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CN104053632A - 用于处理生物膜的组合物及方法 - Google Patents

用于处理生物膜的组合物及方法 Download PDF

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CN104053632A
CN104053632A CN201280052627.0A CN201280052627A CN104053632A CN 104053632 A CN104053632 A CN 104053632A CN 201280052627 A CN201280052627 A CN 201280052627A CN 104053632 A CN104053632 A CN 104053632A
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acid
amino acid
thps
substrate
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CN201280052627.0A
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T.古
D.徐
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Ohio University
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Ohio University
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Abstract

本发明提供用于处理基底上的生物膜形成和生长的组合物和方法。所述组合物包含1ppb-1,000ppm的至少一种D-氨基酸和1ppm-60,000ppm的至少一种抗微生物剂。所述方法包括使所述基底与1ppb-1,000ppm的至少一种D-氨基酸和1ppm-60,000ppm的至少一种抗微生物剂接触。所述组合物和方法有效用于预防、减少或消除生物膜形成或生物膜生长或二者，以及根除已建立的顽固生物膜，特别是包含硫酸盐还原菌的生物膜，已知硫酸盐还原菌导致受微生物影响的腐蚀、生物污着或二者。

Description

用于处理生物膜的组合物及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2011年8月26日提交的美国临时专利申请号61/527,941的优先权和权益，所述申请的内容通过引用结合到本文中。
发明背景
受微生物影响的腐蚀(MIC)为油气工业以及诸如水业等其它工业中的严重问题。常常发现硫酸盐还原菌(SRB)生物膜为MIC点蚀攻击的主要原因。已发现因SRB所致的点状腐蚀为管道失效的原因。MIC点蚀被认为是2006年Alaska输油管泄漏的主要嫌疑。亦已发现产酸细菌和其它微生物促成MIC。
此外，因微生物尤其是呈生物膜形式的微生物的生物污着，为诸如油气、水业、发电厂(尤其是冷却系统，例如冷水系统和冷却塔)以及淡水和咸水航运等许多工业中的主要问题。与相同微生物的浮游细胞相比，生物膜中的微生物远更难以处理。一个具体类型的生物污着为储罐变酸，其常常为SRB产生的生物源性H2S的结果。尽管用于SRB的现行处理部分有效，但是SRB非常易于复原，因为在地下岩土表面上形成的生物膜中的固着SRB非常难以根除。在页岩油气开采中，因微生物的生物污着可堵塞岩土孔，导致油气流量减少。此外，生物污着在膜过滤过程中尤其棘手。所述生物膜在膜上形成和生长，降低通量并缩短膜寿命。此外，生物污着亦为诸如在厨房和浴室等常见家务中的问题。在生物污着的情况下，与处理仅具有浮游细胞的系统相比，生物膜的顽固使其远更难以处理。遗憾的是，绝大多数的微生物偏好于组织为生物膜群落。
包括管线清扫在内的机械清洁和抗微生物剂处理为用于减轻生物膜作用的常见方法。因其广谱而卓越的生物降解能力所致，广泛使用非氧化性抗微生物剂四羟甲基硫酸膦(THPS)。这类抗微生物剂通常有效用于处理浮游细胞。
然而，不论其为腐蚀性的或者仅导致污着，生物膜中的固着细胞比浮游细胞远更难以处理，因为所述生物膜提供免受抗菌剂和其它不利环境影响的良好保护。事实上，根除已建立的生物膜中的固着细胞所需的抗微生物剂剂量常常为根除浮游细胞所需剂量的十倍或更多倍。
发明概述
本文提供用于处理基底上的生物膜形成和生长的组合物和方法。所述组合物和方法有效用于减少或消除生物膜形成或生物膜生长或二者，以及根除已建立的顽固生物膜。在某些实施方案中，所述生物膜包含已知导致MIC、生物污着或二者的硫酸盐还原菌。
在第一个实施方案中，提供用于处理基底上的生物膜形成和生长的组合物。所述组合物包含1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸和1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂。
在第二个实施方案中，提供用于处理基底上的生物膜形成和生长的方法。所述方法包括使所述基底与1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸和1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂接触。
附图简述
并入本说明书且构成本说明书的部分的附图，阐述了本发明的一些实施方案，并连同描述，用于解释本发明的原理。
图 1显示用以下物质处理7天的使用ATCC 1249培养基的普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris，ATCC 7757，常见SRB菌株)培养物中的7天检查片的SEM (扫描电镜)图像：(A) 100 ppm THPS；(B) 500 ppm D-甲硫氨酸；和(C) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 2显示在使用以下物质处理3天之前覆盖有已建立的生物膜的ATCC 1249培养基中的检查片的SEM图像：(A) 500 ppm THPS；(B) 1,000 ppm D-甲硫氨酸；和(C) 50ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。圆圈指示SRB固着细胞位置。)
图 3显示在1/4强度ATCC 1249培养基中使用以下物质处理之前的覆盖有已建立的生物膜的检查片的SEM图像：(A) 50 ppm THPS；和(B) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸。(用于小插图的比例尺为500 μm。)
图 4显示经过使用以下物质的3-h冲击处理之后的检查片(最初覆盖有已建立的生物膜)的SEM图像：(A) 除氧水；(B) 50 ppm THPS；(C) 500 ppm D-甲硫氨酸处理；和(D) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 5显示经过分别使用以下物质的3-h冲击处理之后的检查片(最初覆盖有已建立的生物膜)的SEM图像：(A) 50 ppm THPS；(B) 500 ppm D-甲硫氨酸；(C) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸；(D) 50 ppm THPS + 100 ppm L­-甲硫氨酸；(E) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸 + 1,000 ppm D-丙氨酸；和(F) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸 + 100 ppm L-甲硫氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 6显示生物膜去除之后的检查片表面的SEM图像。在使用以下物质处理之后7天自ATCC 1249 培养基中获得检查片：(A) 50 ppm THPS；(B) 500 ppm D-甲硫氨酸；和(C) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 7用图表表示在减轻碳硬合金检查片的MIC点蚀中不同处理方法的失重数据。
