CN104109645A

CN104109645A - 用于防治果蔬采后病害的菌株及生防菌剂

Info

Publication number: CN104109645A
Application number: CN201410251215.0A
Authority: CN
Inventors: 施俊凤; 孙常青; 王潇冉; 高伟
Original assignee: Institute Of Storage And Preservation Of Agricultural Products Shanxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Storage And Preservation Of Agricultural Products Shanxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2034-06-06
Also published as: CN104109645B

Abstract

本发明涉及生物拮抗菌，具体为一种用于防治果蔬采后病害的菌株，于2014年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M2014076。一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括权利要求1所述菌株的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加25～100mM的Na₂SiO₃；或者，包括权利要求1所述菌株的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加25～100mM的NaHCO₃。本发明所述的菌株能够很好地抑制果蔬采后灰霉病的发生，也就大大提高了果蔬采后病害的防治效果。

Description

用于防治果蔬采后病害的菌株及生防菌剂

技术领域

本发明涉及生物拮抗菌，具体为一种用于防治果蔬采后病害的菌株及生防菌剂。

背景技术

果蔬采后病害引起的腐烂造成的损失是非常巨大的。目前，控制果蔬采后病害最有效的措施是低温贮藏结合化学杀菌剂。但长期使用化学杀菌剂，不仅容易使病原菌产生抗药性，而且污染环境，对人体健康造成不利影响。因此，寻找低毒性、高效、环境友好和残留量低的杀菌剂的替代品或部分替代品就日渐迫切。

应用拮抗菌进行生物防治成为近年来的研究热点。目前，分离到的生防菌主要有小型丝状真菌、细菌和酵母菌等。迄今为止，已从柑橘、苹果、桃、梨、猕猴桃、鲜枣等10多种水果中筛选出几十种拮抗微生物。目前应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)、土壤放射菌(Agrobacterium radiobacter)等。目前商品化应用的主要有丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、酵母菌(Candidoleophil)中的季也蒙毕赤酵母菌(Pichiaguillier mondii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、白粉寄生菌等。

使用拮抗酵母菌防治果蔬采后病害，可以减少化学农药的用量和在果蔬产品上的残毒，对保护人体健康和防止环境污染都极为重要。Aspire^TM、Biosave110和Biosave111是国外己经注册登记的微生物抗菌剂，主要用于控制柑橘类和仁果类果实的采后腐烂。这展示了利用拮抗菌来安全有效地防治水果采后病害具有广阔的前景。

洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)是20世纪50年代作为一种植物病原菌被人们所认识，Burkholder在1950年首次报道该菌可以引起洋葱的鳞茎发生腐烂，称为洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)。农业领域中，洋葱伯克氏菌具有生物防治、生物降解以及促进植物生长等多种功能，也显示了其在农业方面的广泛的应用前景。近年来，随着分子生物学技术的发展，随着细菌分类技术也相应得到发展，洋葱伯克氏菌已不仅仅作为一个种，而是一组基因型不同、表型相近的复合物，称为洋葱伯克霍尔德氏菌复合群(Burkholderia cepacia complex，简称Bcc)。Bcc可以有效防治多种植物的真菌性病害，近年来国外以防治立枯病、镰刀病菌和腐霉病等土传病害的报道较多，但也有一些对梨青霉病、苹果灰霉病和桃褐腐病等采后病害及植株茎叶病害的相关报道。范青等发现Bcc对甜樱桃褐腐病表现出显著的抑制效果，谢关林等发现在离体条件下Bcc菌株可显著抑制水稻纹枯病菌和恶苗病菌的生长。郑维等从堆肥中分离出了Bcc菌株CF-66，并发现该菌株对尖镰孢菌、立枯丝核菌和酵母菌表现出很强的抗菌活性。此外，Bcc还可以利用多种物质作为唯一碳源，可以降解邻苯二甲酸盐、除草剂和氯代烃类化合物等土壤和地下水污染的有毒物质，也是一种很有潜力的生物降解菌，是一种很有潜力的生防菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的用于防治果蔬采后病害的菌株及生防菌剂。

