CN104086656A - 一种TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用。TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；该融合蛋白的制备方法包括以下步骤：(1)构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒；(2)利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；(3)分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白；TAT-RhoGDI2融合蛋白用于抑制膀胱癌T24细胞转移。与现有技术相比，本发明首次制备了TAT-RhoGDI2融合蛋白，纯化蛋白的浓度达到0.5g/L，纯度达到93％，制备的蛋白药物TAT-RhoGDI2能够有效抑制膀胱癌T24细胞的转移。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
在泌尿系统中，膀胱移行细胞癌作为一种最常见的恶性肿瘤，发病率越来越高。膀胱癌的发生是内在的遗传因素和外在的环境因子相互作用的结果，包括一系列非常复杂的病理变化。肿瘤切除后膀胱癌细胞转移是造成病人死亡的最主要原因。在膀胱癌中，RhoGDI2对肿瘤转移表现出抑制作用，被确定为肿瘤转移抑制因子。临床数据也显示RhoGDI2的低表达与病人肿瘤发生转移和预后状况变差有一定的相关性。目前，RhoGDI2具体的作用途径还不清楚，但已发现内皮素1(ET-1)和神经介素U(NmU)是RhoGDI2下游的两个作用靶点。它们都是G蛋白耦联受体的激活剂。内皮素1是由21个氨基酸组成的，参与血管收缩、组织分化和修复等活动。在肿瘤转移过程中，形成利于转移的循环模式，这种循环模式也存在于肺和肾等内皮素反应组织中。内皮素(ET-1)可以与膀胱癌发生转移的主要部位(骨和肺)直接作用。间接地激活缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子(VEGF)。内皮素1(ET-1)和血管内皮生长因子(VEGF)能够刺激血管平滑肌细胞和内皮细胞的增生，从而促进肿瘤的生长。RhoGDI2通过抑制这两种蛋白来影响相应的信号通路。神经介质U(NmU)的生物学作用与肿瘤微环境有关，可以影响肿瘤的生长和转移。RhoGDI2有可能从细胞质转位到细胞核，与其他的信号分子发生作用，间接地调节NmU在基因转录水平上的表达。此外，研究发现多功能蛋白聚糖(versican)在许多有侵袭转移特征的癌组织中都有表达，它有利于肿瘤细胞的增殖、粘附和迁徙并且可以调节肿瘤细胞在微环境中与基质的相互作用。通过改变肿瘤微环境中的炎症来抑制肿瘤的转移可能是RhoGDI2的一种作用机制。
RhoGDI2已经被确定为膀胱癌细胞的转移因子，能够有效地抑制细胞的迁移 和侵袭。RhoGDI2重组蛋白有发展为抗肿瘤的药物的潜力。迄今为止，RhoGDI2的研究还集中在探究其作用机制这部分，关于运用基因工程技术大量制备RhoGDI2蛋白，并将其用于抑制肿瘤细胞转移的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高浓度、高纯度的TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，为TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的RhoGDI2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒；
(2)利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；
(3)分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白。
步骤(1)所述的构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒具体包括以下步骤：
a.以序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物为反应引物，以全长的RhoGDI2基因为模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，PCR反应，获得TAT-RhoGDI2融合蛋白的编码基因，即目的基因；
b.胶回收上述PCR产物，将目的基因和pGEX-4T-2表达质粒用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆送样测序。
所述的PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。
步骤(2)所述的利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：
将测序正确的含有pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒的大肠杆菌DH5α在 在含100mg/l的LB培养基中37℃培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导12h，异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白。
步骤(3)所述的分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：
a.利用GST标签纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白：
利用GST亲和层析，带有GST标签的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白选择性的吸附到谷胱甘肽纯化柱上，纯化获得GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；
b.利用分子筛Sephadex G200进一步分离纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；
c.收集上步纯化的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白，用thrombin酶切融合蛋白，去除GST标签，将酶切反应液浓缩后进行GST亲和层析去除GST标签，穿出液含有TAT-RhoGDI2融合蛋白，Thrombin酶通过超滤除去。
