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CN104017865A - 一种山羊肉用性状快速高效选育方法 - Google Patents

一种山羊肉用性状快速高效选育方法 Download PDF

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CN104017865A CN201410211282.XA CN201410211282A CN104017865A CN 104017865 A CN104017865 A CN 104017865A CN 201410211282 A CN201410211282 A CN 201410211282A CN 104017865 A CN104017865 A CN 104017865A
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徐红
徐云峰
曾琼
杨方福
赵文金
赵维
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Xishui County Fu Xing Animal Husbandry Co Ltd
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Xishui County Fu Xing Animal Husbandry Co Ltd
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Abstract

本发明涉及畜禽育种技术领域，尤其是一种山羊肉用性状快速高效选育方法，包括以下步骤：体重测定、DNA样采集、引物合成、模板PCR扩增引物、基因型判定与分型、不同基因型个体PCR产物的测序验证、个体MBLUP遗传评估、选配建立家系、群体继代选育形成核心群体、优良基因人工扩散；本发明通过通过测定体重和检测分子标记基因型，以MBLUP技术评估种羊育种值进行选配，按设计的选育目标在选育后代中进行体重测定和基因型检测，以MBLUP法进行群体继代选育。最终形成黔北麻羊肉用新品系。以黔北麻羊的选育为例，通过本方法选育出的黔北麻羊肉用型核心群体公羊和母羊的体重分别比基础群体提高14.12kg、9.61kg。

Description

一种山羊肉用性状快速高效选育方法
技术领域
本发明涉及畜牧育种技术领域，尤其是一种山羊肉用性状快速高效选育方法。
背景技术
最佳线性无偏预测BLUP，是20世纪80年代中后期发展起来的一种育种值估算方法，目前已经成为国内外学者普遍认可的、先进的遗传评估方法；现有技术中，普遍将最佳线性无偏预测估算育种值的方法运用于畜禽水产品种的育种，对于该方法适用于水产品种的报道包括有期刊论文文献，也涵盖有专利文献5件，并且在这些大量的文献中介绍了最佳线性无偏预测育种值估算方法比其他育种值估算方法具有明显的有点：其选育是针对育种值而不是表型，剥离了环境效应，因而选择效率较高；通过设计交配策略，有效的控制近交技术难题，有效控制种质资源，从而保障了育种企业和生产者的利益。
标记辅助BLUP(MBLUP)育种技术，国内外主要是将其利用在水产品种中，而还没有应用于哺乳动物之中；山羊作为哺乳动物中的一种，也是我国畜禽遗传资源重要组成部分，具有适应能力强、耐粗饲、繁殖率高、产肉性能良好、膻味轻、肉鲜美可口等优点；但山羊品种仍具有生长速度慢、经济效益不高的技术难题，同时，一个山羊品种种质保护是一个长期性的工作，其经济不足、资源分散使得山羊品种摆脱不了遗传品质不断退化的命运。
因此，如何对地方山羊品种进行快速高效选育，迅速提高生产性能，充分实现对地方优良山羊遗传资源的保护和利用，成为广大本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种
具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种山羊肉用性状快速高效选育方法，包括以下步骤：
