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CN104066440A - 白介素-22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途 - Google Patents

白介素-22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途 Download PDF

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CN104066440A
CN104066440A CN201280064852.6A CN201280064852A CN104066440A CN 104066440 A CN104066440 A CN 104066440A CN 201280064852 A CN201280064852 A CN 201280064852A CN 104066440 A CN104066440 A CN 104066440A
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Abstract

本发明公开了白介素-22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途。具体地，本发明公开了白介素-22或白介素-22二聚体的如下用途：(1)在动物缺血性神经损伤后，保护神经元，从而使损伤的神经功能得到恢复；(2)能够显著抑制黑质多巴胺能神经元的丢失，提高多巴胺能神经元的功能，减少海玛区神经元细胞的凋亡，从而治疗神经退行性疾病。

Description

白介素 -22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途 技术领域
本发明涉及生物和医药技术领域。 具体地， 本发明涉及白介素 -22在治疗和预 防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途。 背景技术
白介素 -22(Interleukin-22， IL-22)是一种 T 细胞分泌的糖蛋白， 又名白介 素 10 诱导的 T 细胞因子（IL- 10- related T cell-derived inducible factor, IL-TIF)。白介素 22 mRNA的表达最初证明在小鼠的 IL-9剌激后的 T细胞株和 IL_9 剌激的肥大细胞株（mast cells), 以及 concanaval inA 激活后的脾细胞。 人白介 素 22 mRNA的表达主要在外周自分离的 T细胞并通过抗 CD-3的抗体或 ConA剌激。 白介素 22 mRNA在激活后的 NK细胞也有表达。 活化的 T细胞主要是 CD4+, 特别是 由 CD28通路的 Thl细胞。
白介素 -22 前体由 179 个氨基酸残基组成（成熟肽为 146 个氨基酸残基）， Dumoutier 等最先报道了克隆小鼠和人的白介素- 22 基因（Dumoutier 等， JI， 164:1814-1819， 2000)。 此外， Dumoutier 还取得了 IL-22 的专利（US6， 359， 117 和 6， 274， 710)。 Gurney 也取得了 IL-22 在治疗人胰腺病变方面的应用专利（US 6， 551， 799)。
白介素 -22主要在胸腺、 大脑、 活化的 T细胞和肥大细胞、 lectin剌激后的 脾细胞（Duroutier 2002)、 白介素 _2/白介素 -12剌激后的 NK细胞（Wolk， K / 2002), 以及 LPS剌激后的多个器官和组织中表达（Dumoutier PNAS paper), 包括 肠道、 肝、 胃、 肾、 肺、 心脏、 胸腺、 脾都可测到 IL-22的表达升高。
IL-22通过结合 IL-22RI受体和 IL-10R2受体， 发挥生物学功能。 IL-22R1是 IL-22特异的受体， 它表达在皮肤， 肾， 消化系统（胰腺、 小肠、 肝、 大肠、 结肠） 以及呼吸系统（肺、 支气管）。 已公开的研究表明白介素 22是一个免疫调节剂。 在 专利申请白介素 -22的医药用途中， 已报道 IL-22对降低血清甘油三酯， 肥胖的医 疗用途（见 W02006/073508, CN200510023103.0)。 然而， 目前并未发现白介素 -22 可以在治疗神经损伤疾病或神经退行性疾病中可发挥积极的作用。
神经退行性疾病（neurodegenerative disease)是大脑和脊髓的神经元细胞渐 进性变性、 死亡的状态， 是一种慢性、 进行性神经系统疾病， 主要包括阿尔茨海 默氏病（Alzhemier' s disease, AD)、 巾白金森氏病（Parkinson' s disease, PD)、 亨廷顿舞蹈病 (Huntington disease)、 肌萎缩侧索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis) , 脊髓肌萎缩病（spinal muscular atrophy)、 脊髓小脑共济失调 (spinal cerebellar ataxias)等， 其共同特征是发生神经元的退行性病变和凋亡， 导致病人行为异常和功能障碍， 引起过早死亡的神经性疾病。 神经退行性疾病的 发病机制尚不清楚， 至今还没有有效的方法和药物来防治， 现有治疗方法包括， 通过服用或静脉注射补充人大脑神经递质治疗 PD， 如左旋多巴， 但是， 左旋多巴 并不能有效的控制 PD的自然病变过程， 不能影响多巴胺能神经元的变性速度， 长 期使用还具有多种不良反应， 如开关现象和运动障碍， 其治疗作用也只能维持两 年左右， 长期使用还可损害神经元， 加速神经元的凋亡； 针对 AD脑内乙酰胆碱不 足， 用胆碱酯酶抑制剂提高其浓度， 该方法只是对症治疗， 不能控制疾病的发展。
综上， 本领域迫切需要开发有效的治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾 病的药物和方法。 发明内容
本发明的目的就是一种有效的治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的 药物及其用途， 即白介素 -22 (Interleukin-22， 即 IL-22)在治疗和预防哺乳动物 神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途。
在本发明的第一方面， 提供了一种白介素 -22或其二聚体或多聚体的用途， 它用 于制备治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物。
在另一优选例中， 所述的神经损伤疾病选自： 中风、 脊柱损伤和伴有血脑屏障损 伤的神经系统疾病；
所述神经退行性疾病选自： 帕金森氏病、 阿尔茨海默氏病、 亨廷顿舞蹈病、 肌萎 缩侧索硬化病、 脊髓肌萎缩病、 原发性侧索硬化病、 或脊髓小脑共济失调。
在另一优选例中， 所述白介素 -22包括： 人白介素 -22或哺乳动物 (如鼠、 兔、 牛、 或羊）的白介素 -22。
在另一优选例中， 所述白介素 -22包括： 重组的白介素 -22、 或天然的白介素 -22。 在另一优选例中， 所述的白介素 -22的二聚体是式 I所示的白介素 -22的二聚体：
M1-L-M2 式 I
式中，
Ml是白介素 -22的第一单体；
M2是白介素 -22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一 起的接头元件，
其中，所述的白介素 -22二聚体保持了白介素 22的生物活性， 并且其血清半衰期是 所述第一单体或第二单体的血清半衰期的 2倍以上。
在另一优选例中， 所述的 IL-22二聚体的血清半衰期是所述第一单体和 /或第二单 体的血清半衰期的 3倍以上、 5倍以上或 10倍以上。
在另一优选例中， 所述的接头元件 L选自下组： (i) 3-50个氨基酸的短肽；
(ϋ) 式 II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z- 式 II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、 或 1-30个氨基酸的短肽；
"-"为化学键或共价键。
在另一优选例中， 所述的第一单体和第二单体是相同的。
在另一优选例中， 所述的第一单体和第二单体是不同的。
在另一优选例中， 所述的生物活性是选自下组的一种或多种活性：
(a) 在体外激活神经元细胞 STAT3;
(b) 在体内脑缺血性损伤后， 能保护神经元， 减少脑梗死体积；
(c) 在体外激活多巴胺能神经元细胞 STAT3或海马神经元细胞 STAT3;
(d) 在体内能显著抑制 PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失；
