌)中野生型序列表达的密码子最佳化(例如伯吉斯-布朗(Burgess-Brown)(2008)蛋白质实验性纯化(Protein Expr.Purif.)59，94-102)和由位点特异性突变诱发而产生的改变本发明脱氢酶氨基酸序列的突变。氨基酸序列中的此类改变可以增加本发明脱氢酶的生物活性。举例来说，编码本发明脱氢酶蛋白质的基因的核苷酸序列可以突变，以增加其生物活性，以使脂肪酸、脂肪酸衍生物或脂质产生增加。
举例来说，本发明提供与参考多肽相比活性增加的脱氢酶片段和变异体，并且在某些实施例中，脱氢酶片段或变异体的活性与变异体所源自的脱氢酶的活性相比可以增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在某些实施例中，由表达片段或变异体的宿主细胞培养物所产生的脂肪酸产物量是由表达片段或变异体所源自的脱氢酶的宿主细胞培养物制得的脂肪酸产物量的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。
另外或或者，本发明提供编码天然存在的脱氢酶氨基酸序列变异体的核酸分子，例如(但不限于)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的脱氢酶序列变异体或其片段，其中在参考序列的N末端和/或C末端、和/或在所述参考序列内已经添加或缺失至少一个氨基酸残基。举例来说，可以在蛋白质中添加细胞靶向信号，以用于将蛋白质引导到细胞中的一个位置，例如叶绿体处。
本发明还涵盖编码脱氢酶缺失突变体的核酸分子，其中蛋白质中已经缺失一或多个氨基酸。举例来说，经编码的多肽在N末端和/或C末端处可以缺乏至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70或80个氨基酸，并且可以具有与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的相应氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在一些实例中，缺失的序列可以包括靶向序列，例如叶绿体运输肽的至少一部分、粒线体靶向序列的至少一部分、内质网靶向序列的至少一部分等。
取代、插入或缺失在所改变的序列实质上抑制与蛋白质关联的生物学功能时可以对蛋白质有不利影响。在某些实施例中，脱氢酶的变异体的活性与变异体所源自的脱氢酶(例如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：13、或其它脱氢酶中的任一种)的活性相比，降低不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，由表达脱氢酶变异体的宿主细胞培养物所产生的脂肪酸产物量不小于由表达变异体所源自的脱氢酶(例如SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13、或其它脱氢酶)的宿主细胞培养物所产生的脂肪酸产物量的约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％或75％。
因此，本发明还包括包含编码多肽的核酸序列的经分离核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的肽序列；其片段，所述片段包含全部蛋白质的至少50、例如至少75、至少100、至少125、至少150个或150个以上氨基酸残基的连续序列；此类序列的氨基酸序列变异体，其中在所公开的含有插入和取代的序列的N末端和/或C末端、和/或在所述序列内已经插入至少一个氨基酸残基；所公开的序列的氨基酸序列变异体和/或其如上文所定义的片段具有氨基酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、70％、75％、80％或85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列一致性的氨基酸序列。所涵盖的变异体可以另外或或者包括含有由例如同源重组或定点或PCR突变诱发造成的预定突变的那些变异体；和其它物种的相应蛋白质，包括(但不限于)本文中所描述的那些蛋白质；含有插入和取代的蛋白质家族的等位基因或其它天然存在的变异体；和/或其中蛋白质已经通过取代、化学、酶或其它适当手段用含有插入和取代的除天然存在氨基酸之外的部分(例如可检测的部分，例如酶)修饰的衍生物。
本发明的“核酸”或“核酸分子”可以是DNA或RNA，例如mRNA。核酸分子可以是双链或单链的；单链RNA或DNA可以是编码或正义链、或非编码或反义链。另外，经表达的核酸和多肽的化学或酶改变可以通过标准方法来进行。举例来说，序列可以通过加成磷酸基团、甲基、脂质、糖、肽、有机或无机化合物，通过掺杂经修饰的核苷酸或氨基酸，或其类似方法来修饰。
另外，核酸可以编码本文中所公开的任何脱氢酶或其活性片段，所述脱氢酶或其活性片段呈包括本文中所公开的多肽或其活性片段的融合蛋白形式。举例来说，本发明的核酸包括编码本发明脱氢酶或其活性片段的多核苷酸序列，所述脱氢酶或其活性片段稠合于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚组氨酸(例如His6)、聚HN、聚赖氨酸、红血球凝集素、HSV-Tag、或HIV-Tat的至少一部分。
本文中所描述的本发明还涉及本文中所描述的经分离核酸分子的片段，所述片段涵盖本文中所描述的核苷酸序列的一部分，其长度为至少20个邻接核苷酸到至少50个邻接核苷酸或更长。此类片段可以适用作探针或引子。具体来说，引子和探针可以选择性地与编码本文中所描述的多肽的核酸分子杂交。举例来说，编码如下文所描述保持活性的多肽的片段尤其适用。
本发明还提供在高严密性杂交条件下与本文中所描述的核苷酸序列(例如与编码本文中所描述的多肽的核苷酸序列特异性杂交并且编码脱氢酶的核酸分子)杂交(例如用于选择性杂交)的核酸分子。杂交探针包括合成寡核苷酸，所述寡核苷酸以碱基特异性方式与核酸的互补链结合。适合的探针包括如尼尔森(Nielsen)(1991)科学(Science)，254，1497-1500中所描述的多肽核酸。
此类核酸分子可以通过例如在高严密性条件下的特异性杂交来检测和/或分离。用于杂交的技术术语“严密性条件”是指允许特定核酸与第二核酸杂交的培育和洗涤条件，例如温度和缓冲剂浓度的条件；所述第一核酸可以与所述第二核酸极佳地(亦即100％)互补，或所述第一和第二核酸可以共用一些程度的互补，所述互补少于完全互补，例如60％、75％、85％、95％或95％以上。举例来说，可以使用对互补极佳的核酸与互补较少的那些核酸进行区分的某些高严密性条件。
用于核酸杂交的“高严密性条件”、“中严密性条件”和“低严密性条件”解释于现代分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)(2011)约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)中。决定杂交严密性的准确条件不仅取决于洗涤缓冲剂的离子强度(例如0.2×SSC、0.1×SSC)、温度(例如23℃、42℃、68℃等)和去稳定剂(例如甲酰胺)或变性剂(例如SDS)的浓度，并且还取决于例如核酸序列长度、基底组成、杂交序列之间错配百分比和所述序列子集在其它不一致序列内出现频率的因素。因此，高、中或低严密性条件可以凭经验确定。
通过将杂交条件从不发生杂交的严密性程度变为初次观测到杂交的程度，可以确定允许既定序列与样本中最类似序列杂交的条件。
例示性条件描述于克劳斯(Krause)(1991)发酵学方法(Methods inEnzymology)，200，546-556中。洗涤是其中条件通常经设定以测定杂交种互补最小程度的步骤。一般来说，从仅发生同源杂交的最低温度开始，在保持SSC浓度恒定的同时，最终洗涤温度每减少1度(℃)使杂交序列中的最大错配程度增加1％。一般来说，SSC浓度加倍导致Tm增加。使用这些准则，取决于所寻求的错配程度，对高、中或低严密性可以凭经验确定洗涤温度。例示性高严密性条件包括(但不限于)在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃下杂交和在0.1×SSC中于60℃下洗涤。逐渐升高的严密性条件的实例包括在杂交之后，用0.2×SSC和0.1％SDS在约室温下洗涤(低严密性条件)；用0.2×SSC和0.1％SDS在约42℃下洗涤(中严密性条件)；和用0.1×SSC在约68℃下洗涤(高严密性条件)。洗涤可以仅使用这些条件之一(例如高严密性条件)来进行，洗涤可以按严密性增加的次序涵盖所述严密性条件中的两者或更多者。最佳条件将取决于所涉及的特定杂交反应而变化，并且可以凭经验确定。
如所属领域中已知的，等效条件可以通过在将目标核酸分子与所用引子或探针之间的一致性或相似性维持在类似程度的同时改变作为实例给出的一或多个参数来确定。举例来说，可杂交的核苷酸序列适用作用于识别包含本发明核酸的生物体的探针和引子，和/或用于分离本发明的核酸。
本发明的核酸分子可以视情况包含另外的非编码序列，例如非编码3′和5′序列(包括例如调控序列)，所述序列可以与脱氢酶基因同源或异源。或者或另外，所提供的任一种核酸分子可以视情况进一步包含来自光合生物的另外的核酸序列，所述核酸序列具有至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸。本文中所描述的核酸分子和多肽可以在本发明的任一种方法中进行使用，并且可以包括在本发明的任一种载体或重组型微生物中。提供包含编码脱氢酶的序列的核酸分子以用于宿主微生物和用于产生脂肪酸产物的方法中，所述脂肪酸产物包括游离脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烷、烯、单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯。
核酸构筑体
本发明还提供构筑体，其包含编码参与脂质产生的脱氢酶或多肽的核酸序列，所述脂质可以更包括一或多个调节或介导宿主基因组中核苷酸序列的转录、转译或整合的序列。例如，本发明提供表达构筑体，其包含一或多个“表达控制元件”或序列，其调节可操作地连接的基因的表达转录，或经转录的RNA的转译。例如，表达对照元件可以是启动子，其可以可操作地连接于表达构筑体或“表达盒”中的相关基因(例如脱氢酶基因)。启动子可以是可调节的，例如可诱导的。