一种用于防治果蔬采后病害的菌株，于2014年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2014076，地址：中国.武汉.武汉大学。

一、本发明所述拮抗菌的筛选方法如下：

1、实验材料与方法

1.1、实验材料

灰葡萄孢霉(B.cinerea)从自然发病的番茄果实表面分离得到，经纯化后接种于PDA培养基上，在26℃下培养7d后，采用血球计数法用无菌水配成1×10⁶孢子/mL的孢子悬浮液。

用于分离拮抗菌的果实蔬菜采自山西省代县、繁峙县及太原市小店区，或购于太原市场，样品及采样地见表1。

接种用的番茄购于太原市小店区。

表1 样品及采样地点

1.2、实验方法

1.2.1、拮抗菌的分离

参照Janisiewicz的方法，分别取5～10个果实(或2～3片菜叶或番茄叶)放入盛有0.2M(摩尔)磷酸缓冲液中，在100r/min摇床中旋转振荡10min后，弃去洗液，再加入磷酸缓冲液，在超声波清洗器中清洗30s，进行二次洗涤。二次洗涤所得的液体经10倍、100倍和1000倍梯度稀释后，各取100μL涂布于PDA培养基上，26℃培养2～3d，挑取单菌落再在PDA平板进行划线培养，进一步纯化。

1.2.2、拮抗菌的筛选

活体筛选法：从PDA培养基上挑取初步筛选出的拮抗菌，经活化后，在28℃下培养24～48h。挑取单菌落于28℃下200r/min振荡培养24h后，配成1×l0¹⁰cfu/mL的悬浮液备用。将番茄健果用2％的NaClO溶液表面消毒2min后，自来水冲洗干净，无菌风吹干。用无菌接种针在果实腰部刺3mm×3mm的伤口，每果刺2个伤口，先在伤口处接种50μL分离的拮抗菌悬浮液，2h后再接种15μL的1×10⁶孢子/mL的病原菌孢子悬浮液，以无菌水作为对照，无菌风吹干后将果实放入塑料盒中，26℃恒温保湿培养。7d后测定果实的发病率和病斑直径。每处理10个果实，3次重复。

2、结果与分析

经过各种果实表面进行筛选，共分离到89株细菌和53株酵母菌，从其中进一步筛选出拮抗效果较好的6株细菌和5株酵母菌，其发病率和病斑直径均显著低于对照(P<0.05)，其中拮抗效果最好的为细菌菌株B-1，对照全部发病，而经过菌株处理后，发病率为0％，可以完全抑制番茄采后灰霉病的发生，如表2所示。

表2 番茄果实伤口接种拮抗菌和灰葡萄孢霉后的发病率和病斑直径

同列不同字母表示邓肯式多重差异范围检测在P＝0.05水平上差异显著。

本实验用来分离拮抗菌的果实为随机选取的，在室温下保湿放置了一段时间后，从未发病果实的表面分离拮抗微生物。用于进行生物防治的拮抗菌，除了能够有效抑制或杀灭病原菌，还要能很好的适应病原菌所处的生态和环境系统。

在果实的病害与微生物的所在的生态系统中，当果实的病害发生较严重时，病原菌占有有利地位，而拮抗菌则被抑制状态。因此，有效的拮抗菌就应在有利于果实发病的条件下，但果实并不表现发病或发病很轻，常常是一种或几种拮抗菌在起作用，而从这些果实中进行拮抗菌的筛选，更容易分离到抑菌效果好的拮抗菌。

关于拮抗菌的筛选方法，很多研究者都是采用离体和活体筛选相结合的方法来进行的。首先，在平板上进行离体初筛和复筛，然后再在果实上活体接种，以活体筛选对靶病原菌有抑制作用的拮抗菌株。离体筛选对于菌株抑菌能力的确定较为方便和快捷。但是，在离体条件下筛选出的有抑菌力的菌株在活体试验时并不一定也能表现同样的抑菌效果，所以，本次实验主要进行的是活体筛选，因为筛选得到的拮抗菌最终也是以抑制番茄活体产生的病害为最终目的的。