(e) 在体内能显著减少 AD模型动物海马区神经元细胞的凋亡。
在另一优选例中， 所述的载体蛋白是白蛋白或人 IgG的 Fc片段。
在另一优选例中， 所述的载体蛋白是二个 IgG的 Fc片段之间通过二硫键连接而形 成。 在另一优选例中， 所述二硫键的数量为 2-4个。
在另一优选例中， 所述的 "-"是肽键。
在另一优选例中， 所述二聚体是由氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2-5所示的单体所构 成的二聚体。
在本发明的第二方面， 提供了式 I所示的白介素 -22的二聚体：
M1-L-M2 式 I
式中，
Ml是白介素 -22的第一单体；
M2是白介素 -22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一 起的接头元件，
其中，所述的白介素 -22二聚体保持了白介素 22的生物活性， 并且其血清半衰期是 所述第一单体或第二单体的血清半衰期的 2倍以上。
在本发明的第三方面，提供了一种可用于治疗和预防神经损伤疾病或神经退行 性疾病的药物组合物， 它含有药学上可接受的载体以及式 I所示的白介素 -22的二聚 体，
M1-L-M2 式 I 式中，
Ml是白介素 -22的第一单体；
M2是白介素 -22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一 起的接头元件，
其中，所述的白介素 -22二聚体保持了白介素 22的生物活性， 并且其血清半衰期是 所述第一单体或第二单体的血清半衰期的 2倍以上。
在另一优选例中， 所述二聚体是由氨基酸序列如 SEQ ID NO : 3或 5所示的单体所构 成的二聚体。
在另一优选例中， 所述 IL-22的二聚体采用以下步骤制备：
(a)采用包含编码 IL-22-Fc复合物的 DNA序列的表达载体转化哺乳动物细胞。
(b)培养所述哺乳动物细胞， 和
(c)分离纯化所述 IL-22二聚体。
本发明使用 IL-22二聚体分子， 一方面在动物体内缺血性神经损伤后， 可以保 护神经元， 从而使损伤的神经功能得到恢复， 能够有效地治疗神经损伤疾病； 另 一方面能够显著抑制 PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失， 提高多巴胺能神经 元的功能。 此外， IL-22二聚体分子能够显著改善 AD模型大鼠学习记忆能力， 保护 神经元， 减少海马区神经元细胞的凋亡， 减轻痴呆的症状。 本发明的二聚体 IL-22 的血清半衰期延长， 有效阻止神经元的丢失， 从而能够更有效地治疗神经退行性 疾病。
应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例） 中具体描述的各技术特征可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于 篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明
图 1显示了本发明一种 IL-22二聚体的示意图。其中， " -" 表示连接肽， IL-22 椭圆形表示 IL-22单体。
该 IL-22二聚体的一种序列如 SEQ ID N0 : 1所示， 其中第 1-146位为 IL-22， 第 147-162位为连接肽， 第 163- 308位为另一 IL- 22。
图 2A和 2B显示了本发明 IL-22 二聚体的示意图。 其中， " -" 表示氨基酸连接 肽， IL-22椭圆形表示 IL-22单体， 标记为 " C " 的椭圆形表示载体蛋白， 并且 IL-22 位于载体蛋白的 N-末端。
一种用于构成该 IL-22二聚体的、 带有 Fc片段的 IL-22单体的序列如 SEQ ID NO : 2所示， 其中第 1-146位为 IL-22 , 第 147-162位为连接肽， 第 163-385位为人 IgG2 的 Fc片段。 二个带有 Fc片段的 IL-22单体， 通过 Fc的配对作用构成二聚体。 一种用于构成该 IL-22二聚体的、 带有 Fc片段的 IL-22单体的序列如 SEQ ID NO : 3所示， 其中第 1-146位为 IL-22 , 第 147-152位为连接肽， 第 153-375位为人 IgG2 的 Fc片段。 二个带有 Fc片段的 IL-22单体， 通过 Fc的配对作用构成二聚体。
图 3A和 3B显示了本发明 IL-22二聚体的示意图。 其中， " - " 表示氨基酸连接 肽， IL-22椭圆形表示 IL-22单体， 标记为 " C " 的椭圆形表示载体蛋白， 并且 IL-22 位于载体蛋白的 C-末端。
一种用于构成该 IL-22二聚体的、 带有 Fc片段的 IL-22单体的序列如 SEQ ID N0 : 4所示， 其中第 1-223位为人 IgG2的 Fc片段， 第 224-239位为连接肽， 第 240-385 位为 IL-22。 二个带有 Fc片段的 IL-22单体， 通过 Fc的配对作用构成二聚体。
一种用于构成该 IL-22二聚体的、 带有 Fc片段的 IL-22单体的序列如 SEQ ID N0 : 5所示， 其中第 1-223位为人 IgG2的 Fc片段， 第 224-229位为连接肽， 第 230-375 位为 IL-22。 二个带有 Fc片段的 IL-22单体， 通过 Fc的配对作用构成二聚体。
图 4显示了 IL-22和 IL-22二聚体（IL-22-Fc)对激活神经元细胞 STAT3的影响。 结果显示， IL-22和 IL-22 二聚体均具有激活神经元细胞 STAT3的生物活性， 而且， IL-22 二聚体比 IL-22具有更显著的生物活性。
图 5显示了本发明的 IL-22二聚体在局灶性脑缺血动物模型（Focal cerebral i schemia)中的治疗作用。 重组人 IL-22二聚体可以显著地减少脑梗死体积。
图 6显示了本发明的 IL-22二聚体在局灶性脑缺血动物模型（Focal cerebral i schemia)中的治疗作用。 重组人 IL-22二聚体可以显著地改善造模动物的神经功 能。
图 7显示了本发明的 IL-22二聚体、 IL-22单体的体外活性分析结果。
图 8A显示了小鼠黑质致密部 TH阳性神经元免疫组化染色图片。
图 8B显示了小鼠黑质致密部 TH阳性细胞计数分析结果。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次意外地发现： 白介素 -22或白介素 -22 二聚体在神经损伤疾病或神经退行性疾病中表现出明显的治疗效果。 此外， 与 IL-22单体相比， 本发明的 IL-22二聚体能够延长体内半衰期， 改善药物的动力学， 减少注射频率， 并且具有显著增强的体内生物活性。 对神经元细胞 STAT3的激活作 用实验表明， 相对于 IL-22单体， IL-22二聚体在 IL-22摩尔终浓度相当于 IL-22单 体的终浓度的 1/10时， 可以使神经元 P-STAT3的信号水平上升更明显， 因此二聚体 有更明显的神经保护作用， 能够更有效地治疗神经损伤疾病； 还可有效地阻止神 经元的丢失， 从而能够更有效地治疗神经退行性疾病。 在此基础上完成了本发明。 术语 术语 "氨基酸序列基本相同" 是指序列相同或由一个或多个氨基酸改变（缺 失、 增加、 取代）引起的不同， 但这种改变基本上不降低其生物学活性， 即可以通 过结合 IL-22靶细胞受体而发生生物学功能。 任何符合 "基本相同" 要求的白介素 -22均包括在本发明内， 无论它是糖基化的（即来源于天然的或来源于真核生物表 达系统的）或是非糖基化的（即来源于原核生物表达系统或化学合成的）。
术语 "治疗" 是指基于治愈、 缓解、 改善、 减轻、 影响治疗对象疾病、 症状、 疾病体质（predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的白介素 -22。
术语 "治疗对象" 是指鼠、 人及其他哺乳动物。
术语 "治疗有效量" 是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的白介素 -22的 量。 本领域的普通技术人员应理解， 所述 "治疗有效量" 可随白介素 -22的给药途 径、 所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。 白介素 22及其制备
如本发明所用， "白介素 -22 " 或 " IL-22 " 是指一种蛋白质， 该蛋白质（a)具 有与 Dumout ier等人在 US359, 117中描述的人 /鼠白介素 -22基本相同的氨基酸序列 和（b)具有与天然白介素 -22相同的生物学活性。 本发明的白介素 -22包括， 但不限 于： 人白介素 -22、 重组人白介素、 鼠白介素 -22和 /或重组鼠白介素 -22。 在本发 明中， 术语 " IL-22 " 可包括单体、 二聚体或多聚体形式的 IL-22。
