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CN104011063A - 增加大豆针对害虫的防御 - Google Patents

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CN104011063A
CN104011063A CN201280060096.XA CN201280060096A CN104011063A CN 104011063 A CN104011063 A CN 104011063A CN 201280060096 A CN201280060096 A CN 201280060096A CN 104011063 A CN104011063 A CN 104011063A
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CN
China
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plant
soybean
gmsamt1
scn
gene
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Application number
CN201280060096.XA
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English (en)
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C·N·斯图尔特
林璟瑜
M·玛扎雷
陈�峰
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University of Tennessee Research Foundation
Original Assignee
University of Tennessee Research Foundation
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Publication date
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Abstract

披露了从大豆分离的害虫抗性基因。在数个实施例中，从大豆分离的一种害虫抗性基因包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其一种简并变体至少80％一致的一种核酸序列或其一种片段。还披露了包含此类核酸的表达载体和构建体。披露了产生一种具有增强的对害虫的抗性的转基因植物的方法。还披露了被所披露的构建体转化的转基因植物、植物细胞或组织(例如一种双子叶植物或一种单子叶植物、植物细胞或组织)。

Description

增加大豆针对害虫的防御
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月28日提交的美国临时申请61/581,039的优先权，该临时申请通过引用以其全文结合于此。
本披露的领域
本披露涉及植物分子生物学的领域。更具体地说，本披露涉及由大豆和其他植物中基因的转基因表达所赋予的对病原体的耐受性。
背景
大豆[黄豆(Glycine max(L.)Merr.)]是世界上最广泛地生长的豆类，它提供了蛋白质和油的一个重要来源。大豆可以通过许多方式来利用，例如作为大量人类食品、动物饲料以及工业产品的调配中的成分。作为世界贸易中主要的含油种子，大豆占到全世界含油种子产量的约56％。大豆制品的估计值在全世界为约$486亿，并且仅在美国，就约$187亿。因此，大豆被认为是最重要的经济作物之一。虽然在过去的一个世纪，全世界的大豆产量已经与日俱增，但归因于世界人口的增长和有限的土地资源，未来对大豆的需求仍然无法得到满足。
在其整个寿命周期期间，大豆可能被例如真菌、细菌、病毒以及线虫的许多病原体侵袭，并且在任何组织中都经历许多疾病。举例来说，细菌性病原体大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)可以引起白叶枯病，在作物残茬中过冬，并且通过种子传播。在实验室研究中，通常选择丁香假单胞菌(P.syringae)作为细菌性病原体的模型。真菌性病原体也可以在地上与地下的组织上引起大豆疾病，占美国和全世界所有大豆疾病损失的约50％。在野外在种子和在植物上检测到的大豆花叶病毒(SMV)是引起大豆疾病的主要病毒。因为此病毒性疾病是通过种子传播的，所以该疾病可能在下一个生长季节引起问题。它对种子质量的影响是主要担心的事。病毒感染的大豆可能产生更少、更小以及经常有斑点的种子。另一个担心的事是SMV感染的大豆倾向于被其他病毒二重感染，这扩大了收得率损失的风险并且甚至进一步降低种子质量。另外，线虫和例如甲虫、毛虫、蚜虫以及蛛螨的大豆昆虫害虫也可以引起大豆的收得率损失。
大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，SCN)是引起美国大豆最大经济损失的害虫，引起几乎$10亿的收得率损失。SCN是一种小的植物寄生性蛔虫并且SCN的大部分阶段都无法通过肉眼看见。SCN以大豆的根为食并且掠夺来自大豆的养分。一个重要的特征，即SCN群体的遗传异质性，帮助此病原体容易克服抗性。为了完成它们的寿命周期，感染性的第二阶段幼体(J2)进入宿主的根并且在细胞内在皮层组织内迁移到维管柱。这些幼体接着开启称为合胞体的专门喂养位点的形成，该合胞体充当供给线虫养分的代谢库。当这些线虫发育成为成年雄性和雌性时，它们只从其合胞体取食。一旦受精，雌性大豆线虫就产生多达数百个的卵，这些卵在很大程度上都保留在线虫子宫内。在雌性死亡后，它的躯体发育成为环绕这些卵的一个保护性囊，给予了该线虫它的名称。
在野外难以识别SCN感染，因为SCN感染的地上的症状容易与养分缺乏症状相混淆。当大豆植物被线虫严重地损坏时，它们变得发育不良并且变萎黄。这些症状可能被误认为养分缺乏和供水不足。直到SCN群体到达一定数目，它的破坏作用才能被农民们清楚地识别。目前，诊断SCN感染的最精确的方式是分析土壤样品并且直接观测害虫(奥泼曼(Opperman)和波德(Bird)1998)。在商业大豆生产中控制SCN仍然是困难的，因为SCN具有短的寿命周期并且群体可以迅速地构建。SCN的群体病毒性频繁改变也促进了此害虫的管理方面的困难。另外，SCN的囊可以在土壤中存活达九年，并且接着在适当条件下打破而释放卵，提高了这些线虫通过感染的土壤散布的可能性。
在大豆生产中用以控制和管理SCN的方法包括作物轮作、SCN抗性载培品种的使用以及杀线虫剂的施用，这些经常以一种整合的方式使用。然而，这些方法始终面临着经济约束，耗时，并且杀线虫剂的用途可能引起环境问题。另外，对于一些区域，经济因素可能限制作物轮作的使用。考虑到大豆的长期需求，关键的是通过育种发展抗性大豆载培品种来管理大豆疾病。甚至对于作物轮作，也需要抗性大豆载培品种。因此，对害虫抗性，例如对SCN感染具有抗性的例如大豆的植物的产生存在需要。本披露满足该需要。
本披露的概述
披露了先前未被认识的从大豆分离的害虫抗性基因。在一个实施例中，一种害虫抗性基因编码一种S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性羧基甲基转移酶并且称为GmSAMT1。在另一个实施例中，一种害虫抗性基因编码一种水杨酸甲酯酯酶并且称为GmSABP2-1。
在数个实施例中，从大豆分离的一种害虫抗性基因包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其一种简并变体至少80％一致的一种核酸序列或其一种片段，它编码称为GmSAMT1的一种活性S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性羧基甲基转移酶或称为GmSABP2-1的水杨酸甲酯酯酶。披露了编码所述基因的分离的核酸，还披露了通过所述基因编码的蛋白质。所述分离的核酸可以可操作地连接到启动子。还披露了包含这些核酸的表达载体和构建体。在一些实施例中，一种表达载体是pJL-OFP-35S::GmSAMT1或pJL-OFP-35S::GmSABP2-1。
所披露的这些构建体提供了增强的对例如大豆胞囊线虫的害虫感染的抗性。因此，披露了用于产生具有增强的对例如大豆胞囊线虫的害虫感染的抗性的一种转基因植物的方法。还披露了被所披露的构建体转化的转基因植物、植物细胞或组织(例如一种双子叶植物或一种单子叶植物、植物细胞或组织)。还提供了一种植物种子、果实、叶、根、芽、花、插枝以及适用于有性或无性繁殖的其他繁殖材料、包括F1杂种的子代植物、雄性不育植物以及可来源于所披露的转基因植物的所有其他植物和植物产品。在此还提供了产生所披露的转基因植物、植物细胞或组织的方法。
上述和其他特征和优点将从数个实施例的以下详细说明变得更加显而易见，该详细说明参考附图进行。
附图简要说明
图1A-1C是一组示意图，展示针对SCN的大豆抗性的一种所提出模型和GmSAMT1和GmSABP2-1的功能。1A展示通过被GmSAMT1和GmSABP2-1催化的SA与MeSA之间的反应。SAM表示充当甲基供体的S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸。1B展示在抗性大豆根中，当大豆被SCN感染时GmSAMT1和GmSABP2-1的基因表达上调。移动信号MeSA的有效输送增强针对SCN的大豆抗性。在易感染大豆根中，当大豆被SCN感染时GmSAMT1的基因表达未改变并且GmSABP2-1的基因表达下调。移动信号MeSA的输送被阻断，这降低了针对SCN的大豆抗性。在易感染大豆根中存在比抗性大豆根中更多的完成其寿命周期的SCN。1C展示在被SCN感染的局部大豆根中，SA经生物合成并且SA的水平增加。SA的水平可以通过GmSAMT1，通过转化为移动信号MeSA来操纵。残余的SA的水平足够诱导GmPR-1基因表达。SA的水平降低有益于茉莉酸(JA)依赖性防御路径，该路径诱导GmPR-3基因表达。在未受损伤的大豆根中，MeSA可以通过GmSABP2-1催化，形成SA，SA对针对进一步SCN感染的全身性获得抗性起作用。病程相关基因非表达子1(NPR1)、WRKY家族转录因子以及脂肪氧合酶(LOX)可能充当调节点。这些点表示大豆根内的成年雌性SCN。
图2展示昂飞(Affymetrix)探针Gma.12911.1.A1_S_AT序列(SEQ IDNO:17)与五种大豆候选基因(SEQ ID NO:18-22)的比对。昂飞探针Gma.12911.1.A1_S_AT的序列与这些大豆基因的开放阅读框架序列的末端比对并且覆盖3’UTR序列的一部分(方框中的TAA是终止密码子)。基于该比对，仅Glyma02g06070具有与探针一致的序列(以方框指示)。
图3展示Glyma02g06070和来自其他植物的功能上表征的SABATH家族蛋白质的一个系统树。一个邻接树是使用ClustalX程序，基于Glyma02g06070与来自其他植物种的所选的功能上表征的SABATH之间的序列相似性程度。Glyma02g06070处于以椭圆形所示的SAMT进化枝中。CbSAMT，仙女扇(Clarkia breweri)SAMT(AF133053)；AmSAMT，金鱼草(Antirrhinum majus)(金鱼草(snapdragon))SAMT(AF515284)；SfSAMT，多花黑鳗藤(Stephanotis floribunda)SAMT(AJ308570)；HcSAMT，绿叶球兰(Hoya carnosa)SAMT(AJ863118)；DwSAMT，怀特曼陀罗(Datura wrightii)SAMT(EF472972)；AmBAMT，金鱼草BAMT(AF198492)；NsBSMT，香甜烟草(Nicotiana suaveolens)BSMT(AJ628349)；AtBSMT，拟南芥(Arabidopsis thaliana)BSMT(BT022049)；AlBSMT，深山南芥(A.lyrata)BSMT(AY224596)；AbSAMT，颠茄(Atropa belladonna)SAMT(AB049752)；OsBSMT1，水稻(Oryza sativa)BSMT1(XM467504)；PhBSMT，碧冬茄(Petunia hybrida)BSMT(AY233465)；OsIAMT1，水稻(O.sativa)IAMT1(EU375746)；PtIAMT1，欧洲大叶杨(Populustrichocarpa)IAMT1(XP_002298843)；AtIAMT，拟南芥(A.thaliana)IAMT(AK175586)；AtGAMT1，拟南芥GAMT1(At4g26420)；AtGAMT2，拟南芥GAMT2(At5g56300)；CaCaS1，小果咖啡咖啡因合成酶1(Coffea arabica caffeine synthase1)(AB086414)；CaXMT1，小果咖啡(C.arabica)XMT1(AB048793)；CaDXMT1，小果咖啡DXMT1(AB084125)。分枝按比例绘制，其中棒条指示每个位点0.1个取代。
图4是纯化的重组GmSAMT1蛋白质的一种SDS-PAGE凝胶的一个数字图象。在大肠杆菌中表达的His标记的GmSAMT1如实例1中所述来纯化。泳道M含有蛋白质分子量标记物。泳道1含有粗提取物并且泳道2含有约2μg纯化的GmSAMT1蛋白质。凝胶用考马斯蓝染色。
图5A-5D是成组的图，展示GmSAMT1的生物化学性质。图5A展示pH对GmSAMT1活性的影响。50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中GmSAMT1活性的水平任意地设定在1.0。图5B展示响应在从0℃到60℃范围内的温度的GmSAMT1活性。在25℃下GmMAN1活性的水平任意地设定在1.0。图5C展示金属离子对GmSAMT1活性的影响。金属离子呈氯盐形式以5mM最终浓度添加到反应中。作为对照(Ctr)的无任何金属离子添加的GmSAMT1活性的水平任意地设定在1.0。图5D展示GmSAMT1呈现假米-门氏动力学，其中对于水杨酸，表观Km值为46.2±4.2μM。
图6是展示pJL-OFP-35S::GmSAMT1的构造的一个示意图，pJL-OFP-35S::GmSAMT1是用于大豆根中GmSAMT1基因的过度表达的一种质粒。通过在NocI位点插入一个35S启动子-ppor RFP-NOS终止子，从pCAMBIA1305.2修饰pJL-OFP。ppor RFP编码一种橙色荧光蛋白质。pJL-OFP是用于植物转化的一种土壤杆菌属相容性二元质粒，并且用于一种载体对照质粒。pJL-OFP-35S::GUS是一种中间载体并且用于测试两个盒内的OFP与GUS是否在大豆根中共表达。pJL-OFP-35S::GmSAMT1是通过用GmSAMT1置换GUS基因，通过BamH I与Sac I位点之间的消化和连接来获得。
图7A和7B是展示烟叶与大豆发根中报导基因表达的一项测试的数字图象。图7A展示烟叶中pJL-OFP和空载体的瞬时表达。图7B展示转基因发根中两种报导基因的共表达。所有测试的具有OFP信号的转基因发根都展示GUS染色。在顶部展示用于一种橙色荧光蛋白质(OFP)报导基因与一种GUS报导基因的共表达的构建体的一个示意图示。“35S-Pro”和“NOS-ter”对应地表示CaMV35S启动子和NOS终止子。用该构建体转化的转基因发根的分析(顶部)。在OFP过滤器下将OFP阳性转基因发根与OFP阴性发根分离。OFP阳性发根经进一步证明，对GUS染色呈阳性。
图8A和8B展示过度表达GmSAMT1的大豆的转基因发根的产生。图8A是用于一种橙色荧光蛋白质(OFP)报导基因和GmSAMT1的共表达的构建体的一个示意图示。“35S-Pro”和“NOS-ter”对应地表示CaMV35S启动子和NOS终止子。图8B展示在来自三种遗传背景TN02-226、TN02-275以及威廉(Williams)82的五类转基因发根中GmSAMT1的表达。“GmSAMT1”表示含有GmSAMT1转基因的转基因发根。“VC”表示使用含有OFP标记物而不是GmSAMT1基因的一种对照载体产生的转基因发根。qRT-PCR用GmSAMT1特异性引物进行。表达值相对于对应的样品中大豆泛素3基因(GmUBI3)的表达水平归一化。TN02-275的“VC”转基因发根中GmSAMT1表达水平任意地设定在1.0。每个棒条表示三个独立实验的平均相对表达水平加标准误差，每个实验含有一组五株植物。这些带星号的棒条显著地不同(LSD p<0.01)。
图9A和9B是一组条形图，展示对针对GmPR-1和GmPR-3的转基因发根的qRT-PCR分析。“GmSAMT1”表示含有GmSAMT1转基因的转基因发根。“VC”表示使用含有OFP标记物而不是GmSAMT1基因的一种对照载体产生的转基因发根。每个棒条表示三个独立实验的平均相对表达水平加标准误差。在图9A和图9B中所示的图中，带不同字母的棒条显著地不同(LSD p<0.05)。
图10是一组数字图象，展示在转基因发根中通过清除和用酸性品红染色所示的大豆胞囊线虫的J2、J3以及J4阶段。
图11是一个条形图和一组数字图象，展示过度表达GmSAMT1的转基因发根与对照发根之间的一个SCN测定。每个棒条表示来自10个大豆发根的抗性指数的平均值加标准误差。抗性指数是在通过SCN接种后两周后，在发根土壤杆菌(A.rhizogenes)转化的发根中所示的J3和J4线虫总数与全部感染雌性线虫的比率。VS和VR表示在易感染(TN02-275和威廉82)和抗性(TN02-226)背景中含有质粒pJL-OFP的发根株系，它们对应地用作易感染和抗性对照株系。SAMT表示在易感染背景中过度表达GmSAMT1和OFP报导基因的发根株系。带星号的棒条显著地不同(LSD p<0.01)。底部照片展示响应的转基因发根株系中SCN的代表性阶段。
图12A和12B是展示有或者没有SCN感染的转基因发根中GmICS1(12A)和GmICS2(12B)的相对转录物丰度的条形图。产生威廉82背景的两类转基因发根并且分析。“GmSAMT1”表示含有GmSAMT1转基因的转基因发根。“VC”表示使用含有OFP标记物基因而不是GmSAMT1的一种对照载体产生的转基因发根。“SCN”表示SCN感染的投与。“Ctr”表示未感染的对照。qRT-PCR用GmSAMT1特异性引物进行。表达值相对于对应的样品中大豆泛素3基因(GmUBI3)的表达水平归一化。无SCN感染的“VC”转基因发根(“Ctr”)中GmSAMT1表达水平任意地设定在1.0。每个棒条表示三个独立实验的平均相对表达水平加标准误差，每个实验含有一组五株植物。带不同字母的棒条显著地不同(LSD p<0.05)。
图13A和13B是展示有或者没有SCN感染的转基因发根中GmNPR1-1(13A)和GmNPR1-2(13B)的相对转录物丰度的条形图。产生威廉82背景的两类转基因发根并且分析。“GmSAMT1”表示含有GmSAMT1转基因的转基因发根。“VC”表示使用含有OFP标记物基因而不是GmSAMT1的一种对照载体产生的转基因发根。“SCN”表示SCN感染的投与。“Ctr”表示未感染的对照。qRT-PCR用GmSAMT1特异性引物进行。表达值相对于对应的样品中大豆泛素3基因(GmUBI3)的表达水平归一化。无SCN感染的“VC”转基因发根(“Ctr”)中GmSAMT1表达水平任意地设定在1.0。每个棒条表示三个独立实验的平均相对表达水平加标准误差，每个实验含有一组五株植物。带不同字母的棒条显著地不同(LSD p<0.05)。
图14是展示大豆花叶病毒感染的大豆叶子上针对GmSAMT1和GmPR-1的qRT-PCR分析的一个条形图。灰色和白色棒条对应地表示来自具有抗性和易感染响应的大豆植物的相对基因表达。每个棒条表示三个独立实验的平均相对表达水平加标准误差。带星号的棒条意味基因表达与不带星号的棒条显著地不同(LSD p<0.05)。
图15展示大豆Glyma16g26060(SEQ ID NO:23)、烟草SABP2(NtSABP2)(SEQ ID NO:24)以及SABP2的拟南芥属直系同源物(At4g37150)(SEQ ID NO:25)的一个多重序列比对。一致残基打上黑色阴影并且类似残基打上灰色阴影。催化三联体残基通过箭头指示，并且接触水杨酸的残基用三角形指示。
图16是纯化的重组GmSABP2-1蛋白质的一种SDS-PAGE凝胶的一个数字图象。在大肠杆菌中表达的His标记的GmSABP2-1如实例2中所述来纯化。泳道M含有蛋白质分子量标记物。泳道1含有粗提取物并且泳道2含有约2μg纯化的GmSABP2-1蛋白质。凝胶用考马斯蓝染色。
图17是展示使用MeSA作为底物，在5μM到100μM浓度下，计算GmSABP2-1的Km值的一个图。表观Km值通过林-贝氏图(Lineweaver-Burkplot)获得。
图18是展示pH对GmSABP2-1活性的影响的一个图。纯化的GmSABP2-1的活性从pH6.0-9.0测定。50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中GmSABP2-1活性水平任意地设定在1.0。
图19是展示过度表达GmSABP2-1的转基因发根与对照大豆株系之间的SCN抗性的一个线虫种群统计学测定的一个条形图。发根中所示的J3和J4线虫的总数与全部感染线虫的比率用作抗性指数。已经描述抗性指数，WS、WR、VS以及VR。WS和WR对应地是易感染和抗性背景中的野生型发根株系。VS和VR是在易感染和抗性背景中含有OFP报导基因的发根株系，对应地作为载体对照株系，。SABP2表示在TN02-275背景中具有过度表达的GmSABP2-1和OFP报导基因的发根株系。带不同字母的棒条显著地不同(LSD p<0.05)。
