CN104105710A - 抗-spla2-v抗体以及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对人sPLA2-V的分离抗体以及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及新颖抗体抗-sPLA2-V以及其在诊断和治疗方法中的用途。
背景技术
分泌型磷脂酶A2(sPLA2)形成催化磷脂的sn-2脂肪酰基键的水解以释放游离脂肪酸和溶血磷脂的结构相关酶的家族。通过催化此反应，sPLA2酶在多种生物过程中起着关键作用，所述生物过程包括细胞膜的稳态、脂类消化、宿主防御、信号转导、以及脂类介质(例如类花生酸和溶血磷脂衍生物)的产生(Valentin等.2000,Bioch.Biophys.Act.59-70；Lambeau,G.,和Gelb,M.H.2008,Annu.Rev.Biochem.77,495-520)。此家族包括11个成员/异形体，称为sPLA2-IB、sPLA2-IIA、sPLA2-IIC、sPLA2-IID、sPLA2-IIE、sPLA2-IIF、sPLA2-III、sPLA2-V、sPLA2-X、sPLA2-XIIA和sPLA2-XIIB。
在蛋白水平上对特异性异形体的量化被证实存在困难因为类似的酶活性以及异形体-特异性sPLA2抗体的缺乏。
对于sPLA2-V，Munoz等开发了针对人sPLA2-V、不与其它家族成员交叉反应的单克隆抗体(Munoz等.2002J.of Immunol.Meth.262:41-51)。这些抗体获自经纯化的重组人sPLA2-V免疫的小鼠的杂交瘤并称为MCL-1B7、MCL-2A5和MCL-3G1。Munoz等描述了一种将MCL-1B7和MCL-2A5用作捕获抗体并将MCL-3G1用作检测抗体的夹心ELISA试验。此测定被描述以提供2ng/ml灵敏限。但是，此测定不在血清样品中试验。目前，单克隆抗体MCL-3G1是由Cayman Chemical以目录号Cat.N°160510出售。
Nevalainen等也开发了一种针对sPLA2-V、用于时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)的抗体。此多克隆抗体是通过使兔子经重组人sPLA2-V蛋白免疫获得。将TR-FIA的分析灵敏度描述为11ng/ml。在来自败血病性休克患者和健康供血者的血清样品中分析sPLA2-V含量：作者发现在两种样品中的sPLA2-V的血清浓度低于试验的分析灵敏度。
目前，需要可更精确并更灵敏地检测出生物样品(例如血清样品)中sPLA2-V的针对sPLA2-V的抗体。
发明内容
本发明的一个目的是一种针对人sPLA2-V的分离抗体，其中所述抗体具有小于5.10-10M，优选小于2.510-10M，优选小于1.10-10M的结合人sPLA2-V的Kd。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体的重链的可变区包括以下CDR中至少一个：如下定义的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体的轻链的可变区包括以下CDR中至少一个：如下定义的SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。
在另一个实施方案中，所述抗体的重链的可变区包括如上定义的CDR中至少一个并且轻链的可变区包括如上定义的CDR中至少一个。
在另一个实施方案中，所述抗体的重链的可变区包括以下CDR：SEQID NO:8(VH-CDR1)、SEQ ID NO:10(VH-CDR2)和SEQ ID NO:12(VH-CDR3)并且轻链的可变区包括以下CDR：SEQ ID NO:5(VL-CDR1)、SEQ ID NO:6(VL-CDR2)和SEQ ID NO:14(VL-CDR3)。
在另一个实施方案中，所述抗体的重链的可变区包括以下CDR：SEQID NO:9(VH-CDR1)、SEQ ID NO:11(VH-CDR2)和SEQ ID NO:13(VH-CDR3)并且轻链的可变区包括以下CDR：SEQ ID NO:5(VL-CDR1)、SEQ ID NO:6(VL-CDR2)和SEQ ID NO:15(VL-CDR3)。
在另一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18并且编码轻链可变区的核酸序列是SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。
本发明的另一个目的是一种表达载体，其包括SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中至少一个。
本发明的另一个目的是产生针对人sPLA2-V的抗体的杂交瘤细胞系CNCM I-4521和CNCM I-4522。
本发明的另一个目的是一种组合物，其包含文中如上定义的针对人sPLA2-V的抗体。
本发明的另一个目的是文中如上定义的用于治疗sPLA2-V-相关病症的针对人sPLA2-V的抗体，其中所述抗体抑制内源性sPLA2-V的活性。
本发明的另一个目的是文中如上定义的用于检测生物样品中sPLA2-V的针对人sPLA2-V的抗体。
本发明的另一个目的是一种利用文中如上定义的针对人sPLA2-V的抗体确定生物样品中sPLA2-V存在的体外诊断或预后测定。
本发明的另一个目的是一种试剂盒，其包括文中如上定义的针对人sPLA2-V的至少一种抗体。
具体实施方式
发明者开发了针对sPLA2-V的新颖抗体，其表现出比现有抗体更佳的sPLA2-V亲和力并可更精确且更灵敏地检测出生物样本中sPLA2-V，如实施例中所示。
定义
sPLA2-V是sPLA2家族的一种异形体。人sPLA2-V蛋白的完全氨基酸序列(SEQ ID NO:1)(GenBank登录号#NP000920)是：
MKGLLPLAWFLACSVPAVQG(信号肽)
GLLDLKSMIEKVTGKNALTNYGFYGCYCGWGGRGTPKDGTDWCCWAHDHCYGRLEEKGCNIRTQSYKYRFAWGVVTCEPGPFCHVNLCACDRKLVYCLKRNLRSYNPQYQYFPNILCS(成熟分泌型蛋白)。
如文中所用，术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们展现出所需的生物活性。在文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”可交换使用。
“分离抗体”是一种从它天然环境的组成中分离和/或回收的抗体。它天然环境的污染物组成是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并可包括酶、激素、以及其它蛋白质类或非蛋白质类组成。在优选实施方案中，使抗体纯化：(1)纯化到利用Lowry法确定的抗体的95重量％以上，并最优选地，大于99重量％；(2)纯化到足以通过使用旋杯式测序仪获得N-端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)纯化到在还原或非还原条件下并利用考马斯蓝或优选地，银染色，通过SDS-PAGE所显示的均质。分离抗体包括在重组细胞中原位的抗体，因为抗体的天然环境中至少一种组成将不存在。通常地，但是，分离抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
基本四链抗体单元是一种由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。根据它们恒定域(CL)的氨基酸序列，将来自任何脊椎动物物种的L链能够被归类到两种明显不同的种类(称为kappa([κ])和lambda([λ]))中的一种。根据它们重链的可变域(CH)的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同类或同型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，分别具有称为alpha([α])、delta([δ])、epsilon([ε])、gamma([γ])和mu([μ])的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异，将[γ]和[α]类进一步分为子类，例如，人表达以下子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。每个L链通过一个共价二硫键连接到H链，而两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接，此取决于H链同型。每个H和L链也具有规则间隔的链内二硫桥。每个H链的N-端具有一个可变域(VH)，后接三个恒定域(CH)(对于每个[α]和[γ]链)以及四个CH域(对于[μ]和[ε]同型)。每个L链的N-端具有一个可变域(VL)，其另一端具有一个恒定域(CL)。使VL与VH对齐并使CL与重链的第一个恒定域(CH1)对齐。特定氨基酸残基被认为形成轻链与重链可变域之间的界面。VH和VL在一起配对形成单抗原-结合部位。IgM抗体是由五个基本异四聚体单元与另一个称为J链的多肽组成，因此，含有十个抗原结合部位，但是分泌型IgA抗体可聚合以形成多价聚集体，其包含2-5个基本4-链单元和J链。在IgG的情况中，4-链单元通常具有约150,000道尔顿。对于不同类抗体的结构和性质，参见，例如，Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页,以及第6章。
术语“可变”指在抗体之间V域某些片段的序列差异很大的事实。V域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，可变性不是均匀地分布在可变域的整个110-氨基酸。反而，V区是由被极度易变的称为“高变区”的各自长9-12个氨基酸的更短区分开的、具有15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变伸展段组成。天然重和轻链的可变域各自包括四个FR，FR主要采用了[β]-折叠构型，并通过三个高变区连接，形成环连接，并且在一些情况中，形成[β]-折叠结构的一部分。每条链中的高变区是通过FR紧密地连在一起，并且与其它链的高变区一起，促成了抗体的抗原-结合部位的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现出多种效应功能，例如在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在文中使用时，是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，当按照Kabat编号系统编号时，VL中大概残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及VH中大概31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，当按照Chothia编号系统编号时，VL中残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及VH中26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的那些残基(例如，当按照IMGT编号系统编号时，VL中残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3)，以及VH中27-38(H1)、56-65(H2)和105-120(H3)；Lefranc,M.P.等Nucl.Acids Res.27:209-212(1999),Ruiz,M.等Nucl.Acids Res.28:219-221(2000))。视情况地，抗体在以下点中一处或多处具有对称插入：当按照AHo编号时，VL中28、36(L1)、63、74-75(L2)和123(L3)，以及VH中28、36(H1)、63、74-75(H2)和123(H3)(Honneger,A.和Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001))。