"白介素 -22 " 还包括 PEG化的 IL-22以及共价修饰的 IL-22蛋白质。 例如， 可 用各种活化的分子量为 5， 000〜 100， 000的聚乙二醇（PEG)修饰以使 IL-22高分子 化，延长其半衰期。具体操作可参见 Greenwald等， Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994， 4， 2465； Cal icet i等， IL Farmaco , 1993， 48， 919； Zal ipsky and Lee , 《聚 乙二醇化学： 生物技术与生物医学应用》 ， J. M. Harri s编， Plenum Press , N. Y. ， 1992。优选使用多臂树杈型活性 PEG (CNZL02101672. 0、 W09932139、 PCT/US95/0755, PCT/US94/13013、 US4， 640， 835、 US 4， 496， 689、 US 4， 301， 144、 US 4， 670， 417、 US 4， 791， 192、 US 4， 179， 337)。
本发明的白介素 -22可用基因重组技术克隆表达的。 表达的宿主细胞包括原核 细胞、 酵母细胞或者高等真核生物细胞。 适用的原核宿主细胞包括， 但不限于： G+或 G—菌， 如大肠杆菌 A coli. , 能够通过公共途径得到的 £ co i.菌株包括： K12 MM294 (ATCC 31, 446)、 X1776 (ATCC 31, 537)、 W3110 (ATCC 27， 325)和 K5 772 (ATCC 53， 635)等。 其他可用的原核细胞包括但不限于： 欧式杆菌（^^i w'a)、 克雷伯杆 mUebsiella)、 变形杆菌（ ^O e^)等。 E. coli. W3110因其常被用作重组 DNA 产品的发酵宿主而被推荐为优选。
除了原核细胞， 真核细胞如丝状真菌（ Ϊ 或酵母菌（j¾^ ) 等同样适用于表达或者克隆本发明的白介素 -22。 酿酒酵母菌（6¾c^ar0 ^C^)就 是一种常用的低等真核宿主微生物， 其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌； 克鲁维酵 母菌； 巴氏毕赤酵母菌等。 甲基营养酵母菌（ e Ar 0 r0 iC yeas^)同样可用于 表达本发明的白介素 -22， 包括但不限于各种能够在甲醇中生长的酵母菌如汉逊酵 母菌 iMansenul )， 念珠菌（ Candida)， 克勒克酵母菌 Udoecker )， 毕赤酵母菌 {Pichia)， 酿酒酵母菌 ^Saccharoniyces)等。
用于表达糖基化的本发明的白介素 -22的宿主细胞可来源于多细胞有机体。 无 脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如 DrosophilaS2和 SpodopteraSf9， 植物细胞。 适用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢细胞（CH0)， COS细胞。 特别是， 经 SV40转化的猴肾 CV1细胞株（C0S-7, ATCC CRL 1651)； 人胚胎肾细胞株 293等。 本领域的普通技术人员应知如何选择合适的宿主细胞。
上述宿主细胞经白介素 -22表达载体或克隆载体转染或者转化后可在传统的 营养基（nutrient media) 中培养， 所述营养基经修饰后适于诱导启动子 (promoter)、 选择性转化体（selecting transf ormant)或者扩增白介素 -22编码基 因序列。 培养条件如培养基、 温度、 pH等的选择对本领域的普通技术人员来说则 是应知的。 如何使细胞培养繁殖力最大化的一般原则、 方案以及操作技术可参见 Mammal i an Cell Biotechnology： a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 禾口 Sambrook 等， supra。
本领域的普通技术人员应熟知真核细胞转染和原核细胞转化的方法， 例如
CaCl2法、 磷酸钙沉淀法、 脂质体媒介法或电穿孔法。 根据使用的宿主细胞的不同， 本领域的普通技术人员可选择相应的标准转化技术， 例如 CaCl2法（Sambrook等， supra. )或电穿孔法通常用于原核细胞； 对于没有细胞壁的哺乳动物细胞， 则可以 使用磷酸钙沉淀法。
编码本发明的白介素 -22的核苷酸序列（gPcDNA或基因组 DNA)可被插入一可复 制载体（replicable vector)进行基因克隆（DNA扩增）或者表达。 各种载体如质粒、 粘粒（cosmic!, 装配型质粒）、 病毒颗粒或噬菌体等均可通过公共途径获得。 运用 本领域的公知技术， 可将本发明的白介素 -22的编码核苷酸序列按常规步骤插入可 复制载体上适宜的限制性核酸内切酶位点。
本发明的白介素 -22不但可以通过基因重组直接表达， 也可以通过与异种多肽 形成融和多肽的方式生产， 后者可以是一段位于成熟蛋白质或多肽 N端的信号序 列， 也可以是位于成熟蛋白质或多肽 N端的具有特异性切割位点的其他多肽片段。 通常情况下， 这段信号序列是上述可复制载体的一部分， 或者它也可以是插入可 复制载体的本发明的白介素 -22编码核苷酸序列的一部分。
表达载体和克隆载体均含有一段核苷酸序列， 该序列使载体能够在一个或多 个相应的宿主细胞内复制。 与各种细菌、 酵母或病毒宿主细胞对应的核苷酸序列 为本领域普通技术人员所公知。例如，质粒 pBR322的复制起点适用于大多数 G—细菌， 2. mu.质粒复制起点适用于酵母细胞， 而各种病毒复制起点（SV40， 多形瘤病毒， 腺病毒， VSV或 BPV)则适用于哺乳动物细胞内的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常含有一段选择基因， 又名 "选择标记" 。 典型的选 择基因编码产生的蛋白质（a)对某些抗生素或毒素如氨苄青霉素， 新霉素， 氨甲蝶 呤，四环素等具有抗性； （b)能弥补营养缺陷型缺乏（auxotrophic deficiencies) (c) 补充复合型培养基不能提供的关键营养物质如杆菌宿主细胞需要的 D-丙氨酸消旋 酶的编码基因。
适用于哺乳动物宿主细胞的选择基因应该可以将有能力吸纳本发明的白介素 -22编码基因的宿主细胞区分出来， 如 DHFR或胸（腺嘧啶核）苷激酶。 适用的以野生 型 DHFR为选择基因的宿主细胞是无 DHFR活性的 CH0细胞株， 该细胞株的制备及繁殖 方法可参见 Urlaub等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)。 适用于酵 母细胞的选择基因是在酵母质粒 Yrp7中表达的 trpl基因（Stinchcomb等， Nature, 282:39(1979) ； Kingsman等， Gene , 7:141(1979) ； Tschemper等， Gene , 10:157(1980))。 trpl基因可用于筛选不能在色氨酸中生长的酵母菌突变株如 ATCC Νο· 44047或 PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977))。
表达载体和克隆载体通常含有一个可人工操纵地连接到本发明的白介素 -22 编码核苷酸序列上的启动子， 以指导 mRNA的合成。 与各种宿主细胞对应的启动子 为本领域普通技术人员所公知。 适用于原核宿主细胞的启动子包括 β -内酰胺酶和 乳糖启动子系统等。 细菌宿主细胞启动子同样包含一段可人工操纵地连接到本发 明的白介素 -22编码基因序列的 Shine-Dalgarno (S. D. )序列。
通过在可复制载体中插入增强子可增强本发明的白介素 -22的编码核苷酸序 列在高等真核生物表达体系中的转录。 增强子是一种 DNA分子的顺式作用元件， 通 常为 10到 300个 bp， 通过作用于启动子而增强 DNA分子的转录。
真核宿主细胞（酵母细胞、 真菌细胞、 昆虫细胞、 植物细胞、 动物细胞、 人类 细胞， 或者来源于其他多细胞有机体的有核细胞）中的表达载体同样含有中止转录 和稳定 mRNA所需的核苷酸序列。 此类序列通常取自真核或者病毒 DNA或 cDNA非翻译 区的 5' 端， 有时也可取自 3' 端。 所述 "非翻译区" 包含的核苷酸片段可转录产 生位于本发明的白介素 -22 mRNA非翻译区的聚腺苷酰化片段。
其他可在重组脊椎动物培养体系中用于合成本发明的白介素 -22的方法、 载体 和宿主细胞可参见 Gething等， Nature, 293:620-625 (1981)； Mantei等， Nature, 281:40-46 (1979)； EP 117, 060； 以及 EP 117,058。
IL-22二聚体
本发明的 IL-22二聚体的结构如式 I所示。代表性的结构如图 1-3中所示。其中， 载体蛋白包括（但并不限于）是指人 IgG (l，2，3，4)的 Fc片段、 或人白蛋白 (albumin)。