(1)性能检测：主要对山羊的体重进行测定；测定时，要记录好每只山羊的体重、性别、年龄、耳标号，并收集山羊的系谱资料；所述的体重测定时，羊只禁食16～24h，禁饮2h后空腹称测山羊的重量，单位为kg；
(2)DNA样采集：按常规方法采集每只山羊的血样或耳组织样，并提取样品DNA，每只山羊的DNA样要与其耳标号一一对应；
(3)标记基因引物合成：将DNA样合成包含生长独立因子1B基因340bp处G/A突变的与山羊体重显著相关的SNP位点的特定引物；
(4)模板PCR扩增引物：将2×Taq PCR MasterMix、ddH2O、引物、模板DNA混合构建成PCR反应体系，其中2×Taq PCR MasterMix为5μL、ddH2O为3.4μL、引物为0.8μL、模板DNA为0.8μL；混合均匀后，进行PCR扩增，获得扩增产物；
(5)基因型判定与分型：将扩增产物在99℃下变性5min后，置于10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳完毕后，进行硝酸银染色拍照，并根据电泳结果直接判定个体基因型；
(6)不同基因型个体PCR产物的测序验证：对不同基因型个体各5个50μL扩增体系，经琼脂糖凝胶检测，有目的条带后，进行基因纯化测序；记录各个个体的基因型，均与体重、DNA样、个体耳标号要一一对应；
(7)个体MBLUP遗传评估：将各个体系谱、年龄、性别、基因型和体重信息纳入标记辅助BLUP(MBLUP)模型估计出各个个体的育种值，其模型如下：
y＝Zu+Qν+e
其中：y为体重测量值向量；u为育种值随机向量，其均值为0，方差协方差矩阵为
ν是固定分子标记效应向量，e为误差向量，其均值为0，方差协方差矩阵为
Z、Q是相应的关联矩阵；
随机向量u和误差向量e的数学期望和方差定义为：
E u e = 0 0 Var u e = G , 0 0 , R , G = A σ A 2 , σ e 2 = σ y 2 - σ A 2 = σ y 2 ( 1 - h 2 )
A为所有个体的血缘系数矩阵，为个体育种值方差；
(8)山羊选配建立家系：以公羊为单位，选取育种值较近的山羊作为家系建立个体(各家系公羊育种值不能低于母羊育种值，公母羊之间应避免近交，公母羊三代内无共亲关系)，每个家系母羊≥15只，至少建立30个家系；
(9)山羊群体继代选育形成核心群体：按照山羊肉用性状快速高效选育目标，在步骤8)的家系后代中进行生产性能测定和基因型检测，以BLUP法进行群体继代选育，重复步骤1-8)≥二世代后，即可获得山羊肉用核心群体；
(10)优良基因人工扩散：在核心群体中，母羊直接送到山羊保种区去作种羊；公羊采用人工授精的方式，在山羊群体中进行山羊扩繁，最终选育形成山羊肉用新品系。
通过以上程序，即可达到对山羊肉用性状快速高效选育的目的。
优选地，所述的步骤1)中，体重检测时，羊只禁食20h。
进一步的，所述的步骤4)中，模板PCR扩增引物采用的是混合法，具体是先把引物、2×Taq PCR MasterMix、ddH2O混匀后分装，加入模板DNA进行离心5s后，转入PCR扩增程序；所述的PCR扩增程序为94℃下预变性5min后，转入35个循环的延伸前扩增程序，待35个循环完成后，在72℃下延伸10min，即可获得扩增产物。
进一步的，所述的35个循环的延伸前扩增程序，其中一个循环为：94℃下变性30s后，转入50.7℃下退火30s，再在72℃下延伸30s。
进一步的，所述的引物为两种，其序列分别为：
F-CCTGGACAGGACTCATCAAACT；
R-GCAAATAGGGGAGGATTTCTCT；其中在模板PCR扩增体系中，上、下游引物各占0.4μL。
优选地，所述的山羊选配建立家系步骤中，各家系公羊育种值≥母羊育种值，公母羊三代内无共亲关系。
进一步的，所述的家系不低于40个，每个家系的母羊≥20只。
进一步的，所述的家系不低于60个，每个家系的母羊≥25只。
进一步的，所述的继代选育，重复步骤1-8)≥三世代。
进一步的，所述的继代选育，重复步骤1-8)≥四世代。