在核酸构筑体不含有与编码相关基因(例如脱氢酶基因)的核酸序列可操作地连接的启动子的方面，可以将核酸序列转型到细胞中使得其通过例如同源重组、位点特异性整合和/或载体整合变成可操作地连接于内源启动子。在一些情况下，用于将同源重组介导到宿主基因组中的核酸构筑体中所包括的基因组宿主序列可以包括基因调节序列，例如启动子序列，其可以调节核酸构筑体的脱氢酶基因的表达。在所述实例中，构筑体的转殖基因可以变成可操作地连接于对宿主微生物而言是内源的启动子。内源启动子可以是可调节的，例如可诱导的。
可操作地连接于编码脱氢酶的核酸序列的启动子可以是对脱氢酶基因而言是异源的启动子。在一些实施例中，启动子可以是可诱导的启动子，即响应与特定刺激而介导可操作地连接的基因的转录的启动子。所述启动子可以有利地例如最小化任何对宿主细胞生长有害的作用和/或最大化脂肪酸产物的产生。可诱导的启动子可以对例如光或黑暗或高温或低温起反应，和/或可以对特定化合物起反应。可诱导的启动子可是ara启动子、lac启动子、trp启动子、tet启动子(例如美国专利第5,851,796号)、包括trp、lac或tet启动子的一部分的杂合启动子、激素响应型启动子(例如脱皮素响应型启动子，例如美国专利第6,379,945号中所描述)、金属硫蛋白启动子(例如美国专利第6,410,828号)、发病机理相关(PR)启动子(其可以对化学物(例如水杨酸、乙烯、硫氨和/或BTH)起反应)(美国专利第5,689,044号)或其类似物或其某种组合。可诱导的启动子也可以对光或黑暗(美国专利第5,750,385号、美国专利第5,639,952号)、金属(真核细胞(Eukaryotic Cell)2：995-1002(2003))或温度(美国专利第5,447,858号；亚伯(Abe)等人，植物细胞生理学(Plant CellPhysiol.)49：625-632(2008)；施罗达(Shroda)等人，植物杂志(Plant J.)21：121-131(2000))起反应。上述列表是例示性并且不造成限制。启动子序列可以来自任何有机物，限制条件是其在宿主有机物中具有功能性。在某些实施例中，可诱导的启动子是通过是来自已知的可诱导的启动子的一或多个部分或结构域与可以在宿主细胞中操作(例如赋予在宿主物种中操作的启动子可诱导性)的不同启动子的至少一部分融合而形成。
对于蓝藻细菌的转型，可以利用多种在蓝藻细菌中具有功能的启动子，包括(但不限于)ara、lac、tac和trc启动子，以及也可以通过添加异丙基β-D-1-硫哌喃半乳糖苷(IPTG)而诱导的衍生物，例如trcY或trcE启动子。其它可以用于本发明中的启动子包括与转位子或细菌染色体负载的抗生素抗性基因天然相关的启动子(例如新霉素磷酸转移酶、氯霉素乙酰转移酶、壮观霉素腺嘌呤转移酶或其类似物或其组合)、与各种异源细菌性和原生藻青菌基因相关的启动子、来自病毒和噬菌体的启动子、合成启动子或其类似物或其组合。例如，启动子可以选自来自多种物种(包括真细菌和藻青菌物种)的原核生物启动子，例如araC或pBAD启动子、rha启动子、Pm启动子、xylS启动子、nir启动子、nar启动子、pho启动子、tet启动子、cys启动子、金属硫蛋白启动子、ftf启动子、gln启动子、热休克启动子、寒冷可诱导的启动子或病毒启动子。上述启动子是例示性并且不造成限制。从蓝藻细菌分离的可以使用的启动子包括(但不限于)以下：nrs(镍可诱导)、secA(分泌；通过细胞的氧化还原态控制)、rbc(核酮糖-1，5-二磷酸羟化/加氧酶(Rubisco)操纵子)、psaAB(PS I反应中心蛋白质；光调节)、psbA(PSII的Dl蛋白质；光可诱导)及其类似物，及其组合。在一些实施例中，启动子是由氮化合物调节，例如nar、ntc、nir或nrt启动子。在一些实施例中，启动子是由磷酸(例如pho或pst启动子)或金属调节，例如nrs启动子(刘(Liu)和柯蒂斯(Curtis)(2009)美国科学院院刊(Proc NatlAcad Sciences USA)106：21550-21554)，或petE启动子(布瑞克玛(Buikema)和哈塞尔克(Haselkorn)(2001)美国科学院院刊98：2729-2734)。如本发明的构筑体中所使用，可诱导的启动子可以使用上述启动子和/或与可以在宿主有机物中操作(例如赋予在宿主物种中操作的启动子可诱导性)的不同启动子的至少一部分融合的其它可诱导启动子的一或多个部分或结构域。
类似地，多种转录终止子可以用于表达载体构造。可能终止子的实例可以包括(但不限于)psbA、psaAB、rbc、secA、T7鞘蛋白及其类似物，及其组合。
在一些实施例中，本发明的经分离的或重组型核酸分子可以包含编码脱氢酶的核酸序列和编码参与脂质合成的多肽(例如硫酯酶或其它脂质产生多肽)的核酸序列。编码脱氢酶和脂质产生多肽的核酸序列可以是例如本文中所描述的核酸序列中的任一种。在某些实施例中，编码脱氢酶的核酸序列和编码参与脂质产生的多肽的核酸序列可以可操作地连接于相同启动子和/或强化子。例如，在特定实施例中，两个基因(编码脱氢酶和例如硫酯酶)可以组织成操纵子，其中例如沿5′到3′方向，启动子序列后接有硫酯酶编码序列(或其它多肽编码序列)并且接着是脱氢酶编码序列，或反之亦然。在包括脱氢酶基因和编码用于脂质合成的多肽的基因的操纵子的任一种上述实施例中，经分离的核酸分子中可以包括一或多个额外调节序列，例如任何基因编码序列的上游可以包括用于增强转译的序列，和/或可以任选地在合成操纵子的3′端或其附近包括转录终止子。
除脱氢酶基因和编码参与脂质产生的多肽的基因之外，本文中提供的合成操纵子中可以任选地包括一或多种附加基因，其中所述一或多种附加基因可以包括例如一或多种编码脂肪酸合成或脂肪酸合成或脂质合成途径的酶或蛋白质的附加基因和/或一或多种编码可增强脂肪酸产物合成的酶或蛋白质的基因、一或多种可增强光合作用或碳固定的基因和/或一或多种报导基因或可选择标记。
在一些实施例中，编码脱氢酶的核酸序列和编码参与脂质产生的多肽的核酸序列可以提供于同一个核酸构筑体上，其在所述构筑体上可操作地连接于不同启动子和/或转录强化子。启动子和强化子可以是例如本文中所描述的启动子和转录强化子中的任一种。
在某些实施例中，设计包含编码脱氢酶的核酸序列的载体经以用于转型到蓝藻细菌中。在特定实施例中，载体允许脱氢酶编码序列与藻青菌基因组的同源重组。
本发明的经分离的核酸分子可以包括本文中公开的序列，其编码脱氢酶或载体(例如(但不限于)表达载体)中的其它多肽。载体可以是通过人类介入(包括通过重组型手段和/或直接化学合成)而产生的核酸，并且可以包括例如以下各者中的一或多种：1)用于一或多种宿主(其可以包括或可以不包括产生宿主)中核酸序列的繁殖的复制起点；2)一或多种可选择标记；3)一或多种报导基因；4)一或多种表达控制序列，例如(但不限于)启动子序列、强化子序列、终止子序列、用于增强转译的序列等；和/或5)一或多种用于促进核酸序列整合到宿主基因组中的序列，例如一或多种与宿主微生物的一或多种核苷酸序列具有同源性的序列。载体可以是表达载体，其包括一或多种指定的核酸核酸“表达控制元件”，其允许宿主细胞中特定核酸的转录和/或转译。载体可以是质体、质体的一部分、病毒构筑体、核酸片段或其类似物，或其组合。
载体可以是高拷贝数载体、可以在一种以上细胞物种中复制的往复载体、表达载体、整合载体或其组合。典型地，表达载体可以包括核酸，其包含可操作地连接于“表达盒”中的启动子的相关基因，所述表达盒还可以包括(但不限于)转录终止子、核糖体结合位点、剪接位点或剪接识别序列、内含子、强化子、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点和类似元件。根据一些实施例，本发明可以涉及在异源启动子控制下用包含相关基因的经分离的核酸转型的重组型微生物。或者，如果载体不含有与包含相关基因的经分离的核酸可操作地连接的启动子，那么可以通过同源重组、位点特异性整合和/或载体整合将经分离的核酸转型到微生物或宿主细胞中，使得其变成可操作地连接于内源启动子。
在一些实施例中，本发明还提供用包含相关基因的经分离的核酸转型的重组型微生物或宿主细胞，所述经分离的核酸可操作地连接于一或多种表达控制元件。在一些情况下，在重组型微生物的繁殖期间的某一点表达蛋白质可以是有利的，例如最小化任何对重组型微生物的生长或增殖有害的作用和/或最大化相关三酸甘油酯或脂肪酸产物的产生。在所述实例中，引入重组型微生物或宿主细胞中的一或多种外源基因可以可操作地连接于可诱导的启动子，所述可诱导的启动子响应于特定刺激而介导可操作地连接的基因的转录。
转型载体可以额外或替代性地包括可选择标记，例如(但不限于)抗药性基因、抗除草剂基因、宿主存活所需的代谢酶和/或因子(例如营养缺陷标记)或其类似物，或其组合。可以在抗生素和/或其它可选择标记存在下、在其中缺乏抗性盒或营养缺陷标记的细胞无法生长的条件下的生长能力为基础来选择经转型的细胞。另外，载体上可以存在非可选择标记，例如编码荧光蛋白质的基因或产生可侦测反应产物的酶。
微生物和宿主细胞的转型
可以通过常规转型和/或转染技术将包含经分离的核酸的载体引入蓝藻细菌中，所述经分离的核酸包含相关基因。本文中所使用的术语“转型”、“转染”、“结合”和“转导”意图包含所属领域的技术人员已知的多种用于将外来核酸(例如外源DNA)引入宿主细胞中的方法，包括磷酸钙和/或氯化钙共沉淀、DEAE-聚葡萄糖介导的转染、脂质体转染、自然感受态、化学介导的转移、电致孔、粒子轰击或其类似方法，或其组合。用于宿主细胞的转型和/或转染的合适方法的实例可以例如见于分子克隆实验指南(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)(2010)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中。