IL-22位于可用载体蛋白的 C-末端， 也可用位于载体蛋白的 N-末端。
如本文所用， 术语 "连接肽" （l inker)指位于 IL-22单体和 IL-22单体之间的、 起连接作用的短肽。 连接肽的长度没有特别限制。 连接肽的长度通常为 5-50个氨 基酸。 通常， 连接肽不影响或不显著影响 IL-22单体和 IL-22单体形成正确的折叠 和空间构象。 一些连接肽的例子包括（但并不限于）：
较佳地， 所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a) 疏水性氨基酸 Gly和 Pro构成 的 3-16个氨基酸序列 ， 例 如 Gly - Pro - Gly - Pro - Gly - Pro；
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。 该序列通常为 5-20个， 较佳地 10-20个 氨基酸；
(c)来自于 IL-22单体之外的蛋白的氨基酸序列， 例如来自于 IgG或白蛋白的氨 基酸序列；
(d)由（a)、 （b)和（c)组合形成的氨基酸序列。
优选的连接肽包括： GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 1中第 147- 162位）和 ASTKGP (SEQ ID NO : 3中第 147- 152位）。
此外， 在融合蛋白的 N端或 C末端还可添加其他不影响 IL-22单体活性的氨基酸 序列。 较佳地， 这些添加的氨基酸序列有利于表达（如信号肽）， 有利于纯化（如 6 X His序列、 酿酒酵母 α -因子信号肽切割位点（Glu-Lys-Arg)， 或可促进融合蛋 白的活性。 二聚体的制备方法
编码本发明 IL-22二聚体或融合蛋白的 DNA序列， 可以全部人工合成。 也可用 PCR扩增或合成的方法获得 IL-22第一单体和 /或 IL-22第二单体的编码 DNA序列， 然 后将其拼接在一起， 形成编码本发明融合蛋白的 DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量， 可以对 IL-22二聚体编码序列进行改造， 例如采 用宿主细胞偏好的密码子， 消除不利于基因转录及翻译的序列。 在本发明中， 可 以采用酵母细胞或哺乳动物细胞偏好的密码子， 并采用计算机 DNA软件对 IL-22二 聚体基因进行检测， 排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列， 包括内含子剪 切位点， 转录终止序列等。
在获得了编码本发明新融合蛋白的 DNA序列之后， 将其连入合适的表达载体， 再转入合适的宿主细胞。 最后， 培养转化后的宿主细胞， 通过分离纯化得到本发 明的新的融合蛋白。
如本文所用， 术语 "载体" 包括质粒、 粘粒、 表达载体、 克隆载体、 病毒载 体等。
在本发明中， 可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。 比如， 选用市售 的载体， 然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列， 可以形成蛋白表达载体。
如本文所用， "可操作地连于" 指这样一种状况， 即线性 DNA序列的某些部分 能够影响同一线性 DNA序列其他部分的活性。 例如， 如果信号肽 DNA作为前体表达 并参与多肽的分泌， 那么信号肽（分泌前导序列） DNA就是可操作地连于多肽 DNA ;如 果启动子控制序列的转录， 那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点 被置于能使其翻译的位置时， 那么它是可操作地连于编码序列。 一般， "可操作 地连于" 意味着相邻近， 而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中， 术语 "宿主细胞" 包括原核细胞和真核细胞。 常用的原核宿主 细胞的例子包括大肠杆菌、 枯草杆菌等。 常用的真核宿主细胞包括酵母细胞， 昆 虫细胞、 和哺乳动物细胞等。 较佳地， 该宿主细胞是真核细胞， 更佳地是哺乳动 物细胞。
在获得转化的宿主细胞后， 可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细 胞， 从而表达出融合蛋白。 然后再分离出表达的融合蛋白。 药物组合物和施用方法
由于本发明 IL-22二聚体可产生更强的受体激活信号并具有优异的血清半衰 期， 因此本发明 IL-22二聚体以及含有本发明 IL-22二聚体为主要活性成分的药物组 合物可用于治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病。 其中， 所述的神经损伤疾 病包括： 中风、 脊柱损伤和伴有血脑屏障损伤的神经系统疾病； 所述神经退行性疾病 选自： 帕金森氏病、 阿尔茨海默氏病、 亨廷顿舞蹈病、 肌萎缩侧索硬化病、 脊髓肌萎 缩病、 原发性侧索硬化病、 或脊髓小脑共济失调。
本发明的药物组合物包含安全、 有效量范围内的本发明 IL-22或其二聚体及药 理上可以接受的赋形剂或载体。 其中 "安全、 有效量" 指的是： 化合物的量足以明 显改善病情， 而不至于产生严重的副作用。 通常， 药物组合物含有 0. 001-lOOOmg 的 IL-22或其二聚体 /剂， 较佳地 0. 05-300 mg的 IL-22或其二聚体 /剂， 更佳地， 含 有 0. 5-200mg的 IL-22或其二聚体 /剂。
本发明的化合物及其药理上可接受的盐可制成各种制剂， 其中包含安全、 有效 量范围内的本发明 IL-22或其二聚体或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋 形剂或载体。 其中 "安全、 有效量" 指的是： 化合物的量足以明显改善病情， 而不 至于产生严重的副作用。 化合物的安全、 有效量根据治疗对象的年龄、 病情、 疗程 等具体情况来确定。
"药理上可以接受的赋形剂或载体"指的是： 一种或多种相容性固体或液体填 料或凝胶物质， 它们适合于人使用， 而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。 "相 容性"在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互惨和， 而 不明显降低化合物的药效。 药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其 衍生物（如羧甲基纤维素钠、 乙基纤维素钠、 纤维素乙酸酯等）、 明胶、 滑石、 固体 润滑剂（如硬脂酸、 硬脂酸镁）、 硫酸钙、 植物油（如豆油、 芝麻油、 花生油、 橄榄 油等）、 多元醇（如丙二醇、 甘油、 甘露醇、 山梨醇等）、 乳化剂（如吐温 ®)、 润湿剂 (如十二垸基硫酸钠）、 着色剂、 调味剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 防腐剂、 无热原水等。
施用本发明 IL-22或其二聚体时， 可以口服、 直肠、 肠胃外（静脉内、 肌肉内或 皮下）、 局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、 片剂、 丸剂、 散剂和颗粒剂。 在这些固 体剂型中， 活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂（或载体)混合， 如柠檬酸钠或磷 酸二钙， 或与下述成分混合： （a) 填料或增容剂， 例如， 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄 糖、 甘露醇和硅酸； （b) 粘合剂， 例如， 羟甲基纤维素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯基 吡咯垸酮、 蔗糖和阿拉伯胶； （c)保湿剂， 例如， 甘油； （d)崩解剂， 例如， 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯淀粉或木薯淀粉、 藻酸、 某些复合硅酸盐、 和碳酸钠； （e)缓溶剂， 例如石蜡； （f) 吸收加速剂， 例如， 季胺化合物； （g) 润湿剂， 例如鲸蜡醇和单硬 脂酸甘油酯； （h) 吸附剂， 例如， 高岭土； 和（i)润滑剂， 例如， 滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二垸基硫酸钠， 或其混合物。 胶囊剂、 片剂和丸剂中， 剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、 糖丸、 胶囊剂、 丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备， 如肠 衣和其它本领域公知的材料。 它们可包含不透明剂， 并且， 这种组合物中活性化合 物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。 可采用的包埋组 分的实例是聚合物质和蜡类物质。 必要时， 活性化合物也可与上述赋形剂中的一种 或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、 溶液、 悬浮液、 糖浆或酊 剂。 除了活性化合物外， 液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂， 如水或 其它溶剂， 增溶剂和乳化剂， 例知， 乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 丙二醇、 1，3-丁二醇、 二甲基甲酰胺以及油， 特别是棉籽油、 花生油、 玉米胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外， 组合物也可包含助剂， 如润湿剂、 乳化剂和悬浮剂、 甜味剂、 娇味剂和香料。
