CN104048957B - 基于石墨烯量子点的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于石墨烯量子点的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法，属于光学传感技术领域。石墨烯量子点具有类过氧化物酶的催化活性，在双氧水存在时可催化双氧水发生还原，同时使无色的还原型四甲基联苯胺氧化为氧化型四甲基联苯胺而显蓝色，在652 nm处产生紫外吸收峰。当氧气存在时，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生双氧水，再利用石墨烯量子点的类过氧化物酶催化特性催化双氧水还原，溶液中的还原型四甲基联苯胺则发生氧化而显色。葡萄糖的浓度越大，溶液的蓝色越深，紫外吸收强度越强，据此可实现葡萄糖的快速、灵敏和可视化检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于石墨烯量子点的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法，属于光学传感技术领域。
背景技术
天然酶是在生物体内存在的、有效的生物催化剂。由于它们具有很高的生物专一性和催化活性，被应用于医药、生物技术、化学工业和环境科学等领域。在这些天然酶中，过氧化物酶因为可以催化过氧化氢进行各种化学反应，被广泛应用于分析诊断学等领域。辣根过氧化酶是一种最常见的过氧化物酶，常被用于双氧水和葡萄糖的检测中。但是，天然酶的催化活性容易受pH、温度等自然环境改变的影响。此外，酶的提取、纯化和储存费用也都比较高。因此，研究新的、有效的、可用于实际应用的过氧化物酶仿生物具有重要意义。
石墨烯量子点（GQD）是一种粒径小于100 nm的石墨烯片，具有良好的光学和电子特性，且分散好、荧光强、低毒、生物相容性好。这些性质使GQD被广泛应用于生物成像、生物传感和光伏器件中。但是，目前关于GQD的研究都是基于其表面的羧基或者电荷而设计的，有关GQD催化活性的研究仍较少。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种基于石墨烯量子点的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法。
本发明是这样来实现的，将葡萄糖氧化酶（GOx）和葡萄糖溶液混合，利用GOx对葡萄糖的催化反应产生双氧水（H2O2）；再加入GQD和还原型四甲基联苯胺（TMB）的混合溶液，GQD催化H2O2发生还原，同时，TMB被氧化为氧化型TMB（oxTMB），溶液由无色变为蓝色，在652nm处产生紫外吸收峰；葡萄糖浓度越大，GOx催化葡萄糖产生的H2O2越多，在GQD的催化作用下，生成的oxTMB量越多，溶液的蓝色越深，吸光度增大，建立了基于GQD的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法。此外，GOx对葡萄糖催化的选择性以及GQD对H2O2的良好催化活性，可实现对葡萄糖的灵敏性和选择性检测。
本发明采用以下技术方案：
（1）氧化石墨烯（GO）的制备：将0.5 g石墨粉和0.5 g硝酸钠加入到23 mL质量百分浓度为98%的浓硫酸中，在冰浴条件下搅拌均匀，再慢慢加入3 g高锰酸钾，在35 °C水浴中搅拌至溶液形成棕色糊状物，加入40 mL超纯水并继续搅拌30分钟，再加入100 mL超纯水后，逐滴滴入质量百分浓度为30%的双氧水，直至溶液颜色变为亮黄色为止；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，在真空干燥箱中50 °C干燥，即制得氧化石墨烯；
（2）石墨烯片的制备：将氧化石墨烯置于管式炉中，氮气保护下，于300 °C还原2小时，冷却至室温，即制得石墨烯片；
（3）GQD的制备：将0.05 g石墨烯片置于体积比1:3的质量百分浓度分别为98%和68%的浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中超声17小时，加入250 mL超纯水稀释，用0.22 μm的微孔滤膜抽滤至中性为止；将滤饼溶于20 mL超纯水中，用NaOH调节溶液的pH为8左右，将溶液转移到高压反应釜中于200 °C反应12小时，冷却到室温；将得到的溶液用0.22 μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为GQD溶液。