用于本发明的宿主细胞(例如植物)可以通过任何可行手段转型，包括(但不限于)使用土壤杆菌(Agrobacterium)、粒子枪介导的转型、激光介导的转型或电致孔。藻类和光合细菌可以通过任何合适方法转型，作为非限制性实例，包括天然DNA摄取(钟(Chung)等人(1998)微生物学期刊(FEMS Microbiot Lett.)164：353-361；弗雷加德(Frigaard)等人(2004)分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)274：325-40；臧(Zang)等人(2007)微生物学杂志（J.Microbiol.)45：241-245)、结合(沃尔克(Wolk)等人(1984)美国科学院院刊81，1561-1565)、转导、玻璃珠转型(金度(Kindle)等人(1989)细胞生物学杂志（J.Cell Biol.)109：2589-601；冯(Feng)等人(2009)分子生物学期刊(Mol.Biol.Rep.)36：1433-9；美国专利第5,661,017号)、碳化硅晶须转型(杜纳赫(Dunahay)等人(1997)分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)(1997)62：503-9)、基因枪(道森(Dawson)等人(1997)现代微生物学(Curr.Microbiol.)35：356-62；哈尔曼(Hallmann)等人(1997)美国科学院院刊94：7469-7474；亚克拜克(Jakobiak)等人(2004)原生生物(Protist)155：381-93；谭(Tan)等人(2005)微生物学杂志43：361-365；施泰因布伦纳(Steinbrenner)等人(2006)应用环境微生物学(Appl Environ.Microbiol.)72：7477-7484；克罗斯(Kroth)(2007)分子生物学方法390：257-267；美国专利第5,661,017号)、电致孔(卡杰拉夫(Kjaerulff)等人(1994)光合物研究(Photosynth.Res.)41：277-283；岩井(Iwai)等人(2004)植物细胞生理学(Plant CellPhysiol.)45：171-5；拉文德兰(Ravindran)等人(2006)微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)66：174-6；孙(Sun)等人(2006)基因(Gene)377：140-149；王(Wang)等人(2007)应用微生物学生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)76：651-657；肖拉西亚(Chaurasia)等人(2008)微生物学方法杂志73：133-141；路德维格(Ludwig)等人(2008)应用微生物学生物技术78：729-35)、激光介导的转型，或在以下各者中的任一者存在下或在用以下各者中的任一者预先处理后与DNA一起培育：聚(酰氨基氨)树枝状聚合物(帕苏菲斯(Pasupathy)等人(2008)生物技术杂志(Biotechnol.J.)3：1078-82)、聚乙二醇(欧努马(Ohnuma)等人(2008)植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)49：117-120)、阳离子性脂质(穆拉德瓦(Muradawa)等人(2008)生物科学和生物工程学杂志(J.Biosci.Bioeng.)105：77-80)、聚葡萄糖、磷酸钙或氯化钙(蒙德斯-阿尔瓦雷斯(Mendez-Alvarez)等人(1994)细菌学杂志(J.Bacteriol.)176：7395-7397)，任选地在用细胞壁分解酶对细胞进行后处理(派诺尼(Perrone)等人(1998)分子生物细胞(Mol.Biol.Cell)：3351-3365)。也可以对海藻细胞进行土壤杆菌介导的转型，例如在移除或损伤海藻细胞壁后(例如WO 2000/62601；库玛(Kumar)等人(2004)植物科学(Plant Sci.)166：731-738)。基因枪方法可以尤其成功地用于植物和真核生物海藻物种的叶绿体的转型(参见例如拉梅斯(Ramesh)等人(2004)分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)274：355-307；杜斯克(Doestch)等人(2001)现代遗传学(Curr.Genet.)39：49-60；美国专利第7,294,506号；WO 2003/091413；WO 2005/005643；和WO 2007/133558，其均以全文引用的方式并入本文中)。
产生脂肪酸产物的方法
本发明涵盖通过在表达脱氢酶并且产生至少一种脂肪酸产物的条件下培养如本文中所描的包括编码脱氢酶的非原生基因的重组型微生物来产生脂肪酸产物的方法。所述方法可以更包含分离至少一种脂肪酸产物。编码脱氢酶的非原生基因的表达可以任选地在培养期期间诱导。任选地，至少一部分由重组型微生物产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以由微生物释放或分泌到生长培养基中。
本文中还提供产生脂质的方法，其包含将包括编码脱氢酶的非原生基因和至少一种编码参与脂质产生的多肽的非原生基因的重组型微生物在所述编码脱氢酶的非原生基因和所述至少一种编码用于脂质产生的多肽的基因经表达的条件下培养，从而产生脂质。所述方法可以更包含分离至少一种脂质。脂质可以是例如脂肪酸产物。
在本文中提供的任一种方法中，与对照微生物的对照培养物所产生的相比，包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物的培养物可以产生更多的脂质(例如脂肪酸产物)，所述对照微生物除了不包括编码脱氢酶的非原生基因以外，在所有其它方面均与包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物的培养物相同。在本文中提供的任一种方法中，与对照微生物相比，包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物具有更高的繁殖和/或增殖速率，所述对照微生物除了不包括编码脱氢酶的非原生基因以外，在所有其它方面均与包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物相同。例如，在培养一天、两天、三天、四天、五天、六天或六天以上之后，与对照培养物所实现的相比，包括非原生脱氢酶基因的重组型微生物的培养物可以实现更高的细胞密度。所述方法中使用的重组型微生物可以是光合微生物，并且所述培养可以在光合自养条件下进行，其中无机碳是用于培养物增殖和脂质产生的实质上唯一碳来源。
在一些实例中，由包括非原生脱氢酶基因和至少一种非原生脂质产生基因的重组型微生物产生的更大量的脂质(例如脂肪酸产物)可以是并非由微生物天然产生的脂质，例如并非由缺乏所述至少一种编码参与脂质(例如脂肪酸产物)产生的多肽的非原生基因的相同物种微生物产生的脂质。
如本文中在本发明的产物的情形中所使用，释放和分泌可以互换地使用，其是指主动和/或被动转运机制用于允许本发明的产物穿过细胞膜从而里靠细胞的过程。所述转运机制的实例可以包括(但不限于)梯度扩散、促进扩散、主动转运及其组合。
培养是指通过使用所选和/或受控条件有意促进一或多种细胞的生长(例如细胞尺寸、细胞内含物和/或细胞活动)和/或繁殖(例如细胞数目通过有丝分裂而增加)。生长和繁殖的组合可以称为增殖。如本文中实例所证明，与不包括非原生脱氢酶基因的脂质产生细胞的培养物相比，脱氢酶基因通过脂质产生细胞的表达引起培养物的细胞密度增加。
可用于培养重组型微生物的所选和/或受控条件的非限制性实例可以包括使用合成培养基(具有已知特征，例如pH值、离子强度和/或碳源)、指定温度、氧张力、二氧化碳含量、在生物反应器中生长或其类似条件，或其组合。在一些实施例中，可以使用经还原的碳源使微生物或宿主细胞按异养方式生长，或使用光和经还原的碳源使其按混合菅养方式生长。或者或另外，微生物或宿主细胞可以按光营养方式培养。当按光营养方式生长时，微生物可以有利地使用光作为能源。无机碳来源(例如CO2或碳酸氢盐)可以用于微生物的生物分子合成。如本文中所使用的“无机碳”包括无法由有机物用作可持续能源的含碳化合物或分子。典型地，“无机碳”可以呈CO2(二氧化碳)、碳酸、碳酸二氢盐、碳酸盐、碳酸一氢盐或其类似物，或其组合的形式，其无法由有机物更进一步地氧化用于持续能量，也不能用作还原能力的来源。按光合自养方式生长的微生物可以在无机碳是实质上唯一碳来源的培养基上生长。例如，在无机碳是实质上唯一碳来源的培养物中，培养基中可以提供的任何有机碳分子或化合物均不能由细胞溶解和/或代谢产生能量和/或不能按足以提供用于细胞培养物的生长和增殖的可持续能量的量存在。
根据本发明的方法，可在全世界的各种位置和环境中发现可以适用的微生物和宿主细胞。用于脂质和/或其它烃成分的繁殖和产生的特定生长培养基可以变化并且可以经最佳化以促进产物(例如脂质)的生长、繁殖或产生。在一些情况下，由于存在一些抑制性组分或缺乏特定微生物或宿主细胞品系的一些必要的营养需求，某些微生物品系可能无法在特定生长培养基中生长。
固体和液体生长培养基通常是从多种来源获得，用于制备适用于多种微生物品系的特定培养基的说明也是如此。例如，对于用于培养藻类的培养基和方法，各种淡水和咸水培养基可以包括巴桑迪(Barsanti)(2005)藻类：解剖学，生物化学和生物工程学(Algae：Anatomy，Biochemistry&Biotechnology)，CRC出版社中描述的培养基。海藻培养基配方也可以见于各种海藻培养物集合的网站，作为非限制性实例，包括UTEX藻类培养物集合(UTEXCulture Collection of Algae)(www.sbs.utexas.edu/utex/media.aspx)(2011年9月20日访问)；藻类和原虫的培养物集合(Culture Collection of Algae and Protozoa)(www.ccap.ac.uk)(2011年9月20日访问)；和Katedra Botaniky (botany.natur.cuni.cz/algo/caup-media.html)(2011年9月20日访问)。
在一些实施例中，用于培养产生脂肪酸的有机物的培养基与标准培养基配方(例如标准BG-11培养基(ATCC培养基616(ATCC Medium 616)，表5))或经改良的培养基(例如ATCC培养基854(经改良以含有维生素B12的BG-11)或ATCC培养基617(经改良以用于海洋蓝藻细菌的BG-11，其含有额外的NaCl和维生素B12))相比，可以包括增加的浓度的金属(典型地按盐和/或离子性形式提供)，例如钠、钾、镁、钙、锶、钡、铍、铅、铁、镍、钴、锡、铬、铝、锌、铜或其类似物，或其组合(尤其多价金属，例如镁、钙和/或铁)。