二、拮抗菌B-1的生物学鉴定

1、实验方法：

1.1、菌体培养

将纯化的菌株在平板上划线分离，培养20h后挑取单菌落接种到20ml液体培养基中，37℃、200rpm培养15h。

1.2、基因组DNA的提取

用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀的方法来提取总DNA。

取单菌落接种于5mL的PDA培养基中，37℃培养24h，取1.0mL菌液于1.5mL离心管中，13000r/min离心2min，弃上清；沉淀重悬于1.0mL0.85％的NaCl，室温13000r/min离心2min，弃上清；沉淀重悬于550μL1×TE。加17μL溶菌酶(35mg/mL)，37℃温育30min；加3μL蛋白酶K，37℃、30min。加30μL的10％SDS，37℃温育30min。加100μL的5M的NaCl后混匀；加80μL的CTAB/NaCl混合液，混匀，65℃水浴10min，加等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻振荡混匀；室温13000r/min离心10min；将上清移至一新的1.5mL离心管，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)轻轻振荡混匀。上清液移到一新的1.5ml离心管，加0.6倍体积异丙醇，混匀后室温静置1h；20℃，13000r/min离心20min；弃上清，加500μl的70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)；4℃，15000r/min离心20min；重复洗盐2次；将离心管倒置，干燥DNA 沉淀10～15min；将DNA沉淀溶于100μl1×TE缓冲液，-20℃保存备用。

1.3、菌株16S rDNA的克隆

依照Coenye等的方法扩增细菌16S rDNA。引物为27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’与1541R：5’-AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’。

PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸1min15s，共35个循环；72℃终止10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳、EB染色后用紫外凝胶成像系统进行分析，回收目的片段并纯化后，由上海英骏基因有限公司进行序列测定。

PCR反应体系为：Taq(5U/μL)0.8μL；10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL；dNTP Mixture(2.5mM/each)8μL；模板DNA2.5ng；引物F1(10μmoL/L)2μL，引物R1(10μmoL/L)2μL；ddH₂O补足到100μL。

1.4、菌株B-1的RecA基因克隆

参照Mahenthiralingam E等方法，克隆recA基因的正向引物BCR1：5'-TgACCgCCgAgAAgAgCAA-3'和反向引物BCR2：5'-CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC-3'。

PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终止10min。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳、EB染色后用紫外凝胶成像系统进行分析，回收目的片段并纯化后，由上海英骏基因有限公司进行序列测定。

RecA基因序列反应体系为100μL：Taq(5U/μL)0.8μL；10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL；dNTP Mixture(2.5mM/each)8μL；模板DNA2.5ng；引物F1(10μmol/L)2μL，引物R1(10μmol/L)2μL；ddH₂O补足到100μL。

1.5、同源比较与系统发育树的构建

将克隆的基因DNA序列进行测序后，进行Blast同源性比较后，用MEGA4.0软件构建序列同源性矩阵表，并采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。