图 8显示在生物膜预防试验中用以下物质处理的使用ATCC 1249培养基的SRB培养物中的7天检查片的SEM图像：(A) 10 ppm D-酪氨酸；和(B) 50 ppm THPS + 10 ppm D-酪氨酸。(C)显示使用与(A)相同处理的点蚀图像，和(D)显示使用与(B)相同处理的点蚀图像。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 9显示在使用以下物质处理之后7天的ATCC 1249培养基中的检查片(最初覆盖有预先建立的SRB生物膜)的SEM图像：(A) 100 ppm D-酪氨酸；和(B) 50ppm THPS + 10 ppm D-酪氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 10显示用以下物质处理的使用ATCC 1249培养基的SRB培养物中的7天检查片的SEM图像：(A) 100 ppm D-色氨酸；和(B) 50 ppm THPS + 100 ppm D-色氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 11显示分别使用以下物质处理之后7天的ATCC 1249培养基中的检查片(最初覆盖有预先建立的SRB生物膜)的SEM图像：(A)对照(未向培养基中加入处理化学品)；(B) 30 ppm THPS；(C) 30 ppm THPS + 500 ppm十二烷基硫酸钠(SDS)；和(D) 30 ppm THPS + 500 ppm SDS + 6.6 ppm D-氨基酸混合物。(用于小插图的比例尺为50 μm。所述D-氨基酸混合物含有等摩尔的D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸。)
图 12显示分别使用以下物质处理的ATCC 1249培养基中的SRB培养物的7天检查片的SEM图像：(A)对照(未向培养基中加入处理化学品)；(B) 100 ppm THPS；(C) 100 ppm D-酪氨酸；和(D) 50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 13显示经过分别使用以下物质的1-h冲击处理之后的检查片(最初覆盖有成熟的SRB生物膜)的SEM图像：(A)含有与全强度培养基相同浓度的MgSO4和(NH4)2Fe(SO4)2的溶液(对照)；(B) 50 ppm TPHS；(C) 100 ppm D-酪氨酸；(D) 30 ppm TPHS + 1 ppm D-酪氨酸；(E) 50 ppm TPHS + 1 ppm D-酪氨酸。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
图 14显示经过使用50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸 + 1,000 ppm D-丙氨酸的3-h冲击处理之后的检查片(最初覆盖有成熟的SRB生物膜)的SEM图像。(用于小插图的比例尺为50 μm。)
发明详述
用于处理基底上的生物膜形成和生长的本文公开的组合物和方法，现将通过参考一些更详细的实施方案和偶尔参考附图来阐述。然而，这些组合物和方法可以不同的形式体现并且不应理解为限于本文所述的实施方案。更确切地说，提供这些实施方案，使得本公开内容为透彻且完整的，并将所述组合物和方法的范围完全传达给本领域技术人员。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与这些组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。用于描述本文的组合物和方法的术语仅用于阐述具体的实施方案并且不意图其为限制。除非文段另有明确指示，否则意图用于本说明书和随附权利要求的单数形式“一”、“一个”和“所述”，亦包含复数形式。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体结合。
除非另有指示，否则本说明书和权利要求中所用的表达成分的量、反应条件等的所有数字均应理解为在所有情况下经术语“大约”修饰。因此，除非指出并非如此，否则以下说明书和随附权利要求中所述的数值参数均为近似值，其可根据通过本发明组合物和方法力图获得的所需特性而不同。至少以及不试图限制对权利要求的范围应用等同原则，应按照有效位数和常规舍入法理解各数值参数。
尽管陈述所述组合物和方法的宽广范围的数值范围和参数为近似值，但是尽可能精确地报道具体实施例中所述的数值。然而，任何数值固有地包含某些误差，所述误差必然由存在于其各自试验测定值中的标准差引起。本说明书各处给出的各数值范围，包含落入所述更宽的数值范围内的各个更窄的数值范围，如同所述更窄的数值范围均明确地写入本文中。
除非另有规定，否则本文所用的术语“受微生物影响的腐蚀”或“MIC”是指其中系统的任何要素因微生物群体的至少一个成员的作用所致而在结构上受损的过程。
除非另有规定，否则本文所用的术语“部分涂覆的”应意指任何部分或全部的基底表面被生物膜覆盖。
本文所用的术语“基底”是指其上细胞可附着以及生物膜可形成和生长的任何类型的表面。所述基底可以是诸如油或气管道系统等“工业”基底，或者诸如厨房柜台或淋浴器等“非工业”基底。
除非另有规定，否则本文所用的术语“生物膜”是指其中细胞粘附邻近细胞或粘附于基底表面或二者的微生物聚集物。这些邻近细胞时常嵌入常常由蛋白质和多糖组成的聚合物质的自产胞外基质中。生物膜中的微生物细胞在生理上不同于同种生物的浮游细胞，相比之下所述浮游细胞为可通过流体泳动或浮动的单细胞。
除非另有规定，否则本文所用的术语“处理”或“处置”意指抑制、减轻、消毒、破坏、消除、减少、根除、杀死、防止、去除、降解、阻抑、延缓或其组合。
除非另有规定，否则本文所用的术语“金属”和“金属合金”分别是指任何元素金属或由元素金属组成的合金(例如黄铜、青铜和钢)。金属和金属合金产品的实例包括但不限于管道、下部结构、梁、护板、装配式结构、水下结构、储藏容器(例如水塔、储罐等)、军事设施和结构以及军事装备(例如潜艇和船)。
除非另有规定，否则本文所用的术语“水溶液”是指其中溶剂为水的溶液，包括但不限于含盐(例如硫酸镁(MgSO4)、柠檬酸钠、硫酸钙(CaSO4)、氯化铵(NH4Cl)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、乳酸钠(NaC3H5O3)和硫酸铁(II)铵Fe(NH4)2(SO4)2)的水；海洋或海水；半咸水；淡水水源，包括湖、河、溪、泥塘、池塘、沼泽、来自雪或冰融化的径流；泉、地下水和含水层；以及降水。
除非另有规定，否则本文所用的术语“油”是指在环境温度下为液体以及为疏水的但可溶于有机溶剂的任何物质，包括但不限于己烷、苯、甲苯、氯仿和二乙醚。包含在上述定义的范围之内的化合物种类包括植物油、石化石油(例如未加工和精炼的石化产品)、挥发性精油(即来自植物的芳香化合物)以及油/水混合物。
除非另有规定，否则本文所用的术语“燃料”是指储存能量的任何物质，包括化石燃料、汽油、烃类化合物的混合物、喷气燃料和火箭燃料、生物燃料和燃料/水混合物。
除非另有规定，否则本文所用的术语“微生物”应意指能够直接或间接定殖、导致受微生物影响的腐蚀或二者的任何和所有微生物。通常在油气工业中定殖管道并对管道造成损害的微生物的实例包括但不限于肠杆菌属(Enterobacter)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)细菌(例如溶解肠杆菌(E. dissolvens)、路德维希肠杆菌(E. ludwigii)、法氏柠檬酸杆菌(C. farmeri)和无丙二酸柠檬酸杆菌(C. amalonaticus))；真细菌属(Eubacterium)和梭菌属(Clostridium)细菌(例如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、解木素梭菌(Clostridium algidixylanolyticum)、Anaeorfilum pentosovorans、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、不动杆菌属(Acinebacter sp.)、丙酸菌属(Propionibacterium sp.))；硫酸盐还原菌，包括但不限于脱硫弧菌目(Desulfovibrionales) (例如脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)、普通脱硫弧菌、嗜氨脱硫弧菌(Desulfovibrio aminophilus))；硝酸盐还原菌；亚硝酸盐还原菌；脱硫菌目(Desulfobacterales)和互营杆菌目(Syntrophobacterales)；硫代硫酸盐还原厌氧菌(例如Geotoga aestuarianis、刚果盐厌氧菌(Halanaerobium congolense)、硫磺单胞菌属(Sulfurospirillum sp.))