图20展示pJL-OFP-35S::GmSAMT1载体的一个质粒图。
图21展示pJL-OFP-35S::GmSABP2-1载体的一个质粒图。
序列表的简要说明
在此展示的核酸和氨基酸序列使用如37C.F.R.1.822中定义的针对核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写展示。仅展示每个核酸序列的一条链，但通过对所呈现的链的任何提及，应理解为包括互补链。序列表以ASCII文本文件，呈名为UTK_0141WP_ST25.txt的文件形式呈递，该文件是在2012年10月30日产生，56千字节，并且通过引用结合于此。
SEQ ID NO:1是GmSAMT1的一种示例性核酸序列。
SEQ ID NO:2是GmSABP2-1的一种示例性核酸序列。
SEQ ID NO:3是pJL-OFP-35S::GmSAMT1的核酸序列。
SEQ ID NO:4是pJL-OFP-35S::GmSABP2-1的核酸序列。
SEQ ID NO:5-16和26-33是引物的核酸序列。
SEQ ID NO:17是昂飞探针Gma.12911.1.A1_S_AT的核酸序列。
SEQ ID NO:18-22是五种大豆候选基因的核酸序列。
SEQ ID NO:23是Glyma16g26060的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是烟草SABP2的氨基酸序列
SEQ ID NO:25是SABP2的拟南芥属直系同源物的氨基酸序列。
详细说明
I.引言
大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，SCN)是大豆[黄豆(Glycine max(L.)Merr.)]最严重的害虫。如在此所披露，通过对具有对SCN的不同响应的两种遗传相关的大豆株系(重组近交株系，RIL)的基因表达的微阵列分析，识别出大豆基因Glyma02g06070和Glyma16g26060是在抗性株系中由SCN诱导的，而不是在易感染株系中。
从序列数据，预测Glyma02g06070编码一种S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性羧基甲基转移酶。基于被此基因编码的大肠杆菌表达的蛋白质的生物化学活性，识别出Glyma02g06070是一种水杨酸甲基转移酶基因并且称为GmSAMT1。GmSAMT1催化水杨酸转变成水杨酸甲酯(MeSA)。为了确定GmSAMT1在针对SCN的大豆抗性中的生物作用，诸位发明人用含有用于GmSAMT1和橙色荧光蛋白质(OFP)基因过度表达的盒的一种二元载体，在易感染大豆背景中产生转基因发根。通过SCN接种后的两周后，比较过度表达的GmSAMT1转基因发根与对照发根中SCN的种群统计学。结果展示在易感染大豆株系中具有GmSAMT1过度表达的转基因发根显示出增加的抗性，类似于抗性大豆株系的抗性。为了进一步了解它在大豆中的防御作用，还在大豆与大豆花叶病毒之间在相容与不相容的反应中比较GmSAMT1的表达水平。发现GmSAMT1的表达在不相容的反应中上调，而在相容的反应中不上调。总之，在此披露的结果指示GmSAMT1在针对SCN和大豆花叶病毒的大豆防御中起到关键作用。
从序列数据，预测Glyma16g26060编码α/β折叠水解酶。克隆此基因并且进行生物化学活性测定后，识别出此基因编码水杨酸甲酯酯酶。因为此基因是来自烟草的名为NtSABP2的水杨酸甲酯酯酶的直系同源基因，所以称其为大豆基因GmSABP2-1。通过GmSABP2-1编码的重组酶可以催化从MeSA到水杨酸(SA)的转变。为了研究GmSABP2-1在针对SCN的大豆抗性中的生物作用，诸位发明人在易感染大豆背景中产生具有GmSABP2-1和橙色荧光蛋白质(OFP)基因的过度表达的转基因发根。通过SCN卵接种后的两周后，比较过度表达的GmSABP2-1转基因发根与对照发根中SCN的种群统计学。结果展示在易感染大豆株系中具有过度表达的GmSABP2-1的转基因发根具有增加的抗性，该抗性类似于抗性大豆对照株系。因此，确定了GmSABP2-1通过SA依赖性信号传导通路在针对SCN的大豆抗性中起作用。
总之，两种组分GmSAMT1和GmSABP2-1工作是输送移动信号MeSA并且在大豆针对SCN的防御中起重要作用。虽然不受理论束缚，但提出GmSAMT1和GmSABP2-1的功能和针对SCN的大豆抗性的一种模型(参见图1)。在SCN感染的局部根中，GmSAMT1对调节基础SA和MeSA的水平起到关键作用。在根结线虫抗性研究中，发现游离SA的残余水平足够赋予基础抗性。此是指示针对SCN的基础防御所需的SA的水平可能是低的。生物合成的SA可以变为其他形式，例如MeSA，以诱导远端根组织中的SAR。相对高水平的基础SA似乎抑制GmSABP2-1的活性，并且因此在局部位点抑制MeSA到SA的转变。在远端根组织中，相对高水平的MeSA和低水平的SA有利于GmSABP2-1的活性，引起MeSA到SA的转变。因此，如在此披露，通过适合的特异性和诱导性启动子驱动转基因植物中的GmSAMT1和GmSABP2-1，可以通过操纵SA和MeSA水平来实现针对SCN的大豆抗性。
II.术语的概述
除非另作说明，否则技术术语是根据常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以在以下各项中找到：本杰明·列文(Benjamin Lewin)，《基因IX》(Genes IX)，由琼斯与巴特莱特出版社(Jones and Bartlet)出版，2008(ISBN 0763752223)；肯德鲁(Kendrew)等人(编辑)，《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular Biology)，由布莱克威尔科学出版公司(Blackwell Science Ltd.)出版，1994(ISBN0632021829)；以及罗伯特·迈尔(Robert A.Meyers)(编辑)，《分子生物学与生物技术：综合案头参考》(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference)，由VCH出版公司(VCH Publishers,Inc.)出版，1995(ISBN9780471185710)。
除非上下文另外清楚地指示，否则单数术语“一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则字“或”意图包括“和”。术语“包含”意味“包括”。如果矛盾，则包括术语解释的本说明书将为主。
为了促进对本披露的各个实施例的回顾，提供以下术语解释：
5'和/或3'：核酸分子(例如DNA和RNA)被说成具有“5'末端”和“3'末端”，因为单核苷酸是以一种方式反应来形成聚核苷酸，使得一个单核苷酸戊醣环的5'磷酸酯在一个方向上通过一个磷酸二酯键连接于其邻居的3'氧。因此，当一个聚核苷酸的5'磷酸酯不连接到一个单核苷酸戊醣环的3'氧时，其一个末端被称为“5'末端”。当一个聚核苷酸的3'氧不连接到另一个单核苷酸戊醣环的一个5'磷酸酯时，其另一个末端被称为“3'末端”。尽管一个单核苷酸戊醣环的一个5'磷酸酯附接到其邻居的3'氧，但一种内部的核酸序列也可以说成具有5'和3'末端。
在一种直线型或环形核酸分子中，不连续的内部元件被称为“下游”或3’元件的“上游”或5'。关于DNA，此术语反映了转录沿着一条DNA链在5'到3'方向上进行。引导一个连接的基因转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5'或上游。然而，增强子元件即使是位于启动子元件和编码区的3'，也可以施加其影响。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3’或下游。
农艺学性状：一种植物的特性，这些特性包括但不限于植物形态学、生理学、生长与发育、产率、营养增强、疾病或害虫抗性，或环境或药剂耐性。一种“增强的农艺学性状”是指一种农艺学性状的可测量的改良，包括但不限于产率增加，包括在非应力条件下增强的产率和在环境应力条件下增强的产率。应力条件可以包括例如干旱、阴暗、真菌性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、昆虫感染、线虫感染、冷温度暴露、热暴露、渗透应力、降低的氮养分有效性、降低的磷养分有效性以及高植物密度。“产率”可能受许多性质影响，这些性质包括但不限于植物高度、豆荚数目、植物上的豆荚位置、节间数目、豆荚粉碎的发生率、颗粒尺寸、生节和固氮作用的效率、养分同化的效率、对生物和非生物应力的抗性、碳同化、植物结构、对倒伏的抗性、种子萌芽百分比、秧苗活力以及幼体性状。在一些实施例中，农艺学性状是对害虫的抗性，例如对SCN的大豆抗性。
改变产生或表达的水平：如与对照的产生或表达的水平相比，改变，通过增加或降低，一种核酸分子或一种氨基酸分子(例如一种基因、一种多肽、一种肽)的产生或表达的水平。
扩增：当在提及一种核酸时使用时，此是指增加一种样品或样本中一种核酸分子的拷贝数目的技术。扩增的的一个实例是聚合酶链反应，其中从一名个体收集的一个生物样品与一对寡核苷酸引物在允许这些引物在样品中杂交成核酸模板的条件下接触。这些引物在适合条件下延伸，从模板解离，并且接着再退火、延伸并且解离，从而扩增核酸拷贝的数目。体外扩增的产物可以使用标准技术，通过电泳、限制性内切酶裂解模式、寡核苷酸杂交或连接和/或核酸序列测序来表征。体外扩增技术的其他实例包括链置换扩增(参见美国专利号5,744,311)；无转录等温扩增(参见美国专利号6,033,881)；修复链反应扩增(参见WO90/01069)；连接酶链反应扩增(参见EP-A-320308)；填隙连接酶链反应扩增(参见美国专利号5,427,930)；偶合的连接酶检测与PCR(参见美国专利号6,027,889)；以及NASBATMRNA无转录扩增(参见美国专利号6,025,134)。
盒：在一组或多组限制位点之间携带(以及能够表达)一种或多种所关注的基因的DNA的一种可操纵的片段。通过使用限制酶“切割”掉该片段并且将其“传”到新的背景中，一个盒可以从一个DNA序列(通常在一个载体上)转移到另一个DNA序列。在所披露的实施例中，一个盒包括或多个所披露的诱导性启动子。
cDNA(互补DNA)：缺乏内部非编码区段(内含子)以及转录调节序列的一片DNA。cDNA也可以含有未翻译区(UTR)，它们负责相对应RNA分子中的翻译控制。cDNA通常在实验室中通过逆转录从提取自细胞或其他样品的信使RNA合成。在一些实例中，cDNA用作一种所关注的基因的一个来源，例如编码GmSAMT1或GmSABP2-1的基因。
构建体：任何重组聚核苷酸分子，例如一种质粒、粘粒、病毒、自主复制聚核苷酸分子、噬菌体或直线型或环形单链或双链DNA或RNA聚核苷酸分子，它来源于任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包含其中一个或多个可转录聚核苷酸分子已经可操作地连接的一种聚核苷酸分子。
对照植物：一种植物，它不含有在一种转基因植物中赋予(例如)一种增强或改变的农艺学性状的一种重组DNA，用作供比较的一种基线，例如以识别出在该转基因植物中一种增强或改变的农艺学性状。一种适合的对照植物可以是用以产生一种转基因植物的亲本株系的一种非转基因植物，或至少对在检验中的具体性状为非转基因的一种植物(也就是说，该对照植物可以已经进行工程化而含有其他异源性序列或重组DNA分子)。因此，在一些情况下，一种对照植物可以是在测试植物中包含一个空载体或标记物基因，但不含有重组DNA，或不含有所有重组DNA的一种转基因植物。
简并变体和保守变体：对包括由于遗传密码而简并的一种序列的一种多肽或一种抗体进行编码的一种聚核苷酸。存在20种天然氨基酸，大部分都通过一种以上密码子指定。因此，包括所有简并的核苷酸序列，只要被该核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列不变就行。由于遗传密码的简并，所以大量功能一致的核酸编码任何既定的多肽。举例来说，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA以及AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在其中在一种蛋白质编码序列内指定一个精氨酸的每个位置，密码子可以在不改变编码的蛋白质下改变成所描述的任何相对应的密码子。这些核酸变体是“沉默变体”，沉默变体是保守变体的一个种类。在此的编码一种多肽的每个核酸序列还描述每个可能的沉默变体。本领域普通技术人员将认识到，一个核酸中的每个密码子(除AUG之外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子)都可以通过标准技术被修饰以得到一种功能上一致的分子。因此，编码一种多肽的一种核酸的每个“沉默变体”隐含在每个描述的序列中。
此外，本领域普通技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中一个单一氨基酸或小百分比氨基酸(例如小于5％，例如小于4％、小于3％、小于2％或甚至小于1％)的单独的取代、缺失或添加是保守变体，其中这些变化引起一种氨基酸被一种化学上类似的氨基酸取代。
提供功能上类似的氨基酸的保守氨基酸取代是本领域中众所周知的。以下六个群组每个含有对于彼此是保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰氨(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
一个蛋白质内不是所有的残基位置都会允许一种另外“保守”取代。举例来说，如果一个氨基酸残基对该蛋白质的功能来说是必不可少的，那么甚至一个另外保守取代也可能破坏该活性。
疾病抗性或害虫抗性：避免作为植物-病原体相互作用的结果的有害症状。例如用于抗细菌保护的溶菌酶或杀菌肽的疾病抗性和害虫抗性基因，或例如用于抗真菌保护的防卫素、葡聚糖酶或几丁质酶的蛋白质，或用于控制线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶都是适用的基因产物的实例。
如在此所用，术语“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、螨、蜱等。昆虫害虫包括选自以下各项的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、隐翅目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，尤其是鞘翅目、鳞翅目以及双翅目。病毒包括但不限于烟草或黄瓜花叶病毒、轮点型病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等。线虫包括但不限于寄生线虫，例如根结、胞囊以及根腐线虫，包括胞囊线虫属(Heterodera spp.)、根结线虫属(Meloidogynespp.)以及球胞囊属(Globodera spp.)；尤其是胞囊线虫的成员，包括但不限于大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode)；甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii，beet cyst nematode)；小麦胞囊线虫(Heterodera avenae，cereal cyst nematode)；以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和苍白球胞囊线虫(Globodera pallida)(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括但不限于短体线虫属(Pratylenchus spp.)。真菌害虫包括引起叶锈、黄锈、条锈以及秆锈的害虫。DNA(脱氧核糖核酸)：DNA是包含大部分生物体的遗传物质的一种长链聚合物(一些病毒具有包含核糖核酸(RNA)的基因)。DNA聚合物中的重复单元是四种不同的核苷酸，每个包含四种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及胸腺嘧啶之一，结合于一个磷酸酯基所连接的一个脱氧核糖。核苷酸三个一组(称为密码子)编码一个多肽中的每个氨基酸或用于一个停止信号。术语密码子也用于DNA序列转录成的mRNA中三个核苷酸的相对应(和互补)序列。
除非另外说明，否则对一种DNA分子的任何提及都包括该DNA分子的反向互补序列。除在此正文需要单链的情况外，DNA分子，尽管书面仅描绘单条链，但涵盖一种双链DNA分子的两条链。
编码：一种聚核苷酸如果在其天然状态下或当通过本领域普通技术人员已知的方法操纵时，聚核苷酸分子可以被转录和/或翻译而产生用于和/或多肽或其片段的一种mRNA，那么被说成编码多肽。反义链是此类核酸的互补序列，并且编码序列可以从其来推断。
增强子结构域：赋予基因表达全面控制的一个方面的一种起顺式作用的转录调节元件(也叫做顺式元件)。一个增强子结构域可以用以结合转录因子，转录因子是调节转录的起反式作用的蛋白质因子。一些增强子结构域结合一种以上转录因子，并且转录因子可以通过不同亲和力与一种以上增强子结构域相互作用。增强子结构域可以通过包括以下各项的大量技术来识别：缺失分析(使从5′末端或在一个启动子内部的一个或多个核苷酸缺失)；使用DNase I足迹法、甲基化干扰、电泳活动性位移测定、利用连接介导的PCR的体内基因组足迹法以及其他常规测定的DNA结合蛋白质分析；或通过使用常规DNA序列比较法与已知的顺式元件基元进行DNA序列比较。一个增强子结构域的精细结构可以通过一种或多种核苷酸的诱变(或取代)或通过其他常规方法进一步研究。增强子结构域可以通过化学合成或通过从包括这些元件的启动子分离来获得，并且它们可以利用含有适用限制酶位点以促进子序列操纵的其他侧接核苷酸合成。
(基因)表达：一个DNA分子转录成一个转录的RNA分子。更通常，基因表达涵盖一个基因的编码信息转变为细胞中存在并且操作的结构的过程。表达的基因包括被转录成mRNA并且接着翻译成蛋白质的基因和被转录成RNA而不翻译成蛋白质的基因(例如siRNA、转移RNA以及核糖体RNA)。因此，例如一个基因或一个基因的一个启动子区域的一种标靶序列的表达可以引起一种mRNA、一种蛋白质或两项的表达。标靶序列的表达可以抑制或增强(降低或增加)。基因表达可以被描述成与时间、空间、发育或形态学质量以及定量或定性指示相关。
基因调节活性：一种聚核苷酸影响一种可操作地连接的可转录聚核苷酸分子(例如一种诱导性启动子)的转录或翻译的能力。具有基因调节活性的一个分离的聚核苷酸分子可以提供该可操作地连接的可转录聚核苷酸分子的时间或空间表达或调控其表达水平和速率。具有基因调节活性的一个分离的聚核苷酸分子可以包括一个启动子、内含子、前导序列或3′转录终止区。
遗传物质：意图包括所有基因、核酸、DNA以及RNA的一个短语。
异源性核苷酸序列：不是与一种启动子序列一起天然存在的一种序列。虽然此核苷酸序列对该启动子序列来说是异源的，但是它对植物主体来说可以是同源的，或天然的，或异源的，或外来的。本发明另外涵盖启动子的同源编码序列，尤其是与抗性表型相关的编码序列的表达。同源编码序列的表达将改变被转化的植物或植物细胞的表型。
增加害虫抗性或增强害虫抗性：抗性增强或升高到越过正常或对照植物或其部分(例如还未用编码S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸依赖性羧基或水杨酸甲酯酯酶的一个分离的核酸，例如在此披露的核酸转化的一个植物)。在一些实例中，增加或增强是至少约25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更高的提高。
呈顺式：指示两种序列位于RNA或DNA的相同片上。
呈反式：指示两种序列位于RNA或DNA的不同片上。
插入DNA：例如所披露的表达盒的一种表达盒内的异源DNA，用以转化植物材料，而“侧接DNA”以包含自然存在于例如一种植物的一种生物体中的基因组DNA，或者通过转化过程引入的外来(异源)DNA，它对例如与转化事件有关的片段的原始插入DNA分子来说是外加的。如在此所使用的“侧接区”或“侧接序列”是指具有至少20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000个碱基对或更大的一种序列，它位于原始外来的插入DNA分子的尾上游和邻接处或者原始外来的插入DNA分子的头下游和邻接处。
分离：一种“分离”的生物组分(例如一种核酸、肽或蛋白质)已经实质上与该组分天然存在的生物体的细胞中的其他生物组分，例如其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质分开，脱离产生或纯化出来。已经“分离”的核酸、肽以及蛋白质因此包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在一个宿主细胞中重组表达所制备的核酸、肽以及蛋白质以及化学上合成的核酸。
