CN104109649B - 粘质沙雷氏菌NlM280及作为杀虫剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌NlM280及作为杀虫剂的应用，粘质沙雷氏菌NlM280发酵培养获得的菌悬液或菌悬液离心后的上清液可应用于褐飞虱或二化螟的防治；对褐飞虱采用注射和饲喂该菌菌悬液或发酵上清液的结果表明，其菌悬液注射对褐飞虱的致死率2天可达100％，饲喂菌悬液3天致死率为79.8％；该菌株发酵液的上清液在55℃以下处理均不影响其致病效果，注射发酵上清液致死率2天时可达97.2％，饲喂发酵上清液效果滞后，6天时致死率达84.2％。菌悬液和发酵上清液喷施水稻后饲喂二化螟，对二化螟的致死率4天时可达80.0％以上。

Description

粘质沙雷氏菌NlM280及作为杀虫剂的应用

(一)技术领域

本发明涉及一株对水稻害虫(褐飞虱和二化螟)具有致病作用的新菌株-粘质沙雷氏菌以及该菌在褐飞虱和二化螟防治方面的应用。

(二)背景技术

水稻是我国主要粮食作物之一，它是超过一半世界人口的主粮。因此在粮食安全生产中占有极其重要的地位。然而，水稻也是受虫害侵袭最为严重的粮食作物之一。全国稻区病虫害常年发生面积在1亿公顷次以上，每年可造成稻谷损失约60万吨。因此，有效地控制水稻害虫对水稻增产具有重要意义。

褐飞虱(Nilaparvata lμgens)(Brown planthopper)属于同翅目飞虱科，是我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫，可以直接取食或将病菌和病毒传给水稻，从而给粮食生产带来巨大损失。褐飞虱具有远距离迁飞的能力和很强的适应性。目前，控制褐飞虱致害性的首要方法是化学杀虫剂如吡虫啉、噻嗪酮、仲丁威及异丙威，但随着吡虫啉大范围高频次的使用，稻飞虱对其抗药性快速提高，各地反映其对稻飞虱的效果大不如前。其次是培育抗性水稻品种，但由于褐飞虱的强适应性，化学农药容易导致产生抗药性种群和飞虱的再猖獗，抗性水稻的培育和种植虽对环境友好但也由于能克服寄主抗性的新褐飞虱致害性种群出现，导致其危害越来越严重。

二化螟(Chilo sμppressalis Walker)属鳞翅目，螟蛾科，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减产3％～5％，严重时减产在3成以上造成的经济损失约为115亿元，已成为取代稻飞虱和棉铃虫，影响我国国计民生的头号害虫(盛承发等，2003)。二化螟除危害水稻外，还能危害茭白、玉米、高粱、甘蔗、油菜、蚕豆、麦类以及芦苇、稗、李氏禾等杂草。目前我国防治水稻二化螟的主要药剂为沙蚕毒素类的杀虫单，杀虫双，三唑磷以及进口农药氟虫晴，锐劲特等化学农药。纯生物农药也得到了逐步推广。但由于化学农药长期大量使用，二化螟对其抗药性逐渐增高，其中对沙蚕毒素类已增长了67倍，已不能单独控制二化螟为害(汪明根等，2004)。进口农药氟虫晴对二化螟防效较好但存在着防治成本高，对水生动物不安全等缺点。因此，开发选用新型高效农药新品种有效防治二化螟显得十分迫切。

通过化学杀虫剂控制水稻害虫，不仅生产成本高，且对生态平衡造成破坏，对人、畜健康危害严重，农药残留对人类生存环境造成长期影响，害虫也产生了抗药性。因此挖掘有益微生物资源，开发新型微生物杀虫剂将成为农药产业的主体。目前主要的微生物杀虫剂包括有细菌杀虫剂、病毒杀虫剂和真菌杀虫剂。细菌杀虫剂其作用机制是胃毒作用，昆虫摄入病原细菌制剂后，通过肠细胞吸收，进入体腔和血液，使之得败血症导致全身中毒死亡。目前筛选的杀虫细菌大约有100多种，其中被开发成产品投入实际应用的主要有4种，即苏云金芽孢杆菌(Bacillμs thμringiensis,Bt)、日本金龟子芽孢杆菌(Bacillμspopilliae)、球形芽孢杆菌(Bacillμs sphaericμs Meyer and Neide)和缓病芽孢杆菌(Bacillμs Lentimorbμs)。其中苏云金芽孢杆菌是商业开发最成功的杀虫剂)。这些杀虫剂在生产实践中均不同程度的存在局限性如杀虫谱窄、稳定性差，易产生抗药性等。因此急需挖掘微生物资源，寻找新的杀虫谱广，性能稳定的微生物杀虫剂，并通过基因工程等手段对其进行有目的的改进，从而能更好地发挥生物防治的综合效益。