1.6、生理生化指标分析

依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》第九版对菌株B-1进行生理生化测定。

2、结果与分析

2.1、菌落形态

菌株B-1呈杆状，短棒状，不运动，无芽孢，革兰氏染色阴性。在细菌培养基平板上培养呈圆形，边缘整齐，乳脂色，不透明(如图2所示)。

2.2、生理生化特性

对菌株B-1的生理生化特性进行了测定，结果如表3：

表3 菌株B-1的生理生化特征

2.3、菌株B-1的16S rDNA同源性分析及系统发育树构建

所用引物扩增出的基因组16S rDNA序列全长为1439bp。将所测得序列经Blast进行同源性比较后，采用DNAMEN软件进行多序列比较。B-1的序列与伯克氏菌Burkholderia lata(CP000150)同源性为99.8％，与伯克氏菌B.arboris(AM747630)同源性为99.8％，与伯克氏菌B.metallica(AM747632)同源性为99.7％，与B.cenocepacia(AF148556)和B.cepacia(U96927)的同源性为99.5％，与B.stabilis(AF097533)和吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)(U96930)同源性均为99.4％，与B.diffusa(AM747629)和B.latens(AM747628)同源性为99.3％，与越南伯克氏菌(B.vietnamiensis)(AF097534)同源性为99.2％，与B.ubonensis(AB030584)的同源性为99.1％。与其它伯克氏菌荚壳伯克氏菌(B.glumae)(U96931)、鼻疽伯克氏菌(B.mallei)(AF110188)、B.oklahomensis(DQ108388)、植物伯克氏菌(B.plantarii)(U96933)、类鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei)(DQ108392)、B.thailandensis(U91838)的同源性均为98％以上。以皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)为外群构建系统发育树(如图3所示)，从系统发育树可知，与菌株B-1亲缘关系最近的是Burkholderia lata(CP000150)，它们聚在一个分支，自举支持率为46％。初定菌株B-1为伯克氏菌属(Burkholderia)，但是由于伯克氏菌的16S rDNA序列同源性较高，所以并不能准确鉴定到种。

2.4、菌株B-1recA基因同源性分析及系统发育树构建

为了更准确鉴定细菌菌株B-1，通过对持家基因recA进行进一步验证，引物BCR扩增的片段测序所得序列长度为804bp。为了进一步鉴定菌株B-1的种，将recA基因16S测序后，经Blast与伯克氏菌属的其它属进行同源性比较，再采用DNAMEN软件进行多序列比较。选取的菌株均为洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderia cepacia complex)的菌株。B-1的序列与Burkholderia contaminans(AF456121)序列相似性为100％，与Burkholderia lata(AF456124)同源性为98.8％，与Burkholderia metallica(AF456103)同源性为98.5％，与Burkholderia arboris(AM748095)同源性为98.1％，与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(AF143786)同源性较低，为96.3％。

采用临位连接法构建菌株B-1与相关种的recA基因的系统发育树，如图4所示。B-1与B.contaminans的模式菌株LMG23361(登录号AF456121)聚在同一个分支，聚类自举支持率为62％，结合细菌形态、生理生化特征、基因组和RecA序列分析，将菌株B-1鉴定为：Burkholderia contaminans。属细菌界(Bacteria)变形菌门(Proteobacteria)β-变形杆菌纲(β-Proteobacteria)伯克氏菌目(Burkholderiales)伯克氏菌科(Burkholderiaceae)伯克氏菌属(Burkholderia)洋葱伯克霍尔德氏菌复合型(Burkholderia cepacia complex)。

三、抑菌效果研究

1、不同浓度菌株B-1菌悬液对番茄采后病害体外抑制实验

方法：

采用菌碟法，将菌株B.contaminans纯化后，挑取单菌落接种于100mL的LB液体培养基(酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL)中，30℃200r振荡培养36h，用稀释平板法测定浓度后，以无菌水配制浓度分别为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹cfu/mL的拮抗菌悬浮液。在装有PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水1000mL)的直径为9cm的培养皿内，待PDA培养基凝固后，分别加入不同浓度的拮抗菌悬浮液100μL，涂布均匀后，无菌风吹干后，再于中心点接入直径为5mm的病原菌菌饼，对照加无菌水。28℃下恒温培养，5～7d后测量菌落直径，并计算其抑制率，每次处理3次重复，实验重复3次。

抑制率(％)＝(dC-dT)/(dC-5)×100

其中，dC：对照菌落直径(mm)；

dT：不同处理条件下菌落直径(mm)。

结果：

不同浓度的B.contaminans可以有效抑制串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)的菌丝正常生长，且菌液的浓度越大，其抑菌作用越强(如图5所示)。