例如，与标准培养基相比，用于产生游离脂肪酸的微生物的生长的培养基可以包括至少2倍，例如至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、2倍与10倍之间和/或10倍与100倍之间的量的金属(例如钙)。用于可以产生游离脂肪酸的微生物的生长的培养基可以在配方中包括例如至少0.5mM、约0.5mM与约1mM之间、约1mM与约2mM之间、约2mM与约5mM之间、约5mM与约10mM之间、约10mM与约25mM之间和大于25mM的金属(例如钙)。例如，通过在培养基中使用过量的金属(例如钙)，至少一部分脂肪酸可以螯合成皂状沈淀物，从而可以引起降低游离脂肪酸的毒性作用。在培养基中添加金属(例如钙)可以额外或替代性地增加培养基中的微生物在相对高浓度的游离脂肪酸情况下的耐受性。或者或另外，产生脂肪酸的品系在过量金属(例如钙)含量情况下可以有利地更加稳固。尽管在本文中描述金属作为过量组分，但预期组分可以更通常地描述成羧酸盐相对离子来源，例如形成皂状物的相对离子来源、金属离子来源(本文中标注为“金属”)、多价(亦即原子价是+2或更高)相对离子来源、二价相对离子来源或其某种组合。关于这种金属/羧酸盐相对离子来源的其它细节描述于共同待决的、共同转让的2011年12月13日申请的题为“Culturing a Microorganism in a Medium with an Elevated Level of aCarboxylate Counterion Source”的美国专利申请案第13/324,636号中。
培养方法可以包括诱导以下基因中的一种或两种的表达：如所描述的脱氢酶基因和编码参与脂肪酸产物和三酸甘油酯产生的蛋白质和/或调节微生物中的代谢途径的基因。诱导表达可以包括向培养物中添加营养物或化合物、从培养基移除一或多种组分、增加或降低光和/或温度，和/或其它促进相关基因的表达的操作。所述操作可以主要依赖于可操作地连接于相关基因的(异源)启动子的性质。
在本发明的一些实施例中，重组型微生物或宿主细胞可以在生物反应器中培养。“生物反应器”是指其中培养(任选地在悬浮液中并且当悬浮时，优选在水性液体中)细胞的封装或部分封装。生物反应器可以用于培养微藻细胞使其达到其生理学循环的各种阶段。生物反应器可以提供许多优点用于异养生长和繁殖方法。为了产生用作食物的生物质，微生物或宿主细胞优选在大量液体中(例如在例如悬浮液培养物中)发酵。生物反应器(例如钢发酵器)可以容纳极大的培养物体积(本发明的各种实施例中可以使用40,000升和更大容量的生物反应器)。生物反应器还可以典型地允许控制一或多种培养物条件，例如温度、pH值、氧张力、二氧化碳含量及其类似物，以及其组合。生物反应器可以典型地是可组态的，例如使用连接到管道的端口，从而允许气态组分(例如CO2、富含CO2的空气、氧和/或氮)与液体培养物接触(例如通过鼓泡)。使用生物反应器可以典型地更容易地操作其它培养物参数，例如培养基的pH值、微量元素和/或营养物的身份和/或浓度、其它培养基成分的身份和/或浓度或其类似参数，或其组合。
微生物和宿主细胞可以额外或替代性地在配备有人工光源(“光生物反应器”)和/或可以具有一或多个对光(包括阳光)足够透明的器壁的生物反应器中培养，从而实现、促进和/或保持可接受的微生物生长和增殖。对于产生脂肪酸产物或三酸甘油酯，光合微生物或宿主细胞可以额外或替代性地在摇瓶、试管、小瓶、微量滴定碟、皮氏培养皿(petridishes)或其类似物或其组合中培养。
或者或另外，重组型光合微生物或宿主细胞可以在池塘、河流、以海水为基础的生长容器、沟渠、水道、通道或其类似物或其组合中生长。与标准生物反应器相同，可以向培养物供应无机碳(例如(但不限于)CO2、碳酸氢盐、碳酸盐及其类似物)来源，包括(但不限于)空气、富含CO2的空气、烟道气或其类似物，或其组合。当供应烟道气和/或其它除CO2以外可能含有CO的无机物来源时，可能需要预先处理所述来源使得引入(光)生物反应器中的CO含量不会对微生物的生长、增殖和/或存活造成危险和/或致死剂量。
所述方法包括培养包括编码如本文中所描述的脱氢酶的非原生基因的重组型微生物(例如光合微生物，例如微藻或藻青菌)以产生至少一种脂肪酸产物，其中在相同条件下培养时，所述方法引起培养物的产量比除了不包括编码脱氢酶的非原生基因以外其它方面均相同的微生物的培养物产生的脂肪酸产物的量高至少或约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。或者或另外，所述方法包括通过培养本文中所描述的重组型微生物，每公升脂肪酸产物的培养物产生至少100毫克、至少110毫克、至少120毫克、至少130毫克、至少140毫克、至少150毫克、至少160毫克、至少170毫克、至少180毫克、至少190毫克、至少200毫克、至少210毫克、至少220毫克、至少230毫克、至少240毫克、至少250毫克、至少260毫克、至少270毫克、至少280毫克、至少290毫克、至少300毫克、至少310毫克、至少320毫克、至少330毫克、至少340毫克、至少350毫克、至少360毫克、至少370毫克、至少380毫克、至少390毫克、至少400毫克、至少450毫克、至少500毫克、至少550毫克、至少600毫克、至少650毫克、至少700毫克、至少750毫克、至少800毫克、至少850毫克、至少900毫克、至少950毫克。尽管通常目标可以是产生和/或回收尽可能多的脂肪酸产物，但在一些情况下，通过本文中所描述的方法产生和/或回收的脂肪酸产物的量可能限于每升培养物约2克或小于2克，例如每升培养物1.5克或小于1.5克、每升培养物1克或小于1克、每升培养物800毫克或小于800毫克、每升培养物600毫克或小于600毫克，例如每升培养物约550毫克或小于550毫克，或每升培养物约500毫克或小于500毫克。
可以通过所属领域的技术人员已知的回收手段从培养物回收脂肪酸产物，例如通过完全培养物提取，例如使用有机溶剂。在一些情况下，可以通过细胞均质化增强脂肪酸产物的回收。例如，可以通过在高温和/或高压下用溶剂对藻类进行提取来从藻类分离脂质，例如脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酸甘油酯，如共同待决的、共同转让的2012年2月29日申请的题为“Solvent Extraction of Products from Algae”的美国专利申请案第13/407,817号中所描述，其以全文引用的方式并入本文中。
当脂肪酸产物从微生物充分释放或分泌到培养基中时，可以调节回收方法以便仅回收释放的脂肪酸产物、仅微生物内产生和储存的脂肪酸产物或产生和释放的脂肪酸产物两者。可以按多种方式回收由上述重组型微生物分泌/释放到培养基中的脂肪酸产物。可以使用简单的分离方法，例如通过使用不混溶溶剂进行分配。或者或另外，可以使用颗粒吸附剂。视回收方法的设计而定，这些颗粒可以包括亲脂性颗粒和/或离子交换树脂。其可以在经分离的培养基中循环并且接着被收集，和/或培养基可以经过含有这些颗粒的固定床管柱，例如层析柱。接着可以从颗粒吸附剂溶离脂肪酸产物，例如通过使用适当溶剂。在所述环境中，一种分离方法可以包括进行溶剂蒸发，接着进一步处理经分离的脂肪酸产物，从而产生可以用于多种商业目的的化学物和/或燃料。
在一些实例中，与除了缺乏非原生脱氢酶基因以外其它方面均相同的微生物或宿主细胞的培养物相比，培养物中的脂肪酸产物(例如C8-C24脂肪酸、C10-C22脂肪酸或C12-C18脂肪酸，例如C12、C14、C16和/或C18脂肪酸中的至少一种)的含量可以增加。本发明更包括组合物，其包括由本发明的方法产生的游离脂肪酸、脂肪酸衍生物或甘油酯。
或者或另外，本发明可以包括以下实施例中的一或多者：
实施例1.包含第一非原生核酸分子和至少一种第二非原生核酸分子的重组型微生物，所述第一非原生核酸分子包含编码脱氢酶的核苷酸序列并且所述第二非原生核酸分子包含编码参与脂质生物合成的多肽的序列；其中与微生物的对照培养物所产生的相比，重组型微生物的培养物产生更高量的脂质，所述对照微生物除了不包括编码脱氢酶的第一非原生核苷酸序列以外，在所有方面均与包括第一非原生核苷酸序列和第二非原生核苷酸序列的重组型微生物相同，其中在产生脂质的条件下，重组型微生物与对照微生物相比具有更高的繁殖和/或增殖速率。
实施例2.如实施例1的重组型微生物，其中脱氢酶是选自由以下组成的群组：醛脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、2-羟基酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甲基丙二酸半醛脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、α酮戊二醛脱氢酶、D-2-羟基酸脱氢酶、D-2-羟基异己酸酯脱氢酶、甲酸脱氢酶、D-甘油酸脱氢酶、万古霉素抗性蛋白质H、D-2-磷酸甘油酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶和山梨醇脱氢酶，和/或脱氢酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少50％一致性的氨基酸序列。
实施例3.如实施例1或2的重组型微生物，其中参与脂质生物合成的多肽是选自由以下组成的群组：酰基ACP硫酯酶、酰基CoA硫酯酶、4-羟基苯甲酰基-硫酯酶、具有解脂活性的多肽、形成醛的酰基CoA还原酶、形成醛的酰基ACP还原酶、羧酸还原酶、形成醇的酰基CoA还原酶、形成醇的酰基ACP还原酶、蜡合成酶、脱羰酶、脱羧酶、GPAT、LPAAT、PAP和DGAT；更任选地其中脂质是选自由以下组成的群组的脂肪酸产物：游离脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、烷、烯、脂肪酸酯、蜡酯、单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯。
实施例4.如先前实施例中任一项的重组型微生物，其中第一非原生核酸分子包含：
编码醛脱氢酶的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：6或SEQ IDNO.：7具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或95％与100％之间的一致性的氨基酸序列；