可操作地连接：此术语是指接近组分，尤其核苷酸序列，使得这些组分的正常功能可以被执行。因此，当一个第一核酸序列以与一个第二核酸序列的一种功能关系放置时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。举例来说，如果一个启动子影响一个编码序列的转录或表达，那么该启动子可操作地连接到该编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是邻接的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下在相同的阅读框架中。“可操作地连接”到调节序列的一种编码序列是指核苷酸序列的一种配置，其中该编码序列可以在这些调节序列的调节控制(例如转录和/或翻译控制)下表达。
植物：任何植物和其子代。该术语还包括植物的多个部分，包括种子、插枝、块茎、果实、花等。如在此所使用，术语植物包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从其中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛以及在植物中完整或为植物的多个部分的植物细胞，例如胚芽、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝条、果实、茎、根、根尖、花粉囊等。再生植物的子代、变体以及突变体也包括在本发明的范围内。术语植物细胞，如在此所使用，是指植物的结构和生理学单元，由一个原生质体和周围细胞壁组成，包括具有遗传学变化，例如转化，已经关于一种所关注的基因受到影响的植物细胞，或是从因此改变的植物或细胞遗传而来并且包含该变化的植物或植物细胞。一种“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量主题植物或植物细胞的表型方面的变化的一个参考点。一种对照植物或植物细胞可以包含例如：(a)野生型植物或细胞，即与用于产生主题植物或细胞的遗传学变化的起始物质相同的基因型；(b)与起始物质相同的基因型，但已经用一种虚无构建体(即用对所关注的性状没有已知的影响的一种构建体，例如包含一种标记物基因的一种构建体)转化的一种植物或植物细胞；(c)是一种主题植物或植物细胞的子代中一种未转化的分离体的一种植物或植物细胞；(d)与主题植物或植物细胞在遗传上一致，但不暴露于将诱导所关注的基因表达的条件或刺激物的一种植物或植物细胞；或(e)处于不表达所关注的基因的条件下的主题植物或植物细胞自身。术语植物器官，如在此所使用，是指一种植物的独特并且明显分化的部分，例如根、茎干、叶或胚芽。更通常，术语植物组织是指在植物体内或在培养中的一种植物的任何组织。此术语包括整株植物、植物细胞、植物器官、原生质体、细胞培养物或组织成一种结构和功能单元的任何植物细胞群组。
聚核苷酸分子：基因组或合成来源的单链或双链DNA或RNA；也就是说，对应地从5′(上游)末端到3′(下游)末端读取的脱氧核塘核苷酸或核糖核苷酸碱基的一种聚合物。
启动子：通过对例如开启转录的RNA聚合酶II和其他蛋白质(起反式作用的转录因子)的识别和结合，引导一种核酸转录的一系列核酸控制序列。一种启动子包括接近转录起始位点的需要的核酸序列，例如在一种聚合酶II型启动子的情况下，一种TATA元件。最低限度地，一种启动子通常包括至少一个RNA聚合酶结合位点以及一个或多个转录因子结合位点，响应于被转录因子的占据而调节转录。在此描述启动子(和可以被组装以产生一种启动子的元件)的代表性实例。启动子可以通过其时间、空间或发育表达模式来定义。
一种植物启动子是在植物细胞中具有功能的一种天然或非天然启动子。在一个实例中，一种启动子是一种高水平组成性启动子，例如一种组织特异性启动子。
蛋白质：通过基因表达并且由氨基酸构成的一种生物分子，例如一种多肽。
原生质体：无细胞壁的一种分离的植物细胞，具有再生成细胞培养物或整个植物的潜能。
纯化：术语纯化不需要绝对的纯净；更确切些，它意图是相对性术语。因此，举例来说，一种纯化的蛋白质制剂是该蛋白质比该蛋白质处于其产生环境中，例如细胞内或生物化学反应室中更富集的蛋白质制剂。优选地，对蛋白质的一种制剂进行纯化，使得该蛋白质代表该制剂的总蛋白质含量的至少50％。
重组：一种重组核酸是具有非天然存在的一种序列或具有通过序列的两个另外分开的区段的人工组合所制造的一种序列的核酸。此人工组合时常是通过化学合成或，更通常，通过例如利用基因工程技术对核酸的分离的区段进行人工操纵来实现。类似地，一种重组蛋白质是通过一种重组核酸分子编码的蛋白质。
可调节启动子或诱导性启动子：活性通过一种作用剂，例如一种转录因子、一种化合物、一种环境条件或一种核酸分子进行调节(直接或间接地)的一种启动子。
调节基因表达：通过增加或减少一种影响基因表达的作用剂的表达、产生或活性来控制一种基因的表达的过程。该作用剂可以是一种蛋白质，例如一种转录因子，或一种核酸分子，例如一种miRNA或一种siRNA分子，它在与该基因或其上游调节序列或通过该基因编码的一种mRNA接触时增加或减少基因表达。
调节序列或元件：这些术语通常是指影响或控制一种可操作地连接的可转录聚核苷酸分子的转录或翻译并且从而影响或控制基因的表达的一类聚核苷酸分子(例如具有DNA序列的DNA分子)。包括在该术语内的是启动子、增强子、前导序列、内含子、基因座控制区、边界元件/隔离体、沉默子、基质连接区(也称为骨架连接区)、抑制子、转录终止子(也叫做转录终止区)、复制起点、着丝点以及减数分裂重组热点。启动子是接近一种基因的5'末端的DNA序列，它充当RNA聚合酶的结合位点并且由它开启转录。增强子是提高从一种启动子转录的水平的控制元件，通常与该增强子的取向或离该启动子的距离无关。基因座控制区(LCR)赋予它们连接到的基因以组织特异性和暂时调节的表达。LCR起作用与其相对于该基因的位置无关，但是与拷贝数目相关。相信它们用以打开核小体结构，使得其他因子可以结合于该DNA。LCR也可以影响复制时序和起点的使用。隔离体(也称为边界元件)是通过阻断周围染色质的作用，预防一种基因的转录活化(或不活化)的DNA序列。沉默子和抑制子是抑制基因表达的控制元件；它们作用于一种基因，与其取向或离该基因的距离无关。基质连接区(MAR)也称为骨架连接区，是DNA内结合于核骨架的序列。它们可以影响转录，可能是通过将染色体分开到调节结构域中。相信MAR介导染色体内更高级的成环结构。转录终止子是基因内邻近RNA聚合酶从模板释放处的区域。复制起点是在细胞分裂的DNA合成或复制期期间，开始DNA的复制过程的基因组区域。减数分裂重组热点是重组比减数分裂期间的平均值更频繁的基因组区域。一种调节区域内的特定核苷酸可以提供多个功能。举例来说，一种特定核苷酸可以是一种启动子的一部分并且参与一种转录激活蛋白的结合。在细胞中(例如，在植物或植物细胞中)起作用的分离的调节元件适用于例如通过基因工程来修饰植物表型。
RNA：通过磷酸二酯键连接的核糖核酸单体的一种典型线性聚合物。天然存在的RNA分子分成三大类：信使(mRNA，它编码蛋白质)、核糖体(rRNA，核糖体的组分)以及转移(tRNA，在蛋白质合成期间负责将氨基酸单体转移到核糖体的分子)。信使RNA包括杂核(hnRNA)和膜相关的多聚核糖体RNA(连接于粗糙型内质网)。总RNA是指所有类型RNA分子的一种不均匀混合物。
可筛选标记物：赋予通过观测或测试被识别的一种性状的一种标记物。
可选标记物：赋予可以通过化学方式，例如通过使用一种选择性试剂(例如，一种除草剂、抗生素等)进行选择的一种性状的一种标记物。可选标记物包括但不限于抗生素抗性基因，例如卡那霉素(nptII)、G418、博来霉素、潮霉素、氯霉素、氨苄西林、四环素等。其他的可选标记物包括一种编码双丙氨磷抗性的bar基因；一种编码草甘膦抗性的突变EPSP合成酶基因；一种赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；一种赋予咪唑啉酮或磺酰基脲抗性的突变乙酰乳酸合成酶基因(ALS)；或一种抗甲氨蝶呤的DHFR基因。在一个实例中，该可选标记物是AAD1。
序列一致性：两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性是根据这些序列之间的相似性，另称为序列一致性来表达。序列一致性经常是根据一致性(或相似性或同源性)百分比来测量；百分比越高，两个序列越相似。序列一致性百分比表示为一致性分数乘以100。一个或多个聚核苷酸或多肽序列的比较可以针对一种全长聚核苷酸或多肽序列或其一部分，或针对一种较长聚核苷酸序列。
用于比较的序列比对方法是本领域中众所周知的。各种程序和比对算法描述于以下各项中：史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)(《应用数学进展》(Adv.Appl.Math.)2:482,1981)；尼德尔曼(Needleman)和伍兹(Wunsch)(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443,1970)；皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)(《美国科学院院报》(PNAS.USA)85:2444,1988)；希金斯(Higgins)和夏普(Sharp)(《基因》(Gene),73:237-244,1988)；希金斯(Higgins)和夏普(Sharp)(《生物科学的计算机应用》(CABIOS)5:151-153,1989)；库珀特(Corpet)等人(《核酸研究》(Nuc.Acids Res.)16:10881-90,1988)；黄(Huang)等人(《生物科学的计算机应用》(Comp.Appls Biosci.)8:155-65,1992)；以及皮尔森(Pearson)等人(《分子生物学方法》(Methods in MolecularBiology)24:307-31,1994)。阿特舒尔(Altschul)等人(《自然-遗传学》(Nature Genet.)，6:119-29,1994)提供了序列对比方法和同源性计算的一个详细探讨。
比对工具ALIGN(麦尔斯(Myers)和米勒(Miller)，《生物科学的计算机应用》4:11-17,1989)或LFASTA(皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)，1988)可以用于执行序列比较(Internet 1996，皮尔森(W.R.Pearson)和弗吉尼亚大学(the University of Virginia)，“fasta20u63”版2.0u63，发稿时间1996年12月)。ALIGN针对彼此比较整个序列，而LFASTA比较局部相似区域。这些比对工具和其对应的教程可在因特网上网址biology.ncsa.uiuc.edu获得。
一种指定序列的直系同源物或旁系同源物(更通常，同源物)典型地特性为使用设定到缺省参数的ALIGN，在与一种指定蛋白质的氨基酸序列(或一种指定核酸分子的核酸序列)的全长比对上计算出具有超过75％序列一致性。具有与这些参考序列甚至更大的相似性的序列在通过此方法评估将展示递增的一致性百分比，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％序列一致性。在此类情况下，一致性百分比将基本上类似于针对全长序列一致性讨论的一致性百分比。
两个核酸分子密切相关的一种替代性指示是该两个分子在严格的条件下彼此杂交。严格的条件与序列相关并且在不同的环境参数下是不同的。通常，严格的条件被选择为约5℃到20℃，低于在界定的离子强度和pH下特定序列的热熔点(Tm)。Tm是50％的标靶序列杂交到一种完全匹配的探针所在的温度(在界定的离子强度和pH下)。核酸杂交的条件和严格性的计算可在萨姆布鲁克(Sambrook)等人(在《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)中，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约(New York)，1989)和田森(Tijssen)(《生物化学与分子生物学的实验室技术第I部分》(Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology Part I)，第2章，爱思唯尔(Elsevier)，纽约(NewYork)，1993)中找到。在严格的条件下杂交到一种指定蛋白质序列的核酸分子将典型地在0.2x SSC、0.1％SDS的洗涤条件下在65℃下杂交到一种探针，该探针基于该蛋白质编码序列、一种整个结构域或该编码序列的其他选择部分。
然而，未展示高度一致性的核酸序列由于遗传密码的简并而可能编码相似的氨基酸序列。应了解，核酸序列的变化可以使用此简并形成以产生每个编码实质上相同蛋白质的多个核酸序列。实质序列一致性百分比为至少约80％序列一致性，例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或甚至更大的序列一致性，例如约98％或约99％序列一致性。
大豆：黄豆并且包括可以用大豆育种的所有植物品种。
大豆胞囊线虫抗性基因：当在一种植物中表达时促进对大豆胞囊线虫的抗性的一种基因。可替代地，一种大豆胞囊线虫基因可以是抗性基因的一种等位基因变体，尤其是引起一种易感染表型的变体。
一个转基因事件是通过以下来产生：用包含一种核酸表达盒的一种异源DNA构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含一种所关注的转基因；由该转基因插入该植物的基因组中所产生的一个植物群体的再生；并且选择一种特性为插入一个具体基因组位置中的具体植物。在本披露的一些实施例中，所关注的转基因可操作地连接到一个所披露的诱导性启动子，例如SEQ ID NO:1或2。一个事件在表型上通过转基因的表达来表征。在遗传学水平，一个事件是一种植物的遗传学组成的一部分。术语“事件”也是指通过转化体与包含异源DNA的另一个品种之间的一种有性远交所产生的子代。甚至在与一种轮回亲本重复反交后，来自转化的母体的插入的DNA与侧接DNA存在于杂交物的子代中相同的染色体位置上。该术语“事件”也是指来自包含插入的DNA和与插入的DNA紧邻的侧接序列的原始转化体的DNA，将期待其转移到因包含插入的DNA的一个亲本株系(例如原始转化体和由自体授精产生的子代)与不含该插入的DNA的一个亲本株系的一个有性杂交而接收了包含所关注的转基因的插入的DNA的一个子代中。
转基因植物：含有被插入其细胞核基因组或细胞器基因组中的一种外来的(异源的)核苷酸序列的一种植物。
转基因：通过一种转化技术插入一种宿主细胞或多种宿主细胞中的一种核酸序列。
转基因：此术语是指含有在此类型实体/物种中通常未发现的重组遗传物质(也就是说，异源的遗传物质)并且已经通过人类操纵引入所讨论的实体中(或该实体的祖代中)的一种植物/真菌/细胞/其他实体或生物体。因此，从通过转化引入重组DNA的一种植物细胞(一种转化的植物细胞)生长的一种植物是一种转基因植物，含有该引入的转基因的该植物的所有后代(无论有性还是无性产生)也是一种转基因植物。
转化：外源性DNA进入并且改变一种受体细胞的过程。其可以在自然条件下发生，或在人工条件下使用本领域中众所周知的各种方法发生。转化可以依赖于用于将外来的核酸序列插入一种原核或真核宿主细胞中的任何已知的方法。该方法的选择受所转化的该宿主细胞影响并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质转染以及粒子轰击。
载体：引入一种宿主细胞中，从而产生一种转化的宿主细胞的一种核酸分子。一种载体可以包含允许其在该宿主细胞中复制的核酸序列，例如一个复制起点。一种载体也可以包括一种或多种治疗基因和/或可选标记物基因和本领域中已知的其他遗传元件。一种载体可以转导、转化或感染一种细胞，从而引起该细胞表达除对该细胞来说是天然的核酸和/或蛋白质以外的核酸和/或蛋白质。一种载体任选地包含有助于实现核酸进入该细胞中的物质，例如一种病毒粒子、脂质体、蛋白质外壳等。
下文中描述用于实践或测试本披露的适合的方法与材料。这些方法与材料仅是例示性的并且不意图限制性。可以使用其他与在此描述的方法与材料相似或同等的方法与材料。举例来说，所披露的发明所涉及的领域中所众所周知的常规方法在各种通常和更特定的参考文献中描述，这些参考文献包括例如萨姆布鲁克等人，《分子克隆实验指南》，第2版，冷泉港实验室出版社，1989；萨姆布鲁克等人，《分子克隆实验指南》，第3版，冷泉港出版社，2001；奥苏贝尔(Ausubel)等人，《分子生物学现行规范》(Current Protocols in Molecular Biology)，格林尼出版公司(GreenePublishing Associates)，1992(和2000增刊)；以及奥苏贝尔等人，《分子生物学的短方案：来自分子生物学现行规范的方法的概要》(ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology)，第4版，威利父子公司(Wiley&Sons)，1999。
III.数个实施例的说明
本披露描述新颖的害虫抗性基因，例如编码GmSAMT1(例如SEQ IDNO:1中所阐述)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述)的一种核酸序列或其功能性片段。还提供DNA构建体，这些DNA构建体包含一种所描述的害虫抗性基因。在一个实施例中，该害虫抗性基因赋予一种表达其的植物以一种农艺学性状，例如害虫抗性，例如对SCN的抗性。
还提供转基因植物。在一个实施例中，一种转基因植物被一种所披露的DNA构建体稳定地转化。在一些实施例中，该转基因植物是一种双子叶植物。在其他实施例中，该转基因植物是一种单子叶植物。在一个具体实施例中，该转基因植物是一种大豆植物。进一步提供一种所披露的转基因植物的一个种子。在一个实施例中，该种子包含该所披露的DNA构建体。甚至进一步提供一种转基因植物细胞或组织。在一个实施例中，一种转基因植物细胞或组织包含一种所披露的害虫抗性基因。在一些实施例中，该植物细胞或组织来源于一种双子叶植物。在其他实施例中，该植物细胞或组织来自一种单子叶植物。在一个具体实施例中，该植物细胞或组织来自一种大豆植物。
还提供了产生一种所披露的转基因植物、植物细胞、种子或组织的方法。在一些实施例中，该方法包括用一种所披露的DNA构建体转化一种植物细胞或组织。在一些实施例中，该方法是在一种植物中增强疾病抗性的一种方法。
进一步提供一种植物细胞、果实、叶、根、芽、花、种子、插枝以及适用于有性或无性繁殖的其他繁殖材料、包括F1杂种的子代植物、雄性不育植物以及可来源于所披露的转基因植物的所有其他植物和植物产品。
A.植物病原体抗性基因
本披露提供了先前未被认识的从大豆分离的害虫抗性基因。在一个实施例中，一种害虫抗性基因编码一种S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性羧基甲基转移酶并且称为GmSAMT1。在另一个实施例中，一种害虫抗性基因编码一种水杨酸甲酯酯酶并且称为GmSABP2-1。
在一个实施例中，一种GmSAMT1核酸序列提供为以下的SEQ ID NO:1：
ATGGAAGTAGCACAGGTACTCCACATGAACGGTGGCGTTGGAGACGCAAGCTATGCAAACAACTCCCTTGTTCAGCAAAAGGTGATTTGTTTGACAAAGCCCATAAGAGAGGAAGCCATAAGAAGCCTCTATTGCAGCACACACCCCAGAAGCTTGGCAATTGCAGATTTGGGTTGCTCTTCTGGACCAAACACTTTATTTGTTGTGTCTGAATTCATAAAAATTGTGGAGAAGCTTTGCCGAGAGCTGAACCACAAATCTCCAGAATACAAAGTCTTTCTGAATGATCTCCCTGGGAATGACTTCAACAACATCTTCAAGTCTCTTGACAGCGTCAAAGAGAAATTGTGTGATGAAATGGAAAGTGGGATCGGTCCATGCTACTTCTCGGGTGTTCCCGGTTCTTTCTATGGAAGGGTTTTCCCATATCAAAGTCTTCATTTTGTCCATTCCTCATACAGCCTTCAATGGCTATCTAAGGTTCCTGAGGGTGTAGACAACAACAAGGGCAATGTTTACATAGGCAGTACGAGCCCCAAAAATGTTGTGAGAGCTTACTATGAGCAATTTCAGAGAGATTTCTCTCTTTTTCTCAAGTGTCGTGCAGAGGAATTGGTTGAAGGAGGACGCATGGTTCTCACATTTTTGGGAAGAAGAAGCGATGATCCATCTAGCAAGGATGGTTGCTACATTTGGGAGCTTTTGGCTACTGCTCTTAGTGATATGGTCTTGCAGGGAATCATAAGAGAAGAGCAATTAGATACTTTTAACATCCCTCAATACACTCCATCCCCATCTGAAGTGAAATTGGAAGTTCTTAAAGAAGGATCATTCGCCATCAATCGTCTAGAGGTTTCTGAGGTGAATTGGAATGCTCTCGATGAGTGGAATGCTCTAGACTTTGAATCTGAAAGGTCTGAATCACTTAGTGATGGTGAATACAATGTGGCACAGTGCATGAGGGCTGTGGCAGAACCTATGCTGATTAGCCACTTTGGTGAAGCTATCATTGAAGAGGTTTTTTGCCGCTACCAGCAAATCTTGGCTGAACGTATGTCCAAGGAGAAAACCAAGTTCATCAATGTTACCATATTATTGACTAGAAAAGCATAA(SEQ ID NO:1)。虽然已经针对GmSAMT1展示一种具体核酸序列，但是应了解，借助于编码一种GmSAMT1蛋白质(例如通过SEQ ID NO:1编码)的遗传密码的简并，一种GmSAMT1核酸序列包括任何核酸序列冗余。