，四氯乙烯降解厌氧菌(例如卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata))；三乙醇胺降解菌(例如醋酸杆菌属(Acetobacterium sp.))；反硝化菌(例如食酸菌属(Acidovorax sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.))；木聚糖降解菌；硝化螺旋菌门(Nitrospirae)；盐单胞菌属(Halomonas spp.)；海源菌属(Idiomarina spp.)；Marinobacter aquaeolei；海旋菌属(Thalassospira sp.)；硅杆菌属(Silicibacter sp.)；色盐杆菌属(Chromohalobacter sp.)；芽孢杆菌(Bacilli) (例如芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、微小杆菌属(Exiguobacterium spp.))；反硝化丛毛单胞菌(Comamonas denitrijicans)；甲烷杆菌目；甲烷微菌目；甲烷八叠球菌目。通常在其它工业中定殖管道并对管道造成损害的微生物的实例包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(“MRSA”)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粪肠球菌(Enterococcus fecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、曲霉(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和不动杆菌属(Acinobacter sp.)。
除非另有规定，否则本文所用的术语“抗微生物剂”是指可通过化学或生物方式杀死、阻抑、延缓、制止任何有害微生物、致使任何有害微生物无害或者对任何有害微生物施以控制作用的任何化学物质或微生物。
除非另有规定，否则本文所用的术语“D-氨基酸”是指任何及所有右旋氨基酸，包括但不限于19种天然存在的L-氨基酸的对映体；包括D-精氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酰胺、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸和D-色氨酸。
除非另有规定，否则本文所用的术语“鸡尾酒混合物”是指至少一种D-氨基酸和至少一种抗微生物剂的组合。
在本公开内容的第一个实施方案中，提供用于处理基底上的生物膜形成和生长的组合物。所述组合物包含1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸和1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂。所述组合物有效用于减少或消除生物膜形成或生物膜生长或二者，以及根除已建立的顽固生物膜，例如包含硫酸盐还原菌(SRB)的生物膜。如前所述，已知包含SRB的生物膜导致MIC、生物污着或二者。
在本公开内容的第二个实施方案中，提供用于处理基底上的生物膜形成和生长的方法。所述方法包括使所述基底与1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸和1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂接触。所述方法可以多种方式实施并且有效用于减少或阻止生物膜形成或生物膜生长或二者，以及根除已建立的顽固生物膜，例如包含SRB的生物膜，所述SRB可导致MIC、生物污着或二者。
除非从文段中明确或另有规定，否则本说明各处所用的单位ppm (百万分之(几))和ppb (十亿分之(几))基于质量(w/w)。例如，1 ppm抗微生物剂溶液会含有1 mg抗微生物剂/kg溶液。
如在下文实施例中所示，使用至少一种D-氨基酸和至少一种抗微生物剂的组合处理生物膜表现出意想不到的协同作用。所有细菌细胞壁(不包括诸如产甲烷菌等古生菌或诸如真菌等真核生物的细胞壁)均含有肽聚糖，其包含一种或多种D-氨基酸，例如D-丙氨酸。不希望受任何具体理论束缚，认为用于本文公开的组合物和方法的D-氨基酸代替肽聚糖中的D-丙氨酸，这导致生物膜发送分散信号。此分散信号导致所述生物膜解体以及所述生物膜中的微生物细胞恢复成浮游形式。当微生物细胞呈浮游形式时，与固着细胞相比其更加响应于抗微生物剂处理。然而，使用普通脱硫弧菌(D. vulgaris)生物膜生成的数据表明，除非存在对生物膜的额外的抗微生物剂应力，否则所述分散信号无效。这是因为普通脱硫弧菌生物膜相对顽固。此外，D-氨基酸不能靶定古生菌和真核生物的细胞壁，因为这些生物不含肽聚糖。然而，至少一种D-氨基酸和至少一种抗微生物剂的组合对于处理含这些生物的现场生物膜聚生体仍有用，因为细菌细胞很可能存在于所述生物膜聚生体中。所述至少一种D-氨基酸可靶定生物膜中的细菌细胞，这可减弱所述生物膜的完整性，从而使所述至少一种抗微生物剂更有效。
在所述组合物和方法的某些实施方案中，所述至少一种D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸、D-精氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酰胺、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸、非标准D-氨基酸及其组合。如上所述，所述至少一种D-氨基酸以1 ppb-1,000 ppm存在，包括10 ppb-900 ppm、包括100 ppb-500 ppm、包括1 ppm-100 ppm以及亦包括30 ppm-70 ppm。
在所述组合物和方法的某些实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为两种、三种、四种或更多种D-氨基酸的混合物。在一个实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸的D-氨基酸混合物。例如，在某些实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为含有等摩尔量的D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D­色氨酸和D-亮氨酸的6.6 ppb-6.6 ppm D-氨基酸混合物(6.6 ppb对应于各D-氨基酸在混合物中10 nM的浓度，而6.6 ppm对应于各D-氨基酸在混合物中10 mM的浓度)。在某些其它实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为含有等摩尔量的D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D­色氨酸和D-亮氨酸的6.6 ppb100 ppm D-氨基酸混合物。在本公开内容组合物和方法的又某些其它实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为包含D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸的100 ppb-100 ppm D-氨基酸混合物。在使用D-氨基酸混合物的所述组合物和方法的某些其它实施方案中，以等摩尔量提供所述D-氨基酸。
在所述组合物和方法的某些其它实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为D-酪氨酸。例如，在所述组合物和方法的某些实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为100 ppb-100 ppm D-酪氨酸，包括1 ppm-90 ppm D-酪氨酸、包括20 ppm-80 ppm D-酪氨酸以及亦包括30 ppm-60 ppm D-酪氨酸。在所述组合物和方法的再其它实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为D-甲硫氨酸。例如，在所述组合物和方法的一个示例性实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为100 ppb-100 ppm D-甲硫氨酸，包括1 ppm-90 ppm D-甲硫氨酸、包括20 ppm-80 ppm D-甲硫氨酸以及亦包括30 ppm-60 ppm D-甲硫氨酸。