编码甲基丙二酸半醛脱氢酶的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或95％与100％之间的一致性的氨基酸序列；
编码D-2-羟基酸脱氢酶的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％与100％之间的一致性的氨基酸序列；
编码D-2-羟基酸脱氢酶的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％与100％之间的一致性的氨基酸序列；
编码磷酸葡糖酸脱氢酶的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％与100％之间的一致性的氨基酸序列；或
编码磷酸葡糖酸脱氢酶的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：13具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或95％与100％之间的一致性的氨基酸序列。
实施例5.如先前实施例中任一项的重组型微生物，其中与微生物的对照培养物所产生的相比，包括编码脱氢酶的第一非原生核酸分子和编码参与脂质产生的多肽的第二非原生核酸分子的重组型微生物的培养物产生更高量的脂质，所述对照微生物除了不包括编码脱氢酶的第一非原生核苷酸序列以外，在所有方面均与包括第一非原生核苷酸和第二非原生核苷酸序列的重组型微生物相同；
其中脂质是不由与不包括第二非原生核酸分子的重组型微生物相同的物种或品系的微生物产生的脂肪酸产物。
实施例6.如先前实施例中任一项的重组型微生物，其中重组型微生物是光合微生物。
实施例7.如先前实施例中任一项的重组型微生物，其中光合微生物是藻青菌，其任选地选自由以下各者组成的群组：阿格藻属、鱼腥藻属、项圈藻属、组囊藻属、束丝藻属、节旋藻、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、藻青菌、双色藻、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝丝菌属、拟筒孢藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、包皮藻属、侧生藻属、夫列藻属、盖特勒氏菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、粘杆菌属、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、海洋海洋原绿球藻品系属、原绿藻属、原绿丝蓝细菌属、假鱼腥蓝细菌属、胶须藻属、裂须藻属、枝藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔氏菌属、斯塔尔氏蓝细菌属、多列藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球蓝细菌属、单歧藻属、束毛藻属、灰线蓝细菌属和异球藻属；或光合微生物是微藻，其任选地选自由以下各者组成的群组：弯杆藻属、苗形藻属、双眉藻属、纤维藻属、星胞藻属、黄金色藻属、包特氏菌属、葡萄藻属、淡水小荀球藻属、角毛藻属、卡特藻属、衣藻属、绿球藻属、绿梭藻属、变异小球藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐甲藻属、隐藻属、小环藻属、杜氏藻属、椭圆藻属、椭圆藻属、独球藻属、眼虫藻属、眼虫藻、被剌藻属、脆杆藻属、丽丝藻属、红球藻属、嗜盐古菌、膜胞藻属、等鞭金藻属、鳞孔藻属、微芒藻属、单针藻属、微球藻属、微拟球藻属、舟形藻属、新绿藻属、肾鞭藻属、肾藻属、菱形藻属、掠鞭藻属、鞘藻属、卵囊藻、绿藻属、巴夫藻属、拟变异小球藻、杜氏亚属盐藻、褐指藻属、嗷菌体属、微微型产油绿藻、扁藻属、颗石藻属、肋球藻属、原壁菌属、拟绿球藻属、拟新藻属、塔胞藻、桑椹藻属、栅列藻属、绿藻、骨条藻属、螺旋藻属、裂丝藻属、四变异小球藻、四鞭藻属、海链藻属、变异小球藻微藻或团藻属。
实施例8.如实施例6或7的重组型光合微生物，其中编码脱氢酶的第一核酸分子的表达使NADPH与NADP+的细胞内比率与除了缺乏第一核酸以外其它方面均相同的微生物中的NADPH与NADP+的比率相比增加，例如其中细胞内NADPH/NADP+比率比除了缺乏第一核酸以外其它方面均相同的微生物高约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约60％、约80％、约100％、约150％、约200％、约300％、约500％、约700％、约900％、约1000％或约2000％。
实施例9.如实施例6至8中任一项的重组型光合微生物，其中重组型微生物的培养物产生的脂肪酸产物比除了缺乏所述第一核酸以外其它方面均相同的微生物的培养物多约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约500％、约700％、约1000％或约2000％。
实施例10.如实施例6至9中任一项的重组型光合微生物，其中重组型光合微生物的复制速率比除了缺乏所述第一非原生核酸分子以外其它方面均相同的光合微生物高约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约60％、约80％、约100％、约150％、约200％、400％、约600％、约800％、约1000％或至少2000％。
实施例11.一种产生脂质的方法，其包含将如前述实施例中任一项的重组型微生物在合适培养基中培养足够长时间，从而产生脂质，任选地其中脂质是选自由以下各者组成的群组的脂肪酸产物：游离脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇、烷、烯、脂肪酸酯、蜡酯、单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯。
实施例12.如实施例11的方法，其中重组型微生物是光合微生物并且重组型光合微生物是按光合自养方式培养。
实施例13.如实施例11或12的方法，其中所述方法包括诱导编码脱氢酶的核酸和编码参与脂质产生的多肽的核酸序列中的一者或两者的表达。
实施例14.如实施例11至13中任一项的方法，其中所述方法更包含从培养物回收脂质。
实施例15.一种增加微生物的生长和/或增殖速率的方法，所述微生物产生脂质，其中所述方法包括在产生脂质的微生物中表达编码脱氢酶的重组型核酸分子，和在支持微生物生长和/或增殖的条件下培养微生物，其中微生物的生长和/或增殖速率大于对照微生物，所述对照微生物是在相同条件下培养并且除了不表达编码脱氢酶的重组型核酸分子以外，其它方面均与重组型微生物相同。
实施例16.如实施例11至15中任一项的方法，其中在培养三天、四天、五天或六天后，与除了缺乏编码脱氢酶的非原生基因以外其它所有方面均相同的微生物的相同培养物达到的培养物密度相比，培养物达到更高的光密度。
实施例17.一种细胞培养物，其包含如实施例1至10中任一项的重组型微生物，任选地其中重组型微生物是光合重组型微生物并且培养物不包括大量的经还原的碳源。
实施例18.一种经分离的核酸分子，其包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性的氨基酸序列。
实例
实例1
设计筛选以用于鉴别编码能够增强微生物产生脂肪酸的蛋白质的基因。尼罗蓝(Nile Blue)筛选使用了携带来自克非亚草的N末端截短型式的CclFatB1酰基ACP硫酯酶(针对集胞藻属密码子优化的核苷酸序列，SEQ ID NO：20，氨基酸序列SEQ ID NO：21；参见US 2011/0020883，以引用的方式并入本文中)的前10种大肠杆菌品系作为背景，用于含有来自从德克萨斯州马德雷湖(Laguna Madre，Texas)的航道移出的环境样品的DNA片段的宏基因组文库的转型。基于板的分析用于鉴别含有10μg/mL尼罗蓝A(马萨诸塞州沃德山的阿法埃莎公司(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)#A17174)的固体培养基上产生游离脂肪酸的重组大肠杆菌集落。尼罗蓝将脂肪酸染成蓝色。通过将板置放在标准光箱上通过针对染色目测检查来检查集落。对相较于表达CclFatB1硫酯酶但并不包括文库片段的背景对照展示高水平的尼罗蓝A染色的集落进行选择，使其生长，并进一步筛选以使用游离脂肪酸检测试剂盒(#SFA-1，北卡罗莱纳州三角研究园的禅生物公司(Zenbio，Inc，Research Triangle Park，NC))测定总非酯化游离脂肪酸(FFA)的量。
在尼罗蓝板分析和随后根据使用游离脂肪酸检测试剂盒的分析中相较于背景对照展示出游离脂肪酸水平提高的大肠杆菌克隆株的游离脂肪酸含量通过气相色谱(GC)使用火焰离子化检测(GC-FID)进一步分析。将在GC-FID分析中相较于背景对照展示出游离脂肪酸水平提高的两百个分离株选择出来，并测定克隆株的核苷酸序列。这些分离株中的克隆的片段基于其序列的生物信息学分析各自含有一到至少五个开放阅读框架(潜在基因)。在DNA测序并去除冗余克隆株之后，再次分析序列以鉴别重现的蛋白域。将指示“NB”的克隆株从尼罗蓝分析中分离出来。还进行引起克隆株B10分离的单独的遗传分析，以用于使用由来自水样品的DNA分离物制成的宏基因组文库检测增强的脂肪酸生物合成，所述水样品采集自位于加利福尼亚州南部索尔顿湖以北(North of the Salton Sea in southernCalifornia)的太平洋水产养殖场(Pacific Aquafarms)的池塘(表1)。
数种克隆株被鉴别为具有编码含有脱氢酶域的多肽的开放阅读框架(表1)。克隆株B10和NB106被鉴别为包括编码D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶的序列；NB8和NB112被鉴别为编码醛脱氢酶；且NB104被鉴别为编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶。因此，在功能筛选中分离的经克隆片段中鉴别出编码三种不同类型脱氢酶的基因。
表1：从分析中选出的克隆株.