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)属于肠杆菌科，革兰氏阴性菌杆状菌。可产生红色或紫色色素。是一类普遍存在于自然界的浮生小杆菌，可从土壤、水，牛奶、面包中分离出来，室内饲养的昆虫易于感染该菌。目前已报道从健康的，死的昆虫都可分离出粘质沙雷氏菌，该菌可侵染昆虫6个目(直翅目，鞘翅目，膜翅目，鳞翅目和双翅目等)之多，是室内饲养昆虫最易感染的一种病原菌之一。小量的消化道感染通常不会造成昆虫发病，但一旦进入血淋巴在1-3天之内大量繁殖即可造成昆虫死亡(Sikorowski，2001)。该菌引起昆虫致死率受到昆虫的种类、昆虫发育的龄期以及其他环境因素等的影响(Steinhaμs1958)。粘质沙雷氏菌杀虫的机制包括其分泌的蛋白酶、脂酶、几丁质酶以及依赖于脂多糖和鞭毛诱导的寄主免疫细胞的程序性死亡等(Lysenko,1976；Kaska,et al1976；Hines et al，1988；Givskov et al1997；Ishii et al，2012)。目前尚无从水稻害虫中分离出粘质沙雷氏菌以及对水稻害虫褐飞虱和二化螟具有致病作用的病原性细菌资源的分离和致病机制的研究报道。

(三)发明内容

本发明目的是从水稻褐飞虱中分离出致病细菌，研究其致病性，为细菌杀虫剂的研究开发提供了新的菌株来源。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)NlM280，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9131，保藏日期为2014年5月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还提供一种所述粘质沙雷氏菌NlM280作为杀虫剂的应用。

进一步，所述粘质沙雷氏菌NlM280以发酵培养获得的菌悬液或菌悬液离心后的上清液作为杀虫剂，优选菌体密度为l×l0⁸CFU/mL的菌悬液。

进一步，所述粘质沙雷氏菌NlM280作为褐飞虱或二化螟杀虫剂的应用。

更进一步，粘质沙雷氏菌NlM280菌悬液按如下步骤制备：

(1)斜面培养：将粘质沙雷氏菌NlM280接种至LB固体培养基上，28℃恒温24h，获得斜面菌体；LB固体培养基终浓度组成：NaCl10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、15g/L琼脂，pH7.2，溶剂为水；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取单菌落接种于LB液体培养基，28℃恒温，200rpm振荡培养24h，获得种子液；LB液体培养基终浓度组成：NaCl10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L，pH7.2，溶剂为水；

(3)发酵培养：取种子液以体积浓度1％的接种量接种于LB液体培养基中扩大培养，28℃恒温，200rpm振荡培养至OD600值为1.0，获得发酵培养液，将发酵培养液用LB液体培养基调整菌体密度制成菌悬液(优选菌体密度为l×l0⁸CFU/mL)。将菌悬液4℃，12000rpm离心10min，去菌体，取上清液即为胞外代谢物的发酵上清液。