（4）葡萄糖检测：将GOx和葡萄糖溶液混合，在37 °C反应30分钟，GOx催化葡萄糖反应产生H2O2；再加入GQD和TMB的混合溶液，室温下反应1小时，在GQD的催化作用下，H2O2发生还原，同时将TMB氧化为oxTMB，使得溶液由无色转变为蓝色，在652 nm处产生明显的紫外吸收峰；葡萄糖浓度越大，产生的H2O2越多，在GQD的催化作用下，生成的oxTMB量越多，溶液的蓝色越深，652 nm处的吸光度增大，吸光度增大的程度与葡萄糖浓度在1-100 µM范围内呈线性关系，对葡萄糖的检测限为0.1 µM，表明本发明建立的传感器可用于对葡萄糖的快速和灵敏检测。
本发明的技术效果是：本发明利用在氧气存在下GOx催化葡萄糖产生H2O2，进而结合GQD的类过氧化物酶的催化特性，在催化H2O2还原的同时，使TMB发生氧化而显色，根据溶液颜色的加深以及紫外吸收强度的增大，可实现葡萄糖的快速、灵敏性和选择性检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是基于GQD的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法示意图。
图2是（A）GO和GQD的傅里叶变换红外光谱图，（B）GQD的紫外可见光谱图和荧光光谱图（激发波长为310 nm），内插图是GQD在可见光照射及紫外灯照射下的照片。
图3是（A）GQD的原子力显微镜图，内插图为粒径分布图，（B）GQD的透射电子显微镜图，内插图为粒径分布图。
图4是（A）不同浓度的H2O2存在时的紫外可见光谱图，从a到o的H2O2浓度依次是0、0.0012、0.0024、0.012、0.024、0.05、0.1、0.2、0.4、0.72、1.5、3、6、12、24 mM，（B）652 nm处的吸光度值与H2O2浓度的线性曲线，内插照片为存在不同浓度的H2O2时溶液颜色的变化照片。
图5是（A）不同浓度的葡萄糖存在时的紫外可见光谱图，从a到l葡萄糖浓度依次为是0、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mM，（B）652 nm处的吸光度值与葡萄糖浓度的线性曲线，内插照片为存在不同浓度的葡萄糖时溶液颜色的变化照片。
图6是对葡萄糖、其他种类糖和氨基酸的选择性实验。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于此。
石墨烯量子点的制备：
（1）氧化石墨烯的制备：将0.5 g石墨粉和0.5 g硝酸钠加入到23 mL质量百分浓度为98%的浓硫酸中，在冰浴条件下搅拌均匀，再慢慢加入3 g高锰酸钾，在35 °C水浴中搅拌至溶液形成棕色糊状物，加入40 mL超纯水并继续搅拌30分钟，再加入100 mL超纯水后，逐滴滴入质量百分浓度为30%的双氧水，直至溶液颜色变为亮黄色为止；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，在真空干燥箱中50 °C干燥，即制得氧化石墨烯；
（2）石墨烯片的制备：将氧化石墨烯置于管式炉中，氮气保护下，于300 °C还原2小时，冷却至室温，即制得石墨烯片；
（3）石墨烯量子点的制备：将0.05 g石墨烯片置于体积比1:3的质量百分浓度分别为98%和68%的浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中超声17小时，加入250 mL超纯水稀释，用0.22μm的微孔滤膜抽滤至中性为止；将滤饼溶于20 mL超纯水中，用NaOH调节溶液的pH为8左右，将溶液转移到高压反应釜中于200 °C反应12小时，冷却到室温；将得到的溶液用0.22 μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为石墨烯量子点溶液。
采用傅里叶变换红外对合成的GO和GQD进行表征，结果如图2A所示。与GO（曲线a）相比，GQD（曲线b）的CO/COOH在1240 cm-1处的伸缩振动强度明显变小，且GQD中的环氧基团在1052 cm-1处的振动带几乎完全消失，表明GQD已成功合成。图2B是GQD的紫外-可见吸收光谱图（曲线a）和荧光光谱图（曲线b），GQD在310 nm处有一个很小的吸收带，当激发波长为310 nm时，GQD在450 nm处有荧光很强的发射峰。内插图是GQD在可见光和紫外光照射下的照片，GQD溶液在可见光照射下是淡黄色液体，而在紫外光照射下发出很强的蓝光。以上结果表明，采用本发明方法合成了荧光GQD。
图3是GQD的原子力显微镜和透射电镜表征。由原子力显微镜图可见，GQD呈均匀分布的片状，高度为1.0 nm左右（图3A），而从透射电镜图中可见，GQD的直径为7-8 nm左右，形态与原子力显微镜结果一致，进一步表明采用本发明方法，已经制成单层或双层GQD。