B10插入物包括编码被鉴别为属于Pfam 02826(“D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶，NAD结合域”，采集截止值，25.1)的多肽(SEQ ID NO：2)的开放阅读框架(ORF)(SEQ ID NO：1)，其中二进制分数为159.3且e值为4.2 e-47。B10 ORF编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与多型浅黄SL003B-26A1的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶NAD-结合蛋白(基因ID：328542593；寄存编号YP_004302702)64％一致；与亚历山大拉布伦茨氏菌DFL-11的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(基因ID：254503433；寄存编号ZP_05115584)57％一致；与丛集斯塔普氏菌IAM126114的2-醇酸脱氢酶(基因ID：118438963；寄存编号ZP_01545666)56％一致；且与海单胞菌属MWYL1(基因ID：5367846；寄存编号YP_001342133)的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(NAD-结合)55％一致。B10 ORF的前十二个氨基酸(SEQ ID NO：2)在蛋氨酸(多型浅黄D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶NAD-结合蛋白的第一个氨基酸)的上游，因此这些氨基酸可能并非由B10 ORF编码的天然蛋白的一部分：所编码的多肽很可能包含SEQ ID NO：2的氨基酸13-326。SEQ ID NO：29代表SEQ ID NO：2的氨基酸13-326。
NB106插入物包括编码与作为粪肠球菌的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(ZP_05597403；SEQ ID NO：16)的氨基酸1-137一致的多肽(SEQ ID NO：15)的开放阅读框架(SEQID NO：14)。此多肽序列募集到Pfam PF00389(“D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶，催化域”，采集截止值，24.6)，其中二进制分数为57.6且e值为7.8e-16。与由NB106ORF(SEQ ID NO：14)编码的多肽具有同源性的其它D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶包括鹑鸡肠球菌EG2(ZP_05648199；EEV31532)的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(79％一致性)；酪黄肠球菌ATCC12755(ZP_08145011；EGC69912)的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(78％一致性)；肉食杆菌属AT7(ZP_02185893；EDP67348)的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(72％一致性)；屎肠球菌E1636(ZP_06695345；EFF23321)的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(78％一致性)；乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)7_4(ZP_06196181；EFA27324)的2-醇酸脱氢酶(63％一致性)；短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC 367(YP_794343；ABJ63312)的2-醇酸脱氢酶(63％一致性)；人类外皮乳酸杆菌(Lactobacillus coleohominis)101-4-CHN(ZP_05553013；EEU30233)的2-醇酸脱氢酶(64％一致性)；和拜氏梭菌NCIMB 8052(YP_001309316.1 GI：150017062)的D-异构体特异性2-醇酸脱氢酶(75％一致性)。
NB8插入物包括编码被鉴别为属于Pfam 00171(“醛脱氢酶”，采集截止值，23.0)的多肽(SEQ ID NO：4)的ORF(SEQ ID NO：3)，其中二进制分数为280.5且e值为1.4e-83。ORF(从插入物的5′最末端开始)与苏云金芽孢杆菌苏云金芽胞亚种醛还原酶(基因ID：118438963；寄存编号ZP_01432004；SEQ ID NO：7)的氨基酸95-455具有至少99％一致性。NB8似乎编码截短型杆菌属醛还原酶，因为ORF是与苏云金芽孢杆菌醛还原酶(SEQ ID NO：7)最N末端90-100个氨基酸同源的缺失的氨基酸。另外，由于当进行表达实验时未认识到的克隆误差，仅此ORF的次部分克隆到整合载体中以用于在集胞藻属中表达。因此，SEQ IDNO：7(杆菌属醛脱氢酶)的氨基酸N末端到氨基酸95和C末端到氨基酸347似乎并不为活性所需，因为NB8部分ORF(SEQ ID NO：5，其编码缺乏杆菌属醛脱氢酶的N末端的94个氨基酸和C末端的108个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：6))的表达展示出对增殖和脂肪酸生产力的作用(参见实例2)。包括与SEQ ID NO：4具有序列同源性的氨基酸序列的其它杆菌属醛脱氢酶包括苏云金芽孢杆菌贝森纳亚种(基因ID：228938499；寄存编号ZP_041501108)的ywdH醛脱氢酶(99％一致性)；苏云金芽孢杆菌IBL 200(基因ID：228907013；寄存编号ZP_04070879)的ywdH醛脱氢酶(98％一致性)；苏云金芽孢杆菌IBL 4222(基因ID：228899962；寄存编号ZP_04064201)的醛脱氢酶(NAD)家族蛋白质(98％一致性)；苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(基因ID：228951764；ZP_04113863)的醛脱氢酶ywdH(98％一致性)、蜡样芽孢杆菌ATCC10876(基因ID：229189465；ZP_04316482)的醛脱氢酶ywdH(98％一致性)、苏云金芽孢杆菌华中亚种(基因ID：228920096；ZP_04083445)的醛脱氢酶ywdH(98％一致性)、蜡样芽孢杆菌(基因ID：206967852；ZP_03228808)的醛脱氢酶(NAD)家族蛋白质(98％一致性)和蜡样芽孢杆菌172560W(基因ID：229177791；ZP_04305164)的醛脱氢酶ywdH(97％一致性)。包括与SEQID NO：4具有至少50％一致性的氨基酸序列的醛脱氢酶包括细胞毒素芽孢杆菌NVH 391-98(基因ID：5344056；YP_001374327)的醛脱氢酶(82％一致性)；巨大芽孢杆菌WSH-002(基因ID：345444973；gb AEN89990)的醛脱氢酶(62％一致性)；蕈状芽孢杆菌Rock3-17(基因ID：228996488 ZP_04156127)的醛脱氢酶ywdH(81％一致性)、蜡样芽孢杆菌AH621(gi229166217；ZP_04293977)的醛脱氢酶ywdH(89％一致性)和苏云金芽孢杆菌Al Hakam(gi118476858；YP_894009)的醛脱氢酶(NAD(P)+)(90％一致性)。
NB112插入物包括编码与解淀粉芽孢杆菌(YP_001423238；SEQ ID NO：19)的甲基丙二酸半醛脱氢酶具有98％一致性的多肽(SEQ ID NO：18)的一部分的开放阅读框架(SEQID NO：17)。此多肽序列募集到Pfam PF00171(“醛脱氢酶”，采集截止值，23.0)，其中二进制分数为203.7且e值为3e-60。与由NB112 ORF(SEQ ID NO：18)编码的多肽具有同源性的其它甲基丙二酸半醛脱氢酶包括萎缩芽孢杆菌1942(YP_003975426；ADP34495)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(92％一致性)；地衣芽孢杆菌ATCC 14580(YP_081323；gi 52082532)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(89％一致性)；树枝形类芽孢杆菌C454(ZP_09676636)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(84％一致性)；土地类芽孢杆菌HPL-003(YP_005075546；AET59323)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(83％一致性)；克劳氏芽孢杆菌KSM-K16(YP_173925；BAD62964)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(80％一致性)；单核球增多性李氏菌FSL F2-208(EFR85827)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(79％一致性)；李斯特菌FSL S4-120(ZP_07869657；EFR88847)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(79％一致性)；和酸热脂环酸芽孢杆菌LAA1(ZP_03495181；EED06125)的甲基丙二酸半醛脱氢酶(70％一致性)。