利用所述菌悬液或发酵上清液注射3-4龄褐飞虱，2天致死率达97％以上，利用含该菌悬液的全纯人工饲料饲喂3-4龄褐飞虱，3天死亡率达79％以上，用含发酵上清液的全纯人工饲料饲喂3-4龄褐飞虱，6天死亡率达84％以上。用喷施过菌悬液或发酵上清液的水稻叶片饲喂二化螟，4天死亡率达80％以上。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--粘质沙雷氏菌NlM280，该菌株发酵培养获得的菌悬液或菌悬液离心后的上清液可应用于褐飞虱或二化螟的防治；对褐飞虱采用注射和饲喂该菌菌悬液或发酵上清液的结果表明，其菌悬液注射对褐飞虱的致死率2天可达100％，饲喂菌悬液3天致死率为79.8％。该菌株发酵液的上清液在55℃以下处理均不影响其致病效果，注射发酵上清液致死率2天时可达97.2％，饲喂发酵上清液效果滞后，6天时致死率达84.2％。菌悬液和发酵上清液喷施水稻后饲喂二化螟，对二化螟的致死率4天时可达80.0％以上。该菌株的分离开拓了抗虫微生物资源，为进一步抗虫物质的分离鉴定提供了材料，在生产实践中具有潜在的应用价值。

(四)附图说明

图1为菌株NlM280在LB平板上的生长情况。

图2为菌株NlM280的16S rDNA序列PCR扩增电泳图，泳道1-5分别为挑取的5个单菌落16S rDNA扩增的结果，泳道M为Marker100bp DNA ladder。

图3为菌株NlM280与其他肠杆菌科细菌16S rDNA序列系统发育树。

图4为褐飞虱微量注射位置示意图(箭头所示)。

图5为实施例3中褐飞虱感染粘质沙雷氏菌菌株NlM280(注射菌悬液)后的发病症状。其中A为超景深显微镜放大100倍的照片，B为普通照相机拍摄。

图6为注射和饲喂NlM280菌悬液(l×l0⁸CFU/mL)对褐飞虱致病性柱形图。

图7为NlM280发酵上清液不同温度处理后注射褐飞虱，褐飞虱发病率柱形图，CK为对照。

图8为注射和饲喂菌株NlM280发酵液上清液对褐飞虱致病性柱形图。

图9为NlM280菌悬液和发酵上清液对二化螟的致病性柱形图，CK为对照。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、菌株NlM280的筛选、鉴定和保存

(1)菌株的筛选

将中国水稻研究所富阳实验室内饲养的褐飞虱种群Mudgo的褐飞虱自然发病虫体(虫体体色全红)用体积浓度75％的乙醇水溶液表面消毒5min后，研磨虫体成粉末，然后用无菌水进行梯度稀释(具体稀释梯度为10倍，100倍，1000倍)，取1000倍稀释度的稀释液涂板于LB固体培养基上，28℃培养12h，获得单菌落，挑取红色单菌落记为菌株NlM280。

(2)菌株的鉴定

菌株的生理生化特征为：

将菌株NlM280涂板于LB固体培养基上，28℃恒温24h活化，菌株NlM280平板生长见图1。菌株的菌落基本上是凸起，中心不透明，边缘不规则，大小为1～2.5mm，均产生红色色素。LB固体培养基上37℃～43℃培养，菌株为白色。

挑取5个单菌落NlM280分别接种于3mL的LB液体培养基中，28℃、200rpm培养12h，取培养OD600值为1.0左右的新鲜菌液，1000rpm离心10min，收集湿菌体。按褐飞虱基因组的提取方法分别提取湿菌体基因组DNA并进行16S rRNA的PCR扩增(参考：王渭霞,罗举,赖凤香,傅强.水稻褐飞虱内生共生细菌Arsenophonμs的鉴定和系统分析.昆虫学报,2010,647-654)。PCR反应条件：94℃变性4min，然后进入下列循环：94℃30s、55℃30s、72℃30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条1500bp左右的特异性片段(图2)，测定该片段序列(PCR产物由上海英俊公司测序)，结果表明，测得菌株NlM280的16S rDNA为1053bp。将测得的16s rDNA全序列(SEQ ID NO.1所示)提交GenBank(www.ncbi.NlM.nlh.gov)，应用其中的BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，发现，菌株NlM280测得的16S rDNA序列与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens strain RJT)16srDNA序列相似性达99.0％。因此初步鉴定菌株NlM280为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。Genbank登陆号为GU124498。系统发育树显示菌株NlM280与肠杆菌科的粘质沙雷氏菌聚类为同一类(图3)。结合菌株NlM280的生理生化特征及16s rDNA序列分析，将菌株NlM280鉴定为粘质沙雷氏菌，命名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)NlM280。