基于GQD的类过氧化物酶催化特性检测H2O2：检测原理如图1所示，将10 µg/mL的GQD和0.8 mM的TMB混合均匀，加入不同浓度的H2O2，室温下反应1小时后进行紫外光谱测定，结果如图4所示。当H2O2浓度较小时，随着H2O2浓度的增大，652 nm处的吸光度值迅速上升；当H2O2浓度增大到6 mM时，吸光度值上升速度逐渐缓慢，直至H2O2浓度达到12 mM时，吸光度值不再上升。吸光度值与H2O2的浓度在0.05-3 mM范围内呈良好的线性关系（图4B内插图），检测限为0.1 µM。图4B内插照片是随H2O2浓度增大，溶液颜色的变化情况，随着H2O2浓度的增大，溶液蓝色逐渐加深，可用于对H2O2的快速可视化检测。
基于GQD的类过氧化物酶特性检测葡萄糖：检测原理如图1所示，在氧气存在下，将GOx和不同浓度的葡萄糖溶液混合，在37 °C反应30分钟，再加入10 µg/mL的GQD和0.8 mM的TMB溶液，室温下反应1小时后进行紫外光谱测定，结果如图5所示。随着葡萄糖浓度的增加，GOx催化葡萄糖产生的H2O2越多，在GQD的催化作用下，生成的oxTMB量越多，溶液的蓝色越深，652 nm处的吸光度增大（图5A）；吸光度增大的程度与葡萄糖浓度在1-100 µM范围内呈线性关系（图5B），对葡萄糖的检测限为0.1 µM。图5B内插照片是溶液颜色随葡萄糖浓度增大的变化情况，由照片可见，随着葡萄糖浓度的增大，溶液的颜色逐渐变深，可用于对葡萄糖的快速可视化检测。
为了验证本发明方法对葡萄糖检测的选择性，按照相同方法将葡萄糖替换为其它的糖（如，果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖）和氨基酸（如，果硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、赖氨酸），测量结果如图6所示。除了对葡萄糖有强的吸收外，对其它糖和氨基酸的吸光度都很小，表明本发明构建的方法对葡萄糖检测具有良好的选择性，可用于复杂体系中葡萄糖的选择性检测。
Claims (2)
1.基于石墨烯量子点的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法，其特征在于葡萄糖的检测：将葡萄糖氧化酶和葡萄糖溶液混合，在37 °C反应30分钟，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应产生双氧水；再加入石墨烯量子点和还原型四甲基联苯胺的混合溶液，室温下反应1小时，在石墨烯量子点的催化作用下，双氧水发生还原，同时将还原型四甲基联苯胺氧化为氧化型四甲基联苯胺，使得溶液由无色转变为蓝色，在652 nm处产生明显的紫外吸收峰；吸光度增大的程度与葡萄糖浓度在1-100 µM范围内呈线性，可用于对葡萄糖的快速和灵敏检测；
所述的石墨烯量子点制备步骤如下：
（1）氧化石墨烯的制备：将0.5 g石墨粉和0.5 g硝酸钠加入到23 mL质量百分浓度为98%的浓硫酸中，在冰浴条件下搅拌均匀，再慢慢加入3 g高锰酸钾，在35 °C水浴中搅拌至溶液形成棕色糊状物，加入40 mL超纯水并继续搅拌30分钟，再加入100 mL超纯水后，逐滴滴入质量百分浓度为30%的双氧水，直至溶液颜色变为亮黄色为止；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，在真空干燥箱中50 °C干燥，即制得氧化石墨烯；
（2）石墨烯片的制备：将氧化石墨烯置于管式炉中，氮气保护下，于300 °C还原2小时，冷却至室温，即制得石墨烯片；
（3）石墨烯量子点的制备：将0.05 g石墨烯片置于体积比1:3的浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中超声17小时，加入250 mL超纯水稀释，用0.22 μm的微孔滤膜抽滤至中性为止；将滤饼溶于20 mL超纯水中，用NaOH调节溶液的pH为8左右，将溶液转移到高压反应釜中于200 °C反应12小时，冷却到室温；将得到的溶液用0.22 μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为石墨烯量子点溶液。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯量子点的类过氧化物酶催化特性的葡萄糖检测方法，其特征在于步骤（3）中，所述的浓硫酸的质量百分浓度为98%，浓硝酸的质量百分浓度为68%。
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