在一个实施例中，一种GmSABP2-1核酸序列提供为以下的SEQ ID NO:2：
ATGGGTTCACAAAATTGTATGGATAGGAAGCACTATGTTCTGGTGCATGGGGCATGCCATGGAGCTTGGTGTTGGTATAAGCTCAAGCCACGCTTGGAATCTGCAGGCCATAAGGTCACAGTACTTGACCTTGCAGCTTCTGGAACCAACATGAAGAAAATTGAAGATGTTGATACTTTCTCAGAGTATTCTGCGCCTTTGTTGCAGCTAATGGCCACAATTCCCTCAAATGAGAAGTTAGTTCTAGTTGGTCACAGCCTTGGAGGGCTGAACATAGCACTTGCAATGGAGAAATTCCCAGAAAAGGTAGCAGTTGGTGTTTTCTTAACAGCTTTTGCTCCAGACACTGAACACCACCCATCTTATGTCTTGGAAAAGTACAATGAGAGGACCCCGTTAGCTGCATGGTTAGACACTGAATTTGCTCCAAGCGGAAACAAAACATCAATGTTCTTCGGCCCCAACTTCTTGTCCGACAAGCTCTACCAACTGTCCCCTATTGAGGACTTGGAATTGGCCAAGACTTTAGCAAGGCCATCATCGCTCTTCATGGAAGACTTGACTAAACAAAAGAACTTCTCCAAAGAGGGATATGGGTCAGTTCCACGTGCCTTTATTGTTTGCACGGAGGACCTTGGAATTCCATTGGAATATCAGCTCTTGATGATCCAAAATGTTGGGTTCAATGACGTTGTAGAGGTCAAAGACGCAGATCATATGGTTATGCTTTGCAAGCCACAAGAACTATTCGATTCCCTCCAGCAGATAGCGACTAAATATGCATGA(SEQ ID NO:2)。虽然已经针对GmSABP2-1展示一种具体核酸序列，但是应了解，借助于编码一种GmSABP2-1蛋白质(例如通过SEQ ID NO:2编码)的遗传密码的简并，一种GmSABP2-1核酸序列包括任何核酸序列冗余。
本披露还涵盖从大豆分离的所披露的害虫抗性基因的变体。变体核苷酸序列还包括合成获得的核苷酸序列，例如，例如通过使用定点诱变产生，但在表达时仍然显示出害虫抗性活性的核苷酸序列。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域中众所周知的。参见例如金克尔(Kunkel)(1985)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl Acad.Sci.USA)52:488-492：金克尔等人(1987)《酶学方法》(Methods in Enzymol.)75:367-382；美国专利号4,873,192；沃克(Walker)和嘉仕堡(Gaastra)编辑(1983)《分子生物学技术》(Techniques in Molecular Biology)(纽约麦克米兰出版有限公司(MacMillan Publishing Company,New York))以及在其中引用的参考文献。将进一步了解，由GmSABP2-1核酸和GmSAMT1核酸编码的氨基酸序列将典型地允许在氨基酸序列中的取代并且实质上保留生物活性。为了按照常规识别出生物学上活性的氨基酸取代，可以基于本领域中已知的任何特性，包括氨基酸侧链取代基的相对相似性或差异，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。通常，核苷酸序列变体将编码与由一种所披露的害虫抗性基因编码的蛋白质具有至少80％序列一致性，例如与由其对应的参考害虫抗性基因核苷酸序列编码的蛋白质具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更大的序列一致性的一种蛋白质。因此，披露的是GmSABP2-1核酸，这些核酸编码与由SEQ ID NO:2或一种简并核酸编码的蛋白质具有约80％序列同源性，例如与由SEQ ID NO:2或一种简并核酸编码的蛋白质具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更大的序列一致性的一种蛋白质。还披露了GmSAMT1核酸，这些核酸与由SEQ ID NO:1或一种简并核酸编码的蛋白质具有约80％序列同源性，例如与由SEQ ID NO:1或一种简并核酸编码的蛋白质具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更大的序列一致性。在一些实施例中，与由SEQ ID NO:1或一种简并核酸编码的蛋白质具有约80％序列同源性，例如与由SEQ ID NO:1或一种简并核酸编码的蛋白质具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更大的序列一致性的一种核酸相对于SEQ ID NO:1不具有在位号627上的一个A。还披露了GmSABP2-1核酸，这些核酸与SEQ ID NO:2或一种简并核酸具有约80％序列同源性，例如与SEQ ID NO:2或一种简并核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更大的序列一致性。还披露了GmSAMT1核酸，这些核酸与SEQ ID NO:1或一种简并核酸具有约80％序列同源性，例如与SEQ ID NO:1或一种简并核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更大的序列一致性。在一些实施例中，与SEQ ID NO:1或一种简并核酸具有约80％序列同源性，例如与SEQ ID NO:1或一种简并核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更大的序列一致性的一种核酸相对于SEQ ID NO:1不具有在位号627上的一个A。
在一些实施例中，一种所披露的害虫抗性核酸编码一种GmSABP2-1或GmSAMT1核酸的一种功能性片段。该GmSABP2-1和GmSAMT1的这些功能性片段仍然显示出害虫抗性活性。功能性片段包括其中N-末端、C-末端和/或全长蛋白质内部的残基已经缺失的蛋白质。
由该GmSABP2-1基因编码的蛋白质是酶的α/β水解酶超家族的一名成员，具有Ser、Asp、His催化三联体，它们的位置在图15中通过箭头展示。另外，来自烟草的该相关酶的晶体结构已经在原子级分辨率上解决(参见福鲁哈尔(Forouhar)等人，《美国科学院院报》102(5)1773-1778,2005)。因此，本领域的普通技术人员可以产生gmSABP2的功能性片段和/或变体(以及编码这些片段的核酸)，例如同时维持催化三联体。这些片段可以使用最少的实验，在说明书中呈现的指导下，针对活性进行测试。举例来说，基于酶的α/β水解酶超家族的结构，本领域的普通技术人员可以使由GmSABP2-1基因编码的蛋白质的N-末端、C-末端和/或内部环路上的几个氨基酸缺失，而不影响活性位点催化三联体。举例来说，从N-末端、C-末端和/或内部环路小于约50个、40个、30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个缺失的缺失，同时维持活性位点催化三联体，使用最少的测试和/或实验确定所得蛋白质的活性。
由GmSAMT1基因编码的蛋白质是一种S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性羧基甲基转移酶，称为GmSAMT1，属于SABATH甲基转移酶家族。SABATH家族成员的晶体结构已经在原子级分辨率上解决，并且该酶的活性位点定位(参见赵(Zhao)等人《植物生理学》(PlantPhysiol.)146(2):455-467,2008)。因此，本领域的普通技术人员可以产生GmSAMT1的功能性片段和/或变体(以及编码这些片段的核酸)，例如同时维持催化三联体。这些片段可以使用最少的实验，在本说明书中呈现的指导下，针对活性进行测试。举例来说，基于酶的SABATH家族的结构，本领域的普通技术人员可以使由GmSAMT1基因编码的蛋白质的N-末端、C-末端和/或内部环路上的几个氨基酸缺失，而不影响活性位点c。举例来说，从N-末端、C-末端和/或内部环路小于约50个、40个、30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个缺失的缺失，同时维持活性位点催化三联体，使用最少的测试和/或实验确定所得蛋白质的活性。
B.表达盒
所披露的害虫抗性基因的这些核苷酸序列，例如编码GmSAMT1(例如SEQ ID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述或其一种简并变体)的一种核酸序列或其功能性片段，适用于任何植物的基因操作，以在与例如一种诱导性或组成性启动子的一种启动子可操作地连接时赋予对害虫，例如昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、螨、蜱等，例如SCN的抗性。“可操作地连接”意思是所披露的害虫抗性基因的转录或翻译在该启动子序列的影响下。以此方式，所披露的害虫抗性基因的核苷酸序列提供于用于在所关注的植物中表达的表达盒中。这些表达盒将典型地包含一个转录开启区，该转录开启区包含与所披露的害虫抗性基因或其变体中的一个或多个可操作地连接的一种启动子核苷酸序列。此类表达盒可以具备多个限制位点供核苷酸序列插入在调节区域的转录调节。该表达盒可以另外含有可选标记物基因或序列。本披露的表达盒可以是一种表达载体的一部分和一种表达载体，例如一种质粒。
在一些实施例中，转录盒在转录的5'到3'方向上将包括一个转录和翻译开启区、一种害虫抗性基因(例如编码GmSAMT1(例如SEQ ID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述或其一种简并变体)的一种核酸序列或其功能性片段)以及在植物细胞中具有功能的一个转录和翻译终止区。该终止区可以与转录开启区一起是天然的，可以与该害虫抗性基因一起是天然的，或者可以来源于另一个来源。适宜的终止区从根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒可获得，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。还参见关宁国(Guerineau)等人，《分子遗传学和基因组学》(Mol.Gen.Genet.)262:141-144,1991；普劳德富特塞尔(Proudfoot)《细胞》(Cell)64:671-674,1991；山法肯(Sanfacon)等人，《基因与发育》(Genes Dev.)5:141-149,1991；摩根(Mogen)等人，《植物细胞》(Plant Cell)2:1261-1272,1990；门罗(Munroe)等人，《基因》(Gene)91:151-158,1990；巴拉斯(Ballas)等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)17:7891-7903,1989；朱西(Joshi)等人，《核酸研究》15:9627-9639,1987。
包括与一种启动子序列可操作地连接的一种所披露的害虫抗性基因(例如编码GmSAMT1(例如SEQ ID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述或其一种简并变体)的一种核酸序列或其功能性片段)的一种表达盒还可以含有有待共同转化到生物体中的一种基因的至少其他核苷酸序列。可替代地，其他的序列可以提供在另一个表达盒上。
适当时，需要表达的核苷酸序列可以针对在转化的植物中的增加表达而优化。也就是说，这些核苷酸序列可以使用针对改良表达优选的植物密码子来合成。方法从用于合成植物优选核苷酸序列的领域中可获得。参见例如美国专利号5,380,831和5,436,391，以及木瑞(Murray)等人，核酸研究17:477-498,1989。
已知其他的序列修饰以增强一种细胞主体中的基因表达。这些包括了编码虚假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及可能对基因表达不利的其他这些良好表征的序列的消除。异源核苷酸序列的G-C含量可以调到一种既定细胞主体的水平平均值，如参考在该宿主细胞中表达的已知基因所计算。可能时，该序列进行修饰以避免所预测的发夹二级mRNA结构。
这些表达盒可以在表达盒构建体中另外含有5'前导序列。这些前导序列可以用以增强翻译。翻译前导序列在本领域中已知并且包括：细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(爱罗伊-斯坦(Elroy-Stein)等人，《美国国家科学院院刊》86:6126-6130,1989)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病病毒)；人类免疫球蛋白重链结合蛋白质(BiP)(马策耶克(Macejak)和萨诺沃(Sarnow)《自然》(Nature)353:90-94,1991)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMVRNA4)(乔布林(Jobling)和格尔克(Gehrke)《自然》325:622-625,1987)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(格里(Gallie)等人《RNA的分子生物学》(Molecular Biology of RNA)，第237-256页，1989；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(洛梅尔(Lommel)等人，《病毒学》(Virology)81:382-385,1991)。又参见黛拉-乔帕(Della-Cioppa)等人，《植物生理学》(Plant Physiology)84:965-968,1987。还可以利用已知增强翻译和/或mRNA稳定性的其他方法，例如内含子等。
在需要使一种害虫抗性基因的表达产物针对一种具体细胞器(例如叶绿体或线粒体)或在细胞的表面或细胞外分泌的情况下，表达盒可以进一步包含用于一种转运肽的一种编码序列。这些转运肽是本领域中众所周知的并且包括但不限于用于酰基载体蛋白的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合成酶等。
在制备表达盒时，各种DNA片段可以通过本领域中已知的方法操纵，以便提供呈适当取向并且视情况呈适当阅读框架的DNA序列。为此，适配子或接头可以用以连接DNA片段或可以包括其他操纵以提供适宜限制位点、去除多余DNA、去除限制位点等。为了这一目的，可以包括体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，例如转换和颠换。
表达盒可以包括报导基因或可选标记物基因。本领域中已知的适合的报导基因的实例可以在以下各项中发现：例如杰佛森(Jefferson)等人《植物分子生物学指南》(Plant Molecular Biology Manual)，格尔文(Gelvin)等人编辑(克吕韦尔学术出版社(Kluwer Academic Publishers))，第1-33页，1991；德维特(DeWet)等人，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)7:725-737,1987；高夫(Goff)等人，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)9:2517-2522,1990；以及凯恩(Kain)等人，《生物技术》(BioTechniques)19:650-655,1995；以及赵(Chiu)等人，《当代生物学》(Current Biology)6:325-330,1996。用于转化细胞或组织的选择的可选标记物基因可以包括赋予抗生素抗性或对除草剂的抗性的基因。适合可选标记物基因的实例包括(但不限于)编码对以下各项的抗性的基因：氯霉素(赫雷拉·埃斯特雷利亚(Herrera Estrella)等人，《欧洲分子生物学组织杂志》2:987-992,1983)；甲氨蝶呤(赫雷拉·埃斯特雷利亚等人，《自然》303:209-213,1983；梅耶尔(Meijer)等人，《植物分子生物学》16:807-820,1991)；潮霉素(沃尔德伦(Waldron)等人，《植物分子生物学》5:103-108,1985；志坚(Zhijian)等人，《植物科学》108:219-227,1995)；链霉素(琼斯(Jones)等人，《分子遗传学和基因组学》(Mol.Gen.Genet.)210:86-91,1987)；大观霉素(布列塔尼-萨尼亚尔德(Bretagne-Sagnard)等人，《转基因研究》(Transgenic Res.)5:131-137,1996)；博来霉素(赫利(Hille)等人，《植物分子生物学》7:171-176,1990)；磺酰胺(关宁国等人，《植物分子生物学》15:127-136,1990)；溴苯腈(斯托克(Stalker)等人，《科学》(Science)242:419-423,1988)；草甘膦(邵(Shaw)等人，《科学》233:478-481,1986)；以及膦丝菌素(德布洛克(DeBlock)等人，《欧洲分子生物学组织杂志》6:2513-2518,1987)。
可以用于转基因事件的回收但可能不是最终产物中所需的其他基因将包括但不限于例如GUS(b-葡萄糖醛酸酶；杰佛森《植物分子生物学》报告5:387,1987)、GFP以及其他相关荧光蛋白质以及萤光素酶的实例。在一些实施例中，表达盒是pJL-OFP-35S::GmSAMT1或pJL-OFP-35S::GmSABP2-1。以下是二元载体pJL-OFP-35S::GmSAMT1的序列，以粗体展示GmSAMT1的反向互补序列。
TCATGGCTCTTTCAAAGCAAAGTGGGGTCAAAGATGTAATGAACACCGAGCTTCAT
ATGGACGGGATCGTCAATGGACACCCCTTTGAGATAAAAGGAAAAGGAAAGGGAAA
CCCGTACAAGGGTGTGCAGACCATGAAACTTACAGTCATTAAGGGTGCGCCTTTGC
CATTTTCTATTGACATTTTGCTGCCTCAACACATGTATGGAAGCAAGCCATTTATT
AAGTATCCTGAGAGTATCCCAGACTACATCAAGTTGTCATTTCCCGAGGGAATCAC
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CCAGGCTCGATGGCGACTCTTTCATCTACGAAGTCAGGTTTCTTGGCGTGAACTTT
CCCCGAGATGGACCTGTTATGCAGAAGAAGACGCGAGGCTGGGACCCGTCCACAGA
GAGACTGTATGAGTGTGGTGGGTGGCAGAGAGGAGACGTCCACATGGCCTTGAAGT
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GGCTTGAAGGTGCCACCGTATCACTTCGTTGACCACAAACTAGATTTACTGAGCCA
CAACACCGATGGTGCTACCTTTGAAGAGTTTGAACAACGAGAAATTGCACATGCAC
ATCTTTCTAACTTACCGGTAGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATCGTTCAAAC
ATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTAT
CATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGA
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ATCTATGTTACTAGATCCCATGGCTACTACTAAGCATTTGGCTCTTGCCATCCTTG
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AATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTT
TTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGT
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ATGTCTGGTACGAACGTGAGTTCACGGTGCCGGCCTATCTGAAGGATCAGCGTATC
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AATGGCCCAACCGGGACTGTGACCTATACGGTGGACTTTCAAGGCAAAGCCGAGAC