在所述组合物和方法的其它实施方案中，所述至少一种D-氨基酸为非标准氨基酸。例如，在所述组合物和方法的某些实施方案中，所述非标准D-氨基酸选自肉碱、γ-氨基丁酸(GABA)、β-氨基酸、γ-氨基酸、羟丁赖氨酸、硒代半胱氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、脱氢丙苯氨酸、磷酸酪氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、3-氨基丙酸、泛酸(panthothenic acid)、牛磺酸、吡咯赖氨酸、5-羟色氨酸(5-HTP)、二羟丙苯氨酸(DOPA)及其组合。本领域技术人员已知的其它非标准D-氨基酸可用于本文所公开的第一和第二个实施方案。
如上所述，本文所公开的组合物和方法利用对处理生物膜发现的至少一种D-氨基酸和至少一种抗微生物剂之间的协同作用。所述至少一种抗微生物剂可以是表现出生物杀伤或抗微生物特性的各种物质的任一种。例如，在本文所公开的组合物和方法的某些实施方案中，所述至少一种抗微生物剂选自四羟甲基硫酸膦(THPS)、戊二醛、一氧化氯、二氧化氯、次氯酸钙、次氯酸钾、次氯酸钠、二溴基次氮基丙酰胺(DBNPA)、亚甲基二(硫氰酸盐) (MBT)、2-(硫代氰基甲硫基)苯并噻唑(TCMTB)、溴硝丙二醇、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇(BNPD)、三丁基十四烷基氯化膦(TTPC)、牛磺酰胺(taurinamide)及其衍生物、酚类、季铵盐、含氯作用剂、喹哪啶盐、内酯类、有机染料、缩氨硫脲类、醌类、氨甲酸酯类、尿素、水杨酰胺、均二苯脲、胍(guanide)、脒类、咪唑啉类、醋酸、苯甲酸、山梨酸、丙酸、硼酸、脱氢醋酸、亚硫酸、香草酸、对羟基苯甲酸酯、异丙醇、丙二醇、苯甲醇、氯丁醇、苯乙醇、甲醛、碘及其溶液、聚维酮碘、六亚甲基四胺、羟甲硫脲、1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮氯化金刚烷、牛磺罗定、氧氢噻二嗪、N-(5-硝基-2-亚糠基)-1-氨基-乙内酰脲、5-硝基-2-糠醛缩氨基脲、3,4,4’-三氯均二苯脲、3,4’,5-三溴水杨酰苯胺、3-三氟甲基-4,4’-二氯均二苯脲、8-羟基喹啉、1-环丙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉甲酸、1,4-二氢-1-乙基-6-氟-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉甲酸、过氧化氢、过乙酸、氧氯苯磺酸钠、对氯间二甲苯酚、2,4,4’-三氯-2’-羟基联苯酚、麝香草酚、氯己定、苯扎氯铵、西吡氯铵、磺胺嘧啶银、硝酸银、溴、臭氧、异噻唑酮、聚氧乙烯(二甲基亚氨基)亚乙基(二甲基亚氨基)二氯化乙烯、2-(叔丁基氨基)-4-氯代-6-乙氨基-均三嗪(特丁津)及其组合。
在本公开内容的组合物和方法的某些实施方案中，所述至少一种抗微生物剂为四羟甲基硫酸膦(THPS)。例如，在所述组合物和方法的一个示例性实施方案中，所述至少一种抗微生物剂为1 ppm-10,000 ppm THPS。在所述组合物和方法的某些其它实施方案中，所述至少一种抗微生物剂为5 ppm-5,000 ppm THPS，包括10 ppm-1,000 ppm THPS、包括20 ppm-500 ppm THPS、包括25 ppm-100 ppm THPS以及亦包括30 ppm-50 ppm THPS。
在本公开内容的组合物和方法的某些其它实施方案中，所述至少一种抗微生物剂为基于氯的抗微生物剂，包括但不限于一氧化氯、二氧化氯、次氯酸钠、次氯酸钙和次氯酸钾。例如，在所述组合物和方法的一个示例性实施方案中，所述至少一种抗微生物剂为100 ppm-60,000 ppm次氯酸钠。在所述组合物和方法的某些其它实施方案中，所述至少一种抗微生物剂为500 ppm-60,000 ppm次氯酸钠，包括1,000 ppm-60,000 ppm次氯酸钠、包括5,000 ppm-60,000 ppm次氯酸钠、包括10,000 ppm-60,000 ppm次氯酸钠以及亦包括30,000 ppm-60,000 ppm次氯酸钠。
在依照本文所公开的组合物和方法的第一和第二个实施方案的其它实施方案中，包括但不限于分散剂、表面活性剂及其组合的另外的化学添加剂可用于增强所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂的组合的功效。用于依照本公开内容的组合物和方法的示例性表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，亦称为月桂基硫酸钠。在所述组合物和方法的某些实施方案中，将100 ppm-1,000 ppm SDS与所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂组合使用，包括200 ppm-800 ppm SDS、包括400 ppm-600 ppm SDS以及亦包括500 ppm SDS。用于依照本公开内容的组合物和方法的某些实施方案的另外的表面活性剂包括但不限于辛基硫酸钠、癸基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸盐(odecyl benzene sulfonate)、双十二烷基苄基三乙基氯化铵、氯化十六烷基吡啶、烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、溴化正十二烷基吡啶、N,N,N-二甲基4-甲苄基十二烷基氯化铵、十二烷基硫酸铵、1,1(十二烷基酰胺基)丙基氯化铵、N,N-二(聚氧乙烯)氨基十二烷基酰胺、亚烷基-α,ω-双-(二甲基烷基溴化铵)、1,2-乙烷双-(二甲基十四烷基溴化铵)、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚、明胶、十二烷基苯磺酸盐(DBS)、N-十二酰基-N-甲基甘氨酸、N-十二酰基-N-甲基牛磺酸或其组合。尽管仅明确公开另外的化学添加剂的少数实例，但是具有类似特性的其它添加剂亦可与本文所述的组合物和方法一起使用。
如前所述，以及依照本公开内容的第二个实施方案，用于处理基底上的生物膜形成和生长的方法包括使所述基底与1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸和1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂接触。在某些实施方案中，所述基底选自管道、储藏容器、井眼、船体、下部结构、梁、槽、桁材、护板、装配式结构、水下结构、地下岩层和地下土壤层。在某些其它实施方案中，所述基底由选自以下的物质形成：金属、金属合金、尼龙、复合材料、木材、塑料、玻璃、陶器、瓷器、漆面、岩石、土壤及其组合。在一个示例性实施方案中，所述基底为管道，例如用于输送油、天然气、水、燃料等的一根或多根管，其可易于形成生物膜。尽管已明确论述基底的数个实例，但本领域技术人员应理解的是，依照本公开内容的组合物和方法可在可易于形成生物膜的任何基底上使用。
依照本公开内容的方法可以多种方式实施。例如，在所述方法的某些实施方案中，将所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂独立且同时地加入接触或润湿所述基底的基质中。在某些其它实施方案中，将所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂独立且序贯地加入接触或润湿所述基底的基质中。在再其它的实施方案中，所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂在单个溶液中，将该溶液加入接触或润湿所述基底的基质中。在所述方法的多个实施方案中，可将所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂通过一个或多个泵、重力进料系统加入基质中或者甚至直接倒入基质中。本领域技术人员应理解的是，用于向基质中添加所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂的其它方式为可得的并且可与本文公开的方法一起使用。