除了活性化合物外， 悬浮液可包含悬浮剂， 例如， 乙氧基化异十八垸醇、 聚氧 乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、 微晶纤维素、 甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、 分散 液、 悬浮液或乳液， 和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。 适 宜的含水和非水载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂包括水、 乙醇、 多元醇及其适宜的混 合物。
用于局部给药的本发明 IL-22或其二聚体的剂型包括软膏剂、 散剂、 贴剂、 喷 射剂和吸入剂。 活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、 缓冲 剂， 或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明 IL-22或其二聚体可以单独给药， 或者与其他药学上可接受的化合物联 合给药。
含有本发明的白介素 -22或其二聚体的微胶囊可用于本发明的白介素 -22的缓 释给药。 重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素（rhGH)、 重 组人干扰素（rhIFN)、 白介素 - 2和 MNrgpl20(Johnson等， Nat. Med. , 2:795-799 (1996)； Yasuda, Biomed. Ther 27:1221-1223 (1993)； W097/03692, W096/40072, WO 96/07399； US5654010。
本发明的白介素 -22或其二聚体的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛 生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物（PLGA)制备。 PLGA的降解产物， 乳酸和羟基 乙酸可被人体很快清除。 而且， 该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同， 从几个月延长到几年 (Lewis, "Controlled release of bioactive agents form lactide/ glycol ide polymer, " in: M. Chasin and R. Langer (Eds. ) ， Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker： New York, 1990)， pp. 1-41))。
本发明的药物组合物的剂量和浓度范围可因实际使用情况的不同而变化。 本 领域的普通技术人员应知如何根据实际需求去选择合适的剂量和给药途径。 对于 不同种系， 例如人和鼠之间药物剂量范围的调整原则， 可参见 Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等； Pergamon Press, New York 1989， pp. 42-96。
使用药物组合物时， 是将安全有效量的本发明 IL-22或其二聚体适用于需要治 疗的哺乳动物（如人）， 其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量， 对于 60kg 体重的人而言， 每次给药剂量通常为 0.01〜300mg， 优选 0.5〜100mg。 当然， 具体 剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内 的。
本发明的主要优点在于：
1. IL-22或其二聚体在体外能激活神经细胞 STAT3。
2. IL-22二聚体在动物模型已证实可有效治疗神经损伤疾病。 3. IL-22 二聚体能够延长体内半衰期， 改善药物的动力学， 减少注射频率； 能显著增强体内生物活性。
4. IL-22或 IL-22二聚体在显著抑制 PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失， 激发多巴胺能神经元的功能。
5. IL-22或 IL-22二聚体显著抑制海马区神经元细胞的凋亡， 改善 AD模型动 物的学习记忆能力。
6. IL-22或 IL-22二聚体在神经退行性疾病中具有显著的神经保护作用， 有效 治疗神经退行性疾病。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1
用常规方法制备和纯化， 获得结构如图 1-图 3所示的 IL-22二聚体（序列为 SEQ ID NO : 1， 或单体序列如 SEQ ID NO : 2-5所示）。 例如， 由 IL-22-Fc复合物制备 IL-22 二聚体， 具体制备方法如下：
a. IL-22 二聚体表达细胞株的构建
采用全基因合成 IL-22-Fc复合物的 cDNA序列（如 SEQ ID NO : 6或 SEQ ID NO : 7 所示， 其中 SEQ ID NO.： 6编码 SEQ ID NO.： 2所示的单体， SEQ ID NO.： 7编码 SEQ ID NO.： 3所示的单体）， 将人 IL-22单体的基因与 IgG2的 Fc基因片段连接， 5 ' 端 引入 EcoRI位点， 以及哺乳动物细胞表达所需要的元件如 Kozak序列和信号肽序列， 3 ' 端引入 Xbal位点， 克隆到市售的 pUC19质粒， 命名为 pIL-22-Fc， 转化常规的 E. col i TG1。 用 EcoRI和 Xbal酶切 pUC19质粒， 回收约 1300bp的 IL-22-Fc片段， 与经 EcoRI和 Xbal酶切后的 pcDNA3 (Invitrogen)表达质粒相连接， 构建表达质粒 pEX-IL-22-Fc。 表达质粒 pEX-IL-22-Fc通过线性化转染 CH0细胞， 表达 IL-22二聚 体， ELISA法检测表达量， 筛选出蛋白产量较高的细胞株， 并制备细胞库。
b . IL-22二聚体的分离纯化
将重组 CH0细胞用常规方法进行培养从而表达重组蛋白。 培养结束后， 收集细 胞上清（含有 IL-22复合物、 IL-22二聚体、 IL-22多聚体及代谢物）， 细胞上清收集 后经过滤、 多级凝胶层析纯化， 例如， rProtein A S印 harose FF (GE Healthcare, 货号： 17- 1279- 04)捕获， 用 20- 50 mM柠檬酸缓冲液， 0. 1- 2M NaCl , pH 3. 5-3. 8 的缓冲液洗脱， 得到纯度〉 90%的 IL-22二聚体， 接下来采用 PPA复合介质的凝胶层 析（PALL Life Sciences 货号： k364- 01)， 用 20- 50 mM NaAc/HAC, pH 3. 0-5. 0的 缓冲液洗脱， 洗脱液经低 pH灭活病毒， Nano20膜除病毒过滤等， 最终获得 IL-22二 聚体。
分离纯化得到的 IL-22二聚体的纯度 >95% (采用反向 HPLC分析）。 电泳显示， 纯 化后 IL-22二聚体（由二个 SEQ ID NO.： 2所示单体构成）分子量为 52 ± 10KD (采用还 原型 SDS-PAGE分析）， 与预测值相符。 紫外吸收光谱为 280nm。 IL-22二聚体在体外 能剌激 Colo205细胞产生 IL-10(ED50为 10-1000 ng/mL)。
实施例 2 IL-22二聚体体内半衰期
大鼠皮下单次注射 IL-22二聚体（由二个序列如 SEQ ID N0:2所示的 IL-22-Fc 单体构成） 100 g/kg, 药代动力学参数如下表 1所示（n=6)。 而单体 IL-22 (重组 人白介素 22) 在大鼠的半衰期约 1.3小时。