(3)菌株的保藏

菌株保藏：将粘质沙雷氏菌NlM280接种至LB液体培养基中，28℃、200rpm培养12h，取菌悬液与质量浓度50％的甘油水溶液等体积混合后，-80℃保存。

LB固体培养基终浓度组成：NaCl10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、15g/L琼脂，pH7.2，溶剂为水。

LB液体培养基终浓度组成：NaCl10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L，pH7.2，溶剂为水。

实施例2、菌悬液的制备

(1)斜面培养

将粘质沙雷氏菌NlM280接种至LB固体培养基上，28℃恒温24h，获得斜面菌体。

(2)种子培养：从斜面菌体挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基，28℃恒温，200rpm振荡培养24h，获得种子液。

(3)发酵培养：取500μL种子液接种于50mL LB液体培养基中扩大培养，28℃恒温，200rpm振荡培养8h，测定菌体OD600值到1.0时，获得发酵培养液，将发酵培养液用LB培养基调整菌体密度为l×l0⁸CFU/mL，制成菌悬液。

实施例3：粘质沙雷氏菌NlM280的菌悬液对褐飞虱的致病性

(1)、注射法检测菌株的致病力：

选取3-4龄褐飞虱若虫，利用eppendorf显微注射仪(型号TransferMan NK2，厂家上海艾本德公司)，每个褐飞虱注射0.1μL实施例2方法制备的菌悬液，注射位置为褐飞虱胸部中足基部柔软的地方，见图4，以注射LB液体培养基为对照，注射后褐飞虱接种于分蘖盛期的水稻品种(Taichung Native1)TN1上，每个水稻单株用笼罩罩住，每个笼罩接50头注射后的褐飞虱。三次重复。将笼罩放置于带水的大水盆中，控制室内温度在25±1℃，湿度80％左右。24h内剔除因注射操作造成的死虫，记录活虫数，48h统计褐飞虱死亡率。褐飞虱病虫症状(褐飞虱通体发红)见图5所示，死亡率见图6所示。结果表明菌悬液注射褐飞虱2天死亡率达100％。

(2)、饲喂法检测菌株对褐飞虱的致病力：

选取3-4龄褐飞虱若虫，在褐飞虱全纯人工饲料(成分见表1，参见：Fu Q,Zhang ZT,Hu C,Lai F X,Sun Z X.A Chemically defined diet enables continous rearing ofthe brown planthopper,Nilaparvata lugens.(Homoptera：Delphacidae).Appl EntomolZool，2001,36(1)：111-116)中加入终浓度为l×l0⁸Cfμ/ml的菌悬液(实施例2方法制备)。用15cm×2.5cm的双通管作为人工饲养褐飞虱的器皿。60.0μL人工饲料放在两端均有开口的双通管中，一端用两层封口膜封口(靠近饲料)，另一端用尼龙网封口，在将测试的50头褐飞虱放入后用尼龙网封口。双通管用潮湿的毛巾包裹起来保湿，有饲料的一头对着光源。饲养环境条件27.0±0.5℃，90.0％湿度，12-14小时的光照。24h换饲料一次，并统计活虫数。结果见图6，表明饲喂3天死亡率达到79.8％。

表1 全纯人工饲料成分

氨基酸类	mg/100ml	维生素类	mg/100ml	无机盐类	mg/100ml
						甘氨酸	30	生物素	0.05	氯化钙	3.115
丙氨酸	130	泛酸钙	5	氯化铜	0.268
						精氨酸	175	氯化胆碱	60	氯化铁	2.228
天冬酰胺	230	叶酸	2.5	氯化锰	0.793
						天冬氨酸	100	肌醇	50	氯化锌	0.396
半胱氨酸	80	烟酸	15	氯化镁	200

胱氨酸	20	盐酸吡哆醇	2.5	磷酸二氢钾	500
						氨基丁酸	10	核黄素	2	蔗糖	9000
谷氨酸	250	硫胺素	2.5
						谷氨酰胺	240	抗坏血酸	100
组氨酸	80
						甲硫氨酸	70
异亮氨酸	100
						亮氨酸	240
普氨酸	100
						赖氨酸	200
苯丙氨酸	200
						丝氨酸	400
苏氨酸	130
						色氨酸	105
酪氨酸	10
						缬氨酸	300