在本文公开的方法的某些实施方案中，所述基质可以是已知利于生物膜的形成和生长的几乎任何基质。例如，在某些实施方案中，所述基质选自油、水溶液、水力压裂液、燃料、二氧化碳、天然气、油/水混合物、燃料/水混合物或组合。在某些其它实施方案中，所述基质选自其中溶剂如下的溶液：水、含盐的水、海洋或海水、半咸水、淡水水源、湖、河、溪、泥塘、池塘、沼泽、来自雪或冰融化的径流、泉、地下水、含水层、降水、在环境温度下为液体以及为疏水的但溶于有机溶剂的任何物质、己烷、苯、甲苯、氯仿、二乙醚、相关的有机化合物、植物油、石化油、原油、精炼的石化产品、挥发性精油、储存能量的任何物质、化石燃料、汽油、烃类混合物、喷气燃料和火箭燃料、生物燃料及其组合。在一个示例性实施方案中，所述基质为油/水混合物。
在依照第一和第二个实施方案的某些实施方案中，所述基底为地下岩层或地下土壤层并且所述基质为水力压裂液。水力压裂液用于页岩油气开采的水力压裂过程。生物膜在地下岩层和地下土壤层之上和之中生长并堵塞岩土孔，这减少油气的流量。1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸和1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂的组合对于在页岩油气开采中处理由存在于地下岩层或地下土壤层中的生物膜引起的生物污着而言为有用的。
如上所简单论述，本文所公开的组合物和方法有效用于减少或阻止生物膜形成或生物膜生长或二者，以及根除已建立的顽固生物膜，例如包含可导致MIC、生物污着或二者的SRB的生物膜。认为所述功效是因所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂之间的协同作用所致。如将在实施例中证实，对于处理生物膜形成或生长或者对于根除已建立的顽固生物膜而言，仅使用高浓度的至少一种D-氨基酸的处理不如所述至少一种D-氨基酸和至少一种抗微生物剂的组合有效。类似地，对于处理生物膜形成或生长或者对于根除已建立的顽固生物膜而言，仅使用高浓度的至少一种抗微生物剂的处理不如所述至少一种D-氨基酸和至少一种抗微生物剂的组合有效。此外，所述至少一种D-氨基酸和至少一种抗微生物剂的组合允许减少达到有效生物膜处理结果所需的所述至少一种抗微生物剂的剂量。因此，本文公开的组合物和方法通过减少处理生物膜所需的抗微生物剂的量来提供资本节约，并且减少所述抗微生物剂的环境暴露。
实施例
下列实施例阐述了依照本文所公开的第一和第二个实施方案的组合物和方法的某些实施方案或特征。给出所述实施例仅用于说明的目的而并非理解为本公开内容的限制，因为在不背离本公开内容的精神和范围的情况下，所述实施例的许多变化为可能的。
实施例 1
实施例1阐述了依照本公开内容的用于处理生物膜的组合物和方法的某些实施方案。
材料和方法
细菌、培养基和化学品
在ATCC 1249培养基中培养实验室SRB菌株普通脱硫弧菌(ATCC 7757)。亦使用仅含4种主要成分(即MgSO4、乳酸钠、Fe(NH4)2(SO4)2和酵母提取物)的四分之一强度培养基模拟低营养环境，所述主要成分的浓度为在完全ATCC 1249培养基中的浓度的1/4。D-甲硫氨酸和THPS获自Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA。临用前将10,000 ppm THPS的储藏液调至中性pH，因为未调节的溶液为相当酸性的并且其自身可导致腐蚀。THPS应用所推荐的pH介于6-8之间。将THPS溶液pH调至接近中性pH并不罕见。将SRB培养基在高压灭菌器中灭菌并随后使用N2 (已过滤除菌)喷射除氧。使用SRB试剂盒(Sani­Check®产品号100, Biosan Laboratories, Warren, MI, USA)对SRB细胞计数。对于高效抗微生物剂系统，残留SRB细胞计数远低于在400X放大倍数的显微镜下直接计数的5×104个细胞/ml检出限，需要所述显微镜观察活动的非常小的普通脱硫弧菌细胞。低于此细胞计数，则难以在光学显微镜下捕捉单个细胞。最可能数(MPN)计数法为估算非常低的细胞计数的标准方法。MPN通过首先培养细胞并将细胞计数与黑色的出现(因SRB产生的FeS所致)相关联而成功。与使用平板培养物的SRB菌落计数(其对非常低的细胞计数不起作用)相比，这远更灵敏和可靠。用于此实施例的SRB试剂盒等同于使用固体培养基代替液体培养基的MPN法。
用于生物膜生长的基底
用于此实施例的厌氧瓶为125 ml (目录号223748, Wheaton Industries Inc., 143 Millville, NJ, USA)，各自装有100 ml培养基。装有经过滤除菌的N2的手套箱提供缺氧环境。为了减少任何可能的氧气泄漏，向培养基中加入100 ppm除氧剂L-半胱氨酸(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)。逐步用200、400和600砂砾砂纸打磨具有1.12 cm2的顶部圆盘表面积的薄盘状C1018碳钢检查片。仅将各检查片的顶面暴露给所述培养基。用惰性特氟隆覆盖剩余的表面。打磨之后，对所述检查片称重。使用异丙醇清洁所述检查片并随后在UV光下干燥15分钟。
生物膜建立的预防
向各厌氧瓶中加入三个重复检查片和1 ml的3天龄SRB种子培养物。刚接种后的各瓶中的初始SRB细胞浓度为约106个细胞/ml。在于接种后加入处理化学品之后，将瓶密封并随后在37℃培养。在培养7天之后，在SEM下观察检查片表面上的生物膜。制备用于生物膜的SEM观察的检查片的程序由Wen等, Inter. Biodeter. Biodegr., (2009), 63:1102-1106阐述。生物膜覆盖的检查片的Au涂层对于SEM而言为必需的，因为所述生物膜不导电。在筛选三个重复检查片之后，对具有最多固着细胞的点获取SEM图像。将特定的对照检查片插入含未经抗微生物剂处理的培养基的瓶中并在无接种的情况下培养。如果发生氧气泄漏，则此非生物对照会显示黄锈。亦在SEM下对其表面针对可能的微生物污染扫描固着细胞。在SEM下观察生物膜期间，亦仔细鉴定看上去不同于普通脱硫弧菌的固着细胞，其可显示微生物污染。
为了获得检查片表面上的平均固着细胞密度，首先将所述固着细胞从重复检查片的表面刮至SRB试剂盒的刷状浸量尺上，使用无菌镊子操作。在刮取之前用除氧水润湿浸量尺。通过浸量尺收集大部分固着细胞。然后将所述检查片置于含1 ml除氧水的试管中并在超声波浴中超声处理30秒以去除检查片表面的任何残留的固着细胞。将浸量尺放入仍含检查片在内的试管中并将试管涡旋30秒以使细胞分散到液体中。使用镊子将浸量尺取回并插入含固体培养基的SRB试剂盒瓶中。基于供应商说明书，出现黑色所需的时间对应于特定的最小SRB浓度。15或30秒脉冲的超声处理为用于在不损害细胞的情况下从固体表面去除生物膜细胞的常见技术，以及在与涡旋组合时，所述方法用于增强生物膜定量。
已建立生物膜的去除
首先从厌氧瓶中的7天龄SRB培养物中获得覆盖有生物膜的检查片。取出检查片并用除氧蒸馏水漂洗以去除浮游细胞。将覆盖有生物膜的三个检查片置于含新鲜ATCC 1249培养基和处理化学品的各个新瓶中。将瓶密封并随后在37℃培养。在培养之后7天取出检查片并使用上述程序分析。亦通过使用不含营养物的抗微生物剂溶液将覆盖有生物膜的检查片处理3小时以模拟短期处理，来重复所述测试。
MIC 点蚀的缓解
重复使用在上文“生物膜建立的预防”中所用的用于SEM的检查片，观察使用Clark溶液去除其生物膜和Au涂层之后的MIC点蚀。检查片失重数据获自各瓶中的另一个重复检查片。在称重之前使用Clark溶液清洗检查片表面以去除生物膜和矿物沉积。对于具有1.12 cm2的暴露表面积的检查片，发现因清洗所致的金属失重少于0.02 mg，其对于此实施例中的失重计算为可忽略的。
结果和讨论
表1显示，与未处理的106个细胞/ cm2相比，30 ppm THPS对检查片表面上的固着细胞计数无影响，而100 ppm D-甲硫氨酸导致105个细胞/ cm2的固着细胞计数。当分别用30 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸、50 ppm THPS、50 ppm THPS + 10 ppm D-甲硫氨酸处理时，固着细胞计数为104个细胞/ cm2。表1亦表明，10 ppm D-甲硫氨酸未显著增强50 ppm THPS，因为二者均导致104个细胞/ cm2的相同固着细胞计数。然而，当50 ppm D-甲硫氨酸与50 ppm THPS组合时，固着细胞计数降为103个细胞/ cm2。将D-甲硫氨酸浓度进一步增加到100 ppm导致不可检出的固着细胞计数。这意味着包含50 ppm THPS和100 ppm D-甲硫氨酸的鸡尾酒混合物比单独100 ppm THPS远更有效，因为后者导致102个细胞/ cm2的固着细胞计数。所述二元抗微生物剂鸡尾酒混合物将固着细胞计数从大于106个细胞/ cm2 (未处理，即对照)减少到低于10个细胞/ cm2，表明5-log减少。
表 1.在使用不同处理方法抑制SRB生物膜建立7天之后的固着细胞计数。*
*所述测试重复三次。
