CN104031962A - 一种pEGF基因工程乳酸乳球菌的发酵优化培养基 - Google Patents

Abstract

本发明对一种pEGF基因工程乳酸乳球菌基础发酵培养基进行优化，优化内容包括了培养基成分优化、发酵时间优化以及接种量优化。优化后的培养基成分为：每1L培养基含低蛋白乳清粉6.5g，葡萄糖5g，蛋白胨15g，牛肉膏1g，酵母浸粉1g，维生素C0.1g，硫酸镁0.25g，硝酸钠2g，硫酸亚铁0.4g。对于优化后的发酵培养基，培养基pH为7.0，最佳发酵时间为27h，最佳接种量为10%。本发明优化后的发酵培养基，菌体浓度达到2×10⁹CFU/ml，明显高于基础发酵培养基，显著提高了发酵效果。同时，本发明的优化基础发酵培养基大大降低了pEGF基因工程乳酸乳球菌的发酵成本。

Description

一种pEGF基因工程乳酸乳球菌的发酵优化培养基

技术领域

本发明属于微生态学，微生物发酵领域，更具体涉及一种可显著提高pEGF基因工程乳酸乳球菌生物量的发酵培养基。

技术背景

猪表皮生长因子（porcine epidermal growth factor ,pEGF）是表皮生长因子的一种，是猪乳中含量最丰富的生长因子之一。在猪初乳和常乳中表皮生长因子浓度含量很高，且其受体在猪小肠的分布研究得最多，EGF与其受体结合可发挥生理功能。有研究表明猪表皮生长因子具有多种生物学功能，如可刺激表皮和内皮细胞的增殖；可刺激胃肠道的生长以及诱导小肠消化酶的表达。对于初生的仔猪和早期断奶仔猪，pEGF能够影响其生产性能、免疫应答和小肠的发育，诱导小肠消化酶的表达。此外，pEGF 具有促进静止期的初级母卵泡变成活化卵泡，从而加速卵子的排出，因此具有提高哺乳动物的窝产仔数的功能。

乳酸乳球菌是一类能够代谢糖类，产生50%以上乳酸的细菌通称，包括乳酸乳球菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属等至少23个属。 其本身具有调节肠道微生态，促进营养成分在肠道的消化吸收，降低血清中的胆固醇含量，缓解高血压以及抗肿瘤作用。乳酸乳球菌为兼性厌氧菌是全球公认的食品级微生物，随着分子生物学技术的不断发展，通过基因重组对其改造，有目的、有选择地使乳酸乳球菌产生有益的异源基因的产物，制成微生态制剂和活菌疫苗等保健品或药品，是乳酸乳球菌分子生物学研究的一个重要方向。

随着基因工程技术的飞速发展，我们可以通过对乳酸乳球菌质粒编码特性的研究来构建我们所需要的质粒载体，通过一系列分子生物学手段例如转导、结合、电转化等，将其转移到乳酸乳球菌中，使我们所需要的目的基因得以表达，从而使基因工程乳酸乳球菌集菌体、自身分泌物、外源蛋白于一体。将基因工程乳酸乳球菌应用到饲料中，可以作为一种新型的饲料添加剂，其能够产生抗微生物(尤其致病菌)物质，还能够调节动物机体肠道内的微生态平衡，增强动物机体免疫力，从而促进动物生长，提高饲料转化率。

发明内容

本发明提供了一种可以显著提高pEGF基因工程乳酸乳球菌生物量的发酵优化培养基。

本发明中，所述的发酵培养基有如下组分组成：

1）低蛋白乳清粉6.5~15g/L;

2) 无水葡萄糖5~20g/L;

3）蛋白胨5~15g/L;

4）牛肉膏1~10g/L;

5）酵母浸出粉1~5g/L;

6）维生素C 0.1~0.5g/L;

7）硫酸镁0~0.25g/L;

8）硝酸钠0~2g/L;

9）硫酸亚铁0~0.4g/L;

10)所述发酵优化培养基的pH值为5.8-7.0；所述发酵优化培养基的培养时间为24~39h；所述发酵优化培养基的接种量为2%~10%；所述发酵优化培养方式为静置培养；所述发酵培养温度为37℃。