生长独立因子1B基因340bp处G/A突变的与山羊体重显著相关的SNP位点，两者之间的显著关系参见：Cai HF,Chen Z,Luo W X.Associations between polymorphisms of the GFI1B gene and growthtraits of indigenous Chinese goats[J].Genetics and molecular research:GMR,2013,13(1):872-880。
2×Taq PCR MasterMix为DNA模板PCR扩增引物过程中生物酶。
引物浓度为10pmol/μL；模板DNA浓度为50ng/m。
另外，在进行模板DNA引物PCR扩增程序时，即引物、酶、ddH2O的份数均比扩增量要稍微多一点，混合均匀后分装，并在各分装的混合物中加入DNA模板后离心处理一定时间后，就进入PCR扩增程序。
标记辅助BLUP计算方法为：针对模型，输入各自需要的方差组分先验值，利用MTDFREML软件计算得到，根据REML算法迭代计算，估计方差组分；方差组分初始值的选取是依据表型方差，并根据张天时在海洋水产研究期刊2008年29卷第3期题目为中国对虾体重育种值估计的动物模型分析一文以及其他相关育种值计算方法的资料文献进行分析，收敛标准为两次迭代所得估计值的方差小于10-13；为保证所获得育种估计值是全局最大估计值，利用不同的初值进行多次估计计算，比较收敛后的函数值，取其中最大的函数值的一次结果作为遗传参数估计值，利用达到收敛标准的方差组分，求解模型方差，获得山羊个体育种值，并根据个体育种值的相似度和相近度，进行山羊公母羊的匹配杂交育种，对于家系育种值是家系所有个体的育种值的平均值。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
①本方法获得的核心群体黔北麻羊山羊和母羊的体重分别比基础群体的公羊、母羊的体重分别提高14.12kg、9.61kg。
②通过育种值的估算，确保山羊遗传资源能够被可控性的进行匹配，缩短了山羊的育种周期，提高了山羊遗传资源的保存和保护能力。
③通过基因人工扩散，使山羊优秀基因在群体中的快速扩散，优秀山羊群体迅速扩大，降低山羊养殖户的养殖成本，促进了山羊养殖，使得山羊种质资源得到最大程度的保护。
④本发明可以提供个体选育和家系选育的基准，准确定位需要保护的遗传资源，使得山羊遗传资源能够充分、准确的被保存和保护。
⑤本发明通过育种值的计算和恰当的组配，避免了山羊的近交。
⑥本发明采用MBLUP技术，将与目标性状显著相关的基因标记纳入传统的BLUP模型，进一步提高了山羊选育的准确性和可靠性。
附图说明
图1为本发明山羊肉用性状快速高效选育方法的基因型判定过程中，对GFI1B基因SNP位点(340bpG/A)电泳图。
图2为本发明山羊肉用性状快速高效选育方法的基因型为CC的GFI1B基因SNP位点(340bpG/A)测序图。
图3为本发明山羊肉用性状快速高效选育方法的基因型为DD的GFI1B基因SNP位点(340bpG/A)测序图。
图4为本发明山羊肉用性状快速高效选育方法的基因型为CD的GFI1B基因SNP位点(340bpG/A)测序图。
图5为本发明本发明山羊肉用性状快速高效选育方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例：
通过测定体重和检测分子标记基因型，以MBLUP技术评估种羊育种值进行选配，按设计的选育目标在选育后代中进行生产性能测定和基因型检测，以MBLUP法进行群体继代选育；最终形成黔北麻羊肉用新品系。
具体是：以习水县富兴牧业有限公司黔北麻羊原种场内进行的关于一种山羊肉用性状快速高效选育方法，包括以下步骤：
(1)生产性能测定：主要对山羊的体重指标进行测定；测定时，要记录好每只山羊的体重、性别、年龄、耳标号，并收集山羊的系谱资料；所述的体重检测时，羊只禁食20h，禁饮2h后空腹称测山羊的重量，单位为kg；
(2)DNA样采集：按常规方法采集每只山羊的血样或耳组织样，并提取样品DNA，每只山羊的DNA样要与其耳标号一一对应；
(3)标记基因引物合成：将DNA样合成包含标记基因——生长独立因子1B基因340bp处G/A突变的与山羊体重显著相关的SNP位点的特定引物；