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CTCTACCAGATCAAAGTGGAACTGGTGAACGACGGACTGACCATCGATGTCTATGA
AGAGCCGTTCGGCGTGCGGACCGTGGAAGTCAACGACGGCAAGTTCCTCATCAACA
ACAAACCGTTCTACTTCAAGGGCTTTGGCAAACATGAGGACACTCCTATCAACGGC
CGTGGCTTTAACGAAGCGAGCAATGTGATGGATTTCAATATCCTCAAATGGATCGG
CGCCAACAGCTTCCGGACCGCACACTATCCGTACTCTGAAGAGTTGATGCGTCTTG
CGGATCGCGAGGGTCTGGTCGTGATCGACGAGACTCCGGCAGTTGGCGTGCACCTC
AACTTCATGGCCACCACGGGACTCGGCGAAGGCAGCGAGCGCGTCAGTACCTGGGA
GAAGATTCGGACGTTTGAGCACCATCAAGACGTTCTCCGTGAACTGGTGTCTCGTG
ACAAGAACCATCCAAGCGTCGTGATGTGGAGCATCGCCAACGAGGCGGCGACTGAG
GAAGAGGGCGCGTACGAGTACTTCAAGCCGTTGGTGGAGCTGACCAAGGAACTCGA
CCCACAGAAGCGTCCGGTCACGATCGTGCTGTTTGTGATGGCTACCCCGGAGACGG
ACAAAGTCGCCGAACTGATTGACGTCATCGCGCTCAATCGCTATAACGGATGGTAC
TTCGATGGCGGTGATCTCGAAGCGGCCAAAGTCCATCTCCGCCAGGAATTTCACGC
GTGGAACAAGCGTTGCCCAGGAAAGCCGATCATGATCACTGAGTACGGCGCAGACA
CCGTTGCGGGCTTTCACGACATTGATCCAGTGATGTTCACCGAGGAATATCAAGTC
GAGTACTACCAGGCGAACCACGTCGTGTTCGATGAGTTTGAGAACTTCGTGGGTGA
GCAAGCGTGGAACTTCGCGGACTTCGCGACCTCTCAGGGCGTGATGCGCGTCCAAG
GAAACAAGAAGGGCGTGTTCACTCGTGACCGCAAGCCGAAGCTCGCCGCGCACGTC
TTTCGCGAGCGCTGGACCAACATTCCAGATTTCGGCTACAAGAACGCTAGCCATCA
CCATCACCATCACGTGTGAATTGGTGACCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAAC
ATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTAT
CATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGA
CGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATAC
GCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTC
ATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCG
GGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTG
AAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTC
GGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGA
CGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCG
ACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCA
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CCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCA
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GGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCAC
AGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCG
GCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGA
GGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGA
CCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGA
AACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCG
GAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCG
GCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCA
GCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAG
TAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACA
AATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTC
AGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCG
ATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTG
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CGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGG
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CCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCG
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GCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTT
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TTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGA
ATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAAC
AACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCA
GGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCC
CGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCG
CTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACG
CATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCC
GCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCC
AAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCG
CGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGAC
GAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCA
GGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTC
CCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCC
GCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGC
GGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGT
TGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGG
GTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAG
TACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAA
CCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCC
GTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTG
TTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTT
CACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGG
AGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGC
GAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGC
AGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACC
CAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATT
GGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTC
CGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCAT
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AAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGT
CGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGA
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TGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTT
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TCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCA
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AGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTT
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TGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCT
CGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCC
CTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTG
TAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCG
CTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTAT
CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGT
GCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATT
TGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTT
GATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAG
ATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTC
TGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGT
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GTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCA
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GATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATA
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TTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTATGGAGAAACTCGAGCTTGTCGAT
CGACAGATCCGGTCGGCATCTACTCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGC
GTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCG
CTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGC
GTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCT
GATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGTCGTGGCGATCCT
GCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAA
CCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCG
CCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTG
GAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAG
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GTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAG
ATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATAGCCTCCGCGACCGGTTGTAGAACAGCGGGCA
GTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAA
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GGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGC
TATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGAT
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CGGGATCTGCGAAAGCTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCA
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GCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGG
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ATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGA
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TGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGA
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ACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCT
TTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATG
ATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGA
TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTC
TCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAG
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CCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGA
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CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA
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GCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCGGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTC
AATTGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTTTTGGAGTAGACAAGTG
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CTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTAGGTCCTCTATTTG
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TCTCTATTACTTGCCTTGGTTTGTGAAGCAAGCCTTGAATCGTCCATACTGGAATA
GTACTTCTGATCTTGAGAAATATATCTTTCTCTGTGTTCTTGATGCAGTTAGTCCT
GAATCTTTTGACTGCATCTTTAACCTTCTTGGGAAGGTATTTGATTTCCTGGAGAT
TATTGCTCGGGTAGATCGTCTTGATGAGACCTGCTGCGTAAGCCTCTCTAACCATC
TGTGGGTTAGCATTCTTTCTGAAATTGAAAAGGCTAATCTGGGGACCTGCAGGCAT
GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGT
TACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCG
AAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGC
TAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAGCTTCAT
GGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAAC
AGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATG
GTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGA
CCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGAT
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TCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGC
CGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAG
ACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTA
AGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAG
TTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTTGAC(SEQiD NO:3)
以下是二元载体pJL-OFP-35S：：GmSABP2-1的序列，以粗体展示GmSABP2-1的反向互补序列。
TCATGGCTCTTTCAAAGCAAAGTGGGGTCAAAGATGTAATGAACACCGAGCTTCAT
ATGGACGGGATCGTCAATGGACACCCCTTTGAGATAAAAGGAAAAGGAAAGGGAAA
CCCGTACAAGGGTGTGCAGACCATGAAACTTACAGTCATTAAGGGTGCGCCTTTGC
CATTTTCTATTGACATTTTGCTGCCTCAACACATGTATGGAAGCAAGCCATTTATT
AAGTATCCTGAGAGTATCCCAGACTACATCAAGTTGTCATTTCCCGAGGGAATCAC
ATGGGAAAGGTCCATGACCTTTGAAGATGGTGCAGTGTGCACTGTCTCTAACGACT
CCAGGCTCGATGGCGACTCTTTCATCTACGAAGTCAGGTTTCTTGGCGTGAACTTT
CCCCGAGATGGACCTGTTATGCAGAAGAAGACGCGAGGCTGGGACCCGTCCACAGA
GAGACTGTATGAGTGTGGTGGGTGGCAGAGAGGAGACGTCCACATGGCCTTGAAGT
TGGAGAACGGTGGCCATTATACGTGCGACTTCAAAACTACTTACAAATCAAAGAAG
GGCTTGAAGGTGCCACCGTATCACTTCGTTGACCACAAACTAGATTTACTGAGCCA
CAACACCGATGGTGCTACCTTTGAAGAGTTTGAACAACGAGAAATTGCACATGCAC
ATCTTTCTAACTTACCGGTAGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATCGTTCAAAC
ATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTAT
CATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGA
CGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATAC
GCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTC
ATCTATGTTACTAGATCCCATGGCTACTACTAAGCATTTGGCTCTTGCCATCCTTG
TCCTCCTTAGCATTGGTATGACCACCAGTGCAAGAACCCTCCTAGATCTGAGGGTA
AATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTT
TTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGT
GTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATG
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GCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGA
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AACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCG
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CGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCC
CTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTG
TAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCG
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CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGT
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GTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCA
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GATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATA
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ATACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCTAA
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GATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGTCGTGGCGATCCT
GCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAA
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CCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTG
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GTTAGTCCTGAATCTTTTGACTGCATCTTTAACCTTCTTGGGAAGGTATTTGATTT
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CTAACCATCTGTGGGTTAGCATTCTTTCTGAAATTGAAAAGGCTAATCTGGGGACC
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AAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCC
ACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTAT
ATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTTGAC(SEQIDNO:4)
C.转基因学
可以使用与启动子和任选地其他异源核酸可操作地连接的一种表达盒来转化任何植物，例如作为载体，例如质粒，该表达盒包括一种编码GmSAMT1(例如SEQ ID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述)的所披露的核酸序列或其功能性片段。以此方式，可以获得遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。因此，披露了产生对害虫有抗性的一种植物的方法。这些方法包括将与启动子和任选地其他异源核酸可操作地连接的GmSAMT1(例如SEQID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述或其一种简并变体)或其功能性片段引入一种植物中。还披露了增加一种植物中害虫抗性的方法。这些方法包括将与启动子和任选地其他异源核酸可操作地连接的GmSAMT1(例如SEQ ID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述或其一种简并变体)或其功能性片段引入一种植物中，从而增加该植物中的害虫抗性。该植物可以瞬时或稳定地转化。害虫抗性，例如害虫抗性的增加可以相对于一种相关对照植物测定，该植物例如不表达一种在此披露的害虫抗性多肽的一种植物、还未被编码如在此披露的一种害虫抗性多肽的一种核酸转化的一种植物、被一种不相关核酸转化的一种植物等。该对照植物通常在物种、品种、龄期等方面匹配并且经受相同的生长条件，例如温度、土壤、阳光、pH、水等。一种适合的对照植物之选择对本领域的普通技术人员来说是常规的。
转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物中的方案可以视目标是进行转化的植物或植物细胞的类型，例如单子叶植物或双子叶植物而变化。将核苷酸序列引入植物细胞并且随后插入植物基因组中的适合方法包括微注射(克洛斯威(Crossway)等人，《生物技术》(Biotechniques)4:320-334,1986)、电穿孔(里格斯(Riggs)等人，美国国家科学院院刊53:5602-5606,1986)、土壤杆菌属介导的转化(美国专利号5,563,055)、直接基因转移(帕克沃斯基(Paszkowski)等人，欧洲分子生物学组织杂志3:2717-2722,1984)以及弹道式粒子加速(参见例如美国专利号4,945,050；汤姆斯(Tomes)等人“通过微粒轰击直接DNA转移到完整植物细胞”(DirectDNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment)，《植物细胞、组织以及器官培养：基本方法》(Plant Cell,Tissue,and OrganCulture:Fundamental Methods)，甘博格(Gamborg)和菲利浦斯(Phillips)编辑(德国施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin)，1995；以及麦凯布(McCabe)等人，生物技术5:923-926,1988)。还参见魏辛格(Weissinger)等人，《遗传学年评》(Ann.Rev.Genet.)22:421-477,1988；桑福德(Sanford)等人，《粒子科学与技术》(Paniculate Scienceand Technology)5:27-37,1987；基斯图(Christou)等人，植物生理学(Plant Physiol)57:671-674,1988；麦凯布等人，《生物技术》(Bio/Technology)5:923-926,1988；法呐(Finer)和麦克马伦(McMullen)，《体外细胞发育生物学》(In Vitro Cell Dev.Biol.)27P:175-182,1991；辛格(Singh)等人，《理论与应用遗传学》(Theor.Appl Genet.)95:319-324,1998；达塔(Datta)等人，生物技术5:736-740,1990；克莱恩(Klein)等人，美国国家科学院院刊55:4305-4309,1988；克莱恩等人，生物技术5:559-563,1988；美国专利号5,240,855、5,322,783以及5,324,646；克莱恩等人，植物生理学97:440-444,1988；弗罗姆(Fromm)等人生物技术5:833-839,1990；霍伊卡-范思罗特(Hooykaas-Van Slogteren)等人，自然377:763-764,1984；柏特贝尔(Bytebier)等人，美国国家科学院院刊54:5345-5349,1987；德威特(De Wet)等人(1985)《胚珠组织的实验性操纵》(The Experimental Manipulation ofOvule Tissues)，查普曼(Chapman)等人编辑(纽约朗曼(Longman,NewYork))，第197-209页；凯普勒(Kaeppler)等人，《植物细胞报告》(Plant Cell Reports)9:415-418,1990；凯普勒等人，《理论与应用遗传学》54:560-566,1992；德·阿吕安(D'Halluin)等人，植物细胞4:1495-15051992；李(Li)等人，植物细胞报告72:250-255,1993；基斯图和福特《植物学年鉴》(Annals of Botany)75:407-413,1995；奥斯雅达(Osjoda)等人，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)74:745-750,1996等。在一种植物细胞、植物组织、植物部分和/或植物的背景下“引入”意指使一种核酸分子与该植物细胞、植物组织、植物部分和/或植物以使该核酸分子进入该植物细胞或该植物组织、植物部分或植物的一个细胞内部的方式接触。在引入一种以上核酸分子的情况下，这些核酸分子可以被装配成一种单一聚核苷酸或核酸构建体的一部分，或装配成分开的聚核苷酸或核酸构建体，并且可以位于相同或不同的核酸构建体上。因此，这些聚核苷酸可以在一个单一转化事件中，在分开的转化事件中，或，例如作为一种育种方案的一部分，引入植物细胞中。
已经转化的细胞可以根据常规的方式生长成植物。参见例如麦考密克(McCormick)等人《植物细胞报告》5:81-84,1986。这些植物接着可以生长，并且用相同转化品系或不同品系传粉，并且识别出所得到的具有所需表型特性的表达的杂种。可以生长两代或更多代以确保所需表型特性的表达被稳定地维持和遗传，并且接着收获种子以确保所需表型特性的表达已经实现。
在此披露的害虫抗性基因，例如编码GmSAMT1(例如SEQ ID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述或其一种简并变体)的核酸序列或其活性变体和片段可以用于任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物的转化。所关注的植物物种的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zea mays))、芸苔属(Brassicasp.)(例如欧洲油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、印度芥菜(B.juncea))(尤其适用作种子油来源的那些芸苔属物种)、苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))、稻(水稻)、黑麦(黑麦(Secale cereale))、高粱(双色高粱(Sorghum bicolor)、甜高粱(Sorghum vulgare))、栗(例如珍珠稗(珍珠狼尾草(Pennisetum glaucum)))、黍(稷(Panicummiliaceum))、谷子(小米(Setaria italica))、龙爪稷(穇子(Eleusinecoracana))、向日葵(向日葵(Helianthus annuus))、红花(红花(Carthamus tinctorius))、小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、大豆(黄豆)、烟草(普通烟草(Nicotiana tabacum))、马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、红薯(甘薯(Ipomoea batatus))、木薯(木薯(Manihot esculenta))、咖啡豆(咖啡属(Coffea spp.))、椰子(椰子(Cocos nucifera))、菠萝(凤梨(Ananas comosus))、柑橘树(柑橘属(Citrus spp.)、可可(可可(Theobroma cacao))、茶(中国茶(Camellia sinensis))、香蕉(芭蕉属(Musa spp.))、酪梨(油梨(Persea americana))、无花果(无花果(Ficus casica))、番石榴(番石榴(Psidium guajava))、芒果(杧果(Mangifera indica)、橄榄(橄榄(Olea europaea))、番木瓜(番木瓜(Carica papaya))、腰果(腰果(Anacardium occidentale))、胡桃(澳洲坚果(Macadamia integrifolia))、杏仁(扁桃(Prunus amygdalus))、糖用甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、甘蔗(糖属(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。在具体实施例中，在此披露的害虫抗性基因，例如编码GmSAMT1(例如SEQ ID NO:1中所阐述或其一种简并变体)和/或GmSABP2-1(例如SEQ ID NO:2中所阐述或其一种简并变体)的核酸序列或其活性变体和片段可以用于大豆(黄豆)的转化。
蔬菜包括番茄(西红柿(Lycopersicon esculentum))、莴苣(例如莴苣(Lactuca sativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(利马豆(Phaseolus limensis))、豌豆(山黎豆属(Lathyrus spp.)以及黄瓜(Cucumis)属的成员，例如黄瓜(黄瓜(C.sativus))、棱瓜(有棱甜瓜(C.cantalupensis))以及香瓜(甜瓜(C.melo))。
观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花属(Rhododendron spp.)、八仙花属(绣球(Macrophylla hydrangea))、木槿(朱槿(Hibiscus rosasanensis))、玫瑰(蔷薇属(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、黄水仙(水仙属(Narcissus spp.))、矮牵牛(碧冬茄(Petunia hybrida))、康乃馨(香石竹(Dianthus caryophyllus))、一品红(圣诞花(Euphorbiapulcherrima))以及菊花。
可以用于实践本发明的针叶树包括例如松树，例如火炬松(火炬松(Pinus taeda)、湿地松(湿地松(Pinus elliotii))、西黄松(西黄松(Pinus ponderosa))、黑松(小干松(Pinus contorta))以及辐射松(辐射松(Pinus radiata))；花旗松(Douglas-fir)(北美海滨黄杉(Pseudotsuga menziesii))；美国西部铁杉(加拿大铁杉(Tsugacanadensis))；美国西加云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；冷杉(例如银杉(美国冷杉(Abiesamabilis)))和香脂冷杉(加拿大胶杉(Abies balsamea))；以及雪松，例如北美香柏(北美香柏(Thuja plicata))以及阿拉斯加黄杉(Alaskayellow-cedar)(加拿逊扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))以及白杨和桉树。
在特定实施例中，本发明的植物是作物类植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、栗、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，并且在其他实施例中，大豆植物是最佳的。所关注的其他植物包括提供所关注的种子的谷物植物、含油种子植物以及豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。含油种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈树、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔豆、槐豆、苦豆、大豆、菜用刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
在一些实施例中，包含所披露的害虫抗性基因的聚核苷酸被工程化成一种分子堆。因此，在此披露的各种植物、植物细胞以及种子可以进一步包含一种或多种所关注的性状，并且在更特定实施例中，该植物、植物部分或植物细胞与所关注的聚核苷酸序列的任何组合堆叠以产生具有所需性状组合的植物。如在此所使用，术语“堆叠”包括具有存在于相同植物的多种性状。