表 1
参数 单位 平均值 SD
AUC(O-t) ng/mL*h 4216.7 638.3
MRT(O-t) H 22.6 1.6
CLz/F L/h/kg 0.028 0.003
Cmax ng/mL 153.2 26.2 实施例 3 IL-22或 IL-22二聚体对神经元细胞 STAT3的激活作用
取孕 17天 SD大鼠的胎鼠的全脑放入预冷的 D-Hanks液中， 在解剖显微镜下取大 脑皮层并除去脑膜。 剪碎脑组织成 1匪3大小， 加入 10 mLO.125%胰酶， 并放入 37°C 孵箱内消化 15 min, 随后吸出组织转移到装有预冷的 DMEM+10%FBS的离心管内终 止消化， 用移液枪吹打数次， 静置后取上清并吸到另一支离心管内。 重复上述步 骤 2〜3次。
用无血清神经元基础培养基 neurobasal(invitrogen， 货号: 21103049)+无血 清添加剂 B27(invitrogen， 货号： 17504044)培养 8天， 每 2天换液一次。
培养至第八天， 分别用不同浓度 IL-22二聚体（由二个序列如 SEQ ID N0:2所示 的 IL-22-Fc单体构成）和 IL-22(IL-22二聚体的终浓度： 0.3 μ g/mL; IL-22的终浓 度： 1.2 μ g/mL)处理神经元 15分钟。 将含药物的培养基上清完全吸出， 细胞用 PBS 洗两遍， 按照细胞裂解液使用说明步骤裂解细胞。 用细胞裂解液（Cell Signaling Technology, 货号： 9803； 主要成分： 20 mM Tris- HC1 (pH 7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM Na2EDTA， 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM beta- glycerophosphate, 1 mM Na3V04， 1 g/ml leupeptin, 1 mM PMSF)冰上裂 解细胞 20分钟， 用细胞刮子刮取细胞。 收集细胞裂解液， 12000rpm， 4°C离心 10分 钟。
吸取上清， 测定蛋白浓度。 另取 Ιθθμΐ的上清用 STAT3 [pY705] ELISA试剂盒 (invitrogen, 货号： KH00481)检测 STAT磷酸化水平变化。
结果如图 4所示： 与空白对照组相比， IL-22、 IL-22二聚体均能激活神经元细 胞信号转导及转录活化因子 3 (STAT3)的生物活性。 其中， IL-22单体（终浓度为 1. 2 4 §/1^)可使神经元 -51 13的信号水平上升5. 4倍， 而 IL-22二聚体， 其终浓度 仅为 0. 3 w g/mL， 相当于 IL-22单体的终浓度的 1/10， 而且可以使神经元 p-STAT3的 信号水平上升 7. 8倍， 可见， IL-22二聚体对神经元细胞 STAT3的激活作用显著优于 IL-22单体。 实施例 4 IL-22二聚体在局灶性脑缺血动物模型（Focal cerebral i schemia) 中的治疗作用
雄性 SD大鼠， 体重为 250〜300g。 动物分成 3组：模型组（MCA0+溶剂， n=12)， IL- 22二聚体组（MCA0+IL- 22- D100 μ g/kg, IL- 22- D由二个序列如 SEQ ID N0 : 2 所 示的 IL-22-Fc单体构成）， 假手术组（手术 +溶剂， n=12)。
麻醉后， 大鼠的右颈总动脉（CCA)、 右颈内动脉（ICA)、 右颈外动脉（ECA)通过 颈部手术暴露在外。 一种头部硅胶包裹的线栓通过大鼠颈外动脉插入颈总动脉再 回拨至颈内动脉进行阻塞， 插入长度大约 18. 5 ± 0. 5mm。 插入后感觉略微受阻， 表 明已到达中动脉处，能够阻塞中动脉的血流供应。阻塞 60min后，线栓被拔出约 10mm 左右进行再灌注。 IL-22二聚体组分别于再灌注 0. 5h和 48h时， 皮下注射 IL-22二聚 体 100 μ g/kg, 假手术组和模型组皮下注射相同体积的溶剂。 整个手术过程中， 动物体温被保持在 36. 5 。 假手术组只切开颈部皮肤分离颈部动脉， 不插入线栓。 21天后动物被安乐处死取出大脑。
用 2mm的冠状切片模具将大脑切成 6片， 放在 2%TTC溶液中， 37°C避光温孵 20-30min,最后固定在 10%福尔马林溶液中。固定后将这些脑切片用数码相机拍照， 白色未染上的部分为梗死区。 然后计算其体积百分比％= (对侧脑半球面积-同侧脑 半球未梗死部位面积）/对侧脑半球面积 *100%。 梗死面积的测量用 Photoshop 7. 0 软件完成。
神经学症状的临床评价
神经功能学分数在手术的 0天， 1天， 2天， 3天或者第 0、 1、 2、 3、 7、 14、 21 天被评价， 其分数分级标准为： 0-无神经功能性损伤； 1-左前肢不能伸展； 2-不 连续地向左边转圈； 3-连续的向左边转圈； 4-向左侧倾倒； 5-神经意识丧失， 不 能自发行走。
结果如图 5-6所示， 模型组梗死体积为 54. 7%。 与模型组比较， 注射 IL-22二聚 体后显示出了显著的治疗效果（P<0. 01)， 其梗死体积为 33. 8%， 相对于模型组， IL-22二聚体组的梗死体积减少了 20.9%。 在术后第三天， IL-22二聚体组与模型组 相比， 神经功能评分有显著性差异（P<0.05)， 提示 IL-22二聚体可以保护神经的坏 死， 促进神经功能的恢复。 实施例 5 IL-22二聚体在食蟹猴体内的药代动力学
成年健康猕猴， 8只， 雌雄各半， 体重 3-5公斤， 按动物体重随机分成 2组， 分 别为 IL-22二聚体 30、 100 w g/kg给药组， 其中给药组各组 4只 /组， 雌雄各半。 分 别皮下注射给予相应剂量的 IL-22二聚体（由二个序列如 SEQ ID NO.： 2所示的 IL-22-Fc单体构成）， 给药体积 0.2 ml/kg体重， 单次给药， 于给药前、 给药后 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 24、 48、 72、 96、 120、 144、 168小时下肢隐静脉取血 0.6ml， 室温静置 30min后， 分离血清， 采用 ELISA试剂盒（Biolegend, 货号: 434507)检测 血清中的 IL-22二聚体浓度， 检测结果采用非房室模型分析药代动力学参数， 结果 如下表 2所示。 IL-22在食蟹猴体内的半衰期（tl/2z)约为 2hr。
表 2 药代动力学参数（均值士 SD， n=4)
给药 AUC (0 - t) MRT (0 - t) Tmax CLz/F Cmax 剂量 mg/L*hr hr hr hr mL/h/kg ng/mL
3(^g/kg 11.92±0· 91 50.5±5 63.3±38· 9 17±9· 5 2±1 172.3±17.1
10(^g/kg 39.9±6· 2 51.1±4· 7 65.6±10.9 24±0 2±0 506.9±115.7 实施例 6 IL-22二聚体、 IL-22的体外活性分析
本实施例利用某些细胞在受到 IL-22剌激时， 会产生 IL-10, 通过检测相应的 0D值， 从而测定 IL-22的活性。 方法如下：
Colo205细胞（ATCC号 CCL-222, 人结肠癌细胞）培养于 RPMI164010%FBS培养 基中，细胞生长至对数期时，弃上清，加入 PBS洗去残留培养基，加入 2〜5mL 0.25% 胰蛋白酶 -EDTA消化， 加入培养基吹打均匀， 1500rpm离心 5min， 收集细胞， 然后 用基础培养基配制成 5.0X105Cell/ml 的细胞悬液， 于 96 孔板各孔分别添加 ΙΟΟμΐν孔， 于 37°C、 5%C02培养箱中过夜。 次日， 取出 C02培养箱中的 96孔板， 于 4°C条件下， 800rpm离心 5分钟， 从各孔抽出细胞上清液 90 μ L， 并补入 90wL 0.1%BSA/RPMI1640, 加入 IL-22二聚体（由二个 SEQ ID NO.： 2所示单体构成）至 终浓度 1.4、 4.1、 12.3、 37.0、 111.1、 333.3、 1000、 3000ng/mL, 加入 IL- 22至 终浓度 0.01、 0.04、 0.12、 0.37、 1.1、 3.3、 10、 30ng/mL, 于 37°C， 5%C02培养 箱中培养 20hr， 收集细胞上清液， 采用 IL-22ELISA试剂盒（R&D， 货号 S1000B)检 测 0D值。
结果如 图 7 所示 ， IL-22 二聚体的半数有效浓度 （ED50) 值为 229ng/mL (2675pM)， IL-22的 ED50为 0. 54ng/mL (32. 4pM)。
以上结果显示， 虽然体外实验中 IL-22活性略优于 IL-22二聚体的活性， 而 IL-22二聚体在体内的药代动力学参数和有效活性远远优于 IL-22 ,可见评价 IL-22 二聚体的生物活性宜采用体内实验模型。