(4)模板PCR扩增引物：将2×TaqPCRMasterMix、ddH2O、引物、模板DNA混合构建成PCR反应体系，其中2×Taq PCR MasterMix为5μL、ddH2O为3.4μL、引物为0.8μL、模板DNA为0.8μL；混合均匀后，进行PCR扩增，获得扩增产物；所述的模板PCR扩增引物采用的是混合法，具体是先把引物、2×Taq PCR MasterMix、ddH2O混匀后分装，加入模板DNA进行离心5s后，转入PCR扩增程序；所述的PCR扩增程序为94℃下预变性5min后，转入35个循环的延伸前扩增程序，待35个循环完成后，在72℃下延伸10min，即可获得扩增产物。所述的35个循环的延伸前扩增程序，其中一个循环为：94℃下变性30s后，转入50.7℃下退火30s，再在72℃下延伸30s；所述的引物为两种，其序列分别为：
F-CCTGGACAGGACTCATCAAACT；
R-GCAAATAGGGGAGGATTTCTCT；
其中在模板PCR扩增引物的原料配比中各占0.4μL；
(5)基因型判定与分型：将扩增产物在99℃下变性5min后，置于10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳完毕后，进行硝酸银染色拍照，并根据电泳结果直接判定个体基因型；
(6)不同基因型个体PCR产物的测序验证：对不同基因型个体各5个50μL扩增体系，经琼脂糖凝胶检测，有目的条带后，进行基因纯化测序；记录各个个体的基因型，均与体重、DNA样、个体耳标号要一一对应；
(7)个体MBLUP遗传评估：将各个体系谱、年龄、性别、基因型和体重信息纳入标记辅助BLUP(MBLUP)模型估计出各个个体的育种值，其模型如下：
y＝Zu+Qν+e
其中：y为体重测量值向量；u为育种值随机向量，其均值为0，方差协方差矩阵为
ν是固定分子标记效应向量，e为误差向量，其均值为0，方差协方差矩阵为
Z、Q是相应的关联矩阵；
随机向量u和误差向量e的数学期望和方差定义为：
E u e = 0 0 Var u e = G , 0 0 , R , G = A σ A 2 , σ e 2 = σ y 2 - σ A 2 = σ y 2 ( 1 - h 2 )
A为所有个体的血缘系数矩阵，为个体育种值方差；
(8)山羊选配建立家系：以公羊为单位，选取育种值较近的山羊作为家系建立个体，每个家系母羊≥15只，至少建立30个家系；各家系公羊育种值≥母羊育种值，公母羊三代内无共亲关系；
(9)山羊群体继代选育形成核心群体：按照山羊肉用性状快速高效选育目标，在步骤8)的家系后代中进行生产性能测定和基因型检测，以BLUP法进行群体继代选育，重复步骤1-8)≥二世代后，即可获得山羊肉用性状核心群体；
(10)优良基因人工扩散：在核心群体中，母羊直接送到山羊保种区去作种羊；公羊采用人工受精的方式，在山羊群体中进行山羊扩繁，即可使肉用型山羊能够得到快速高效选育并对山羊优良基因能够得到保种处理。
在此有必要指出的是：以上实施例仅限于对本发明的有益效果和实施方式做进一步的阐述，不能理解为对本发明的技术方案的进一步限制，本领域的技术人员在上述内容中作出的与本发明的不具有突出的实质性和显著的改进的发明创造，仍然属于本发明的技术方案的保护范畴。

Claims (10)

1.一种山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)性能测定：主要对山羊肉用性状的主要指标体重进行测定；测定时，要记录好每只山羊的体重、性别、年龄、耳标号，并收集山羊的系谱资料；所述的体重测定时，羊只禁食16～24h，禁饮2h后空腹称测山羊的重量，单位为kg；
(2)DNA样采集：按常规方法采集每只山羊的血样或耳组织样，并提取样品DNA，每只山羊的DNA样要与其耳标号一一对应；
(3)标记基因引物合成：将DNA样合成包含目的基因中与山羊体重显著相关的SNP位点的特定引物；
(4)模板PCR扩增引物：将2×Taq PCR MasterMix、ddH2O、引物、模板DNA混合构建成PCR反应体系，其中2×Taq PCR MasterMix为5μL、ddH2O为3.4μL、引物为0.8μL、模板DNA为0.8μL；混合均匀后，进行PCR扩增，获得扩增产物；