这些堆叠的组合可以通过包括但不限于通过任何常规的方法对植物进行育种或遗传转化的任何方法产生。如果通过对这些植物进行遗传转化来堆叠这些序列，那么所关注的聚核苷酸序列可以在任何时候并且以任何顺序组合。这些性状可以在通过转化盒的任何组合所提供的与所关注的聚核苷酸的一种共转化方案中同时引入。举例来说，如果将引入两个序列，那么该两个序列可以含于分开的转化盒中(反式)或含于相同的转化盒上(顺式)。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能所希望的是引入一种将抑制所关注的聚核苷酸的表达的转化盒。此可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所需性状组合。进一步认识到聚核苷酸序列可以使用一种位点特异性重组系统在一个所需基因组位置上堆叠。参见例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855以及W099/25853。
转化的植物可以针对所关注的基因的存在以及表达水平进行分析。本领域的普通技术人员可以采用许多方法对转化的植物进行分析。举例来说，用于植物分析的方法包括DNA和RNA印迹分析、基于PCR(或其他基于核酸扩增)的方法、生化分析、表型筛选法、野外评价以及免疫诊断测定(例如用于蛋白质的检测、定位和/或定量)。
实例
实例1
GmSAMT1的分离和表征
植物、线虫、细菌以及化学来源：在此所述的研究中，使用两种遗传相关的大豆株系TN02-226和TN02-275，用于基因克隆和产生大豆发根。关于此两种大豆株系的育种细节已经描述于马扎雷(Mazarei)等人《理论与应用遗传学》123:1193-1206,2011中，通过引用以其全文特定结合于此。此两种源自F6的姐妹株系TN02-226和TN02-275对应地对SCN品种2(HG类型1.2.5.7)为抗性的和易感染的，这已经在从2004年到2007年USDA南部区域测试中进行证实。在此所述的研究中，SCN品种2的卵用作转基因发根的生物测定法中的病原体，因为以上两种大豆株系显示出对SCN品种2不同的响应。SCN的供养根据阿瑞利(Arelli)等人，大豆胞囊线虫.《作物科学》(Crop Sci.)40:824-826,2000描述的方法。大肠杆菌品系BL21(DE3)(加利福尼亚州拉乔拉市斯曲杰公司(Stratagene,La Jolla,CA))用于重组蛋白质的表达。利用土壤杆菌培养物、根癌土壤杆菌GV3101以及发根土壤杆菌品系K599用于烟草瞬时转化和大豆发根的产生。所有化学物质都从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯市(St.Louis,MO))获得。
病毒、大豆基因型、接种以及SMV检测：在此所述的研究中，大豆花叶病毒SMV-N的一种突变体(SMV-N25)用于大豆上的病毒感染。使用对SMV-N25和L78-375敏感、对SMV-N25有抗性的两种大豆基因型威廉82。机械接种的植物维持在生长室中，该生长室在22℃下在16小时的光周期下操作。SMV接种的大豆秧苗再生长21天并且收获其具三叶的叶子，在液氮存在下磨碎并且存储在-80℃下，直到加工用于定量的逆转录PCR分析。
序列分析：在微阵列实验中识别出我们的目标基因的昂飞探针Gma.12911.1.A1_S_AT的序列用作针对大豆数据库GmGDB/GMtranscript(如在环球网上plantgdb.org/GmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl可获得)的BLAST搜索的一个查询。程序blastn是在1e-20的E值下执行。五种大豆基因展示高相似性(图2)。所选SABATH蛋白质与Glyma02g06070的一个多重序列比对是使用ClustalX程序执行并且使用TreeView软件(如在环球网上taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html可获得)观察。构建一个邻接无根的系统树(图3)。
Glyma02g06070基因从大豆的分离：使用植物小型试剂盒(美国加利福尼亚州瓦伦西亚市(Valencia,CA,USA))从SCN感染的大豆株系TN02-226的根组织分离总RNA，并且用柱上DNase(美国加利福尼亚州瓦伦西亚市)来去除DNA污染。然后使用如先前所述的第一链cDNA合成试剂盒(美国新泽西州皮斯卡塔韦市的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA))，以15μl反应体积，从总RNA合成cDNA。基于微阵列分析，挑选一种大豆候选基因Glyma02g06070用于进一步研究。Glyma02g06070的全长cDNA序列是从公共大豆数据库(如在环球网上phytozome.net/soybean可获得)得到，并且引物如下设计ATGGAAGTAGCACAGGTACTCCACATG(SEQ ID NO:5)和TGCTTTTCTAGTCAATAATATGGTAAC(SEQ ID NO:6)。PCR条件如下：94℃2min，接着94℃30s、57℃30s以及72℃1min30s循环35次，以及72℃10min最终延伸。PCR产物克隆到载体中。通过测序，来自TN02-226大豆的PCR产物与在大豆数据库中预测的序列相同。
为了验证其生物化学功能，接着将候选基因克隆到一种蛋白质表达构建载体载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsband,CA))中并且在大肠杆菌品系BL21(DE3)(加利福尼亚州拉乔拉市斯曲杰公司)中表达。通过异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在500μM的浓度下在25℃下18h诱导蛋白质表达，其中细胞通过声波处理来溶解。大肠杆菌表达的具有一个His标签的Glyma02g06070是使用Ni-NTA琼脂糖，根据制造商的说明书(英杰公司)从大肠杆菌细胞溶解产物纯化。蛋白质纯度通过SDS-PAGE验证并且蛋白质浓度通过布拉福德测定(Bradford assay)来确定。
放射化学SAMT活性测定：使用50μl体积，它含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM SA以及3μM14C-SAM，具有51.4mCi/mmol的比活性(马萨诸塞州波士顿市的珀金埃尔默公司(Perkin-Elmer,Boston,MA))。通过添加SAM来起始测定，维持在25℃下30min，并且通过添加乙酸乙酯(150μl)停止。通过在14,000g下1min离心进行相分离后，使用一种液体闪烁计数器(加利福尼亚州富勒顿市贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter,Fullerton,CA))对上部有机相计数。有机相中的辐射数指示合成的MeSA的量。还针对重组GmSAMT1执行底物特异性测定，其中一系列底物包括SA、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、烟酸、对香豆酸、咖啡酸、肉桂酸、香草酸、茉莉酸(JA)、赤霉酸、吲哚-3-乙酸以及2,4-二氯苯氧乙酸。在SA下活性设定在100％。针对每一种化合物执行三个独立的测定。
GmSAMT1的动力学参数的测定：在时程测定中测定适当的酶浓度和培育时间以确保在测定期期间反应速度是线性的。林-贝氏图得到表观Km值。为了测定关于SA的Km，SA的浓度从2到150μM独立地变化，而SAM保持在200μM下不变。测定在25℃下进行30min，如SAMT活性测定中所述。关于GmSAMT1的最佳pH从pH6.0到pH9.0测定，并且温度的最佳反应在从0℃到60℃的范围内测定。用一系列金属离子测定金属离子对GmSAMT1活性的影响，这些金属离子包括K+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ca2+、Na+、NH4 +以及Mg2+，呈氯盐形式，在5mM最终浓度下。
用过度表达的GmSAMT1和OFP报导基因产生构建体：pCAMBIA1305.2载体用作一种原发性二元载体。以下是构建含有过度表达的GmSAMT1的载体的程序(图6)。作为一种筛选工具，将一种橙色荧光蛋白质(OFP)基因ppor RFP与含有NcoI片段的引物引入pCAMBIA1305.2载体的NcoI位点。此修饰的pCAMBIA1305.2载体被称作pJL-OFP载体并且用以通过瞬时转化烟草测试OFP表达。接着通过用EcoRI和HindIII消化，从一种pBI121载体取得35S::GUS/NOS终止子的盒，并且插入pJL-OFP载体的EcoRI和HindIII位点中以形成pJL-OFP-35S::GUS载体，该载体用于在一种二元载体中测试OFP和GUS基因表达。GmSAMT1基因从以上提及的具有含有BamHI和SacI片段的引物的载体扩增，并且通过消化和连接被pJL-OFP-35S::GUS载体中的GUS基因置换。最终构建过度表达的GmSAMT1载体并且称为pJL-OFP-35S::GmSAMT1载体。pJL-OFP-35S::GmSAMT1和pJL-OFP的载体对应地作为目标基因和载体对照转化到发根土壤杆菌中。根癌土壤杆菌GV3101和发根土壤杆菌品系K599通过冻融方法转化。无二元载体的细胞涂铺在无抗生素的LB培养基上。具有二元载体的细胞涂铺在具有卡那霉素的选择性LB培养基上并且在28℃下培育2天。
通过烟草瞬时转化测试报导基因的表达：根据斯帕克(Sparkes)等人，《自然-实验手册》(Nat.Protocols)1:2019-2025,2006，在产生发根前，将含有OFP基因的构建体通过在烟草植物中瞬时表达测定来测试。针对OFP功能，通过对根癌土壤杆菌GV3101进行土壤杆菌渗入到烟叶中，并且无二元质粒的根癌土壤杆菌GV3101作为一个阴性对照，来对质粒pJL-OFP和pJL-OFP-35S::GmSAMT1进行测试。携带目标质粒的细菌悬浮液使用无针注射器进行压力浸润，通过在位于从叶子的中肋分叉的主静脉之间的叶节上的背轴表面，进入5周龄烟叶中。浸润2天后，使用一个奥林巴斯(Olympus)SZX12荧光显微镜和一个OFP过滤器在覆盖周围未浸润组织的浸润区域部分的切离的叶部分中研究OFP萤光。
转基因大豆发根的产生：通过用含有目标基因的发根土壤杆菌感染的大豆发根转化系统进行修饰并且用以研究针对SCN的大豆抗性。含有目标基因的发根土壤杆菌K599、载体对照和单独发根土壤杆菌K599用以接种易感染SCN品种2的TN02-275大豆。为了更好地评估目标基因的抗性，含有载体对照的发根土壤杆菌和单独发根土壤杆菌K599也用以接种对SCN品种2具有抗性的TN02-226大豆。大豆发根的产生如下修饰：首先，大豆种子用氯气灭菌。其次，将具有完整种皮的一个单层成熟大豆种子放在开口皮氏培养皿中，将该培养皿放进一个通风橱内的一个钟罩干燥器中。具有100ml漂白剂的一个烧杯也放入该干燥器中并且沿着烧杯侧面添加5ml浓(12N)HCl。接着种子立即保持在密闭的干燥器中并且维持在氯气氛围中过夜(约16h)。灭菌后，种子转移到皮氏培养皿中被灭菌蒸馏水湿润的高压蒸汽灭菌的滤纸，以在一个层流净化罩中发芽。发芽的大豆种子种在灭菌蛭石中并且六颗种子生长在18细胞发芽托盘的每个孔中。对来自含有50mg ml-1卡那霉素的LB培养盘的具有二元载体pJL-OFP、pJL-OFP-35S::GUS或pJL-OFP-35S::GmSAMT1的发根土壤杆菌K599的过夜培养的菌苔，或在无任何抗生素的LB培养基中生长的缺乏二元载体的发根土壤杆菌K599的一个培养物进行收集，并且对应地悬浮于1ml无菌蒸馏水中。具有展开子叶的5日龄秧苗的大豆子叶节和上部下胚轴被含有细菌悬浮液的注射器刺入三次。第一周中，托盘被无菌透明的盖子覆盖以保持高湿度。在随后三周中，植物转移到盆中并且发根土壤杆菌受伤位点被湿的无菌蛭石覆盖以不断地保持高湿度。每天使用无菌B&D溶液为大豆植物浇水，该B&D溶液含有1mM CaCl2、0.5mM KH2PO4、10μM柠檬酸铁、0.25mMMgSO4、0.25mM K2SO4、1μM MnSO4、2μM H3BO4、0.5μM ZnSO4、2μMCuSO4、0.1μM CoSO4、0.1μM Na2MoO4以及1mM KNO3。用于大豆植物的生长条件是在28℃/25℃下，12h光/12h黑暗，其中发光来自150-200μmol m-2·s-1下的荧光灯泡。约四周后，发根生长成约10cm长。基于OFP表达，使用一个荧光立体显微镜(奥林巴斯SZX12荧光显微镜和OFP过滤器)检测大豆转基因根。在受伤位点下切除主根和非转基因根。将通过OFP信号筛选的含有pJL-OFP-35S::GUS的转基因根浸在GUS溶液(1mMX-Gluc)、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％(v/v)TRITONTMX-100、100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，并且在37℃下培育过夜。第二天，弃去X-Gluc溶液。用70％乙醇重复洗涤根以去除叶绿素。记录具有视觉GUS染色的转基因根。
线虫感染和种群统计学测定：为了容易地比较SCN感染，留下一个转基因根进行SCN接种。收集其他转基因根以进行RNA提取和基因表达的检测。含有相同构建体的二十株大豆植物的发根部分水平负载于含有无菌砂子与表土(1:1)的一种薄层混合物的13×9×2cm灭菌接种托盘中，并且从接种托盘省去芽部分。添加约0.75ml含有约5600个SCN卵的接种物到每个根系。使线虫在潮湿条件下感染根7天。接着所有根都进行洗涤以去除额外的SCN卵和尚未穿透根组织的幼年线虫。容器内的无菌蛭石用于在生长室中生长感染的嵌合体。接种后两周内，用自来水对感染的根样品进行洗涤以去除蛭石并且通过20％(v/v)漂白剂清理不超过4min，并且接着通过酸性品红染色。记录每个感染的根样品内不同阶段的线虫。因为易感染与抗性大豆株系之间的响应发生在SCN的J3阶段，所以每株植物J3+J4的数目与线虫总数的比率用作确定含有对应构建体的发根中抗性差异的一个指数。每个载体分析最少10株转化的植物。
定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)：根据马扎雷等人，2007执行定量逆转录PCR以检查转基因大豆发根的GmSAMT1和一些防御相关的基因的转录水平。为了进行qRT-PCR测定，设计GmSAMT1、防御相关基因GmPR-1(GenBank编录号BU577813)、GmPR-3(GenBank编录号AF202731)以及参考基因大豆ubiqutin3基因(GmUBI-3，GenBank编录号D28123)的基因特异性引物(表1)。
表1.用于大豆SA甲基转移酶基因和相关病程相关基因的qRT-PCR分析的引物。
使用柱根据制造商对于植物的说明书，从转基因发根和对照发根的对应根组织分离总RNA。用无RNase的DNase组处理RNA以去除基因组DNA并且使用用于qRT-PCR的大容量cDNA逆转录试剂盒(APPLIED)，根据制造商的说明书，对总RNA(约1.5μg)进行逆转录以合成cDNA。第一链cDNA稀释并且放入每个qRT-PCR反应中。使用绿色作为参考染料测量DNA累积。使用RNA样品作为模板，通过PCR监测基因组DNA污染。如通过扩增产物的参考染料的解离曲线所指示，仅一种产物存在于每个反应中。使用以下PCR条件：50℃2min；95℃10min；接着95℃15s，60℃1min，72℃30s，循环40次。所有qRT-PCR测定都一式三份进行。在目标与对照样品之间目标和参考基因的PCR效率是相等的。使用与APPLIED7900HT快速实时PCR系统一起提供的软件计算Ct值和相对丰度。
统计分析：在具有GmSAMT1的过度表达的转基因大豆发根与对照大豆发根中抗性差异是通过单因素ANOVA，使用SAS混合模型(SAS9.2版)分析。使用费歇尔最低有效位差(LSD)测试分开抗性指数的最小平方平均值。通过qRT-PCR检验的目标基因与防御相关基因的表达差异也通过单因素ANOVA，使用SAS的混合模型分析。相对表达水平的最小平方平均值使用费歇尔LSD测试分开。P<0.05被认为是显著的。
结果
Glyma02g06070是SABATH家族的一个成员：对大豆重组近交系(RIL)TN02-226和TN02-275的微阵列分析揭露了在对SCN的抗性和易感染反应期间具有显著的表达改变的一些基因。这些基因之一展示仅在SCN接种的抗性大豆根中显著的上调，而在SCN接种的易感染大豆根中未出现其基因表达的显著变化(马扎雷等人，《理论与应用遗传学》123:1193-1206,2011)。为了获得此抗性候选基因的完整开放阅读框架，从微阵列识别出我们的目标基因的昂飞SoyChip探针Gma.12911.1.A1_S_AT的序列用作针对大豆数据库GmGDB/GMtranscript(如在环球网上plantgdb.org/GmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl可获得)和SoyBase(如在环球网上soybase.org/gbrowse/cgi-bin/gbrowse/gmax1.01/可获得)的BLAST搜索的一个查询，发现大豆基因Glyma02g06070与Gma.12911.1.A1_S_AT的序列具有最高相似性(99％)并且注释用于编码SAM依赖性羧基甲基转移酶(图2)。
通过与来自其他物种的已知的甲基转移酶的进一步比较，由Glyma02g06070编码的此SAM依赖性羧基甲基转移酶被确定是SABATH家族的一个成员。SABATH家族是以此家族中第一个被识别的酶(SAMT、BAMT和可可碱合成酶)命名(陈(Chen)等人，2003a)。为了研究Glyma02g06070与来自其他物种的已知的SABATH成员之间的进化关系，构建所选择的功能上表征的SABATH成员与Glyma02g06070的一个系统树。结果展示Glyma02g06070属于含有具有水杨酸甲基转移酶活性的酶簇(图3)。
Glyma02g06070编码大豆SAMT：一个蛋白质BLAST搜索揭露Glyma02g06070含有370个氨基酸并且在氨基酸序列水平上与先前识别的稻SAMT OsBSMT140.1％一致。还预测Glyma02g06070含有一个SAM结合结构域。当在EST数据库中搜索Glyma02g06070的序列时，它还展示此基因是由SCN和SA诱导。为了证实来自数据库的预测，我们对来自从大豆TN02-226株系的SCN感染的根组织获得的cDNA的此基因的完整开放阅读框架(ORF)进行扩增和测序。
因为Glyma02g06070编码成员酶可以将一个甲基从甲基供体SAM转移到一系列底物的SABATH家族的一个成员，所以Glyma02g06070的重组蛋白质的酶活性使用各种可能底物检验(表2)。
表2.GmSAMT1在水杨酸和其他相关底物下的相对活性
a：值是三个独立测量值的平均值。所有底物都在1mM浓度下测试。重组GmSAMT1在水杨酸下的活性任意地设定在100％。
发现反应速率随着增加SAM和SA的浓度而增加服从米-门氏动力学。在14种检验的底物中，SA、苯甲酸、邻氨基苯甲酸以及3-羟基苯甲酸在由被Glyma02g06070编码的重组蛋白质所催化的反应中用作体外底物，不过它们展示清楚的活性差异。在1mM的底物浓度下，重组蛋白质在SA下展示最高活性(100％)，而不是苯甲酸(16.9％)、邻氨基苯甲酸(9.3％)以及3-羟基苯甲酸(1.8％)。对于包括JA、吲哚-3-乙酸以及赤霉酸的其他底物，在相同的反应条件下未检测到活性。Glyma02g06070催化SA的甲基化，其中表观Km值为32.9±1.7μM。最终值代表三个独立测量值的平均值。由于SA用作其足够底物，所以Glyma02g06070被称为GmSAMT1。
大豆SAMT的生物化学性质：对在大肠杆菌中表达的具有一个His标签的重组GmSAMT1进行纯化到电泳均匀性并且进行详细的生物化学表征。凝胶上估计的具有His标签的GmSAMT1蛋白质的分子质量是43kDa，此接近预期尺寸(图4)。纯化的重组GmSAMT1显示出对于水杨酸32.9±1.7μM的表观Km值。当在不同pH值的缓冲液中执行酶测定时，GmSAMT1在pH7.5下展示最高催化活性水平(图5A)。关于GmSAMT1活性的最适温度是25℃(图5B)。测量各种金属离子对GmSAMT1活性的影响。与对照比较，GmSAMT1在K+存在下显示出双重活性，而它在Cu2+、Zn2+、Fe2+以及Fe3+存在下展示无活性。GmSAMT1活性被Mn2+和Ca2+适度抑制。包括Na+、NH4+以及Mg2+的其他金属离子对GmSAMT1活性具有最少的影响(图5C)。GmSAMT1呈现假的米-门氏动力学，其中对于水杨酸的表观Km值为46.2±4.2μM(图5D)。所有以上结果表明重组GmSAMT1展示水杨酸甲基转移酶活性。总之，系统发育和生物化学证据表明GmSAMT1是一种在大量植物种中保守的酶。
通过烟草瞬时转化的报导基因表达：在执行发根土壤杆菌介导的转化前，在烟叶中通过根癌土壤杆菌介导的转化进行pJL-OFP-35S::GUS的瞬时表达以在OFP过滤器下检查OFP信号。含有目标基因的转基因烟叶呈现OFP荧光，而模拟的植物未展示OFP信号(图7A)。此结果有助于迅速地证实OFP表达。