实施例 3和 6的结果提示， IL-22单体或二聚体形式对不同细胞的作用存在很 大差异。 对神经细胞而言， IL-22二聚体对神经细胞的激活作用明显优于 IL-22单 体的作用， 对人结肠癌类细胞（如 Colo205细胞）而言， IL-22单体的活性略优于较 IL-22二聚体的活性。
因此， 实施例 3的体外测定方法更适合用于测定二聚体 IL-22的活性（尤其是 针对神经细胞的保护作用）， 也更适合反映二聚体 IL-22在体内的活性。 实施例 7 IL-22或 IL-22二聚体对 MPP+诱导的 PC12细胞神经毒性的保护作用
PC12细胞是一种大鼠嗜铬细胞瘤细胞系， 体外培养能合成、 代谢、 传递多巴 胺， 可作为体外模型筛选具有活性的化合物。
实验将 PC12细胞按 40000个 /孔种于 96孔板， 培养基成分： DMEM, 10%马血清 +5%FCS, 1%青霉素-链霉素。 MPP+ (Sigma)加入至 30〜3000 μ m终浓度，分别加入 IL-22 至终浓度为 0. 04 ng/mL、 0. 4ng/mL、 4ng/mL、 40ng/mL IL- 22二聚体（由两个选自 序列如 SEQ ID N0 : 2-5所示的 IL-22-Fc单体构成）至终浓度为 0. 1 ng/mL、 Ing/m 10ng/mL、 100ng/mL。 培养 24hr后， 采用荧光细胞存活分析（Fluorimetric cell viabi l ity assay)。
结果显示， MPP+处理后， PC12细胞的存活率随着 MPP+浓度的增加而降低， IL-22 和 IL-22二聚体对 PC12细胞均显示出显著的保护作用。 实施例 8 IL-22或 IL-22二聚体对 MPTP诱导的动物帕金森氏病（PD)模型的治 疗作用
1-甲基 -4-苯基 -1， 2， 3， 6-四氢吡啶（MPTP) , 可以特异性的损伤多巴胺能神 经元， 使黑质多巴胺能神经元大量丢失， 出现类似帕金森氏病的症状。
实验选取 C57/BL6J小鼠， 雄性， 〜28g， 12-14周， 动物饲养于室温 24± 2 ° C 的环境中， 维持光-暗 12小时循环交替， 给以充足的饲料， 自由饮水。
50只小鼠随机分成 5组， 每组 10只， 分别为溶剂对照组、 MPTP模型组、
MPTP+IL-22 40 μ g/kg组、 MPTP+IL - 22 - D 40 μ g/kg组、 MPTP+IL - 22 - D 100 μ g/kg 组， 其中 IL-22-D为由二个序列如 SEQ ID NO : 2-5所示的 IL-22-Fc单体构成的 IL-22 二聚体。
MPTP以 30mg/kg的剂量腹腔注射， 连续给予 5天， 恢复一天后（从第 7天 起） MPTP+IL-22 40 μ g/kg组按 IL-22 40 μ g/kg皮下注射给药， 每天给药 IL-22 , 每 天一次， 连续 7天， 即从第 7〜13天； MPTP+IL-22-D 40 μ g/kg组按 40 μ g/kg皮下注 射给药， 于第 7、 9、 11天分别给药 IL-22-D—次； MPTP+IL-22-D 100 w g/kg组按 100 μ g/kg皮下注射给药， 于第 7、 9、 11天分别给药 IL-22-D—次； 溶剂对照组皮 下注射给予等体积的生理盐水。
第 14天对动物进行以下评价。
a. PD小鼠的行为学评价
在本实验于 MPTP末次给药后第 10天进行行为学检测。方法：爬杆法（pole test) 用于检测 PD中典型行为学症状一运动徐缓（Matsuura 等， 1997; Araki等， 2001 ; Kato等， 2004)。
将小鼠头向上轻柔的放在粗糙的杆顶（直径 8 mm, 高 55cm)。 小鼠从头向上调 整至头完全向下的时间记录为 T-turn (t ime to turn) , 小鼠从向下运动至四肢全 部到达杆底的时间记录为 T-LA (locomotion activity time) , 超过 30 s按照 30 s 记录。 每只小鼠重复检测 5次取平均值。
结果显示， IL-22和 IL-22二聚体均能显著改善 MPTP诱导的小鼠行为学异常。 b.检测紋状体内多巴胺的浓度
方法： 小鼠断头处死， 将纹状体取出称重后装在 1. 5 ml的离心管中， 并立即 置于碎冰中。 样本每 10 mg加入 300 μ 1冰水浴中的样品处理液（0. 2 M高氯酸、 0. 2 mM焦亚硫酸钠、 0. 01% EDTA-2Na， 同时含有 0. 3 μ Μ ϋΗΒΑ作为内标）。 以上混合液 使用超声仪超声粉碎， 随后将其在 4°C下 10， 000 g离心 20 mi n e 取其上清液并用 0. 22 μ Μ水相滤膜过滤， 采用高效液相色谱法检测纹状体多巴胺的浓度。
结果显示， IL-22和 IL-22二聚体能显著抑制 MPTP诱导的小鼠纹状体多巴胺浓 度的降低。
c.黑质内多巴胺能神经元的情况观察
方法： 10%水合氯醛麻醉， 4%多聚甲醛灌流后取脑。 4%多聚甲醛后固定 24h， 再将样本转入 10%， 20%, 30%的蔗糖溶液中梯度脱水至样本沉底， 在 -20 ° C冰冻切 片机中做中脑与纹状体部位冠状切片， 小鼠脑切片厚度为 15 μ πι。 ΤΗ为多巴胺能能 神经元的特异性标记。 一抗为单克隆小鼠抗 ΤΗ (1 : 1000， CHEMIC0N) , 与纹状体和 中脑部位的脑片 4° C共同孵育过夜， PBS洗三遍后用生物素化二抗， 室温孵育 lh。 SABC复合物室温孵育 lh。 DAB显色， 乙醇梯度脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封片。 黑质 TH阳性细胞计数， 纹状体 TH阳性染色光密度扫描。
结果显示， IL-22和 IL-22二聚体可以明显抑制 MPTP诱导的多巴胺能神经元的 大量丢失。 实施例 9 IL-22或 IL-22二聚体对海马神经元细胞 STAT3的激活作用
取孕 17天 SD大鼠的胎鼠的全脑放入预冷的 D-Hanks液中， 在解剖显微镜下取海 马。 剪碎成 1 mm3大小， 加入 10 mL 0. 125%胰酶， 并放入 37°C孵箱内消化 15 min, 随后吸出组织转移到装有预冷的 DMEM+ 10%FBS的离心管内终止消化， 用移液枪吹 打数次， 静置后取上清并吸到另一支离心管内。 重复上述步骤 2〜3次。
用无血清神经元基础培养基（neurobasal ,购自 invitrogen,货号: 21103049) + 无血清添加剂 B27 (invitrogen， 货号： 17504044)培养 8天， 每 2天换液一次。
培养至第八天， 分别用不同浓度 IL-22二聚体（由两个选自序列如 SEQ ID N0 : 2-5所示的 IL-22-Fc单体构成）和 IL-22 (IL-22二聚体的终浓度： 1、 10、 100 ng/mL; IL-22单体的终浓度： 0. 4、 4、 40 ng/mL)处理神经元 15分钟。 将培养基完 全吸出， 细胞用 PBS洗两遍， 按照细胞裂解液使用说明步骤裂解细胞。 用细胞裂解 液（Cel l Signal ing Technology,货号： 9803； 主要成分： 20 mM Tri s-HCl (ρΗ 7· 5)， 150 mM NaCl， 1 mM Na2EDTA， 1 mM EGTA， 1% Triton, 2. 5 mM焦磷酸钠， 1 πιΜ β - 甘油磷酸盐， 1 mM Na3V04， 1 μδ/πι1 亮抑酶肽， 1 mM PMSF)冰上裂解细胞 20分钟， 用细胞刮子刮取细胞。 收集细胞裂解液， 12000rpm， 4°C离心 10分钟。 吸取上清， 测定蛋白浓度。 另取 Ιθθμΐ的上清用 STAT3 [pY705] ELISA 试剂盒（invitrogen, 货号： KH00481)检测 STAT磷酸化水平变化。
结果显示， IL-22二聚体（IL-22-D)与 IL-22单体均能激活海马神经元 STAT3的 生物学活性。 实施例 10 IL-22或 IL-22二聚体对 Α β诱导的 PC12细胞凋亡的保护作用
PC12细胞用神经生长因子（NGF)诱导后可长出突起， 具有神经细胞特性， Α β ( β淀粉样蛋白）诱导 PC12细胞凋亡可作为体外模拟埃尔茨海默 (AD)模型。
将 PC12细胞培养于基础培养基（DMEM， 10%FCS， 1%青霉素 -链霉素）， 胰酶消化， 重悬于含 NGF 50ng/mL的培养基中， 细胞浓度调整为 2X104cells/孔加入 96孔板， 于 37°C , 5%C02培养箱中培养 24hr。 加入 A β至终浓度 1-100 mol/L， 分别用不同浓度 的 IL-22单体和 IL-22-D (IL-22-D由二个选自序列如 SEQ ID NO : 2-5所示的 IL-22-Fc 单体构成）处理， IL-22单体的终浓度分别为 0. 4、 4、 40ng/mL, IL-22-D的终浓度 分别为 1、 10、 lOOng/mL, 模型孔加入等体积的 PBS， 阴性对照孔不加 Α β， 继续培 养 24hr。 Hochest染色观察细胞形态学， 或 MTT法检测 PC12细胞的增殖。