如文中所用，术语“单克隆抗体”指获自基本上均质抗体的群体的抗体，即，该群体所包括的单独抗体是相同的，除了可少量存在的可能自然发生的突变。单克隆抗体具有高度特异性，直接针对单抗原部位。并且，与包含针对不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定基。除了特异性，单克隆抗体利于其合成不受其它抗体污染。修饰语“单克隆的”不应被理解成抗体需通过任何特定方法制得。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过Kohler等,Nature,256:495(1975)最先描述的杂交瘤方法制备，或可利用重组DNA法在细菌、真核动物或植物细胞中制得(参见，例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可利用(例如)Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体库中分离出来。
文中单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中一部分重和/或轻链与从特定种属得到或属于特定抗体类或子类的抗体的相应序列相同或同源，但是链的其余部分与从另一种种属得到或属于另一种抗体类或子类的抗体的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们展现出所需的生物活性(参见美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本发明提供获自人抗体的可变域抗原结合序列。因此，文中首要关注的嵌合抗体包括具有一种或多种人抗原结合序列(例如，CDR)并含有一种或多种获自非人抗体的序列(例如，FR或C区序列)的抗体。此外，文中首要关注的嵌合抗体包括那些包含一种抗体类或子类的人可变域抗原结合序列和获自另一种抗体类或子类的另一种序列(例如，FR或C区序列)的抗体。文中目标嵌合抗体也包括那些含有与文中所述的那些相关或获自不同种属(例如，非人灵长目动物(例如，旧大陆猴(Old World Monkey)、猿(Ape)等))的可变域抗原结合序列的抗体。嵌合抗体也包括灵长类化抗体和人源化抗体。并且，嵌合抗体可包括在受体抗体中或在供体抗体中找不到的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。对于更多细节，参见Jones等,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地，完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；二体；线性抗体(参见，美国专利号5,641,870；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。短语抗体的“功能性片段或类似物”是一种具有与全长抗体一样的定性生物活性的化合物。例如，抗-IgE抗体的功能性片段或类似物是一种可以防止或基本上降低IgE免疫球蛋白具有结合高亲和力受体Fc[ε]RI的能力的方式结合所述分子的物质。抗体经木瓜蛋白酶的消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和一个残留的“Fc”片段，其名称反映了易结晶的能力。Fab片段是由整个L链、H链的可变区域(VH)以及一个重链的第一个恒定域(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即，它具有单个抗原结合部位。抗体经胃蛋白酶的处理得到单个大F(ab')2片段，其大概相当于两个具有二价抗原结合活性的二硫键连接的Fab片段并仍可交联抗原。Fab'片段不同于Fab片段，前者的CH1域的羧基端具有额外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在文中是其中恒定域中半胱氨酸残基具有一个游离巯基的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初是以其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对制得。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。
“人源化”抗体或“人”抗体指一种抗体，其中一种或多种人免疫球蛋白中恒定区和可变框架区与动物免疫球蛋白中结合区(例如，CDR)融合。将这些抗体设计成保留了从其获得结合区的非人抗体的结合特异性，但避免了对非人抗体的免疫反应。这些抗体可获自转基因小鼠或其它动物，这些动物已经“工程化”以回应于抗原刺激产生特定人抗体(参见，例如，Green等(1994)Nature Genet7:13；Lonberg等(1994)Nature368:856；Taylor等(1994)Int Immun6:579，其整篇教导以引用的方式并入文中)。完全人抗体也可通过基因或染色体转染法，以及噬菌体展示技术构建，所有这些方法和技术在该领域中是已知的(参见，例如，McCafferty等(1990)Nature348:552-553)。人抗体也可通过体外活化的B细胞产生(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，其全文是以引用的方式并入)。因此，“灵长类化”抗体指一种抗体，其中一种或多种灵长类动物免疫球蛋白中恒定和可变框架区与非灵长类动物免疫球蛋白中结合区(例如，CDR)融合。
“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替代或交换以使抗原结合部位(可变区)连接到不同的或变化的类、效应功能和/或物种的恒定区，或连接到赋予嵌合抗体新颖性质的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物、等；或(b)可变区或其一部分被具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、替代或交换。
“Fc”片段包括通过二硫键连在一起的两H链的羧基端部分。抗体的效应功能是由Fc区序列决定，该区也是通过在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是含有完全抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此片段是由紧密的非共价缔合的一个重链可变区域和一个轻链可变区域的二聚体组成。从这两个域的折叠发散出六个高变环(三个环各自来自H和L链)，提供用于抗原结合的氨基酸残基并赋予了抗体的抗原结合特异性。但是，甚至单可变域(或只包括对抗原特异的三个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，但是比整个结合部分的亲和力小。
也缩写成“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接到单多肽链中的VH和VL抗体域的抗体片段。优选地，sFv多肽又包含介于VH与VL域之间的使sFv形成用于抗原结合的所需结构的多肽连接子。关于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Borrebaeck1995,见下文。
术语“二体”指小抗体片段，其制备是通过构建具有介于VH与VL域之间的短连接子(约5-10个残基)的sFv片段(参见先前段落)以使V域的链间而非链内成对，得到二价片段，即，具有两个抗原结合部位的片段。双特异性二体是两个“交叉”的sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL域存在不同的多肽链上。二体在(例如)EP404,097、WO93/11161、以及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中被更详尽地描述。
如文中所用，抗体如果与抗原在可检测的水平上反应，优选以大于或等于约104M-1、或大于或等于约105M-1、大于或等于约106M-1、大于或等于约107M-1、或大于或等于108M-1的亲和力常数(Ka)与抗原反应，则所述抗体被称为对所述抗原具有“免疫特异性”、“特异性”或“特异地结合”抗原。也通常将抗体与其关联抗原的亲和力表示成解离常数Kd，在某些实施方案中，抗体如果以小于或等于10-4M，小于或等于约10-5M，小于或等于约10-6M，小于或等于10-7M，或小于或等于10-8M的Kd结合，则其特异地结合抗原。抗体的亲和力可利用传统技术轻易地确定，例如，Scatchard等所述的那些技术(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA51:660(1949))。抗体与抗原、其细胞或组织的结合性质通常可利用免疫检测法确定并评价，该免疫检测法包括(例如)基于免疫荧光的测定，例如免疫-组织化学(IHC)和/或荧光激活细胞分选法(FACS)。
“分离的核酸”是一种基本上从其它基因组DNA序列以及自然地伴随有天然序列的蛋白或复合物(例如核糖体和多聚酶)分离出的核酸。该术语涵盖已从其天然环境移除的核酸序列，并包括重组或克隆DNA分离物以及化学合成的类似物或通过异源系统以生物方式合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，此指最初分离的核酸并不排除随后人工地添加到分离核酸中的基因或序列。术语“多肽”按照其传统意思使用，即，作为氨基酸的序列。
不将多肽限于特定长度的产物。肽、寡肽和蛋白包括在多肽的定义内，并且这些术语在文中可交换使用，除非另外特定指出。此术语也不指排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及该领域中已知的其它修饰，这两方面的修饰是天然的以及非天然的。多肽可为整个蛋白，或其子序列。在本发明全文中目标特定多肽是包含CDR并能够结合抗原的氨基酸子序列。“分离的多肽”是一种已经识别并从其天然环境的组成中分离和/或回收的多肽。在优选的实施方案中，使分离的多肽纯化：(1)纯化到利用Lowry法确定的多肽的95重量％以上，并最优选地，大于99重量％；(2)纯化到足以通过使用旋杯式测序仪获得N-端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)纯化到在还原或非还原条件下并利用考马斯蓝或优选地，银染色，通过SDS-PAGE所显示的均质。分离的多肽包括在重组细胞中原位的多肽，因为多肽的天然环境中至少一种组成将不存在。通常地，但是，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制得。