图1中的SEM图像证实表1中的关键结果。其显示，使用单独的100 ppm THPS (图1A)、单独的500 ppm D-甲硫氨酸(图1B)处理的检查片在其表面具有固着SRB细胞。然而，当使用50 ppm THPS加100 ppm D-甲硫氨酸的组合处理检查片时，难以找到固着细胞(图1C)，表明使用二元抗微生物剂鸡尾酒混合物处理成功预防检查片表面上的SRB生物膜建立。
已建立 SRB 生物膜的去除
与使用抗微生物剂预防生物膜建立相比，当生物膜已建立时，其通常远更难以去除。图2A显示，在用500 ppm THPS处理7天之后，检查片表面上仍存在某些固着细胞。当单独使用1,000 ppm D-甲硫氨酸处理时，检查片表面上有大量的固着SRB细胞(图2B)，表明未抑制生物膜中的固着细胞。然而，当使用包含50 ppm THPS和100 ppm D-甲硫氨酸的二元抗微生物剂鸡尾酒混合物处理时，检查片表面上无显著的固着细胞(图2C)，表明成功去除了已建立的生物膜。此结果显示，所述协同的二元抗微生物剂鸡尾酒混合物在生物膜去除上远更优于即使为远更高浓度的其单个组分。图2A与图2C的比较表明，包含50 ppm THPS和100 ppm D-甲硫氨酸的二元抗微生物剂鸡尾酒混合物在去除生物膜方面比500 ppm THPS更有效。
为了模拟用于已建立SRB生物膜的较低营养环境，亦在抗微生物剂处理期间在1/4强度培养基中进行生物膜去除试验。以与先前对于全强度培养基所述的相同方式获得处理之前覆盖有生物膜的检查片。尽管使用1/4强度培养基这一事实，但是单独的50 ppm THPS仍为不足的，因为在图3A中可见许多固着SRB细胞。然而，当使用50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸抗微生物剂鸡尾酒混合物时，去除了所述生物膜(图3B)。
在一些现场应用中，去除局部介质并在无营养物的环境中使用抗微生物剂溶液处理已建立的生物膜。当其应用于管线时，将呈“冲击处理”形式的这一过程称为“栓塞处理(slug treatment)”。在此实施例中，通过在移取检查片进行检测之前将覆盖有生物膜的检查片浸入无培养基的抗微生物剂溶液中达3小时来重复上述试验。图4显示通过分别使用以下物质处理检查片获得的结果：(A)除氧蒸馏水(对照)；(B) 50 ppm THPS；(C) 100 ppm D-甲硫氨酸；和(D) 50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸。再次地，包含50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸的二元鸡尾酒混合物比单独的50 ppm THPS和单独的100 ppm D-甲硫氨酸远更有效。
可能的 D- 甲硫氨酸生物膜去除机制的探索
使用包括THPS、D-甲硫氨酸、D-丙氨酸和L-甲硫氨酸在内的处理化学品的不同组合进行3小时冲击处理试验的独立组。在这些试验中，以其在完全ATCC 1249培养基中的对应浓度的1/4向处理化学品中添加MgSO4和(NH4)2Fe(SO4)2，以减少在培养基转换期间对细胞的可能的不良渗透作用。图5C证实含有50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸的二元鸡尾酒混合物比单独的50 ppm THPS (图5A)和单独的500 ppm D-甲硫氨酸(图5B)远更有效。图5D显示，与图5A进行比较时，50 ppm THPS + 100 ppm L-甲硫氨酸(代替D-甲硫氨酸)未显著增强50 ppm THPS处理。这表明L-甲硫氨酸并非抗微生物剂增强剂。图5E显示，1,000 ppm D-丙氨酸的添加抑制包含50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸的二元抗微生物剂鸡尾酒混合物的功效。这很可能是因为溶液中高浓度的D-丙氨酸阻抑了D-甲硫氨酸取代细胞壁肽聚糖分子中的D-丙氨酸的能力。
图5F显示，L-甲硫氨酸的存在不会干扰包含50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸的二元鸡尾酒混合物的功效。这意味着可使用由化学合成制备的D/L-甲硫氨酸混合物代替更昂贵的D-甲硫氨酸以削减成本。
MIC 点蚀的缓解
图6显示不同处理方法在缓解MIC点蚀上的作用的比较。在生物膜和Au涂层去除之后重新检测用于图1的相同检查片。在SEM下，定位具有最大点蚀的区域并在图6中显示。图6A和6B显示，单独的50 ppm THPS和单独的500 ppm D-甲硫氨酸未阻止MIC点蚀，因为存在水平尺寸高达4 μm的点蚀。这与显示检查片表面上的固着SRB细胞的图1A和1B中的生物膜结果相符合。当使用包含50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸的抗生物剂鸡尾酒混合物时，不存在大的点蚀(图6C)。所述抗微生物剂鸡尾酒混合物的功效通过图7中显示的标准化失重数据进一步证实。其显示，与其它处理方法和未经任何化学处理的对照检查片相比，50 ppm THPS和100 ppm D-甲硫氨酸的鸡尾酒混合物处理得到0.45 mg/cm2的最小失重。与单独使用50 ppm THPS处理中平均0.65 mg/cm2的失重相比，50 ppm THPS + 100 ppm D-甲硫氨酸的二元组合导致0.45 mg/cm2的更小平均失重。
表2显示，单独的100 ppm D-甲硫氨酸未表现出对浮游SRB细胞计数的任何可测量影响，但与对照(106个细胞/cm2)相比其能够将固着细胞计数减少到105个细胞/cm2 (表1)。表2亦显示，与未经处理的108个细胞/ml相比，50 ppm THPS相当有效地将浮游SRB细胞计数减少到102个细胞/ml。然而，与50 ppm THPS处理相比，向所述50 ppm THPS抗微生物剂溶液中加入100 ppm D-甲硫氨酸未增强浮游SRB根除(表2)。这表明D-甲硫氨酸并非为生物杀伤的。
表 2.使用不同处理方法预防SRB生物膜建立7天之后的浮游细胞计数。*
*初始普通脱硫弧菌细胞浓度为106个细胞/ml以及将所述试验重复三次。
其它 D- 氨基酸的功效
图8显示，包含50 ppm THPS + 10 ppm D-酪氨酸的抗生物剂鸡尾酒混合物在防止SRB生物膜形成(图8B)和MIC点蚀(图8D)方面有效，而单独的10 ppm D-酪氨酸在防止SRB生物膜形成(图8A)或MIC点蚀(图8C)方面无效。包含50 ppm THPS + 10 ppm D-酪氨酸的鸡尾酒混合物在去除已建立的SRB生物膜方面亦有效，如图9所示。图10显示100 ppm D-色氨酸在防止检查片表面上的SRB生物膜形成方面无效，而包含50 ppm THPS + 100 ppm D-色氨酸的抗微生物剂鸡尾酒混合物则有效。类似地，表3中的固着细胞计数数据显示，包含50 ppm THPS + 100 ppm D-亮氨酸的抗微生物剂鸡尾酒混合物在防止生物膜形成方面有效。
表 3.使用不同处理方法预防检查片表面上的SRB生物膜建立7天之后的固着细胞计数。
如果存在多于一种D-氨基酸，则需要更低的D-氨基酸浓度。此外，诸如月桂基硫酸钠(亦称为十二烷基硫酸钠或SDS)等表面活性剂亦可改善所述功效。图11显示，包含30 ppm THPS + 500 ppm SDS + 6.6 ppm含等摩尔D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸的D-氨基酸混合物的抗微生物剂鸡尾酒混合物(图11D)在去除检查片表面上已建立的生物膜方面有效，而发现30 ppm THPS (图11B)和30 ppm THPS + 500 SDS (Figure 11C)均无效。
实施例 2
实施例2阐述了依照本公开内容的用于处理生物膜的组合物和方法的某些实施方案。
材料和方法
细菌和营养培养基
在此实施例中使用常见SRB菌株普通脱硫弧菌(ATCC 7757)。在接种之前，将培养基高压灭菌并随后用过滤除菌的氮气喷射至少45分钟以去除溶解氧。在装有100 ml培养基的125 ml厌氧瓶(目录号223748, Wheaton Industries Inc., Millville, NJ, USA)中进行SRB培养。在所述试验中，使用1 ml SRB种子培养物接种各厌氧瓶，以达到刚接种后106个细胞/ml的SRB浓度。使用含200 ppm Fe2+的全强度ATCC 1249培养基以在检查片表面上生长SRB生物膜。
化学品和生物膜生长基底