(5)基因型判定与分型：将扩增产物在99℃下变性5min后，置于10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳完毕后，进行硝酸银染色拍照，并根据电泳结果直接判定个体基因型；
(6)不同基因型个体PCR产物的测序验证：对不同基因型个体各5个50μL扩增体系，经琼脂糖凝胶检测，有目的条带后，进行基因纯化测序；记录各个个体的基因型，均与体重、DNA样、个体耳标号要一一对应；
(7)个体MBLUP遗传评估：将各个体系谱、年龄、性别、基因型和体重信息纳入标记辅助BLUP(MBLUP)模型估计出各个个体的育种值，其模型如下：
y＝Zu+Qν+e
其中：y为体重测量值向量；u为育种值随机向量，其均值为0，方差协方差矩阵为
ν是固定分子标记效应向量，e为误差向量，其均值为0，方差协方差矩阵为
Z、Q是相应的关联矩阵；
随机向量u和误差向量e的数学期望和方差定义为：
E u e = 0 0 Var u e = G , 0 0 , R , G = A σ A 2 , σ e 2 = σ y 2 - σ A 2 = σ y 2 ( 1 - h 2 )
A为所有个体的血缘系数矩阵，为个体育种值方差；
(8)山羊选配建立家系：以公羊为单位，选取育种值较近的山羊作为家系建立个体(各家系公羊育种值不能低于母羊育种值，公母羊之间应避免近交，公母羊三代内无共亲关系)，每个家系母羊≥15只，至少建立30个家系；
(9)山羊群体继代选育形成核心群体：按照山羊肉用性状快速高效选育目标，在步骤8)的家系后代中进行体重测定和基因型检测，以MBLUP法进行群体继代选育，重复步骤1-8)≥二世代后，即可获得山羊肉用核心群体；
(10)优良基因人工扩散：在核心群体中，母羊直接送到保种区去作种羊；公羊采用人工授精的方式，在山羊群体中进行山羊扩繁。
2.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的步骤1)中，体重测定检测时，羊只禁食20h。
3.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的步骤4)中，模板PCR扩增引物采用的是混合法，具体是先把引物、2×Taq PCR MasterMix、ddH2O混匀后分装，加入模板DNA进行离心5s后，转入PCR扩增程序；所述的PCR扩增程序为94℃下预变性5min后，转入35个循环的延伸前扩增程序，待35个循环完成后，在72℃下延伸10min，即可获得扩增产物。
4.如权利要求3所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的35个循环的延伸前扩增程序，其中一个循环为：94℃下变性30s后，转入50.7℃下退火30s，再在72℃下延伸30s。
5.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的引物为上游引物和下游引物两种，其序列分别为：
F-CCTGGACAGGACTCATCAAACT；
R-GCAAATAGGGGAGGATTTCTCT；其中在模板PCR扩增体系中，上下游引物各占0.4μl。
6.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的山羊选配建立家系步骤中，各家系公羊育种值≥母羊育种值，公母羊三代内无共亲关系。
7.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的家系不低于40个，每个家系的母羊≥20只。
8.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的家系不低于60个，每个家系的母羊≥25只。
9.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的继代选育，重复步骤1-8)≥三世代。
10.如权利要求1所述的山羊肉用性状快速高效选育方法，其特征在于，所述的继代选育，重复步骤1-8)≥四世代。
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