“天然序列”多核苷酸是一种具有与获自天然的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是一种具有与获自天然(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)相同的氨基酸序列的多肽。这些天然序列多核苷酸和多肽可从天然分离出或可通过重组或合成方法制得。多核苷酸“变体”，当该术语在文中使用时，其是一种通常与文中所特定公开的多核苷酸的不同之处在于在一处或多处置换、缺失、添加和/或插入的多核苷酸。这些变体可为天然的或可以合成的方式生成，例如，通过如文中所述和/或使用该领域熟知的多种任意技术，修饰本发明的一个或多个多核苷酸序列并评价编码多肽的一种或多种生物活性。多肽“变体”，当该术语在文中使用时，是一种通常与文中所特定公开的多肽的不同之处在于在一处或多处置换、缺失、添加和/或插入的多肽。这些变体可为天然的或可以合成的方式生成，例如，通过如文中所述和/或使用该领域熟知的多种任意技术，修饰本发明的一个或多个上述多肽序列并评价多肽的一种或多种生物活性。可对本发明的多核苷酸和多肽结构进行修饰并仍获得编码具有所需特征的变体或衍生多肽的功能性分子。当需改变多肽的氨基酸序列以产生本发明多肽的等效体，或甚至改进的变体或部分时，技术人员通常将变换编码DNA序列的一个或多个密码子。例如，某些氨基酸可置换蛋白结构中其它氨基酸，而不明显损及其结合其它多肽(例如，抗原)或细胞的能力。因为蛋白的结合能力和性质定义蛋白生物功能活性，所以某些氨基酸序列置换可在蛋白序列以及(当然)其潜在的DNA编码序列中进行，仍然得到具有类似性质的蛋白。因此，考虑可在所公开组合物的肽序列，或编码该肽的相应DNA序列中进行多处变换，而不明显损及其生物用途或活性。在多种情况中，多肽变体将含有一种或多种保守置换。“保守置换”是一种其中以一种氨基酸置换具有类似性质的另一种氨基酸，以使肽化学领域的技术人员将期望多肽的二级结构和亲水性基本上不变的置换。如上所列出，因此，氨基酸置换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到以上多种特征的示例性置换对于技术人员是熟知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。氨基酸置换可又根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的类似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有不带电荷的极性首基的具有类似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸以及酪氨酸。可表示保守变换的氨基酸的其它组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。变体也可，或替代地，含有非保守变换。在一个优选实施方案中，变体多肽与天然序列的不同之处在于置换、缺失或添加五个氨基酸或更少。变体也可(或替代地)通过(例如)缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性具有最小影响的氨基酸来加以修饰。
如文中所用，“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括人、牲畜和农场动物、以及动物园、运动场、以及玩赏动物，例如狗、猫、牛、马、羊、猪、山羊、兔子等。优选地，该哺乳动物是人。
“治疗”或“缓解”指治疗性治疗以及预防性或防范性措施；其中目的在于阻止或减缓(减轻)目标病理病症或紊乱。需要处理的那些人包括已经患有紊乱的那些人以及易患上紊乱的那些人或预防紊乱的那些人。如果在接受了治疗量的根据本发明方法的抗体后，受试者或哺乳动物表现出可观察到的和/或可测量的以下一种或多种的减轻或不存在，则该患者的感染得到成功地“治疗”：致病细胞数目减少；致病总细胞的百分比下降；及/或与特定疾病或病症相关的一种或多种症状缓解到一定程度；发病率和死亡率降低，以及生活质量改善。用于评价成功治疗以及疾病改善的以上参数易通过医生所熟悉的常规步骤测量。
术语“治疗有效量”指有效地“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或紊乱的抗体或药物的量。
本发明
本发明涉及针对sPLA2-V的分离抗体。
抗体抗-sPLA2-V
本发明的一个目的是一种针对人sPLA2-V的抗体，其中所述抗体具有小于5.10-10M、优选小于2.510-10M、优选小于1.10-10M的结合人sPLA2-V的Kd。
Kd是在试验A的条件下确定：
使微板孔用50ng重组人sPLA2-V的PBS pH7.5室温下包被过夜。然后，利用含有0.05％Tween20的PBS冲洗样品孔三次。最后一次冲洗后，在室温下，使样品孔经含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液的封闭溶液处理60min。经含0.05％Tween20的PBS冲洗后，将增加量(0.1ng/mL至10μg/mL)的针对人PLA2-V的mAb加入经抗原包被的孔中，并在室温下温育120min。经含0.05％Tween20的PBS冲洗后，通过HRP-结合的多克隆山羊抗-小鼠IgG(Abcam ab7068)在室温下处理60min来检测mAb的结合。添加TMB，终止反应并在450nm下测定吸光度。使数据与单址饱和模型拟合并从模型估计出相对Kd值。
本发明的一个目的是一种针对人sPLA2-V的抗体，其中重链的可变区包含以下CDR中至少一个：
VH-CDR1：GX1X2X3X4DX5X6I(SEQ ID NO:2)其中
X1是Y、F、W、T、或S并优选Y或F，
X2是T或N，
X3是F、L、V、I、A、或Y，并优选F或I，
X4是T或K,
X5是Y、F、W、T、或S并优选Y或S，
X6是V或Y。
VH-CDR2：X1PX2X3G(SEQ ID NO:3)其中
X1是Y或D，
X2是G、P或A，优选A或G，
X3是S或N。
VH-CDR3：X1CARX2X3X4X5DY(SEQ ID NO:4)其中
X1是Y、W、F、T、S，并优选F或Y，
X2是W或D，
X3是F、L、V、I、A、或Y，并优选F或V，
X4是P或V，
X5是Y或A。
CDR编号和定义按照Chothia定义。
本发明的另一个目的是一种针对人sPLA2-V的抗体，其中轻链的可变区包含以下CDR中至少一个：
VL-CDR1:SASSSVSYMYW(SEQ ID NO:5)
VL-CDR2:TSNLASG(SEQ ID NO:6)
VL-CDR3:QX1X2SYPLTF(SEQ ID NO:7)其中
X1是Y、W、F、T、或S，并优选Y或W，
X2是H或S。
在本发明的一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V在其重链中包含3个如上所述的CDR(SEQ ID NO:2、3和4)以及其轻链中包含3个如上所述的CDR(SEQ ID NO:5、6和7)。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V在其重链中包含GYTFTDY(SEQ ID NO:8)与GFNIKDS(SEQ ID NO:9)中的一个VH-CDR1，YPGSG(SEQ ID NO:10)与DPANG(SEQ ID NO:11)中的一个VH-CDR2以及FCARWFPY(SEQ ID NO:12)与YCARDVVA(SEQ ID NO:13)中的一个VH-CDR3。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-V在其轻链中包含VL-CDR1：SASSSVSYMYW(SEQ ID NO:5)、VL-CDR2：TSNLASG(SEQID NO:6)以及QYHSYPLTF(SEQ ID NO:14)与QWSSYPLTF(SEQ ID NO:15)中的一个VL-CDR3。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V在其重链中包含3个CDR：SEQ ID NO:8、10和12。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V在其重链中包含3个CDR：SEQ ID NO:9、11和13。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V在其轻链中包含3个CDR：SEQ ID NO:5、6和14。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V在其轻链中包含3个CDR：SEQ ID NO:5、6和15。
根据本发明，可将重链和轻链中CDR1、2和3中任一个表征为具有与以相应的SEQ ID NO列出的特定CDR或CDR组具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V选自由以下组成的组：
-一种抗体，其分别具有(i)如SEQ ID NO:8、10和12所示的重链CDR1、2和3(VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3)氨基酸序列、以及(ii)如SEQ ID NO:5、6和14所示的轻链CDR1、2和3(VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列；
-一种抗体，其分别具有(i)如SEQ ID NO:9、11和13所示的重链CDR1、2和3(VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3)氨基酸序列，以及(ii)分别如SEQ ID NO:5、6和15中所示的轻链CDR1、2和3(VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列；
视情况地，其中所述序列中任一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同氨基酸置换。
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V(18G6抗体)包含序列SEQ ID NO:16的重链可变区和序列SEQ ID NO:17的轻链可变区。
(SEQ ID NO:16):
QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVITWVKQRTGQGLEWIGEIYPGSGSTYYDEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSMTSEDSAVYFCARWFPYFDYWGQGTTLTVSS.
(SEQ ID NO:17)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLELKR.