2、B.contaminans发酵液对樱桃番茄灰霉病的抑制效果

方法：

取番茄健果，采用2％的NaClO进行果实表面消毒后在，于果实赤道部位刺直径为5mm、深3mm的伤口，每果2个伤口。在伤口分别加1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰cfu/mL的菌株B-1菌悬液，对照加无菌水。2h后在伤口接1×10⁶孢子/mL的灰葡萄孢(B.cinerea) 20μL，25℃下保温培养，7d后测量病斑直径并计算抑制率。每处理10个果，实验重复3次。

结果：

接入不同浓度的B.contaminans菌悬液后，发病率统计结果如图6所示，随着浓度的升高，番茄灰霉病的发病率下降。CK灰霉病的发生率为100％；在1×10⁷cfu/mL时，其发生率65.40％，1×10⁸cfu/mL为45.36％，1×10⁹cfu/mL时仅为4.42％，在最高浓度1×10¹⁰cfu/mL时，可完全抑制番茄灰霉病的发生。

3、B.contaminans发酵液对樱桃番茄采后青霉病的抑制效果

方法：

B.contaminans发酵液制备方法如下：菌株B.contaminans在LB液体培养基中，30℃，20r/min摇瓶培养48h即可。

取番茄健果，采用2％的NaClO进行果实表面消毒后在，于果实赤道部位刺直径5mm、深3mm的伤口，每果2个伤口。在伤口分别加48h的发酵液50μL，对照加50μL无菌水。2h后在伤口接1×10⁶孢子/mL的扩展青霉(Penicillium expansum)20μL，26℃下保温培养，7d后检查发病情况。每处理20个果。实验重复3次。

结果：

番茄果实分别接入拮抗菌和无菌水(对照)后，对照果实的发病率为100％，而接入发酵液处理的果实的发病率仅为13.2％。

4、B.contaminans发酵液对草莓自然腐烂的抑制效果

方法：

取草莓健果，采收当天于0℃下预冷24h后，进行如下处理：用B.contaminans的48h的发酵液浸泡草莓果实，充分浸泡3min后，无菌风吹干，吹干后置于4℃保湿贮藏，对照直接置于4℃保湿贮藏。13～15天时检查发病情况。每处理20个果。实验重复3次。

结果：

采用拮抗菌B.contaminans发酵液处理的草莓果实，其腐烂率和腐烂程度均明显低于对照。

5、B.contaminans结合Na₂SiO₃对番茄采后灰霉病的抑制效果

将1×10⁸cfu/mL的B.contaminans菌悬液中添加不同浓度的Na₂SiO₃，如图6所示(图中，注：1、CK；2、1×10⁸cfu/ml B.contaminans；3、1×10⁸cfu/ml B.contaminans+25mM Na₂SiO₃；4、1×10⁸cfu/ml B.contaminans+50mM Na₂SiO₃；5、1×10⁸cfu/ml B.contaminans+100mM Na₂SiO₃)，结果表明，Na₂SiO₃可显著提高拮抗菌B.contaminans的生防效力，而浓度为50mM的Na₂SiO₃对拮抗菌B.contaminans的生防效力提高最有效。樱桃番茄在常温下接种灰葡萄孢菌对照发病率为100％。而单纯使用1×10⁸cfu/mL的拮抗菌，其发病率为45.36％，而添加50mM的Na₂SiO₃后，其发病率则降为17.97％。

6、B.contaminans结合NaHCO₃对番茄采后灰霉病的抑制效果

用不同浓度的NaHCO₃与1×10⁸cfu/mL结合使用，如图7所示(图中，注：1、CK；2、1×10⁸cfu/ml B.contaminans；3、1×10⁸cfu/ml B.contaminans+25mM NaHCO₃；4、1×10⁸cfu/ml B.contaminans+50mM NaHCO₃；5、1×10⁸cfu/ml B.contaminans+100mM NaHCO₃)，结果表明NaHCO₃也可以有效提升拮抗菌B.contaminans的生防效力，而使用不同浓度的NaHCO₃，其抑制效果也不同，与添加Na₂SiO₃效果相同的是，添加50mM的NaHCO₃对拮抗效果的提高最显著。但是添加相同浓度的Na₂SiO₃较添加NaHCO₃效果更好。在添加Na₂SiO₃时番茄发病率为17.97％，而添加NaHCO₃时为21.47％。