在发根土壤杆菌介导的转化的具有目标基因的大豆发根长到约10cm长后，在OFP过滤器下筛选含有过度表达的GmSAMT1的转基因发根。此方法通过对含有质粒pJL-OFP-35S::GUS的转基因发根进行染色，检查GUS表达来证明。通过OFP信号筛选的所有阳性转基因发根都展示在根组织中均一的GUS表达，而通过OFP信号筛选的阴性对照发根未展示GUS表达(图7B)。
GmSAMT1和数个病程相关(PR)基因的基因表达：转基因发根中GmSAMT1和所选PR基因的基因表达水平通过qRT-PCR检验(图8和图9)。过度表达的GmSAMT1转基因发根中GmSAMT1的表达水平比对照植物高约25倍(图8B)。与一些对照发根株系相比较，GmPR-1展示在过度表达的GmSAMT1转基因发根中显著更高的表达。但在易感染大豆背景下具有GmSAMT1的过度表达的转基因发根与载体对照之间GmPR-1的基因表达无显著差异(图9A)。此可能表明当SCN感染未发生时易感染大豆可以对外源性蛋白质作出响应。当发生SCN寄生时，易感染大豆的防御系统可能通过SCN改变或抑制，这产生和分泌寄生蛋白质，进入大豆内，从而帮助其自身抑制宿主植物防御。发现分支酸变位酶是SCN寄生蛋白质的一种，它可以操纵植物的莽草酸通路。因为SA生物合成与莽草酸通路紧密有关，所以易感染大豆的SA信号传导通路将被SCN抑制。已经发现拟南芥属根中SA信号传导的局部抑制是甜菜胞囊线虫寄生所需要的。将来，PR基因的表达需要被针对SCN感染的转基因发根检验。因为PR-1基因被认为是SA信号传导通路的一个标记物基因，所以过度表达的GmSAMT1可以通过为响应SCN感染提供丰富的移动分子MeSA，来增加SA通路的信号转导。有趣地，观测到编码大豆壳多糖酶的PR-3的表达在过度表达的GmSAMT1转基因发根中比其他对照株系中更高(图9B)。发现JA诱导拟南芥属中PR-3表达。
SCN是美国最有经济破坏性的大豆害虫，因此已经研究大豆与SCN之间的相互作用的机制以更好地控制此害虫。随着基因组的发展，已经执行大量微阵列分析以研究当被SCN感染时大豆的基因表达改变。然而，由于大豆和SCN样品的不同类型，因此各种实验不一致。在本发明的研究中，基于对应地对SCN品种2感染是抗性和易感染的两种遗传相关的大豆姐妹株系TN02-226和TN02-275的微阵列分析，识别出候选基因。
在SCN的接种期间，还可以通过改变大豆细胞的钾的浓度操纵GmSAMT1活性。SCN感染的最常见的地上的症状是叶缘变亮黄色的一种缺钾症状。然而，这些SCN诱导的缺钾症状是由于线虫食用，植物无法提供足够的钾的结果。据证实在中等水平的钾肥沃性条件下生长的大豆根中钾的浓度通过SCN减少(史密斯(Smith)等人2001)。结果指示体外GmSAMT1展示在钾存在下双重活性，这表明除抑制GmSAMT1的转录水平外，SCN还可以通过降低钾的浓度抑制GmSAMT1的活性。
GmSAMT1可以对针对SCN的大豆抗性中SA与JA信号传导通路之间的串扰起作用。据证实稻SAMT的基因表达可以通过JA诱导。在野生型拟南芥属被MeJA处理后还检测到MeSA到大大提高。如在此披露，易感染大豆株系中GmSAMT1的过度表达引起GmPR-1和GmPR-3的上调，这对SA和JA信号传导通路具有综合的影响。微阵列分析还指示JA通路在大豆针对SCN的防御响应中活化。因此，SA依赖性通路，与通过包括NPR1、WRKY家族转录因子以及LOX的调节点的JA通路组合，起到约束SCN发育的作用。在此呈现的结果指示GmSAMT1是SA与JA通路之间的串扰的另一个调节点。
对SCN的抗性：已经通过测定SCN发育，即每株植物的线虫、胞囊或卵，来评估大豆对SCN的抗性。在此研究中，此方法根据麦利托(Melito)等人，《BMC植物生物学》(BMC Plant Biology)10:104,2010修改。J3和J4阶段线虫数目与总SCN数目的比率设定为指数，(J3+J4)/总SCN，以评估在用SCN卵接种两周后不同的发根中的抗性。
对于大部分转基因发根部分，观测到从J2到J4阶段的雌性线虫，并且有时候观测到雄性线虫(图11)。SCN的数目在单独的转基因和对照植物中广泛变化。建立的SCN的平均数目在转基因发根株系与对照之间不是显著不同的(数据未示出)。然而，(J3+J4)/总SCN的比率展示转基因发根与易感染对照株系之间的显著差异。过度表达GmSAMT1的转基因发根的(J3+J4)/总SCN比率(对于TN02-275，3.4％，对于威廉82，5.3％)与抗性载体对照(对于TN02-226，2.5％)是可比较的，并且与易感染载体对照(对于TN02-275，23.6％，对于威廉82，18.4％)是显著不同的。与易感染大豆背景中的载体对照相比较，过度表达GmSAMT1的转基因大豆发根具有显著更少的发育到J3和J4阶段的雌性幼体SCN。当易感染背景中载体对照的敏感性水平任意地设定在100％时，过度表达GmSAMT1的转基因大豆发根的敏感性显著减少(对于TN02-275，85.6％减少，对于威廉82，减少71.2％)。
最关注的是过度表达GmSAMT1的转基因发根显示出比对照转基因发根更高的对SCN的抗性(图11)。通过GmSAMT1介导的抗性不是株系特异性的，因为两种易感染株系展示相同的表型(图11)。GmSAMT1在SCN抗性中的生物作用可以使用稳定的转化进一步评估。
转基因发根中SA通路相关基因的表达：在SAMT转基因发根中测定对于一种SA生物合成蛋白质异分支酸合成酶(ICS)编码基因的转录物丰度(图12)。在拟南芥属中，AtICS1是病原体诱发的SA累积所需要的。虽然提出ICS基因是SA生物合成的一种关键基因，但对于ICS在大豆中的作用几乎不知道。GmICS1(Glyma01g25690)(图12A)和GmICS2(Glyma03g17420)(图12B)的表达也是通过qRT-PCR检验的。在无SCN处理下，GmSAMT1过度表达转基因发根中GmICS1和GmICS2都展示比对照更高的转录物丰度(5.3倍和8.2倍)。在SCN攻击处理下，在转基因发根与对照株系之间GmICS1表达无显著差异。对于GmICS2，转基因发根比对照具有略微更大的转录物丰度。
为了进一步研究SA依赖性信号转导通路，大豆中SA信号通路的关键调节基因，PR1(NPR1)基因的非表达子的两种同源物GmNPR1-1(Glyma09g02430)和GmNPR1-2(Glyma15g13320)通过qRT-PCR测试(图13)。对于GmNPR1-1，在无SCN处理下转基因发根与对照株系之间表达水平无显著差异。然而，在SCN处理下，GmNPR1-1展示比对照更高的表达(图13A)。对于GmNPR1-2，在SCN处理下转基因发根与对照株系之间的表达水平无显著差异。然而，在无SCN处理下，GmNPR1-2展示比对照更高的表达。总之，GmNPR1-2展示响应于SCN处理，在转基因发根中相对更高的表达(图13B)。
大豆针对大豆花叶病毒的防御中GmSAMT1的生物作用：为了测试GmSAMT1是否还参与针对SMV的抗性，还关于测量在SMV与大豆之间的相互作用期间GmSAMT1和GmPR-1的表达，进行qRT-PCR。在此测定中，利用两种大豆株系L78-379(Rsv1)和威廉82(rsv1)。大豆基因型L78-379是威廉的一种等效株系，但含有来自PI96983的Rsv1抗性基因(Rsv1)。用来源于SMV-N(N25)的一种突变体接种L78-379(Rsv1)，引起延迟的过敏反应的诱导，而用相同的病毒感染威廉82(rsv1)引起嵌合体。
当对于L78，针对大豆病毒25出现抗性反应(接种后21天)时，大豆主叶的GmSAMT1表达是模拟植物中的约7.3倍，并且有趣地，还观测到高表达水平(44.6倍)的GmPR-1。同时在大豆威廉82的易感染响应中，GmSAMT1和GmPR-1的表达减少到模拟植物中的一半(图14)。因此GmSAMT1与GmPR-1的表达之间的强烈正相关指示GmSAMT1在大豆针对大豆花叶病毒的防御中起作用。
总之，GmSAMT1和所选PR基因的基因表达差异在抗性大豆株系的两种接种组织根和叶子中上调，但在易感染大豆株系中下调或未改变，证明大豆针对病原体的响应。
实例2
GmSABP2-1的分离和表征
植物、线虫、细菌以及化学来源：在此研究中，使用两种遗传相关的大豆株系TN02-226和TN02-275，用于基因克隆和产生大豆发根。已经描述此两种大豆株系的育种细节。SCN品种2卵用作发根的生物测定中的病原体，使用与上述相同的接种方法。大肠杆菌品系BL21(DE3)用于表达重组蛋白质。利用发根土壤杆菌品系K599携带过度表达的GmSABP2-1和产生大豆发根。此研究所用的化学物质从西格玛奥德里奇公司获得。
数据库搜索和序列分析：昂飞探针GmaAffx.92649.1.S1_at和Gma.5867.1.A1_s_at的序列都展示与一种大豆基因Glyma16g26060的100％相似性。基于phytozome(如在环球网上phytozome.net/soybean可获得)中的注解，此基因编码α/β折叠水解酶。进行Glyma16g26060与两种其他表征的甲酯酯酶的比对以研究此候选蛋白质的保守结构域。
Glyma16g26060基因从大豆的分离：总RNA提取和DNA污染去除如所述进行。为了进一步研究Glyma16g26060的功能，从公共大豆数据库(如在环球网上phytozome.net/soybean可获得)获得Glyma16g26060的全长cDNA序列。使用特定引物ATGGGTTCACAAAATTGTATGGATAGG(SEQ ID NO:15)和TCATGCATATTTAGTCGCTATCTGCTG(SEQ ID NO:16)，热循环条件是：94℃2min，接着94℃30s、57℃30s和72℃1min循环35次，以及72℃10min最终延伸。PCR产物克隆到载体 中。来自TN02-226大豆的PCR产物的测序结果与在大豆数据库中在威廉82大豆上预测的序列一致。
为了验证其生物化学功能，接着候选基因克隆到蛋白质纯化载体载体中并且在大肠杆菌品系BL21(DE3)中表达。通过异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在500μM的浓度下在25℃下18h诱导蛋白质表达，其中细胞通过声波处理来溶解。大肠杆菌表达的具有一个His标签的Glyma16g26060是使用Ni-NTA琼脂糖，根据制造商的说明书(英杰公司)从大肠杆菌细胞溶解产物纯化。蛋白质纯度通过SDS-PAGE验证并且蛋白质浓度通过布拉福德测定来确定。
甲酯酯酶活性测定：根据先前由(福鲁哈尔(Forouhar)等人，《美国国家科学院院刊》102:1773-1778,2005)报导的一种方案，执行一项两步放射化学酯酶测定以确定大肠杆菌表达的Glyma16g26060的活性。第一步的反应是底物10μM MeSA与纯化的重组的大肠杆菌表达的Glyma16g26060在25℃下反应30min。此后，样品煮沸以中止反应并且使酶变性。第二反应步骤是以添加3μM14C标记的具有51.4mCi/mmol的比活性的S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸(SAM)(美国马萨诸塞州波士顿市的珀金埃尔默公司)和对应的已知的纯化的具有高活性的甲基转移酶为开始。在此，先前提及的GmSAMT1用于SA甲基转移酶。反应在25℃下进行30min。接着对放射性标记的产物进行提取并且使用一种液体闪烁计数器对放射性计数。
大豆SABP2的动力学参数的测定：使用上述放射化学测定对反应速率随着增加MeSA的浓度而增加进行评估，并且发现它服从米-门氏动力学。在时程测定中测定适当的酶浓度和培育时间以便确保在测定期期间反应速度是线性的。为了确定针对MeSA的Km，MeSA的浓度在从5μM到100μM的范围内独立地变化。制得林-贝氏图以获得表观Km值。关于GmSABP2-1的最佳pH是从pH6.0到pH9.0测定。最终值是三个独立测量值的平均值。
GmSABP2-1过度表达的转基因发根的SCN抗性的评估：具有过度表达的GmSABP2-1的转基因大豆发根用于评估GmSABP2-1的生物功能。如所述进行包括以下各项的步骤：产生具有过度表达的GmSABP2-1和OFP报导基因的构建体，产生含有过度表达的GmSABP2-1的转基因大豆发根，SCN接种，以及线虫的种群统计学测定，但使用GmSABP2-1基因代替GmSAMT1基因。
统计分析；过度表达GmSABP2-1的大豆发根与对照大豆发根之间的抗性差异是通过单因素ANOVA，使用SAS的混合模型(SAS9.2版)分析，并且抗性指数的最小平方平均值使用费歇尔LSD测试分开。P<0.05被认为是显著的。
结果
大豆中一种假定的SCN抗性基因的识别和序列分析：微阵列分析揭露了在对SCN的抗性和易感染反应期间展示显著表达改变的基因。通过微阵列分析和定量实时PCR，这些基因之一仅在SCN接种的抗性大豆根中显著上调，而它在SCN接种的易感染大豆根中显著下调。
为了获得此抗性相关基因的完整开放阅读框架，在微阵列分析中识别目标基因的昂飞SoyChip探针GmaAffx.92649.1.S1_at和Gma.5867.1.A1_s_at的序列用作针对大豆数据库GmGDB/GMtranscript(如在环球网上plantgdb.org/GmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl可获得)的BLAST搜索的一种查询，发现大豆基因Glyma16g26060展示与以上两种探针的序列最高相似性(100％)并且预测它属于α/β水解酶基因超家族。
Glyma16g26060编码大豆甲酯酯酶：一种BLAST搜索揭露了在氨基酸序列水平上，Glyma16g26060与先前表征的NtSABP2(GenBank编录号AAR87711.1)61.2％一致，并且在大豆同源基因中它与NtSABP2的一致性是最高的。执行Glyma16g26060和NtSABP2、At4g37150中肽序列的比对(图15)。Glyma16g26060含有在来自烟草、拟南芥属(AtMES)、白杨以及马铃薯的SABP2直系同源物(StMES1)中高度保守的催化三联体(Ser-86、His-239以及Asp-211)，以及α/β水解酶超家族的紧密相关成员。Glyma16g26060还含有在与SA相互作用的NtSABP2中识别出的所有15个氨基酸。相比之下，AtMES9含有这15个残基中的仅5个并且StMES1共享12个。Glyma16g26060与NtSABP2之间高序列相似性和关键SA结合残基的保守指示此两种蛋白质共享相似的生物化学性质。为了证实来自数据库的预测，Glyma16g26060的全长cDNA通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从SCN感染的大豆TN02-226株系的根组织克隆并且测序。测序的基因含有786bp，编码261个氨基酸的一种蛋白质。
大豆SABP2的生物化学性质：为了进一步研究由Glyma16g26060编码的酶的生物化学性质，将此基因克隆到一种蛋白质表达载体中。对在大肠杆菌中表达的具有一个His标签的重组Glyma16g26060进行纯化到电泳均匀性并且进行详细的生物化学表征。凝胶上估计的具有His标签的Glyma16g26060蛋白质的分子质量是33kDa(图16)，此接近我们的目标酶的预期尺寸。纯化的重组Glyma16g26060展示将MeSA转变成SA的活性。在稳态条件下，Glyma16g26060以46.2±2.2μM的表观Km值使MeSA水解(图17)。因此Glyma16g26060被称为大豆SABP2(GmSABP2-1)。当在不同pH条件的缓冲液中执行酶测定时，GmSABP2-1在约pH7.0下展示最高催化活性水平(图18)。
SCN抗性中大豆SABP2的生物作用：SABP2在其他植物种中的生物作用的研究通过观测叶在病毒或细菌感染下的抗性来执行。因为针对SCN的大豆抗性在根组织中存在，所以对存在于转基因发根中的处于不同阶段的SCN数目进行记录以分析GmSABP2-1的抗性水平并且评估其生物功能。如所提及，易感染(TN02-275)与抗性(TN02-226)大豆株系之间对SCN品种2不同的抗性响应发生在SCN的J3阶段，挑选由SCN接种两周后的时间点用于分析具有对应构建体的所有发根中SCN的种群统计学。J3+J4/总SCN数目的指数用以估计具有过度表达的GmSABP2-1的易感染株系与其他对照株系之间的抗性，与所描述的测定一样。易感染背景中载体对照的敏感性水平任意地设定在100％。结果展示与易感染大豆背景中载体对照株系比较，具有过度表达的GmSABP2-1的转基因大豆发根具有显著更少的发育到J3阶段的雌性SCN幼体(84.5％减少)。并且在抗性大豆背景中具有过度表达的GmSABP2-1的转基因发根与载体对照之间抗性水平无显著差异，它们与易感染大豆背景中阴性载体对照比较，还具有显著更少的发育到J3阶段的雌性SCN幼体(94.8％减少)(图19)。
描述了从大豆识别GmSABP2-1并且证明它与其烟草和拟南芥属直系同源物共享高相似性和保守基元。通过进一步生物化学测定，指示重组GmSABP2-1显示出对MeSA的酯酶活性。GmSABP2-1的Km(46.2μM)比NtSABP2(8.6μM)、PtSABP2-2(24.6μΜ)的Km更高，并且比AtMES1(57.3μΜ)、AtMES9(147.1μΜ)、PtSABP2-1(68.2μΜ)以及StMES1(57.9μΜ)更低。这些动力学参数的差异可以反映出植物种的内源性MeSA水平。
在易感染大豆株系中具有过度表达的GmSABP2-1的转基因发根展示增加的针对SCN的抗性。此结果指示大豆针对SCN的防御需要一定表达水平的GmSABP2-1。考虑SCN群体内SCN在到达大豆维管组织的喂养位点的时间和空间差异，GmSABP2-1是一种重要的组分，它接收MeSA信号以在大豆针对SCN的防御中诱导SAR。在SCN感染下通过上调其基因表达而增加的GmSABP2-1蛋白质的水平可以有益于移动MeSA的捕捉。通过GmSABP2-1催化的MeSA脱甲基化可能增加远端未受损伤的大豆根组织中的SA水平，因为其直系同源物NtSABP2具有诱导未受损伤的烟叶中的SAR的作用。
虽然本披露已经着重于具体实施例来描述，但本领域的普通技术人员将显而易见的是，可以使用具体实施例的变体，并且意图本披露可以通过除在此所特定描述以外的方式实践。应了解连同本发明的一个具体方面、实施例或实例描述的特征、特性、化合物、化学部分或实例可应用到本发明任何其他的方面、实施例或实例。因此，本披露包括在如以下权利要求书所定义的本披露的精神和范畴内所涵盖的所有修改。

Claims (23)

1.一种分离的核酸分子，包含一种核酸序列或其一种功能性片段，该核酸序列编码与由根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列或其一种简并变体编码的一种蛋白质至少80％一致的一种害虫抗性蛋白质。
2.一种分离的核酸分子，包含与如权利要求1所述的分离的核酸分子可操作地连接的一种启动子。
3.一种表达载体，包含如权利要求2所述的核酸分子。
4.如权利要求3所述的载体，其中该载体是pJL-OFP-35S::GmSAMT1(SEQ ID NO:3)或pJL-OFP-35S::GmSABP2-1(SEQ ID NO:4)。
5.用如权利要求3或权利要求4所述的载体转化的一种分离的宿主细胞。
6.一种构建体，包含与一种启动子可操作地连接的如权利要求1所述的分离的核酸分子。
7.如权利要求6所述的构建体，其中该构建体赋予表达其的一种植物以一种农艺学性状。
8.如权利要求7所述的构建体，其中该农艺学性状包括害虫抗性。
9.如权利要求8所述的构建体，其中害虫抗性包括对大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，SCN)的抗性。
10.一种用如权利要求6至9中任一项所述的构建体稳定地转化的转基因植物。
11.一种如权利要求10所述的转基因植物的种子，其中该种子包含该构建体。
12.如权利要求10所述的转基因植物，该植物是一种大豆植物。
13.一种产生转基因植物的方法，包括将一种植物细胞或组织用如权利要求6至9中任一项所述的构建体转化。
14.一种增强植物中的害虫抗性的方法，包括将一种植物细胞或组织用如权利要求6至9中任一项所述的构建体转化，从而增强该植物中的害虫抗性。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中该植物是一种双子叶植物。
16.如权利要求13或14所述的方法，其中该植物是一种单子叶植物。
17.如权利要求14所述的方法，其中害虫抗性包括对大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，SCN)的抗性。
18.如权利要求14所述的转基因植物，该植物是一种大豆植物。
19.一种用如权利要求6至9中任一项所述的构建体转化的植物细胞或组织。
20.如权利要求19所述的植物细胞或组织，其中该植物细胞或组织来自一种双子叶植物。
21.如权利要求19所述的植物细胞或组织，其中该植物细胞或组织来源于一种单子叶植物。
22.一种植物细胞、果实、叶、根、芽、花、种子、插枝以及适用于有性或无性繁殖的其他繁殖材料、包括F1杂种的子代植物、雄性不育植物以及可来源于如权利要求10所述的转基因植物的所有其他植物和植物产品。
23.一种产生商用植物产品的方法，包括获得如10所述的植物或其一部分，其中该商用植物产品是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、大豆皮、粗粉、面粉或油，并且从其中产生该商用植物产品。
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