在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-V(19F3抗体)包括序列SEQ ID NO:18的重链可变区和序列SEQ ID NO:19的轻链可变区。
(SEQ ID NO:18)
EVQLQLSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIKDSYIHWVKQRPEPGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCARDVVALDYWGQGTTLTVSS
(SEQ ID NO:19)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELKR
根据本发明，重链或轻链可变区中一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同氨基酸置换。
根据本发明，重链可变区涵盖具有与SEQ ID NO:16或1860％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
根据本发明，轻链可变区涵盖具有与SEQ ID NO:17或1960％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
在本发明的任意抗体例如18G6和19F3中，特定可变区和CDR序列可包含保守序列修饰。保守序列修饰指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。该保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可通过本领域中已知的标准技术，将修饰引入本发明抗体，例如定点诱变和PCR-介导的诱变。保守氨基酸置换通常是其中氨基酸残基被具有类似物理化学性质的含侧链的氨基酸残基替代的那些置换。特定可变区和CDR序列可包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或置换。当置换时，优选置换是保守修饰。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在该领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代并且可利用文中所述测试测定所改变抗体的保留功能(即，文中所述性质)。
术语“同一性”或“相同的”，当用于两个或更多个多肽序列之间的关系时，指多肽之间序列相关程度，利用两个或更多个氨基酸残基串之间的匹配数决定。“同一性”利用间隙对准(如果有)衡量两个或更多个序列中较小序列间同一性匹配的百分比，通过特定数学模型或计算机程序(即，“演算法”)解决。相关多肽的同一性可通过已知方法容易地计算。这些方法包括，但不限于，Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics和Genome Projects,Smith,D.W.,编辑.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑,M.Stockton Press,New York,1991；以及Carillo等,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)中所述的那些。将确定同一性的优选方法设计成给出所测试序列间的最大匹配。确定同一性的方法在公开可用的计算机程序中有描述。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.\2,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul等,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可公开获自国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual,Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等,如上所述)。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
在一个实施方案中，本发明也提供了一种实质上结合与18G6或19F3抗体相同的表位的抗体。
本发明的另一个目的是一种编码序列SEQ ID NO:16的重链可变区的分离的核酸序列。优选地，该核酸序列是SEQ ID NO:20(CAG GTT CAGCTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAGTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GACTAT GTT ATA ACC TGG GTG AAG CAG AGA ACT GGA CAG GGC CTTGAG TGG ATT GGA GAG ATT TAT CCT GGA AGT GGT AGT ACT TACTAC GAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GACAAA TCC TCC AAC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC ATG ACATCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TTC TGT GCA AGA TGG TTC CCCTAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCCTCA)。
本发明的另一个目的是一种编码序列SEQ ID NO:17的轻链可变区的分离的核酸序列。优选地，该核酸序列是SEQ ID NO:21(CAA ATT GTTCTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAGAAG GTC ACC ATA TCC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TACATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCCTGG ATT TAT CGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCTCGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACAATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGCCAG CAG TAT CAT AGT TAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACCAAG CTG GAG CTG AAA CGG)。
本发明的另一个目的是一种编码序列SEQ ID NO:18的重链可变区的分离的核酸序列。优选地，该核酸序列是SEQ ID NO:22(GAG GTT CAGCTA CAG CTG TCT GGG GCA GAC CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCAGTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATA AAA GACTCC TAT ATT CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GAA CCG GGC CTGGAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAATAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GACACC TCC TCC AAC ACA GCC TAC CTG CAG CTC ACC AGC CTG ACATCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG GAC GTG GTGGCC TTG GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCCTCA)。
本发明的另一个目的是一种编码序列SEQ ID NO:19的轻链可变区的分离的核酸序列。优选地，该核酸序列是SEQ ID NO:23(CAA ATT GTTCTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAGAAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TACATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTCCTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTTCGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACAATC AGC CGG ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGCCAG CAG TGG AGT AGT TAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACCAAG CTG GAG CTG AAA CGG)。
本发明的另一个目的是一种包含编码本发明抗体抗-sPLA2-V的核酸序列的表达载体。
本发明的另一个目的是一种包含所述载体的分离的宿主细胞。该宿主细胞可用于本发明抗体的重组制备。
本发明的另一个目的是一种制造该本发明抗体的杂交瘤细胞系。
将根据本发明的优选杂交瘤细胞系保藏在巴黎红医生街25号的巴斯德研究院的国立微生物保藏中心(CNCM)，邮编75014(Collection Nationalede Culture de Microorganismes(CNCM),Institut Pasteur,25rue du DocteurRoux,75014Paris：
| 细胞系 | 保藏号 | 保藏日期 |
| 18G6杂交瘤 | CNCM I-4521 | 2011.9.21 |
| 19F3杂交瘤 | CNCM I-4522 | 2011.9.21 |
在本发明的一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。