NB104插入物(SEQ ID NO：8)包括编码被鉴别为粪肠球菌(例如ZP_0521253；SEQID NO：11)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的一部分的多肽(SEQ ID NO：10)的开放阅读框架(SEQID NO：9)。此多肽序列募集到Pfam 00393(“磷酸葡糖酸脱氢酶”，采集截止值，20.4)，其中二进制分数为55.4且e值为4.4e-15。NB104开放阅读框架编码与粪肠球菌6-磷酸葡糖酸脱氢酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸13-311具有100％一致性的多肽。与由NB104 ORF(SEQ IDNO：10)编码的多肽具有同源性的其它6-磷酸葡糖酸脱氢酶包括肉食杆菌属AT7的6-磷酸葡糖酸脱氢酶(基因ID：163791487；ZP_02185894；56％一致性)、阴道厌氧球菌ATCC 51170的6-磷酸葡糖酸脱氢酶(基因ID：256546044；ZP_05473398；51％一致性)、酪黄肠球菌的6-磷酸葡糖酸脱氢酶(基因ID：257867259；ZP_05646912；51％一致性)和拜氏梭菌NCIMB 8052的6-磷酸葡糖酸脱氢酶样蛋白质(基因ID：150017061；YP_001309315；49％一致性)。
实例2
经测序的克隆株(包括NB8、NB104和B10品系)中的数者的经克隆DNA片段(在IPTG诱导型trcY启动子(SEQ ID NO：22)控制下)随后被转型到包括在不同基因座处的整合的CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因的集胞藻属PCC 6803中。
N末端截短型CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因(SEQ ID NO：20)被克隆到集胞藻属整合载体YC28(SEQ ID NO：23)中，所述载体包括大肠杆菌的P15A复制起点、用于在集胞藻属6803中同源重组的“RS1向上”(SEQ ID NO：24)和“RS1向下”(SEQ ID NO：25)片段、针对IPTG诱导型trcE驱动萼距花属CclFatB1硫酯酶基因的lacIQ抑制子和用于选择的卡那霉素(kanamycin)耐药性标记。用于PCR扩增载体区段的DNA源材料来自集胞藻属基因组DNA、pUC-19载体、pACYC-184载体和含有合成的萼距花属CclFatB1基因的载体(DNA2.0，门洛帕克(Menlo Park))。
表达载体还经构筑以用于过度表达通过实例1中所述的功能筛选被鉴别为具有编码脱氢酶(或其部分)的序列的片段。使用含有与蓝细菌整合载体pSGI-YC63(SEQ ID NO：28)同源的约15bp序列的引物，在文库筛选中鉴别独立地从“contig”克隆株扩增的B10 ORF(SEQ ID NO：1)、NB104 contig片段(SEQ ID NO：8)和NB104 ORF(SEQ ID NO：9)。NB8部分ORF片段(SEQ ID NO：5)也被克隆于pSGI-YC63整合载体中。pSGI-YC63含有用于选择的壮观霉素(spectinomycin)标记、用于在集胞藻属的RS2位点中整合的同源“RS2向上”(SEQ IDNO：26)和“RS2向下”(SEQ ID NO：27)臂、调节trcY启动子的lacIQ抑制子(SEQ ID NO：22)和用于大肠杆菌繁殖的pUC复制起点。
为了将CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因构筑体和脱氢酶ORF构筑体引入到蓝细菌中，将集胞藻属PCC 6803细胞培养在BG-11培养基(其不包括实质性量的还原性碳源)中达到约0.7-0.9的OD(730nm)。将约10mL培养物在约2000g下旋降15分钟，且将细胞沉淀重悬在1mL新鲜BG-11培养基中。300μL细胞的等分试样用约100ng整合载体转型。将细胞在光(80μE)下孵育约6小时，接着展布到Minipore过滤器上且置放于不含抗生素的BG-11琼脂板的顶部。将板在约30℃下在约80μE光下孵育约24小时。接着，将过滤器转移到具有20μg/mL卡那霉素的新鲜BG-11 1.5％琼脂板上且培养7天。挑选集胞藻属PCC 6803的集落且将其贴到新的琼脂板上。将用于整合到集胞藻属基因组中的假定性编码脱氢酶的构筑体使用相同程序转型到CclFatB1转型的品系中，除了抗生素选择包括除20μg/mL卡那霉素之外的20μg/mL壮观霉素。
使包括CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因和编码脱氢酶的开放阅读框架的培养物在约60μE光下在持续振荡和1％CO2下生长。在诱导时的OD是0.6。培养物用1mM IPTG诱导。使品系生长在初始体积为1.5mL的4mL玻璃小瓶中。在6天结束时，提交整个小瓶以及小瓶中剩余的约1mL培养物(归因于蒸发损失)以用于气相色谱。CcFatB1硫酯酶基因(在TrcY启动子控制下)整合于6803的RS2位点中但不携带外源性脱氢酶基因的品系充当对照。
游离脂肪酸通过具有火焰离子化检测(GC-FID)的气相色谱(GC)分析。将用PTFE(聚四氟乙烯)加衬的帽(国家科学公司(National Scientific))加帽的4mL小瓶中的1mL培养物提交到Analytical以用于分析。将包括游离脂肪酸C9：0、C13：0和C17：0(各自浓度为600μg/mL)于己烷中的八十四微升内标(I.S.)组以及83微升50％H2SO4、167微升5M NaCl和1.4毫升己烷依序加入到培养物样品中。各I.S.的最终浓度相对于样品体积是50μg/mL。用于制造I.S.组的脂肪酸是购自福路卡公司(Fluka)或纽查克制备公司(Nu-Chek Prep，Inc.)。三种I.S.被用于给出游离脂肪酸的可变响应。C8：0和C10：0用C9：0 I.S.校准；C12：0和C14：0使用C13：0 I.S.；且剩余C16：0到C18：2 cis9，12使用C17：0 I.S.。在加入试剂和I.S.后，将培养物在2,500rpm下在多管涡旋仪上涡旋30分钟。将小瓶最后在2500rpm下离心3分钟以提供有机相与水相之间的良好分离。己烷层通过Gerstel MPS2L自动取样器取样。脂肪酸样品在包括J&W Scientific DB-FFAP毛细管柱(10m长，0.10mm内径，0.10μm膜厚度)的配备有FID(火焰离子化检测器)的Agilent型号7890A气相色谱上分析。GC烘箱如下程控：120℃持续0.1分钟，接着在40℃/分钟下加热到240℃(保持3分钟)。将注射器温度保持在250℃下，且使用40∶1拆分的1.0μl注射。氢气以0.5999ml/min的流速用作载气。将FID设为320℃。通过与个别注射的标准品比较保留时间来鉴别分析物。分析物的校准范围是：对于C8：0-C16：1脂肪酸，2.5μg/ml到200μg/ml，且对于C18：0-C18：2脂肪酸，0.625μg/ml到50μg/ml。各分析物的定量限是校准范围中列出的最低浓度，除了C18：0、C18：1 cis9(1.25μg/mL)和C18：2 cis9，12(2.5μg/mL)。整个细胞培养物中的外加和回收实验展示出，提取方法针对此样品运行批次中的每一分析物在85％-115％范围内一致地回收，除了C16：1 cis9(74％)、C18：1 cis9(63％)和C18：2 cis9，12(64％)。
由这些经工程改造的集胞藻属品系产生的游离脂肪酸的总量提供于图1中。可看出，表达B10 ORF(“dehydrd”；SEQ ID NO：1)、NB8部分ORF片段(SEQ ID NO：5)、NB104 ORF(“6-P-de”；SEQ ID NO：9)和NB104 ORF完全contig片段(SEQ ID NO：8)以及CclFatB1硫酯酶编码序列(SEQ ID NO：20)的集胞藻属品系与仅含有CclFatB1硫酯酶基因的对照品系相比产生更高量的游离脂肪酸。图2展示出，在此实验中，从筛选获得的包括CclFatB1硫酯酶和脱氢酶基因的品系能够获得比表达CclFatB1硫酯酶但缺乏脱氢酶基因的品系的细胞密度高四到五倍的培养物。
实例3
为了进一步研究增强脂肪酸产生的表达基因的作用，评估经工程改造以表达B10(2-醇酸脱氢酶NAD-结合域蛋白质)基因和NB104(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)基因以及CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因的集胞藻属品系改变细胞氧化还原态的能力。作为对照，在RS2位点整合载体pSGI-YC63(1A/YC63)处整合的CclFatB1基因表达于并不具有额外的脱氢酶基因的独立的集胞藻属6803品系中。不具有转基因的集胞藻属6803(“6803”)作为另外的对照包括在内。细胞在振荡下在60μE的恒定光下生长，且通过在0.5的OD730下加入1mM IPTG诱导以表达硫酯酶和(当存在时)假定性脱氢酶：每24小时收集样品持续三天。
为了测定用脱氢酶基因工程改造的集胞藻属品系和对照品系的氧化还原态，进行酶促分析以在诱导后1、2和3天采集的样品上测定NADPH/NADP+比率。为此目的使用NADP/NADPH定量试剂盒(加利福尼亚州山景城生物视野公司(BioVision，Inc.，Mountain View，CA))。分析试剂盒中的酶特异性地识别酶循环反应中的NADP+/NADPH。针对分析，将每一时间点的约1.5×107个细胞溶解于与分析试剂盒一起提供的1ml NADPH提取缓冲剂中。细胞经历液氮中的2个冷冻/解冻循环和4轮珠粒击打。接着将溶解物离心，且在10K截止柱上过滤上清液。可消耗NADPH的所有光合色素和酶保留在过滤膜上。滤液仅由小的代谢物组成且被用于NADPH分析。分析试剂盒能够实现总NADP(NADP+外加NADPH)和NADPH的测量。NADPH/NADP+比率通过以下方式测定：从总NADP中减去NADPH的量，从而提供NADP+的量，且接着将NADPH的量除以所计算的NADP+的量。
分析结果概述于图3中。图3展示在连续数天实验时NADPH与NADP+的比率。在对照品系野生型集胞藻属PCC 6803中，培养物中每增加一天NADPH相对于NADP+降低。表达外源性酰基ACP硫酯酶的品系CclFatB1在与野生型细胞相比时展示出NADPH与NADP+的比率显著降低。预期这是已知需要大量还原能力的脂肪酸生物合成过程。然而，向表达外来酰基ACP硫酯酶的品系中加入脱氢酶基因使NADPH与NADP+的比率增大，且在此实验中NB104(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)基因与B10(2-醇酸脱氢酶NAD-结合域蛋白质)基因相比对NADPH/NADP+比率具有更大的作用。虽然NADPH与NADP+的比率并未恢复到野生型水平，但其比仅表达酰基ACP硫酯酶的品系高至少2倍。