一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的应用，所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白用于抑制膀胱癌T24细胞转移。
利用Transwell方法检测纯化的TAT-RhoGDI2融合蛋白的活性。分别用0nM，5nM和20nM的浓度处理膀胱癌T24细胞，24h后计算迁移和侵袭的细胞数量，计算相应的细胞迁移率和侵袭率，分析融合蛋白对细胞转移的抑制作用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)首次将人类免疫缺陷病毒HIV-1的TAT穿膜肽融合到RhoGDI2的氮端，构成TAT-RhoGDI2融合蛋白。构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒，经过异源表达和分离纯化，大量制备TAT-RhoGDI2融合蛋白。最终TAT-RhoGDI2融合蛋白的浓度为0.5g/l，纯度为93％。该纯化工艺的回收率可达36％。
(2)TAT-RhoGDI2融合蛋白的TAT穿膜肽可以将RhoGDI2蛋白转运到细胞内发挥作用。本发明首次在体外检测了TAT-RhoGDI2融合蛋白的活性。Transwell实验结果表明可以有效的抑制膀胱癌T24细胞的转移，这使得TAT-RhoGDI2融合蛋白在肿瘤治疗上有很大的应用前景。
附图说明
图1为pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒的质粒图谱；
图2为SDS-PAGE分析利用GST标签亲和层析纯化的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白的表达和纯化分析；
图3为SDS-PAGE分析利用分子筛Sephadex G200分离纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白的表达和纯化分析；
图4为SDS-PAGE分析去除GST标签的TAT-RhoGDI2融合蛋白的表达和纯化分析；
图5为纯化的TAT-RhoGDI2融合蛋白对膀胱癌T24细胞侵袭的抑制作用图；
图6为纯化的TAT-RhoGDI2融合蛋白对膀胱癌T24细胞迁移的抑制作用图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，为TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的RhoGDI2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒：
a.以序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物为反应引物，以全长的RhoGDI2基因为模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，PCR反应，获得TAT-RhoGDI2融合蛋白的编码基因，即目的基因；
PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒(Omiga)回收目的片段。
b.胶回收上述PCR产物，将目的基因和pGEX-4T-2表达质粒用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，T4连接酶连接后，16℃过夜，获得pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒，其质粒图谱如图1所示，将连接产物转化E.coli DH5α感受态。挑选阳性克隆，通过菌液PCR和重组质粒上酶切初步验证阳性克隆，将初步验证正确的重组菌送样测序。
(2)利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白：
将测序正确的含有pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒的大肠杆菌DH5α在 在含100mg/l的LB培养基中37℃培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导12h，异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白。在4℃下，5000×g离心15min，收集菌体。超声破碎细胞，收集上清。
(3)分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白：
a.利用GST标签纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白(纯化结果见图2)；
用10CV的含有250mM NaCl和10mM DTT的50mM Tris-HCl缓冲液平衡谷胱甘肽亲和柱(2ml/min)。将含有GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白的上清液以2ml/min的流速上样，带有GST标签的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白被选择性的亲和吸附。用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以5ml/min的流速冲洗去除杂蛋白，最后用含有10mM DSH的50mM Tris–HCl缓冲液(pH8.0)以2ml/min流速洗脱GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白。
b.分子筛进一步分离纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白(纯化结果见图3)；
用5CV的200mM PBS缓冲液(pH8.0)平衡分子筛Superdex G200。浓缩上步收集的GST/TAT-RhoGDI2，以1.5ml/min的流速上样，出峰时收集含有GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白的穿出液。
c.去除GST标签，获取TAT-RhoGDI2融合蛋白(纯化结果见图4)；
利用0.05U thrombin酶切GST-TAT-RhoGDI2融合蛋白，在24℃下处理2h去除GST标签。将酶切反应液浓缩后进行GST亲和层析去除GST标签，穿出液含有TAT-RhoGDI2融合蛋白。Thrombin酶可通过超滤除去。
(4)纯化的TAT-RhoGDI2蛋白的定量
总蛋白质量采用Lowry法来测定。将纯化操作各步的收集液进行SDS-PAGE电泳，电泳后用考马斯亮蓝R-250染色30min，然后用脱色液脱色，最后用计算机软件Gel-Pro analyzer扫描凝胶，分析TAT-RhoGDI2融合蛋白的纯度，浓度及纯化工艺的回收率。