本发明抗体的片段和衍生物(如本申请所用，涵盖在术语“抗体”中，除非另外指出或文中明确否认)，优选，18G6或19F3-样抗体，可通过该领域中已知的技术制得。“片段”包括完整抗体的一部分，一般来讲，抗原结合部位或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、和Fv片段；二体；以下的任何抗体片段：其为一种具有由相邻氨基酸残基的不间断序列组成的一级结构的多肽(在文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子(2)只含有一个轻链可变区的单链多肽，或含有轻链可变区中三个CDR的其片段，没有所缔合的重链部分以及(3)只含有一个重链可变区的单链多肽，或含有重链可变区中三个CDR的其片段，没有所缔合的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本发明抗体片段可利用标准方法获得。例如，Fab或F(ab')2片段可根据传统技术通过蛋白酶消化分离的抗体制得。期望免疫反应性片段可利用已知方法修饰，例如以减缓体内清除并得到更令人满意的药物代谢动力学特征，片段可经聚乙二醇(PEG)修饰。使PEG与Fab'片段偶合并部位特异性地结合的方法在(例如)Leong等,16(3):106-119(2001)和Delgado等,Br.J.Cancer73(2):175-182(1996)中有描述，其公开内容是以引用的方式并入文中。
或者，可对产生本发明抗体(优选18G6或19F3-样抗体)的杂种瘤的DNA进行修饰以编码本发明片段。然后，将经修饰的DNA插入表达载体中并用于转化或转染适宜的细胞，来表达所需片段。
在某些实施方案中，可在插入表达载体中之前对产生本发明抗体(优选18G6或19F3-样抗体)的杂种瘤的DNA进行修饰，所述修饰为例如通过用人重链恒定域和轻链恒定域的编码序列替换同源的非人序列(例如，Morrison等,PNAS pp.6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列共价结合到非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。以此方式，制得具有对原始抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。一般来讲，用这些非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定域。
因此，根据另一个实施方案，使本发明抗体(优选18G6或19F3-样抗体)人源化。根据本发明的抗体的“人源化”形式是特定的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有来自鼠免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补确定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基替代，但仍保留所需的原始抗体的特异性、亲和力、和能力。
在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架残基可被相应的非人残基替换。并且，人源化抗体可包括在受体抗体或输入的CDR或框架序列中找不到的残基。进行这些修饰可进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包括基本上所有或至少一个(一般而言，两个)可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于原始抗体的那些并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地也包括免疫球蛋白(一般地人免疫球蛋白的)恒定区(Fc)的至少一部分。对于更多细节，
参见Jones等,Nature,321,pp.522(1986)；Reichmann等,Nature,332,pp.323(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2,pp.593(1992)；Verhoeyen等Science,239,pp.1534；和美国专利号4,816,567，其整个公开内容是以引用的方式并入文中。人源化本发明抗体的方法在该领域是熟知的。
用于制备人源化抗体的人可变域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳适配”方法，从已知的人可变域序列的整个库中，筛选出本发明抗体的可变域的序列。然后，将最接近小鼠的人序列当作人源化抗体的人框架(FR)(Sims等,J.Immunol.151,pp.2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.196,pp.901)。另一种方法使用来自轻或重链的特定子组的所有人抗体的共同序列的特定框架。可将相同框架用于多种不同的人源化抗体(Carter等,PNAS89,pp.4285(1992)；Presta et J.Immunol.,51(1993))。另外，重要的是抗体人源化后应保留对sPLA2-V的高亲和力以及其它有利的生物学性质。为此，根据一个优选方法，人源化抗体是通过利用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和多种概念性人源化产物的分析制得。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并为该领域技术人员所熟悉。计算机程序是可获得的，其阐述并展示了选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维结构。这些展示的检验允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能化中可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，FR残基可从共有和输入序列中选定并组合，以得到所需的抗体特征，例如对目标抗原的亲和力增加。一般来说，CDR残基可直接地并大多数基本上涉及影响抗原结合。制得“人源化”单克隆抗体的另一种方法是将XenoMouse(Abgenix,Fremont,CA)用作免疫用的小鼠。XenoMouse是一种鼠宿主，根据本发明，其具有被功能性人免疫球蛋白基因替代的免疫球蛋白基因。因此，由此小鼠制得的抗体或在由此小鼠的B细胞制得的杂交瘤中制得的抗体已经人源化。XenoMouse在美国专利号6,162,963中有描述，其全文是以引用的方式并入文中。
人抗体也可根据多种其它技术制得，例如为了免疫，通过使用经工程化以表达人抗体库的其它转基因动物(Jakobovitz et Nature362(1993)255)，或通过利用噬菌体展示法选择抗体库。这些技术对于技术人员是已知的并能够从单克隆抗体开始实施，如本申请所公开。
也可将本发明抗体(优选18G6或19F3-样抗体)衍生化成“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链/轻链与原始抗体中相应序列相同或同源，但是链的其余部分与从另一种种属得到或属于另一种抗体类或子类的抗体的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只有它们展现出所需的生物活性和结合特异性(Cabilly等,如上所述；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,pp.6851(1984))。
组合物以及在治疗中的用途
本发明的一个目的是一种组合物，其包括至少一种本发明抗体抗-sPLA2-V，优选18G6或19F3抗体。
本发明的另一个目的是一种医药组合物，其包含至少一种如上所述的本发明抗体抗-sPLA2-V(优选18G6或19F3抗体)以及一种医药上可接受的载剂。
本发明的另一个目的是本发明抗体抗-sPLA2-V，其用于或用在抑制sPLA2-V活性，或用于或用在治疗或预防sPLA2-V-相关病症。
本发明的另一个目的是一种用于抑制有需求的受试者的sPLA2-V活性的方法，其包括对该受试者施用有效量的本发明抗体抗-sPLA2-V。
本发明的另一个目的是一种用于治疗或预防有需求的受试者的sPLA2-V-相关病症的方法，其包括对该受试者施用有效量的本发明抗体抗-sPLA2-V。
可用于这些组合物的医药上可接受的载剂包括，但不限于，离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
为施用给受试者，对组合物进行调配以施用给受试者。本发明的组合物可口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠内、经鼻、经口颊、阴道内或通过植入的容器施用。文中所用包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或滴注技术。
本发明组合物的无菌可注射形式可为水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据该领域所知的技术，利用适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂调配。无菌可注射制剂也可为在非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。在可接受的媒剂和溶剂中，可使用水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，传统上，将无菌不挥发性油用作溶剂或悬浮媒质。为此，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单-或二甘油酯。脂肪酸(例如油酸以及其甘油酯衍生物)可用于制备可注射液，脂肪酸如天然的医药上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其采用其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素，或常用于配制医药上可接受剂型(包括乳液和悬浮液)的类似分散剂。其它常用的表面活性剂，例如吐温(Tweens)、Spans和常用于制备医药上可接受的固体、液体、或其它剂型的其它乳化剂或生物可利用的增强剂，也可用于调配的目的。
本发明组合物可采用任何口服可接受的剂型口服，剂型包括，但不限于，胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服片剂的情况中，常用载剂包括乳糖和玉米淀粉。通常也可添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于采用胶囊形式的口服，有用稀释剂包括(例如)乳糖。当口服需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合在一起。如需要，也可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
可根据用于这些物质的已知方法确定本发明的医药组合物中抗体的施用流程和剂量，例如使用制造商的指示。例如，本发明的医药组合物中所存在的抗体可在100mg(10mL)或500mg(50mL)的单次使用的小瓶中以10mg/mL浓度提供。产品被配制在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7ing/mL聚山梨醇酯80和注射用无菌水中用于静脉内(IV)施用。将pH调节在6.5。期望这些流程是示例性的并考虑到需在临床试验中确定的医药组合物中特定抗体的亲和性和耐受性，采用最佳的流程和方案。