因此，集胞藻属6803中的B10 ORF或NB104 ORF以及CclFatB1硫酯酶的表达增大了细胞的NADPH/NADP+比率(图3)，允许如通过在六天下培养物密度所测量的品系的较高增殖速率(图2)，并且也引起所有链长的游离脂肪酸的较高产生(图1)。NB104 ORF编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(戊糖磷酸途径的一种酶)的一部分(图4)。此途径从6C糖产生核苷酸和核酸生物合成中使用的5C糖。戊糖磷酸途径帮助产生呈NADPH形式的还原当量，NADPH被用于细胞内的还原性生物合成反应(如脂肪酸生物合成)。
实例4
来自宏基因组文库的NB104 ORF编码肠球菌6-磷酸葡糖酸脱氢酶的一部分。来自集胞藻属PCC 6803的6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因(SEQ ID NO：12)的过度表达还经测试以确定其是否将施加与肠球菌衍生的6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因相同的作用。因此，将集胞藻属6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因sll0239(寄存编号BAA10105；GI：1001479；SEQ ID NO：12)克隆到YC63构筑体中，在所述构筑体中其经置放以处于trcY启动子的控制下，且被整合在表达由trcE启动子(SEQ ID NO：30)调节且整合于RS1位点处的CclFatB1酰基ACP硫酯酶基因的集胞藻属品系的RS2位点中。测试所得品系以及仅表达根据trcY启动子的酰基ACP硫酯酶基因(整合于RS2位点处)的对照集胞藻属PCC 6803品系的脂肪酸产生。在此实验中，品系在其已达到高密度之后诱导，从而获得较大水平的游离脂肪酸产生。简言之，将5.0 OD等效细胞旋降且重悬于含有1mM IPTG和适当抗生素的新鲜BG11培养基中。最终培养物体积是1.5ml。这些品系在恒定振荡、60μE光强度和1％CO2下生长于4mL玻璃小瓶中。在此实例中，其中细胞在相对较高密度下诱导且在诱导下培养6天，同源集胞藻属脱氢酶基因的表达也增大了游离脂肪酸的量(图5)。如实例2中进行样品的脂肪酸分析。
天然集胞藻属6-磷酸葡糖酸脱氢酶与仅表达CclFatB1硫酯酶的品系相比使FFA增大至少两倍(图5)。图案化条柱代表在集胞藻属以及CclFatB1中克隆的天然集胞藻属68036-磷酸葡糖酸脱氢酶。我们因此推断出，生物体(包括光自养培养的光合微生物，没有支持培养物生长或增殖的还原碳源)中产生NADPH的脱氢酶(如6-磷酸葡糖酸脱氢酶)的过度表达改进了增殖速率并且也增强了培养物产生游离脂肪酸的总产率。
发明内容和摘要部分可能阐述如发明人预期的本发明的一或多个但非所有示例性实施例，且因此并不打算以任何方式限制本发明和所附权利要求书。
特定实施例的先前描述将揭露本发明的一般性质，使得别人可通过应用此项技术内的知识在无过度实验的情况下且在不背离本发明一般概念的情况下容易地针对各种应用修改和/或改编所述特定实施例。因此，基于本文中呈现的教示和指导，所述改编和修改打算处于所公开的实施例的等效物的含义和范围内，且本发明的广度和范围应不受到任何上述示例性实施例限制。

Claims (10)

1.一种培养产生脂质的藻青菌的方法，其包含：
在合适培养基中提供重组型藻青菌的培养物，所述重组型藻青菌包含编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因和编码硫酯酶的非原生基因，所述D-2-羟基酸脱氢酶由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成的群组，所述提供是在编码所述D-2-羟基酸脱氢酶的所述非原生基因和编码硫酯酶的非原生基因表达的条件下进行，
其中与包含除了不包括编码非原生D-2-羟基酸脱氢酶的基因以外其它所有方面都相同的对照藻青菌的培养物相比，所述培养物产生更大量的所述脂质，此外其中包含编码D-2-羟基酸脱氢酶的所述非原生基因的所述重组型藻青菌与缺乏编码所述非原生D-2-羟基酸脱氢酶的基因的对照藻青菌相比具有更高的生长和/或增殖速率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱氢酶是NADP依赖性脱氢酶。
3.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法，其中所述重组型藻青菌是选自由以下各属组成的群组的物种的藻青菌：阿格藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、组囊藻属(Anacystis)、束丝藻属(Aphanizomenon)、节旋藻属(Arthrospira)、星球藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、眉藻属(Calothrix)、管孢藻属(Chamaesiphon)、拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、发毛针藻属(Crinalium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、蓝螺菌属(Cyanospira)、蓝丝菌属(Cyanothece)、拟筒孢藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、包皮藻属(Dermocarpella)、侧生藻属(Fischerella)、夫列藻属(Fremyella)、盖特勒氏菌属(Geitleria)、吉特勒氏线状蓝细菌属(Geitlerinema)、粘杆菌属(Gloeobacter)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、英加藻属(Iyengariella)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、湖丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、微囊藻属(Microcystis)、粘囊藻属(Myxosarcina)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、拟珠藻属(Nostochopsis)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮丝藻属(Planktothrix)、宽球藻属(Pleurocapsa)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、原绿丝蓝细菌属(Prochlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、胶须藻属(Rivularia)、裂须藻属(Schizothrix)、伪枝藻属(Scytonema)、螺旋藻属(Spirulina)、斯塔尼尔氏菌属(Stanieria)、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、真枝藻属(Stigonema)、束藻属(Symploca)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、单歧藻属(Tolypothrix)、束毛藻属(Trichodesmium)、灰线蓝细菌属(Tychonema)和异球藻属(Xenococcus)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组型光合藻青菌按光合自养方式培养。
5.一种重组型藻青菌，其包含编码D-2-羟基酸脱氢酶的第一非原生基因，所述D-2-羟基酸脱氢酶由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:29、SEQID NO:15和SEQ ID NO:16组成的群组，
其中所述重组型藻青菌进一步包含至少一个编码选自由以下各者组成的群组的酶的第二非原生基因：酰基ACP硫酯酶、酰基CoA硫酯酶和羟基苯甲酰基硫酯酶；
其中所述重组型藻青菌产生脂质；
此外其中所述重组型藻青菌与除了缺乏编码D-2-羟基酸脱氢酶的非原生基因以外其它方面都相同的藻青菌相比具有更高的生长和/或增殖速率。
6.根据权利要求5所述的重组型藻青菌，其中所述脂质是脂肪酸、脂肪酸衍生物或三酸甘油酯。
7.根据权利要求5或6所述的重组型藻青菌，其中所述脱氢酶是NADP依赖性脱氢酶。
8.根据权利要求5或6所述的重组型藻青菌，其中所述重组型藻青菌是选自由以下各属组成的群组的物种的藻青菌：阿格藻属、鱼腥藻属、项圈藻属、组囊藻属、束丝藻属、节旋藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、蓝菌属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝丝菌属、拟筒孢藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、包皮藻属、侧生藻属、夫列藻属、盖特勒氏菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、粘杆菌属、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿藻属、原绿丝蓝细菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、伪枝藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔氏菌属、斯塔尔氏蓝细菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻属、单歧藻属、束毛藻属、灰线蓝细菌属和异球藻属。
9.一种经分离的核酸分子，其由编码SEQ ID NO:29的核酸序列组成。
10.一种脱氢酶，其由氨基酸序列SEQ ID NO:29组成。
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