与阴性对照孔相比， 模型孔的 PC12细胞细胞核荧光染色明显不均匀， 可见到 细胞凋亡引起的致密浓染的高荧光细胞核， IL-22单体和 IL-22二聚体处理的 PC12 细胞细胞核荧光染色均匀，未见到明显的致密浓染的高荧光细胞核。 IL-22和 IL-22 二聚体均能抑制 NGF分化后 Α β 诱导所致的 PC12细胞的凋亡， 保护神经细胞。 实施例 11 IL-22或 IL-22二聚体对 ΜΡΤΡ诱导的 PD动物模型的治疗作用
1-甲基 -4-苯基 -1， 2， 3， 6-四氢吡啶 （ΜΡΤΡ) ， 可以特异性的损伤多巴胺能 神经元， 使黑质多巴胺能神经元大量丢失， 从而出现类似帕金森氏病 （PD) 的症 状。 酪氨酸羟化酶 （TH) 是多巴胺能神经元的特异性标记， 可以用于定量检测黑 质多巴胺能神经元的数量。
因 IL-22单体与 IL-22-D的分子量之比为约 1 : 5，且一个 IL-22-D含 2个 IL-22单 体， 故为了比较试验结果， 本试验中选用等摩尔用量（按 IL-22单体计）， 即 IL-22 用量为 40 g/kg, 而 IL- 22- D用量为 100 μ g/kg。
实验选取雄性 C57/BL6J 小鼠， 22〜30g， 12-14周， 随机分成 4组， 分别为： MPTP+IL-22 40 μ g/kg组: 以 30 mg/kg的剂量腹腔注射 MPTP, 连续给予 5天， 动物恢复一天后 （即从第 7天起） 按 40 μ g/kg皮下注射给予 IL-22 (重组人白介素
22)， 连续给药 7天；
MPTP+IL-22-D 100 μ g/kg组： 以 30 mg/kg的剂量腹腔注射 MPTP, 连续给予 5天， 动物恢复一天后 （即从第 7天起） 按 100 μ g/kg皮下注射给予 IL-22-D, 分别于第 7、 9、 11天分别给药一次；
MPTP模型组： 以 30 mg/kg的剂量腹腔注射 MPTP, 连续给予 5天， 动物恢复一天 后， 从第 7天起给予等体积的溶剂 （0. 5%鼠血清 /PBS ) ；
正常对照组： 给予等体积的生理盐水， 连续给予 5天， 动物恢复一天后， 从第 7天起给予等体积的溶剂 （0. 5%鼠血清 /PBS ) 。
所述 IL-22二聚体 （IL-22-D) 由二个序列如 SEQ ID N0 : 2所示的 IL-22-Fc构成。 IL-22-D也可以由二个选自序列如 SEQ ID NO : 3-5所示的 IL-22-Fc单体构成。
第 14天处死动物， 检测黑质内多巴胺能神经元的情况。
黑质内多巴胺能神经元的情况观察
方法： 10%水合氯醛麻醉， 4%多聚甲醛灌流后取脑。 4%多聚甲醛后固定 24h， 再将样本转入 10%， 20%, 30%的蔗糖溶液中梯度脱水至样本沉底， 在一 20°C 冰冻 切片机中做中脑部位冠状切片， 小鼠脑切片厚度为 20 μ πι， TH免疫组化分析。 一抗 为单克隆小鼠抗 TH抗体 （1 : 1000， Sigma) ， 与中脑部位的脑片 4°C共同孵育过夜， PBS 洗三遍后用生物素化二抗（羊抗鼠）， 室温孵育 lh。 SABC复合物室温孵育 lh。 DAB显色， 乙醇梯度脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封片。 进行黑质致密部 TH阳性细 胞计数分析。
结果如图 8A、 图 8B所示：
图 8A显示了小鼠黑质致密部 TH阳性神经元免疫组化染色图片。 小鼠连续 5天注 射 MPTP后， 黑质致密部 TH阳性神经元大量丢失， 在施用 IL-22或者 IL-22二聚体后， 明显恢复了 TH阳性神经元数量。
图 8B显示了小鼠黑质致密部 TH阳性细胞计数分析结果。 与正常对照组相比， MPTP模型组中， 黑质致密部 TH阳性神经元的数量显著减少， 大约为正常对照组的 51%， 说明 MPTP导致黑质内多巴胺能神经元的大量丢失。 MPTP+IL-22 40 μ g/kg组 中， 黑质内 TH阳性多巴胺神经元大约为正常对照组的 80%， MPTP+IL-22-D 100 g/kg组中， 黑质内 TH阳性多巴胺神经元大约为正常对照组的 86%。
可见， IL-22、 IL-22二聚体对 MPTP诱导的多巴胺能神经元的大量丢失有保护 作用（IL-22二聚体的保护作用更为显著）， 从而对 MPTP诱导的帕金森疾病模型小鼠 脑多巴胺神经元的退行性病变具有治疗作用。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

  1. 权 利 要 求
    1. 一种白介素 -22或其二聚体或多聚体的用途， 其特征在于， 用于制备治疗和预 防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物。
    2. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的神经损伤疾病选自： 中风、 脊 柱损伤和伴有血脑屏障损伤的神经系统疾病；
    所述神经退行性疾病选自： 帕金森氏病、 阿尔茨海默氏病、 亨廷顿舞蹈病、 肌萎 缩侧索硬化病、 脊髓肌萎缩病、 原发性侧索硬化病、 或脊髓小脑共济失调。
    3. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的白介素 -22的二聚体是式 I所示 的白介素 -22的二聚体，
    M1-L-M2 式 I
    式中，
    Ml是白介素 -22的第一单体；
    M2是白介素 -22的第二单体；
    L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一 起的接头元件，
    其中，所述的白介素 -22二聚体保持了白介素 22的生物活性， 并且其血清半衰期是 所述第一单体或第二单体的血清半衰期的 2倍以上。
    4. 如权利要求 3所述的用途， 其特征在于， 所述的接头元件 L选自下组：
    (i) 3-50个氨基酸的短肽；
    (ϋ) 式 II所示的多肽元件：
    -Z-Y-Z- 式 II
    式中，
    Y为载体蛋白；
    Z为无、 或 1-30个氨基酸的短肽；
    "-"为化学键或共价键。
    5. 如权利要求 3所述的用途， 其特征在于， 所述的第一单体和第二单体是相同的。
    6. 如权利要求 3所述的用途， 其特征在于， 所述的生物活性是选自下组的一种或 多种活性：
    (a) 在体外激活神经元细胞 STAT3;
    (b) 在体内脑缺血性损伤后， 能保护神经元， 减少脑梗死体积；
    (c) 在体外激活多巴胺能神经元细胞 STAT3或海马神经元细胞 STAT3;
    (d) 在体内能显著抑制 PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失；
    (e) 在体内能显著减少 AD模型动物海马区神经元细胞的凋亡。 7. 如权利要求 4所述的用途， 其特征在于， 所述的载体蛋白是白蛋白或人 IgG的 Fc 片段。
    8. 如权利要求 4所述的用途，其特征在于，所述二聚体是由氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2-5所示的单体所构成的二聚体。
    9. 一种白介素 -22的二聚体， 其特征在于， 所述二聚体的结构如式 I所示的白介 素 -22的二聚体，
    M1-L-M2 式 I
    式中，
    Ml是白介素 -22的第一单体；
    M2是白介素 -22的第二单体；
    L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一 起的接头元件，
    其中，所述的白介素 -22二聚体保持了白介素 22的生物活性， 并且其血清半衰期是 所述第一单体或第二单体的血清半衰期的 2倍以上。
    10. 一种可用于治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物组合物， 其特 征在于， 所述药物含有药学上可接受的载体以及式 I所示的白介素 -22的二聚体，
    M1-L-M2 式 I
    式中，
    Ml是白介素 -22的第一单体；
    M2是白介素 -22的第二单体；
    L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一 起的接头元件，
    其中，所述的白介素 -22二聚体保持了白介素 22的生物活性， 并且其血清半衰期是 所述第一单体或第二单体的血清半衰期的 2倍以上。
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