可使用本发明方法的疾病或病症包括抑制sPLA2-V是有利的所有疾病。
该sPLA2-V-相关病症包括，但不限于，炎症、癌症、败血症、严重手术或带有严重伤口区域的其它损伤、糖尿病休克、急性肝衰竭、胰腺炎、神经变性疾病、自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE)、骨关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、葛瑞夫兹氏病(Graves'disease)、寻常型银屑病、扩张型心肌病、糖尿病、别赫捷列夫(Bechterew)、炎症性胆疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、成形性贫血(plastic anemia)、特发性扩张型心肌病(IDM)、自身免疫性甲状腺炎、古德帕斯彻氏病(Goodpastures'disease)、动脉和静脉慢性炎症。
在另一个实施方案中，该sPLA2-V-相关病症是心血管疾病和/或心血管事件。该心血管疾病和/或心血管事件包括，但不限于，代谢性综合症、综合症X、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、稳定和不稳定型心绞痛、中风、主动脉以及其分支的疾病(例如，主动脉瓣狭窄、血栓症或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病、以及任何急性缺血性心血管事件。
组合物以及用于诊断和预后的用途
本发明的另一个目的是本发明的至少一种抗体抗-sPLA2-V用于体外或体内检测样品(优选生物样品)中sPLA2-V的用途。
可使用本发明抗体的测定的实例包括，但不限于，ELISA、夹心ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白印迹、以及免疫沉淀。
本发明的另一个目的是一种检测样品中sPLA2-V的方法，其包括使样品与本发明抗-sPLA2-V抗体接触并检测结合sPLA2-V的抗-sPLA2-V抗体，进而指示样品中sPLA2-V的存在。
在本发明的一个实施方案中，样品是生物样品。生物样品的实例包括，但不限于，体液，优选血液，更优选血清、血浆、滑液、支气管肺泡灌洗液、痰、淋巴液、腹水液、尿、羊水、腹水、脑脊髓液、胸膜液、心包液、以及肺泡巨噬细胞、组织溶解物以及由患病组织制得的提取物。
在本发明的一个实施方案中，术语“样品”意指在任何分析前从个体得到的样品。
在本发明的一个实施方案中，使抗-sPLA2-V抗体直接标记有可检测的标记并可直接检测到。在另一个实施方案中，抗-sPLA2-V抗体未被标记(并称为第一/一级抗体)并使可结合抗-sPLA2-V抗体的二级抗体或其它分子标记。如该领域所熟知，对二级抗体进行选择以特异地结合一级抗体的特定种属和类。
抗-sPLA2-V/sPLA2-V复合物在样品中的存在可通过检测标记的二级抗体的存在检测出。例如，从包含一级抗体/抗原复合物的孔中或从包含该复合物的膜(例如硝基纤维素或尼龙膜)中冲走未结合的二级抗体后，结合的二级抗体可显色并例如根据标记的化学发光检测出。
抗-sPLA2-V抗体或二级抗体的标记包括，但不限于，多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、磁性剂和放射性物质。这些酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物的实例包括链酶亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质的实例包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯(dansyne chloride)或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；磁性剂的实例包括钆；以及适宜的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
本发明的另一个目的是本发明抗-sPLA2-V抗体用于通过确定受试者样品中sPLA2-V含量的体外诊断测定的用途。这些测定可用于诊断与sPLA2-V过表达相关的疾病。
在一个实施方案中，所述疾病是炎症。
该sPLA2-V-相关病症包括，但不限于，炎症、癌症、败血症、严重手术或带有严重伤口区域的其它损伤、糖尿病休克、急性肝衰竭、胰腺炎、神经变性疾病、自身免疫性疾病，例如SLE、骨关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、葛瑞夫兹氏病(Graves'disease)、寻常型银屑病、扩张型心肌病、糖尿病、别赫捷列夫(Bechterew)、炎症性胆疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、成形性贫血、特发性扩张型心肌病(IDM)、自身免疫性甲状腺炎、古德帕斯彻氏病(Goodpastures'disease)、动脉和静脉慢性炎症。
在另一个实施方案中，该sPLA2-V-相关病症是心血管病和/或心血管事件。该心血管病和/或心血管事件包括，但不限于，代谢性综合症、综合症X、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、稳定和不稳定型心绞痛、中风、主动脉以及其分支的疾病(例如，主动脉瓣狭窄、血栓症或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病、以及任何急性缺血性心血管事件。
受试者样品中所存在的sPLA2-V的浓度或量可利用特定地确定sPLA2-V存在量的方法确定。该方法包括ELISA法，其中，例如，可通过传统方法将本发明抗体固定在不溶性基质(例如聚合物基质)上。另外，可使用如上所述的夹心ELISA法。也可使用免疫组织化学染色测定。
使用提供每个进展或治疗阶段统计学上显著结果的样品群体，可得出视为每个疾病阶段的特征的sPLA2-V浓度的范围。
在一个实施方案中，从受试者得到血样或血清样并确定样品中sPLA2-V的浓度以评价所研究的受试者的疾病阶段，或表征受试者对治疗过程的反应。将所得浓度用于识别值所落入的浓度范围。将所识别的范围与在诊断的受试者的多种群体中所识别的疾病进展阶段或治疗阶段相关联，进而提供所研究受试者的阶段。
本发明的一个目的是一种可用于比较获自受试者的样品中结合sPLA2-V蛋白的含量与阈值以确定受试者是否患有sPLA2-V-相关病症的夹心ELISA法。
如文中所用，“阈值”指一种sPLA2-V表达水平，超出该水平，受试者样品被视为对该疾病呈“阳性”，而低于该值，将该样品分类为对该疾病呈“阴性”。特定生物标记物(例如，sPLA2-V)的表达阈值可基于对来自健康受试者样品(即，健康受试者群体)的数据的汇编。例如，可根据对健康受试者的样品的分析，将表达阈值确定为平均sPLA2-V表达值加两倍的标准偏差。本领域技术人员将认识到用于确定表达阈值的多种统计和数学方法在该领域是已知的。
本领域技术人员将进一步地认识到捕获和显示抗体可与样品连续地接触，如上所述，或同时地接触。并且，显示抗体可先与样品一起温育，然后使样品与固定化捕获抗体接触。当将本发明的抗-sPLA2-V单克隆抗体用于文中所公开的夹心ELISA法时，可将18G6或19F3抗体用作捕获或显示抗体。在一个特定实施方案中，捕获抗体是单克隆抗体18G6并且显示抗体是19F3抗体，更特定地HRP-标记的19F3抗体。可将本发明抗体用于任何测定形式中以检测sPLA2-V，包括但不限于基于微珠的多重测定。
关于其中使用针对相同生物标记(即sPLA2-V)的两种抗体的上述夹心ELISA形式，捕获抗体和显示抗体应具有不同的抗原部位。对于“不同的抗原部位”意指抗体对于目标生物标记蛋白(即，sPLA2-V)上的不同部位具有特异性，以使一种抗体与该生物标记蛋白的结合不显著地影响所述另一抗体与该生物标记蛋白的结合。不互补的抗体紊乱用于上述的夹心ELISA法。
本发明的另一个目的是一种试剂盒，其包含本发明的至少一种抗-sPLA2-V单克隆抗体。
关于“试剂盒”应是任何制品(例如，包装或容器)，其包含至少一种用于特异地检测sPLA2-V的表达的反应物(即，抗体)。可将试剂盒作为一个单元推销、分配或出售以实施本发明方法。而且，可将任何或所有试剂盒反应物提供在保护它们免遭外界环境影响的容器中，例如密封容器。试剂盒也可含有描述试剂盒和其使用方法的说明书。
一般来讲，实施本发明的夹心ELISA法的试剂盒包含捕获抗体，视情况地固定在固体载体(例如，微量滴定板)上，以及与可检测物质(例如，比如，HRP、荧光标记、放射性同位素、β-半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶)结合的显示抗体。
在某些实施方案中，捕获抗体和显示抗体是抗-sPLA2-V单克隆抗体，特定地讲，称为18G6和19F3的抗-sPLA2-V单克隆抗体。在用于实施夹心ELISA法的本发明试剂盒中，捕获抗体是抗-sPLA2-V单克隆抗体18G6，其固定在微量滴定板上，并且显示抗体是HRP-标记的19F3。用于检测并量化结合固体载体的显示抗体的量(其直接与样品中sPLA2-V含量有关)的化合物可视情况地包括在试剂盒中。纯化的sPLA2-V也可以抗原标准品提供。
在另一个实施方案中，本发明抗体可体内使用以定位表达sPLA2-V的组织和器官。
该方法包括以下步骤：对需要这种诊断测试的患者施用可检测的标记的抗-sPLA2-V抗体或其医药组合物，并使该患者进行成像分析以确定抗体或片段结合的sPLA2-V表达的组织。成像分析在医学领域中是熟知的，包括，但不限于，X-射线分析、磁共振成像(MRI)或计算机断层扫描(CT)。在本方法的另一个实施方案中，从患者得到活组织以确定所关注组织是否表达sPLA2-V，而不是对患者进行成像分析。如上所述，在本发明的一个实施方案中，使抗-sPLA2-V抗体经可在患者体内成像的可检测制剂标记。例如，可使抗体标记有造影剂(例如钡)，其可用于X射线分析，或磁性造影剂(例如钆螯合物)，其可用于MRI或CE。其它标记剂包括，但不限于，放射性同位素，例如(99)Tc；或文中所述的其它标记。这些方法可用于(例如)诊断sPLA2-V-介导的紊乱或追踪该紊乱的治疗进程。
附图说明
图1：sPLA2-V抗体在间接ELISA中的稀释曲线
图2：生物素化抗体与非生物素化抗体之间的亲和力比较
图3：利用18G6和19F3-生物素抗体的夹心ELISA试验
图4：(A)和(B)。从夹心ELISA测试得到的典型校准曲线和3-SD评价。
图5：人血浆样品中sPLA2-V浓度。
图6：sPLA2-V酶活性的抑制。
实施例
实施例1：人重组sPLA2-V蛋白的制备
根据公开的步骤(Othman等Biochim Biophys Acta1996,1303:92-102；Bezzine等J.Biol.Chem.2000,275:3179-3191；Singer等J Biol Chem2002,277:48535-48549)并作出下述修改制备人sPLA2-V。