本发明所述的菌株能够很好地抑制果蔬采后灰霉病以及青霉病的发生，也就大大提高了果蔬采后病害的防治效果。

附图说明

图1是菌株B-1的培养基平板上的形态示意图。

图2是菌株B-1的显微镜示意图。

图3是通过邻接法构建的基于菌株B-1的16S rDNA序列的系统发育树示意图。

图4是通过邻接法构建的基于菌株B-1的recA基因序列的系统发育树示意图。

图5是不同浓度B.contaminans菌悬液对三种病原真菌的抑制柱形图。

图6是Na₂SiO₃对拮抗菌B.contaminans抑制番茄灰霉病的影响。

图7是NaHCO₃对拮抗菌B.contaminans抑制番茄灰霉病的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

实施例1

一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括菌株B-1的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加25mM的Na₂SiO₃。

实施例2

一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括菌株B-1的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加50mM的Na₂SiO₃。

实施例3

一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括菌株B-1的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加100mM的Na₂SiO₃。

实施例4

一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括菌株B-1的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加25mM的NaHCO₃。

实施例5

一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括菌株B-1的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加50mM的NaHCO₃。

实施例6

一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括菌株B-1的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加100mM的NaHCO₃。

实施例7

一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，包括菌株B-1的发酵液，发酵条件：在LB液体培养基中，30℃，20r/min摇瓶培养48h。

实施例8

一种用于防治果蔬采后病害的菌株的培养方法，配制培养基的组成如下：麦芽浸粉8～15g/L，大豆蛋白胨8～15g/L，MnSO₄·7H₂O0.5～1.5g/L，KH₂PO₄0.5～1.0g/L，然后在所述培养基中进行接种培养。