本发明中，所述的发酵培养基中含有低蛋白乳清粉6.5~15g/L；较佳地，所述的发酵优化培养基中含有低蛋白乳清粉6.5g/L。

本发明中，所述的发酵培养基中含有无水葡萄糖5~20g/L；较佳地，所述的发酵优化培养基中含有无水葡萄糖5g/L。

本发明中，所述的发酵培养基中含有蛋白胨5~15g/L；较佳地，所述的发酵优化培养基中含有蛋白胨15g/L。

本发明中，所述的发酵培养基中含有牛肉膏1~10g/L；较佳地，所述的发酵优化培养基中含有牛肉膏1g/L。

本发明中，所述的发酵培养基中含有酵母浸出粉1~5g/L；较佳地，所述的发酵优化培养基中含有酵母浸粉1g/L。

本发明中，所述的发酵培养基中含有维生素C0.1~0.5g/L；较佳地，所述的发酵优化培养基中含有维生素C0.1g/L。

本发明优选地，所述的发酵优化培养基中含有硫酸镁0.25g/L；所述的硝酸钠2g/L；所述的硫酸亚铁0.4g/L。

本发明优选地，所述的发酵优化培养基pH值为7.0；所述的发酵培养时间为27h；所述的接种量为10%；所述的培养方式为厌氧静置培养；所述的发酵培养温度为37℃。

本发明更优选地，所述的发酵优化培养基由如下组分组成：每1L培养基含低蛋白乳清粉6.5g，葡萄糖5g，蛋白胨15g，牛肉膏1g，酵母浸粉1g，维生素C0.1g,硫酸镁0.25g，硝酸钠2g，硫酸亚铁0.4g。

本发明中，溶解所述发酵优化培养基的介质为本领域常规，较佳地为水；所述水为本领域常规所述，如蒸馏水、双蒸水等。

本发明中，所述的发酵优化培养基的制备方法为本领域常规，只需将其包含的各组分简单混合，然后按照本领域常规微生物培养基的制备条件制备即可；所述的常规制备条件为121℃，高压湿热灭菌15min。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基的积极进步效果在于：本发明的发酵优化培养基可提供pEGF基因工程乳酸乳球菌良好生长，显著提高了pEGF基因工程乳酸乳球菌的发酵生物量；同时，本发明的发酵优化培养基大大降低了pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵培养基的成本。

附图说明

附图1 pEGF基因工程乳酸乳球菌的生长曲线。

附图2 pEGF表达量测定。

具体实施方式

下面通过实验实例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。

实施例1：pEGF基因工程乳酸乳球菌的活化

液体活化培养基的制备：M17培养基3.76g，无水葡萄糖1g，蒸馏水100ml，121℃，高压湿热灭菌，15min，超净台中冷却后，加入100μl红霉素溶液，红霉素溶液浓度为1mg/ml，4℃保存备用。

活化培养基平板的制备：M17培养基3.76g，无水葡萄糖1g，琼脂粉15g，蒸馏水100ml，121℃，高压湿热灭菌，15min，加入100μl红霉素溶液，红霉素溶液浓度为1mg/ml，每块平板倒入20-25ml培养基，超净工作台中冷却凝固后，封口，4℃保存备用。

将保存于40%甘油中的菌种拿于室温下，在超净工作台中用高压灭菌过的接种环挑取菌种，然后划在平板上，封口，37℃下倒置培养24小时。

24小时后，用灭菌的接种环挑取单菌落，接种于液体培养基中，所述的培养基为上述液体活化培养基，37℃下静置培养24小时。

24小时后，用移液器移取10%（v/v）的菌液，重新接种于一瓶液体活化培养基中，37℃下静置培养24小时，即得到种子液，收集菌液，4℃保存，备用。

实施例2：pEGF基因工程乳酸乳球菌生长曲线的测定

将pEGF基因工程乳酸乳球菌活化后，以10%（v/v）的接种量接种到基础发酵培养基中，所述的基础发酵培养基的组分如下：蛋白乳清粉 6.5g，葡萄糖10g，蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，酵母浸粉 2.5g，硫酸镁 0.25g，硝酸钠 1g，氯化钠 2g，硫酸亚铁 0.4g，维生素C 0.3g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

装液量为100ml的三角牌装80ml培养基，在37℃下静置培养，每隔3个小时，采用血球平板计数法测定不同时间的菌落单位数，以培养时间为横坐标、菌落单位数为纵坐标绘制生长曲线图（图1）。