D-酪氨酸和THPS购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。为了避免因向培养基中添加THPS所致的酸度，配制10,000 ppm储藏THPS溶液。通过加入氢氧化钠溶液将其中和至pH 7.0。使用具有1.12 cm2的顶部暴露表面积的硬币状C1018碳钢检查片作为SRB生长的基底。用惰性特氟隆包被侧面和底面。通过200、400和600砂砾砂纸序贯打磨顶面。使用氮气喷射来去除所有液体中的溶解氧并提供手套箱中的缺氧环境。向培养基中加入100 ppm L-半胱氨酸(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)作为除氧剂，以减轻任何可能的氧气泄漏。
SRB 生物膜建立的预防
为了测试检查片表面上生物膜建立的预防，向各瓶中加入三个检查片连同100 ml全强度培养基、THPS和D-酪氨酸。在试验开始时加入一毫升的SRB种子培养物，将瓶密封并在无振荡的情况下于37℃培养。7天之后，取出检查片并检测固着SRB细胞。
已建立 SRB 生物膜的去除
首先使用全强度ATCC 1249培养基在检查片表面上生长SRB生物膜。在37℃培养3天之后，检查片覆盖有成熟的SRB生物膜。在厌氧室中，取出检查片并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液漂洗以去除松散的浮游细胞。然后将检查片放入含处理化学品的水溶液的培养皿中。将某些检查片处理1 h以及某些处理3 h。这分别模拟接触时间持续1和3 h的栓塞处理，如同抗微生物剂栓塞流入管线内的情况。在此未考虑流动效应。将检查片上的SRB细胞从ATCC 1249培养基中暴露给缺乏盐离子的水溶液可能引起渗透性冲击，其可干扰抗微生物剂功效评价。代替使用常用于细胞培养物的PBS缓冲液的是，向所述1 h和3 h处理液中以其在全强度ATCC 1249培养基中的相应浓度的1/4添加初始培养基中的两种盐MgSO4和(NH4)2Fe(SO4)2。然后移出经处理的检查片并检测固着SRB细胞。在此使用稀释的培养基以模拟在现场处理期间当主体管线或槽罐流体替换成抗微生物剂溶液时由局部生物膜保留的残留营养物。
用于生物膜观察的 SEM
Wen等, Inter. Biodeter. Biodegr.,(2009), 63:1102-1106阐述了制备用于SEM观察检查片表面上的生物膜的检查片的程序。固着细胞相当不均匀地分布在经THPS和D-酪氨酸处理的检查片上。因此，在搜索具有最多固着细胞的斑点之后获取SEM图像。因不均匀分布所致，SEM图像中看到的细胞不应用于计数固着细胞。而是使用最可能数(MPN)法计数固着细胞。SEM图像可用作生物膜去除的定性目视确认。
固着细胞的计数
在400X光学显微镜下，活的普通脱硫弧菌细胞可显示为活动细胞。因此，其可使用血球计数器计数。然而，此方法在400X放大倍数下具有5 × 104个细胞/ml最小量的检出限。标准惯例是使用液体培养基或固体培养基利用半定量最可能数(MPN)法来计数非常低的细胞计数。MPN的精确度通常为细胞数量上的1-log。因此，需要至少2-log减少来保证抗微生物剂系统的功效。在此实施例中，通过使用作为SRB试剂盒(Sani-Check®产品号100，来自Biosan Laboratories, Warren, MI, USA)的部分的刷状浸量尺刮取检查片上的固着细胞并收集到试管中。然后将浸量尺浸入10 ml无菌蒸馏水中并涡旋30 s。最后，将浸量尺插入含固体SRB培养基的所述试剂盒的瓶中。SRB固着细胞浓度是基于浸量尺周围的培养基中出现黑色(FeS)所耗费的时长。将所述试验独立重复三次。每次将两个检查片用于固着SRB细胞计数。
结果和讨论
SRB 生物膜建立的预防
表4显示，对于未处理的检查片(对照)，7天之后在检查片表面上有多于107个SRB细胞/cm2，而单独的100 ppm THPS获得SRB固着细胞的5-log (即105)的减少或99.999%杀伤。这意味着100 ppm THPS未完全防止SRB生物膜建立，因为仍有102个SRB细胞/cm2。单独的100 ppm D-酪氨酸获得仅1-log减少，允许106个SRB细胞/cm2留在检查片表面，表明在没有THPS的情况下使用D-酪氨酸时，其分散固着SRB细胞的能力非常有限。50 ppm THPS亦为不足的，因为在检查片表面上发现104个SRB细胞/cm2。然而，当使用50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸的二元组合时，固着SRB细胞为不可检出的。这表明THPS和D-酪氨酸之间非常强的协同作用完全阻止SRB生物膜建立。使用非常有效的抗微生物剂系统获得尽可能大的细胞计数上的log减少，为高度合乎需要的。这是因为在现场微生物回弹并常常需要重复处理。高效的抗微生物剂系统通过增加处理之间的时间间隔来减少处理频率。
表4中的固着细胞计数数据受到检查片表面的SEM观察结果支持。图12A显示取自使用不含处理化学品的全强度培养基的7天龄培养物的检查片表面上的生物膜图像。图12A中的SRB细胞似乎非常丰富。图12B显示使用含100 ppm THPS的全强度培养基处理7天的检查片上的某些SRB细胞。这意味着所述处理部分有效。当使用100 ppm D-酪氨酸处理检查片时，固着SRB细胞与未处理对照(12A)一样丰富(图12C)，表明单独的D-酪氨酸完全无效。然而，当使用50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸的组合处理检查片时，未见固着SRB细胞(图12D)。在图12D中，可在矿物沉积下看到裸露的检查片表面，其具有大致135°角的平行金属抛光线。基于所述图片清楚的是，所述50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸组合与100 THPS处理(图12B)相比获得远更干净的检查片表面(12D)。因此，1 ppm D-酪氨酸能够使THPS剂量减半，同时获得远更佳的生物膜预防结果。
表 4.取自与用于预防SRB生物膜建立的不同处理化学品混合的1249培养基中的7天SRB培养物的检查片上的固着细胞计数。
已建立 SRB 生物膜的去除
对于针对检查片表面上已建立SRB生物膜的1-h模拟栓塞处理，表5显示单独的100 ppm D-酪氨酸无效，因为其仅将固着SRB浓度从106减少到105个细胞/cm2，而50 ppm THPS稍更有效，其具有2-log减少。然而，当使用50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸的组合时，所述106个细胞/cm2 SRB生物膜完全根除，显示不可检出的SRB固着细胞(＜10个细胞/cm2)。使用100 ppm THPS获得相同结果，意味着1 ppm D-酪氨酸能够将THPS剂量减半。表5中的3-h模拟栓塞处理数据与1-h数据相同，只是与1-h数据相比，50 ppm THPS显示在固着SRB细胞计数的减少上的1log改善。所述数据表明，使用所述二元鸡尾酒混合物处理，在给定试验条件下1 h为足够的。
检查片表面上的生物膜的SEM图像支持表5中的1-h冲击处理数据。图13A显示使用含有与全强度培养基相同浓度的MgSO4和(NH4)2Fe(SO4)2的溶液处理1-h的对照检查片。在所述检查片表面有丰富的固着SRB细胞。图13B显示，大量固着SRB细胞保留在单独使用50 ppm THPS处理的检查片表面。类似地，图13C显示单独使用100 ppm D-酪氨酸的处理亦在检查片表面留下许多固着细胞。图13D显示，30 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸在去除生物膜上部分有效，因为可见少量固着细胞。在使用50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸的组合处理的检查片上不存在固着SRB细胞(图13E)。在图13E (包括插图)中，部分可见裸露的检查片表面，其具有大致45°角的有序的平行抛光线。对于图13中其它的无效或部分有效的处理情况，未见所述抛光线。图13D表明，如果需要完全的SRB生物膜根除，则此实施例中的最低THPS剂量应为约30 ppm。
表 5.分别经1-h处理和3-h处理之后的检查片(初始覆盖有成熟的(即已建立的) SRB生物膜)上的固着细胞计数。
图14显示，当向50 ppm THPS + 1 ppm D-酪氨酸组合鸡尾酒混合物中引入高浓度(1,000 ppm)的D-丙氨酸时，所述组合鸡尾酒混合物不再有效，因为在SEM图像中可见许多SRB固着细胞。这似乎表明，丰富的D-丙氨酸抑制D-酪氨酸取代细菌细胞壁中肽聚糖的D-丙氨酸末端的能力。此外，值得注意的是，发现即便在高浓度(100 ppm)单独使用时，D-酪氨酸亦对普通脱硫弧菌生物膜无效。这表明，所述SRB生物膜比文献中研究的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)生物膜远更顽固。