在大肠杆菌中重组制备人sPLA2-V概述如下：
1.将人sPLA2cDNA亚克隆到pET21a表达载体中
2.转化大肠杆菌BL21并大规模地蛋白表达
3.包含体制备
4.还原和磺化
5.溶于高离液剂的缓冲液中
6.通过在低离液剂的缓冲液中快速稀释来再折叠
7.浓缩并通过反相HPLC纯化
8.冷冻干燥、蛋白定量以及结构/功能分析(OD280nm、MALDI-TOF、SDS-PAGE凝胶、酶活性)
1.将人sPLA2-V cDNA亚克隆到pET21a载体中
使编码成熟酶的cDNA进行PCR-扩增并克隆到pET21a表达质粒中所存在的NdeI位点所编码的起始Met密码子的框架中(Novagen Inc.)。此载体因此可制得作为非融合蛋白的sPLA2，即，没有任何额外的氨基酸。此策略可能改善再折叠步骤的得率并同时避免利用蛋白酶(如因子Xa或胰蛋白酶)的裂解步骤，该步骤通常降低整个得率。
2.大肠杆菌BL21Rosetta或BL21-CodonPlus(DE3)的转化以及蛋白表达
将pET21a构建体转化到化学感受态大肠杆菌Rosetta BL21DE3pLYS(Novagen)或BL21DE3CodonPlus(Stratagene)中并选择路尼亚肉汤(LuriaBroth)/琼脂/氨比西林(100μg/ml)/氯霉素(34μg/ml)平板上的菌落后，进行蛋白表达。使单个抗氨比西林菌落在10ml具有氨比西林(100μg/ml)的Terrific肉汤培养基(TB/A)中生长并在搅拌下，在37℃下培养约4h。然后，将预培养物稀释到2升TB/A中并进一步生长到～1.0OD600nm。然后，添加IPTG(0.5mM)以诱导蛋白在37℃下表达过夜。第二天，使细菌沉淀、经溶菌酶处理并对包含体纯化。
3.包含体制备
含有以及不含有洗涤剂的裂解缓冲液如表1所述制备。
表1：含有洗涤剂的裂解缓冲液。对于不含洗涤剂的裂解缓冲液，去掉Triton X-100和DOC。
| 组成 | 最终浓度 |
| Tris pH8.0 | 50mM |
| NaCl | 50mM |
| EDTA | 2mM |
| PMSF | 1mM |
| Triton X-100 | 1％ |
| Na+-脱氧胆酸盐(DOC) | 1％ |
收集IPTG-诱导的细菌的过夜培养物(2升)并在4℃下以5,000rpm离心30min。然后，将细菌沉淀再悬浮在100ml含有洗涤剂的裂解缓冲液中。添加5mg溶菌酶、1.5mg DNAse I和10mM MgCl2后开始裂解，并进行剧烈的超声处理，然后在37℃下，伴随着温和搅拌，在水浴中温育1小时。在一些情况中，再悬浮在不含洗涤剂(含有溶菌酶、DNAse I和MgCl2)的裂解缓冲液中并利用弗氏压碎机均质化(1200pSi，两个来回)后，进行细菌裂解。裂解后，使溶液在4℃下以10,000rpm离心15min。然后，彻底地冲洗蛋白颗粒，在含有洗涤剂的裂解缓冲液中冲洗一次，并在不含洗涤剂的裂解缓冲液中冲洗至少两次。对于每次冲洗，利用杜恩斯(dounce)均质机，使沉淀再悬浮在裂解缓冲液中，然后在4℃下，以10,000rpm离心15min。最后一次离心后，丢弃上清液并将含有纯化sPLA2蛋白包含体的沉淀保存在-20℃下。在离液缓冲液(50mM Tris pH8.0、8M脲或7M胍、10mM DTT)中溶解并还原后，利用SDS-PAGE分析和MALDI-TOF质谱，分析这些颗粒中所期望的成熟sPLA2蛋白的存在以及纯度。在这个步骤中，总得率通常是约50至100mg未折叠sPLA2蛋白/升细胞培养物。
4.包含体的还原和磺化
将含有人sPLA2-V(高达100mg)的包含体颗粒溶于40ml的7M胍、50mM Tris pH8.0、0.3MNa+亚硫酸盐中。1小时后，添加10至20ml NTSB试剂(sPLA2中NTSB/半胱氨酸比例>5)并在25℃下温育，取决于蛋白溶解度温育可最长达过夜(在一些情况中，将脲代替胍)。当溶液颜色变成浅黄色时，反应结束(溶液最初是橙红色)。溶解并还原后，使蛋白溶液离心以移除不可溶聚集物，利用4L的0.1％醋酸对上清液透析(截留8kDa的膜)，更换3次缓冲液，每2小时一次。回收磺化的沉淀的sPLA2-V蛋白(白色粉末)并离心，得到干颗粒，在再折叠前保存在-20℃下。
5.再折叠步骤、HPLC纯化以及结构/功能分析
通过在室温下搅拌2小时或在4℃下搅拌过夜，将磺化人sPLA2-V(50-100mg蛋白)在6M盐酸胍、50mM Tris-HCl、pH8.0中溶解为10mg/ml(该缓冲液以及所有随后使用的缓冲液和HPLC溶剂也含有1mM甲硫氨酸)。使样品在4℃下，以12,000rpm离心20min以移除未溶解蛋白。逐滴地(快速稀释法，在连续搅拌下，每秒约1滴，滴在再折叠缓冲液中，)将蛋白溶液(5-10ml)加入1-2升室温再折叠缓冲液中(50mMTris-HCl、pH8.0,0.9M盐酸胍、10mM CaCl2、5mM新鲜添加的L-半胱氨酸、30％乙腈(体积比)；乙腈最后加入预调节到pH8.0的缓冲液中)。使再折叠在4℃下进行2-3天。此时进行sPLA2活性测定以评价成功再折叠。然后，在30℃下通过旋转蒸发使体积减小到70％。添加月桂基硫代甜菜碱(SB12)，达到5mM的最终浓度，使蛋白溶液连续地通过Sephadex G50床柱和低蛋白吸收0.45μm过滤式注射器(Millipore)过滤，然后在室温下，利用具有YM-10膜的Amicon搅拌室浓缩到20-30ml的最终体积。在4℃下，利用20％乙腈(ACN)、0.1％三氟乙酸(TFA)对浓缩的蛋白溶液透析(三次循环，每次循环使用40体积的缓冲液)。使透析溶液过滤、通过OD280nm定量蛋白量并多次负载到C18半制备反相HPLC柱(250X10mm,5μm,C2封端,Macherey-Nagel)上，该HPLC柱经20％溶剂B的溶剂A溶液(溶剂A:H2O/0.1％TFA/1mM L-甲硫氨酸；溶剂B:ACN/0.1％TFA/1mM L-甲硫氨酸)预平衡。注射加样后，溶剂梯度开始如下：75min内，从20％B到45％B，然后20min内，到95％B(流速3ml/min)。检测HPLC馏分的sPLA2酶活性并通过MALDI-TOF质谱检测分子量。成熟的适当折叠的非氧化性hGV在含有sPLA2活性的主峰开始时洗脱。将含有hGV折叠的成熟蛋白的活性馏分合并、冻干、再悬浮于20％ACN/0.1％TFA中并利用不含L-甲硫氨酸的溶剂A和B与从20％到35％ACN的线性梯度的ACN水溶液在100分钟内(流速1ml/min)负载到C18symmetry shield分析柱上。根据OD280nm，人工地收集馏分。将有活性的适宜折叠的馏分(如上鉴定的)合并、干燥、再悬浮在30％ACN/0.1％TFA中，并分析蛋白量(OD280nm和SDS-PAGE)以及性质(MALDI-TOF质谱术以及酶的比活性)。纯的再折叠hGV的总得率是约2mg/升细菌培养物。通过15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶确定所述蛋白质达到>98％纯度。所观察到的分子质量(MALDI-TOF质谱术，使用芥子酸作为基质和AppliedBiosystems TOF-TOF4800仪器以线性模式测量的质量)与计算的质量(13,578.6Da)不同，即比计算的质量小1Da。将放射标记的经高压灭菌的大肠杆菌膜用作磷脂底物测定酶的比活性(Rouault等Biochemistry2007,46:1647-1662)。使重组蛋白等分，冻干并储存在20℃下。
实施例2：抗-sPLA2-V抗体的产生以及抗体通过间接ELISA的直接对比
三种不同的单克隆抗-sPLA2-V抗体(18G6、19F3和25D9克隆体)是通过利用如实施例1制得的重组人sPLA2-V使小鼠免疫制得。通过蛋白A亲和力纯化并定量mAb。
不同的mAb的直接对比是通过间接ELISA进行。
使微量滴定板孔用含50ng重组人sPLA2-V的PBS pH7.5在室温下过夜包被。利用含有0.05％Tween20的PBS，对样品孔冲洗三次。最后一次冲洗后，在室温下，利用在PBS缓冲液中含有1％牛血清白蛋白(BSA)的封闭溶液对样品孔处理60min。利用含有0.05％Tween20的PBS冲洗后，将递增量(从0.1ng/mL一直到10μg/mL)的针对人PLA2-V的mAb加入包被了抗原的孔中，并在室温下温育120min。利用含有0.05％Tween20的PBS冲洗后，通过利用HRP结合的多克隆山羊抗-小鼠IgG(Abcamab7068)在室温下处理60min来检测mAb的结合。添加TMB，终止反应并通过Optima FluoStar微量滴定板读取器(BMG Labtech)测定在450nm下的吸光度。
所得的稀释曲线在图1中绘出。
使数据用单址饱和模型拟合并由模型估计出相对的Kd值(下表2)。
表2
如上表所示，这些结果清楚地表明三个mAb#18G6、#19F3和#25D9展现出针对重组人sPLA2-V，比市售单克隆抗体MCL-3G1(目录号160510,Cayman Chemicals,NM,Boetticher E,Sperling AI,等Quantitation ofsecretory group V phospholipase A(2)in human tissues by sandwichenzyme-linked immunosorbent assay.J Immunol Methods.2002；262:41-51)高得多的亲和力。
实施例3：抗-sPLA2-V抗体的生物素化以及夹心ELISA的形成
通过利用Pierce试剂盒(目录号21435)，使1mg每个单克隆抗体#18G6、#19F3和#25D9生物素化。将标记抗体储存在-20℃下。
利用间接ELISA，比较非生物素化mAb和生物素化mAb(#18G6、#19F3和#25D9)对重组人sPLA2-V的特异免疫反应性。
使微量滴定板孔用含50ng重组人sPLA2-V的PBS pH7.5在室温下过夜包被。利用含有0.05％Tween20的PBS，对样品孔冲洗三次。最后一次冲洗后，在室温下，利用在PBS缓冲液中含有1％牛血清白蛋白(BSA)的封闭溶液对样品孔处理60min。
利用含有0.05％Tween20的PBS冲洗后，将递增量(从1ng/mL到1μg/mL)的针对人sPLA2-V的mAb和生物素化-mAb加入包被了抗原的孔中，并在室温下温育60min。
利用含有0.05％Tween20的PBS冲洗后，通过在室温下，利用HRP-结合的多克隆山羊抗-小鼠IgG(Abcam ab7068)或高灵敏度链霉亲和素-HRP(Thermo fisher21130)处理60min来检测mAb的结合。添加TMB，终止反应并通过Optima FluoStar微量滴定板读取器(BMG Labtech)测定在450nm下的吸光度。
使数据用单址饱和模型拟合并由模型估计出Kd(下表3)。如图2和表3中所示，结果表明不同mAb的生物素化没有显著地影响对重组人sPLA2-V的亲和力特征。利用链霉亲和素-HRP的显示导致信号放大。
表3
通过使用上述反应物，建立了人sPLA2-V夹心ELISA。先对不同的单对的非标记的包被抗体(1μg/mL)以及生物素化的显示抗体(30ng/mL到1μg/mL)进行测试。