通过以上三步纯化操作，获得浓度为0.5g/l，纯度为93％的TAT-RhoGDI2融合蛋白。回收率达到36％。
一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的应用，所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白用于抑制膀胱癌T24细胞转移。
体外检测TAT-RhoGDI2融合蛋白对膀胱癌T24细胞转移的抑制作用。采用Transwell分析法检测TAT-RhoGDI2融合蛋白对膀胱癌T24细胞转移的影响。具体 操作如下：
(1)活化并培养膀胱癌T24细胞。
(2)Transwell小室铺基质胶。水化基质胶：将小室放入培养板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，室温下静置15-30min，使基质胶再水化，吸去剩余培养液。
(3)制备细胞悬液。胰酶消化细胞1min，终止后离心弃去培养液，用PBS清洗2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度为3×105个/ml。
(4)接种细胞。将Transwell小室放置到24孔板上，取200μl细胞悬液加入Transwell小室。在24孔板下室加入600μl含10％FBS培养基。注意下层培养液与小室之间不能产生气泡。
(5)用TAT-RhoGDI2融合蛋白处理T24细胞。分别用0nM、5nM和20nM的TAT-RhoGDI2融合蛋白对T24细胞处理24h。将0nM TAT-RhoGDI2融合蛋白处理组作为对照组。
(6)统计分析实验结果。计算各组细胞的平均侵袭数。细胞的侵袭率(100％)＝实验组细胞平均侵袭数×100％/对照组细胞平均侵袭数。
未铺基质胶的Transwell小室可以用来检测TAT-RhoGDI2对细胞迁移的影响。方法与侵袭检测唯一不同的是不需要(2)铺基质胶这步操作。
细胞的迁移率(100％)＝实验组细胞平均迁移数×100％/对照组细胞平均迁移数。
对数据进行统计分析，结果显示TAT-RhoGDI2融合蛋白可以显著的抑制膀胱癌T24细胞的转移(如图5、图6所示)。
序列表
Claims (9)
1.一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，为TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的RhoGDI2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.一种如权利要求1～3任一所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒；
(2)利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；
(3)分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒具体包括以下步骤：
a.以序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物为反应引物，以全长的RhoGDI2基因为模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，PCR反应，获得TAT-RhoGDI2融合蛋白的编码基因，即目的基因；
b.胶回收上述PCR产物，将目的基因和pGEX-4T-2表达质粒用BamH I和EcoR I进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆送样测序。
6.根据权利要求5所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：
将测序正确的含有pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒的大肠杆菌DH5α在在含100mg/l的LB培养基中37℃培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导12h，异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白。
8.根据权利要求4所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：
a.利用GST标签纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白：
利用GST亲和层析，带有GST标签的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白选择性的吸附到谷胱甘肽纯化柱上，纯化获得GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；
b.利用分子筛Sephadex G200进一步分离纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；
c.收集上步纯化的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白，用thrombin酶切融合蛋白，去除GST标签，将酶切反应液浓缩后进行GST亲和层析去除GST标签，穿出液含有TAT-RhoGDI2融合蛋白，Thrombin酶通过超滤除去。
9.一种如权利要求1～3任一所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白的应用，其特征在于，所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白用于抑制膀胱癌T24细胞转移。
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| CN105061568A (zh) * | 2015-09-11 | 2015-11-18 | 吉林大学 | 重组Cytohesin拮抗多肽TAT-Sec7及其制备方法 |
| JP2021505135A (ja) * | 2017-11-30 | 2021-02-18 | アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド | Ｃｄｋｌ５発現変異体及びｃｄｋｌ５融合タンパク質 |
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