虽然已通过其实施方案的描述来阐述本申请，以及虽然已相当详细地描述了所述实施方案，但是将随附权利要求的范围约束或以任何方式限制于所述详情并非为本申请人的意图。本领域技术人员将容易地想到另外的优点和修改。因此，本申请以其更广泛的方面而言不限于具体详情、代表性组合物和过程以及所显示和描述的说明性实施例。因此，在不背离申请人的总体发明概念的精神或范围的情况下，可从所述详情作出变更。

Claims (20)

1. 一种用于处理基底上的生物膜形成和生长的组合物，所述组合物包含：
1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸；和
1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂。
2. 依照权利要求1的组合物，其中所述D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸、D-精氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酰胺、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸、非标准D-氨基酸及其组合。
3. 依照权利要求1或2的组合物，其中所述D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸及其组合。
4. 依照权利要求1或2的组合物，其中所述D-氨基酸为D-酪氨酸。
5. 依照权利要求1或2的组合物，其中所述抗微生物剂选自四羟甲基硫酸膦(THPS)、戊二醛、一氧化氯、二氧化氯、次氯酸钙、次氯酸钾、次氯酸钠、二溴基次氮基丙酰胺(DBNPA)、亚甲基二(硫氰酸盐) (MBT)、2-(硫代氰基甲硫基)苯并噻唑(TCMTB)、溴硝丙二醇、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇(BNPD)、三丁基十四烷基氯化膦(TTPC)、牛磺酰胺及其衍生物、酚类、季铵盐、含氯作用剂、喹哪啶盐、内酯类、有机染料、缩氨硫脲类、醌类、氨甲酸酯类、尿素、水杨酰胺、均二苯脲、胍、脒类、咪唑啉类、醋酸、苯甲酸、山梨酸、丙酸、硼酸、脱氢醋酸、亚硫酸、香草酸、对羟基苯甲酸酯、异丙醇、丙二醇、苯甲醇、氯丁醇、苯乙醇、甲醛、碘及其溶液、聚维酮碘、六亚甲基四胺、羟甲硫脲、1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮氯化金刚烷、牛磺罗定、氧氢噻二嗪、N-(5-硝基-2-亚糠基)-1-氨基-乙内酰脲、5-硝基-2-糠醛缩氨基脲、3,4,4’-三氯均二苯脲、3,4’,5-三溴水杨酰苯胺、3-三氟甲基-4,4’-二氯均二苯脲、8-羟基喹啉、1-环丙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉甲酸、1,4-二氢-1-乙基-6-氟-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉甲酸、过氧化氢、过乙酸、氧氯苯磺酸钠、对氯间二甲苯酚、2,4,4’-三氯-2’-羟基联苯酚、麝香草酚、氯己定、苯扎氯铵、西吡氯铵、磺胺嘧啶银、硝酸银、溴、臭氧、异噻唑酮、聚氧乙烯(二甲基亚氨基)亚乙基(二甲基亚氨基)二氯化乙烯、2-(叔丁基氨基)-4-氯代-6-乙氨基-均三嗪(特丁津)及其组合。
6. 依照权利要求1或2的组合物，其中所述抗微生物剂为四羟甲基硫酸膦(THPS)。
7. 一种用于处理基底上的生物膜形成和生长的方法，所述方法包括：
使所述基底与1 ppb-1,000 ppm的至少一种D-氨基酸和1 ppm-60,000 ppm的至少一种抗微生物剂接触。
8. 依照权利要求7的方法，其中所述基底为金属、金属合金、尼龙、塑料、复合材料、木材、玻璃、陶器、瓷器、漆面、岩石或土壤之一。
9. 依照权利要求7或8的方法，其中所述基底选自管道、储藏容器、地下岩层、地下土壤层、船体、井眼、下部结构、梁、槽、桁材、护板、装配式结构和水下结构。
10. 依照权利要求7或8的方法，其中所述基底为管道。
11. 依照权利要求7或8的方法，其中将所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂独立且同时地加入接触所述基底的基质中。
12. 依照权利要求7或8的方法，其中所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂在加至接触所述基底的基质的溶液中。
13. 依照权利要求7或8的方法，其中将所述至少一种D-氨基酸和所述至少一种抗微生物剂独立且序贯地加入接触所述基底的基质中。
14. 依照权利要求11-13中任一项的方法，其中所述基质选自油、水溶液、水力压裂液、燃料、二氧化碳、天然气、油/水混合物、燃料/水混合物、含盐的水、海洋或海水、半咸水、淡水水源、湖、河、溪、泥塘、池塘、沼泽、来自雪或冰融化的径流、泉、地下水、含水层、降水、在环境温度下为液体以及为疏水的但可溶于有机溶剂的任何物质、己烷、苯、甲苯、氯仿、二乙醚、植物油、石化油、原油、精炼的石化产品、挥发性精油、化石燃料、汽油、烃类混合物、喷气燃料和火箭燃料、生物燃料及其组合。
15. 依照权利要求11-13中任一项的方法，其中所述基质为油/水混合物。
16. 依照权利要求7-15中任一项的方法，其中所述D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸、D-精氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酰胺、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸、非标准D-氨基酸及其组合。
17. 依照权利要求16的方法，其中所述D-氨基酸选自D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸及其组合。
18. 依照权利要求7-16中任一项的方法，其中所述抗微生物剂选自四羟甲基硫酸膦(THPS)、戊二醛、一氧化氯、二氧化氯、次氯酸钙、次氯酸钾、次氯酸钠、二溴基次氮基丙酰胺(DBNPA)、亚甲基二(硫氰酸盐) (MBT)、2-(硫代氰基甲硫基)苯并噻唑(TCMTB)、溴硝丙二醇、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇(BNPD)、三丁基十四烷基氯化膦(TTPC)、牛磺酰胺及其衍生物、酚类、季铵盐、含氯作用剂、喹哪啶盐、内酯类、有机染料、缩氨硫脲类、醌类、氨甲酸酯类、尿素、水杨酰胺、均二苯脲、胍、脒类、咪唑啉类、醋酸、苯甲酸、山梨酸、丙酸、硼酸、脱氢醋酸、亚硫酸、香草酸、对羟基苯甲酸酯、异丙醇、丙二醇、苯甲醇、氯丁醇、苯乙醇、甲醛、碘及其溶液、聚维酮碘、六亚甲基四胺、羟甲硫脲、1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮氯化金刚烷、牛磺罗定、氧氢噻二嗪、N-(5-硝基-2-亚糠基)-1-氨基-乙内酰脲、5-硝基-2-糠醛缩氨基脲、3,4,4’-三氯均二苯脲、3,4’,5-三溴水杨酰苯胺、3-三氟甲基-4,4’-二氯均二苯脲、8-羟基喹啉、1-环丙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉甲酸、1,4-二氢-1-乙基-6-氟-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉甲酸、过氧化氢、过乙酸、氧氯苯磺酸钠、对氯间二甲苯酚、2,4,4’-三氯-2’-羟基联苯酚、麝香草酚、氯己定、苯扎氯铵、西吡氯铵、磺胺嘧啶银、硝酸银、溴、臭氧、异噻唑酮、聚氧乙烯(二甲基亚氨基)亚乙基(二甲基亚氨基)二氯化乙烯、2-(叔丁基氨基)-4-氯代-6-乙氨基-均三嗪(特丁津)及其组合。
19. 依照权利要求18的方法，其中所述抗微生物剂为10 ppm-1,000 ppm四羟甲基硫酸膦(THPS)，以及所述D-氨基酸为100 ppb- 100 ppm D-酪氨酸。
20. 依照权利要求18的方法，其中所述抗微生物剂为10 ppm-1,000 ppm四羟甲基硫酸膦(THPS)，以及所述D-氨基酸为包含等摩尔量的D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸的100 ppb- 100 ppm D-氨基酸混合物，以及进一步包含100 ppm-1,000 ppm的表面活性剂。
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