配置好饲料后调节pH为6.8，过滤灭菌。

实施例4、粘质沙雷氏菌NlM280的发酵上清液对褐飞虱的致病性

1、发酵上清液的制备：

将实施例2方法制备的l×l0⁸CFU/mL菌悬液置于50mL离心管中，室温下12000rpm离心12min，取上清液作为发酵上清液用于致病性检测。发酵上清液分别经28℃、55℃、65℃、85℃和120℃水浴处理15min后，进行致病性检测。

2、注射法检测菌株的致病力：

选取3-4龄褐飞虱若虫，利用eppendorf显微注射仪，每个褐飞虱注射0.1μL的不同温度处理15min的发酵上清液，注射50头，以注射LB液体培养基为对照，注射后褐飞虱接种于水稻品种TN1上，24h内剔除因注射操作造成的死虫，记录活虫数，48h统计褐飞虱死亡率。室内，三次重复。结果见图7，结果表明55℃以下处理15min不影响发酵上清液的杀虫活性，两天褐飞虱死亡率达92.2％，高于65℃处理15min后杀虫效果与对照无显著差异，对褐飞虱的致病力丧失。

3、饲喂法检测菌株对褐飞虱的致病力：

将全纯人工饲料配置为2倍的浓缩液，选取3-4龄褐飞虱若虫，将2倍的褐飞虱全纯人工饲料浓缩液与28℃条件下培养的菌悬液发酵上清液等体积混合后，按照实例3饲喂褐飞虱。24h换饲料一次，并统计活虫数。结果见图8，结果表明饲喂3天死亡率为21.2％，连续饲喂6天死亡率可达84.2％。

实施例5、粘质沙雷氏菌NlM280的菌悬液和发酵上清液对二化螟的致病性

采用实施例2方法制备l×l0⁸CFU/mL菌悬液，剪取水稻叶片约10cm，用菌悬液喷施水稻叶片，叶片两端用卫生纸保湿，接种1龄二化螟若虫20头，将接种了二化螟的叶片放置于15cm x3cm的离心管中，棉塞封口。试管放置于人工光照培养箱内26±1℃、80％湿度。以喷施LB液体培养基的水稻叶片为对照。每个重复3次，4天后统计死亡率。

将实施例2方法制备的l×l0⁸CFU/mL菌悬液置于50mL离心管中，室温12000rpm离心12min，取上清液作为发酵上清液用于二化螟致病性检测。剪取水稻叶片约10cm，用发酵上清液喷施水稻叶片，叶片两端用卫生纸保湿，接种1龄二化螟若虫20头，将接种了二化螟的叶片放置于15cm×3cm的玻璃试管中，棉塞封口。试管放置于人工光照培养箱内26±1℃，80％湿度。以喷施LB液体培养基的水稻叶片为对照。每个重复3次，4天后统计死亡率。结果见图9，结果表明4天后喷施菌悬液的二化螟死亡率达93.3，喷施发酵上清液的二化螟死亡率为80.0％。

Claims (5)

1.粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)NlM280，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9131，保藏日期为2014年5月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.一种权利要求1所述粘质沙雷氏菌NlM280作为褐飞虱或二化螟杀虫剂的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述粘质沙雷氏菌NlM280以发酵培养获得的菌悬液或菌悬液离心后的上清液作为杀虫剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述菌悬液菌体密度为l×l0⁸CFU/mL。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于粘质沙雷氏菌NlM280菌悬液按如下步骤制备：

(1)斜面培养：将粘质沙雷氏菌NlM280接种至LB固体培养基上，28℃恒温24h，获得斜面菌体；LB固体培养基终浓度组成：NaCl 10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、15g/L琼脂，pH7.2，溶剂为水；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取单菌落接种于LB液体培养基，28℃恒温，200rpm振荡培养24h，获得种子液；LB液体培养基终浓度组成：NaCl 10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L，pH7.2，溶剂为水；

(3)发酵培养：取种子液以体积浓度1％的接种量接种于LB液体培养基中，28℃恒温，200rpm振荡培养至OD₆₀₀值为1.0，获得发酵培养液，将发酵培养液用LB液体培养基调整菌体密度制成菌悬液。