由生长曲线确定pEGF基因工程乳酸乳球菌的最佳培样时间为27h。

实施例3：调整培养基各成分比例对pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵生物量的影响

在以下实验中，采用两因子，每次优化两种培养基成分比例，其余成分不便，37℃下静置培养27h，用血球平板计数法测定菌落单位数。

3.1 其他成分不变，设置低蛋白乳清粉浓度6.5g/L、10g/L、15g/L和葡萄糖浓度5g/L、10g/L、20g/L，每个组合重复3次，求平均值，（如表1）。结果表明，当低蛋白乳清粉浓度为6.5g/L，葡萄糖浓度为5g/L时，菌落单位数达到最高。

表1 细菌生物量lgCFU

3.2 在3.1优化实验的基础上，设置蛋白胨浓度5g/L、10g/L、15g/L和牛肉膏浓度1g/L、5g/L、10g/L，

其他成分不变，每个组合重复3次，求平均值，（如表2）。结果表明，当蛋白胨浓度为15g/L，牛肉膏浓度为1g/L时，菌落单位数达到最高。

表2 细菌生物量 lgCFU

3.3 在3.2优化实验的基础上，设置酵母浸粉浓度1g/L、2.5g/L、5g/L和维生素C1g/L、5g/L、10g/L，

其他成分不变，每个组合重复3次，求平均值，（如表3）。结果表明，当酵母浸粉浓度为1g/L，维生素C浓度为0.1g/L时，菌落单位数达到最高。

表3 细菌生物量 lgCFU

实施例4 接种量对pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵生物量的影响

将pEGF基因工程乳酸乳球菌分别以2%、5%、10%、15%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，37℃下静置培养27h，用血球平板计数法测定菌落单位数（如表4）。结果表明，在培养基成分固定，培养时间不变，培养温度恒定时，10%的接种量小测得的菌落单位数最高。

表4细菌生物量 lgCFU

实施例5 pEGF表达量测定

使用发酵优化培养基培养细菌，采用超声波破碎法来破碎菌体，在破碎后的菌体中按1:50的比例加入8M尿素，由于目标蛋白比较小，所以采用Tricine-SDS-Page法进行蛋白电泳（图版2），低浓度氢氧化钠洗脱目标蛋白，用标准曲线法测定目标蛋白含量如下表5。

表5 pEGF表达量测定

Claims (10)

1.一种pEGF基因工程乳酸乳球菌的发酵优化培养基，其特征在于：优化后的发酵培养基由如下组分组成：

1）低蛋白乳清粉6.5~15g/L;

2） 无水葡萄糖5~20g/L;

3）蛋白胨5~15g/L;

4）牛肉膏1~10g/L;

5）酵母浸出粉1~5g/L;

6）维生素C 0.1~0.5g/L;

7）硫酸镁0~0.25g/L;

8）硝酸钠0~2g/L;

9）硫酸亚铁0~0.4g/L;

10)所述pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基的pH值为5.8-7.0；所述pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基的培养时间为24~39h；所述pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基的接种量为2%~10%；所述pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养方式为厌氧静置培养；所述pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵培养温度为37℃；所述的pEGF基因工程乳酸菌发酵优化培养基中添加1ml/L的红霉素溶液；所述的红霉素溶液浓度为10mg/ml。

2.如权利要求1所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基中含有低蛋白乳清粉6.5g/L；所述的无水葡萄糖5g/L。

3.如权利要求2所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基中含有蛋白胨15g/L;所述的牛肉膏1g/L。

4.如权利要求3所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基中含有酵母浸出粉1g/L；所述的维生素C 0.1g/L。

5.如权利要求4所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基中含有硫酸镁0.25g/L；所述的硝酸钠2g/L；所述的硫酸亚铁0.4g/L。

6.如权利要求5所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基中包括以下组分：每1L培养基含低蛋白乳清粉6.5g，葡萄糖5g，蛋白胨15g，牛肉膏1g，酵母浸粉1g，维生素C0.1g，硫酸镁0.25g，硝酸钠2g，硫酸亚铁0.4g。

7.如权利要求6所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基最佳发酵时间为27h；所述的发酵培养基最佳接种量为10%；所述发酵培养基的pH为7.0。

8.如权利要求7所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基中添加100μl的红霉素溶液；所述的红霉素溶液浓度为10mg/ml；所述的发酵优化培养基装液量为100ml瓶装80ml。

9.如权利要求8所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基，其特征在于，所述的发酵优化培养基培养方式为静置培养；所述培养温度为37℃。

10.如权利要求1~9所述任一项的pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵优化培养基在pEGF基因工程乳酸乳球菌发酵培养中的应用。