即使#18G6抗体展现出对重组人sPLA2-V的最小的亲和力，但看起来其为在利用#19F3-生物素或#25D9-生物素进行显示的条件下的最有效的捕获sPLA2-V的包被抗体。并且，18G6/19F3-生物素对表现出比19F3/18G6-生物素对更好的灵敏度。因此，将#18G6抗体保留用于包被步骤。
然后，对显示抗体或包被抗体的混合物进行测试，但没有保留，因为不同的测试组合没有显示出任何协同效应，最好的信号限制在最好的单对信号。总而言之，保留的对是1μg/mL的#18G6和300ng/mL的#19F3-Biot。
对不同参数进行研究以优化测定，所述参数为例如微量滴定板性质、孔的最终体积、温育时间和温度、链霉亲和素-HRP的性质和浓度、测定缓冲液组成、所添加洗涤剂的性质和浓度。
典型的测定条件如下：将96-孔微量滴定板(High Binding Greiner目录号655061)在室温下，在碳酸盐缓冲液100mM pH9.6中，与50μL1μg/mL#18G6一起温育过夜。然后，抽干孔并利用300μL含0.05％Tween20的PBS冲洗3次。最后一次冲洗后，在37℃下，利用在PBS缓冲液中含有1％牛血清白蛋白的封闭溶液对样品孔处理60min。利用含0.05％Tween20的PBS冲洗后，将重组人sPLA2-V标准品(在由PBS1X、0.5％BSA、0.05％Tween20组成的测定缓冲液中含不同浓度的蛋白)加入孔中以得到校正曲线。使血清或血浆样品在PBS1X、BSA0.5％、TritonX1000.005％中10倍稀释并加入其相应的孔中，使ELISA板在37℃下温育2小时。抽干后，利用含有0.05％Tween20的PBS冲洗孔3次，并将50μL/孔的300ng/mL19F3-生物素加入孔中，在37℃下保持2小时。利用含0.05％Tween20的PBS冲洗后，通过在37℃下，利用25ng/mL链霉亲和素-聚HRP(Thermofisher目录号21140)处理30min来检测mAb的结合。添加TMB，终止反应并通过Optima FluoStar微量滴定板读取器(BMG Labtech)测定在450nm下的吸光度。
实施例4：测定性能的评价
测定特异性
为评价ELISA试验对重组人sPLA2-V的特异性，对浓度高达1000ng/mL的重组人sPLA2-X、重组人sPLA2-IIA以及纯化的蜂毒sPLA2(bv-PLA2)进行测试。如图3中所示，ELISA试验没有识别出这些相关酶，即，人sPLA2-X、人sPLA2-IIA和bvPLA2。
测定灵敏性
图4A和4B显示了利用上述最终的ELISA定位得到的典型校正曲线，其中制备在10μM浓度的人sPLA2-V蛋白并连续地稀释以得到校正曲线。
根据零校正品的3-SD评价，将ELISA的定量限值确定为0.75ng/mL。
测定变化
测定内的变异系数(CV)是通过计算两名操作人员以两次重复的方式得到的范围为0至100ng/mL的九条标准校正曲线或以四次重复的方式得到的范围为0至100ng/mL(0至1ng/mL中具有更多点)的六条标准校正曲线的平均CV来进行评价。测定间CV是通过计算每个浓度的平均光密度和相关的标准偏差(SD)并计算测定内CV的平均CV来确定。
当考虑来自一个操作人员所进行试验的数据时，测定内和测定间CV分别是4.7％±0.015和15.6％±0.088。对于两名操作人员，测定内和测定间CV分别是6.5％±0.013和21.7％±0.089。
测定回收
为评价人血清中人sPLA2-V的回收，以10ng/mL的浓度，将人重组sPLA2-V蛋白加入到三个包含不可检测浓度的内源性sPLA2-V的不同人EDTA血浆样品。然后，通过利用夹心ELISA，对这些样品进行分析，平均(SD)结果分别是9.2(1％)ng/mL、11.4(12％)ng/mL、和9.5(41％)ng/mL，得到92％、114％和95％回收率。
实施例5：人血浆样品中sPLA2-V浓度的确定
将上述ELISA夹心用于筛选总共100个来自健康个体的血浆样品。在这些样品中没有检测到sPLA2-V蛋白，即其在血清中的浓度小于ELISA测定的检测限值(0.75ng/mL)。
如图5中所示，利用ELISA对患有类风湿性关节炎RA(n＝10)、急性心肌梗死AMI(n＝9)、败血症(n＝7)、和家族性高胆固醇血症FH(n＝30)的患者的血清样品进行分析。这些分析表明sPLA2-V浓度在类风湿性关节炎RA(平均2.3ng/mL)、败血症(5.7ng/mL)、和家族性高胆固醇血症(7.1ng/mL)患者中略微升高。在筛选出的9个样品中有4个样品的sPLA2-V浓度大幅度升高，平均sPLA2-V浓度为111.6ng/mL。
实施例6：酶活性的抑制
如下测试不同mAb对sPLA2-V酶活性的抑制：在37℃下，使重组人sPLA2-V(30nM)与递增量的纯化的单克隆抗体(0、5、10、20、30、50和100nM)一起温育60min。然后，利用选择性荧光法(sPLA2Activity,Aterovax,Paris,France)测量sPLA2酶活性。将结果表示成单位/mL样品(U/mL)，将一个单位定义成在一分钟内催化1nmol产物释放的sPLA2酶的量。测定的检测限值是17U/mL，上线性分析范围是232U/mL并且功能灵敏度(20％)是21U/mL。平均批内变异和平均测定内变异分别是5.9％和8.9％。
使酶活性与没有和抗体一起温育的sPLA2-V(不含mAb的对照)的活性比较并表达成不含抗体对照的活性抑制％。将一个针对sPLA2-X的非特异性单克隆抗体用作阴性对照。
结果显示在下表4中：
表4
如上表4和图6中所示，与针对人sPLA2-X的非特异性mAb一起温育对sPLA2-V酶活性的抑制非常有限。
抗-sPLA2-V单克隆抗体与sPLA2-V结合使sPLA2-V活性得到部分的抑制。利用50nM mAb#18G6和#19F3观察到最大的抑制(分别31.9％和28.7)，随着mAb浓度升高，％抑制降低，表明平衡移动。
克隆MCL-3G1(Cayman)当在50nM的浓度下与sPLA2-V一起温育时，展现出最低的酶活性抑制效力(24.6％)。
Claims (17)
1.一种针对人sPLA2-V的分离抗体，其中所述抗体具有小于1.10-10M的结合人sPLA2-V的Kd。
2.根据权利要求1所述的针对人sPLA2-V的分离抗体，其中重链的可变区包含以下CDR中至少一个：
VH-CDR1:GX1X2X3X4DX5X6I(SEQ ID NO:2)其中
X1是Y、F、W、T、或S并优选Y或F，
X2是T或N，
X3是F、L、V、I、A、或Y，并优选F或I，
X4是T或K，
X5是Y、F、W、T、或S并优选Y或S，
X6是V或Y；
VH-CDR2:X1PX2X3G(SEQ ID NO:3)其中
X1是Y或D，
X2是G、P或A，优选A或G，
X3是S或N，
VH-CDR3:X1CARX2X3X4X5DY(SEQ ID NO:4)其中
X1是Y、W、F、T、S，并优选F或Y，
X2是W或D,
X3是F、L、V、I、A、或Y，并优选F或V，
X4是P或V，
X5是Y或A。
3.根据权利要求1所述的针对人sPLA2-V的分离抗体，其中轻链的可变区包含以下CDR中至少一个：
VL-CDR1:SASSSVSYMYW(SEQ ID NO:5)；
VL-CDR2:TSNLASG(SEQ ID NO:6)，以及
VL-CDR3:QX1X2SYPLTF(SEQ ID NO:7)其中
X1是Y、W、F、T、或S，并优选Y或W，
X2是H或S。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的针对人sPLA2-V的分离抗体，其中重链的可变区包含权利要求2所定义的CDR中的至少一个并且轻链的可变区包含权利要求3所定义的CDR中的至少一个。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的针对人sPLA2-V的分离抗体，其中重链的可变区包含权利要求2所定义的CDR并且轻链的可变区包含权利要求3所定义的CDR。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的针对人sPLA2-V的分离抗体，其中重链的可变区包含以下CDR：SEQ ID NO:8(VH-CDR1)、SEQ ID NO:10(VH-CDR2)和SEQ ID NO:12(VH-CDR3)并且轻链的可变区包含以下CDR：SEQ ID NO:5(VL-CDR1)、SEQ ID NO:6(VL-CDR2)和SEQ ID NO:14(VL-CDR3)。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的针对人sPLA2-V的分离抗体，其中重链的可变区包含以下CDR：SEQ ID NO:9(VH-CDR1)、SEQ ID NO:11(VH-CDR2)和SEQ ID NO:13(VH-CDR3)并且轻链的可变区包含以下CDR：SEQ ID NO:5(VL-CDR1)、SEQ ID NO:6(VL-CDR2)和SEQ ID NO:15(VL-CDR3)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的针对人sPLA2-V的分离抗体，其中编码重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18并且编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。
9.一种表达载体，其包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中至少一个。
10.一种产生针对人sPLA2-V的抗体的以CNCM I-4521和CNCM I-4522保藏的杂种瘤细胞系。
11.一种组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的针对人sPLA2-V的抗体。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的针对人sPLA2-V的抗体，其用于治疗sPLA2-V-相关病症，其中所述抗体抑制内源性sPLA2-V的活性。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的针对人sPLA2-V的抗体，其用于检测生物样品中sPLA2-V。
14.一种利用根据权利要求1至8中任一项所述的针对人sPLA2-V的抗体用于确定生物样品中sPLA2-V的存在的体外诊断或预后测定。
15.根据权利要求14所述的体外诊断或预后测定，其中所述测定是夹心ELISA，所述夹心ELISA使用权利要求6所述的抗体作为包被抗体并使用权利要求7所述的抗体作为显示抗体。
16.一种试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的针对人sPLA2-V的抗体。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其包含根据权利要求6所述的抗体和根据权利要求7所述的抗体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141015 |