菌株16S rDNA 序列如下：

1 TACCATGCAG TCGAACGGCA GCACGGGTGC TTGCACCTGG TGGCGAGTGG

51 CGAACGGGTG AGTAATACAT CGGAACATGT CCTGTAGTGG GGGATAGCCC

101 GGCGAAAGCC GGATTAATAC CGCATACGAT CTACGGATGA AAGCGGGGGA

151 CCTTCGGGCC TCGCGCTATA GGGTTGGCCG ATGGCTGATT AGCTAGTTGG

201 TGGGGTAAAG GCCTACCAAG GCGACGATCA GTAGCTGGTC TGAGAGGACG

251 ACCAGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC

301 AGTGGGGAAT TTTGGACAAT GGGCGAAAGC CTGATCCAGC AATGCCGCGT

351 GTGTGAAGAA GGCCTTCGGG TTGTAAAGCA CTTTTGTCCG GAAAGAAATC

401 CTTGGCTCTA ATACAGTCGG GGGATGACGG TACCGGAAGA ATAAGCACCG

451 GCTAACTACG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGTAGGGTGC GAGCGTTAAT

501 CGGAATTACT GGGCGTAAAG CGTGCGCAGG CGGTTTGCTA AGACCGATGT

551 GAAATCCCCG GGCTCAACCT GGGAACTGCA TTGGTGACTG GCAGGCTAGA

601 GTATGGCAGA GGGGGGTAGA ATTCCACGTG TAGCAGTGAA ATGCGTAGAG

651 ATGTGGAGGA ATACCGATGG CGAAGGCAGC CCCCTGGGCC AATACTGACG

701 CTCATGCACG AAAGCGTGGG GAGCAAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC

751 CACGCCCTAA ACGATGTCAA CTAGTTGTTG GGGATTCATT TCCTTAGTAA

801 CGTAGCTAAC GCGTGAAGTT GACCGCCTGG GGAGTACGGT CGCAAGATTA

851 AAACTCAAAG GAATTGACGG GGACCCGCAC AAGCGGTGGA TGATGTGGAT

901 TAATTCGATG CAACGCGAAA AACCTTACCT ACCCTTGACA TGGTCGGAAT

951 CCCGCTGAGA GGTGGGAGTG CTCGAAAGAG AACCGGCGCA CAGGTGCTGC

1001 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG

1051 AGCGCAACCC TTGTCCTTAG TTGCTACGCA AGAGCACTCT AAGGAGACTG

1101 CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC CTCATGGCCC

1151 TTATGGGTAG GGCTTCACAC GTCATACAAT GGTCGGAACA GAGGGTTGCC

1201 AACCCGCGAG GGGGAGCTAA TCCCAGAAAA CCGATCGTAG TCCGGATTGC

1251 ACTCTGCAAC TCGAGTGCAT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA

1301 GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGTCT TGTACACACC GCCCGTCACA

1351 CCATGGGAGT GGGTTTTACC AGAAGTGGCT AGTCTAACCG CAAGGAGGAC

1401 GGTCACCACG GTAGGATTCA TGACTGGGGT GAAGTCGAA

菌株recA基因序列如下：

1 GGAATCGTCC GGTAAAACCA CGCTCACGCT GCAGGTCATT GCCGAACTGC

51 AGAAGCTGGG CGGCACCGCA GCGTTTATCG ACGCCGAGCA CGCGCTCGAC

101 GTTCAATATG CAGCGAAGCT CGGCGTGAAC GTGCCGGAGC TGCTGATCTC

151 GCAGCCGGAC ACCGGCGAGC AGGCGCTTGA AATCACCGAC GCGCTGGTGC

201 GCTCGGGCTC GATCGACATG ATCGTCATCG ACTCGGTCGC GGCGCTCGTG

251 CCGAAGGCCG AAATCGAAGG CGAGATGGGC GATTCGCTGC CGGGTCTGCA

301 GGCCCGCCTG ATGTCGCAGG CGCTGCGCAA GCTGACCGGC ACGATCAAGC

351 GCACGAACTG CCTCGTGATC TTCATCAACC AGATCCGGAT GAAGATCGGC

401 GTGATGTTCG GCAACCCGGA AACCACGACG GGCGGTAACG CACTGAAGTT

451 CTACTCGTCG GTGCGTCTCG ACATCCGCCG GATCGGCTCG ATCAAGAAGA

501 ACGACGAGGT GATCGGCAAC GAAACCCGCG TGAAGGTCGT CAAGAACAAG

551 GTGTCGCCGC CGTTCCGCGA AGCGATCTTC GACATCCTGT ATGGCGAAGG

601 AATTTCGCGC CAGGGCGAGA TCATCGATCT CGGCGTGCAG GCGAAGATCG

651 TCGACAAGGC GGGCGCCTGG TACAGCTACA ACGGCGAGAA GATCGGCCAG

701 GGCAAGGACA ACGCGCGTGA ATTCCTGCGC GAAAATCCGG AAATCGCACG

751 CGAGATCGAG AACCGCATTC GCGAATCGCT TGGCGTGGTC ACCATGCCCG

801 ATGG

Claims

1.一种用于防治果蔬采后病害的菌株，于2014年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M 2014076。

2.一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，其特征在于：包括权利要求1所述菌株的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加25～100mM的Na₂SiO₃。

3.一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，其特征在于：包括权利要求1所述菌株的菌悬液，所述菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL，所述每毫升菌悬液中添加25～100mM的NaHCO₃。

4.一种用于防止果蔬采后病害的生防菌剂，其特征在于：包括权利要求1所述菌株的发酵液，发酵条件：在LB液体培养基中，30℃，20r/min摇瓶培养48h。

5.一种权利要求1所述的用于防治果蔬采后病害的菌株的培养方法，其特征在于：配制培养基的组成如下：麦芽浸粉 8～15g/L，大豆蛋白胨 8～15 g/L，MnSO₄·7H₂O 0.5～1.5 g/L，KH₂PO₄0.5～1.0 g/L，然后在所述培养基中进行接种培养。

6.权利要求1所述的菌株在防止果蔬采后病害方面的应用。