CN1040054A

CN1040054A - 具有生物活性的新化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN1040054A
Application number: CN89106081A
Authority: CN
Inventors: 奥原正国; 俊藤俊男; 堀康宏; 藤田隆; 上田博嗣; 重松伸治
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-07-26
Filing date: 1989-07-25
Publication date: 1990-02-28
Also published as: FI893359A; DE68909139D1; EP0352646A2; HU211514A9; JPH0285296A; EP0352646A3; CA1335083C; NO893021D0; ATE94561T1; US4977138A; NO893021L; JPH0764872B2; DE68909139T2; AU3829089A; DK366889A; ZA895121B; GB8817743D0; EP0352646B1; ES2058411T3; FI893359A0

Abstract

本发明涉及具有生物活性的FR901228物质、其制备方法及含有该物质的药用组合物。

Description

本发明涉及具有生物活性的新化合物，以下称此化合物为FR901228物质。更具体地说，本发明涉及具有生物活性的新物质FR901228，该物质具有抗微生物和抗肿瘤活性;本发明还涉及该物质的制备方法和含有该物质的药用组合物。

本发明的FR901228物质可通过能产生FR901228物质的菌株在营养培养基中发酵而制得，该菌株属于色杆菌属（Chromobacterium），如紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）WB968。

发酵方法详细说明如下：

（1）微生物：

用于生产FR901228物质的微生物的详细情况说明如下：

WB968菌株的分类研究：

WB968菌株是从日本山形县（Yamagata-ken）得到的土壤样品中分离出来的。

本分类研究主要应用《Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology》（第1卷）叙述的方法进行。

（ⅰ）形态特征

取在营养肉汤和琼脂中于30℃培养20小时的细胞用光学显微镜和电子显微镜进行WB968菌株的形态观察。

WB968菌株是一种革兰氏阴性的游动性细菌。细胞形状为杆状，大小约0.5-0.6×1.2-1.8μm。

结果示于表1。

表1 WB968菌株的形态特征

革兰氏染色阴性

菌落颜色淡橙色

细胞形状杆状

细胞大小 0.5-0.6×1.2-1.8μm

芽孢阴性

游动性阳性

鞭毛单极鞭毛

（ⅱ）生理特征

WB968菌株的生理特征总结于表2。生长温度范围从15℃到40℃。

WB968菌株是氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性、O-F试验发酵。酪蛋白水解、七叶苷水解为阴性。使葡萄糖、果糖和海藻糖发酵。吲哚试验为阴性。伏-普二氏试验为阴性。β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）为阴性。

表2 WB968菌株的生理特征

条件特征

生长温度 15-40℃

在空气中生长阳性

在无氯化钠的胨水中生长阳性

在6%氯化钠中生长阴性

在氰化钾肉汤中生长阳性

紫色素阴性

表2（续）

条件特征

过氧化氢酶阳性

氧化酶阳性

O-F试验发酵

由葡萄糖产气阴性

0/129敏感性（10，150μg）阴性

硝酸盐反应阳性

吐温80酯酶阳性

H₂S产生（TSI）阴性

吲哚阴性

MR 阴性

VP 阴性

西蒙氏柠檬酸盐阳性

ONPG试验阴性

脲酶阳性

DNA酶阳性

淀粉水解阴性

明胶液化阳性

酪蛋白水解阳性

七叶苷水解阴性

细胞溶素脱羧酶阴性

鸟氨酸脱羧酶阴性

精氨酸二水解酶（dihydrolase）阳性

表2（续）

条件特征

DNA的G+C含量 62.7摩尔%

主要细胞脂肪酸 C₁₆∶1

醌型 Q-8

由糖产酸

D-葡萄糖阳性

L-阿拉伯糖阴性

D-甘露糖醇阴性

D-果糖阳性

D-半乳糖阴性

D-山梨醇阴性

D-海藻糖阳性

蔗糖阴性

乳糖阴性

水杨苷阴性

麦芽糖阴性

纤维二糖阴性

（ⅲ）鉴定

根据上述特征，按照《Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology》（第1卷），WB968菌株被鉴定为紫色色杆菌。

紫色色杆菌WB968的菌种按照《布达佩斯条约》的规定于1988年7月20日保藏在Fermentation Research Inst-itute Agency of Industrial Science and Technology（日本305茨城筑波市东1丁目1-3号），编号为FERM BP-1968。

在这方面，在上述机构保藏WB968菌株时，该菌株曾被鉴定为气单胞菌（Aeromonas），但现在该菌株被鉴定为紫色色杆菌。（2）FR901228物质的生产：

生产本发明的FR901228物质的菌株属于色杆菌属（例如紫色色杆菌WB968）。在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基中，于有氧条件下（例如摇瓶培养和深层培养等）培养该菌株，则可生产本发明的FR901228物质。

营养培养基中优选的碳源是碳水化合物如葡萄糖、淀粉、果糖或甘油。

优选的氮源是肉汤、酵母提取物、胨、麸质粗粉、棉子粉、大豆粗粉、玉米浆、干酵母和麦胚等，以及无机和有机含氮化合物如铵盐（例如硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵等）、尿素或氨基酸。

碳源和氮源合并应用是有益的，但不必用纯品，因为含微量生长因子和相当量无机营养素的稍不纯的物质也适用。

需要时，可向培养基中加无机盐，例如碳酸钠或碳酸钙、磷酸钠或磷酸钾、氯化钠或氯化钾、碘化钠或碘化钾、镁盐、铜盐或钴盐。

如必要，特别是培养基剧烈地产生泡沫时，可加入消泡剂如液体石蜡、脂肪油、植物油、矿物油或硅酮。

与大量生产其他生物活性物质所应用的优选方法一样，大量生产FR901228物质时优选用深层有氧培养条件。

小量生产则采用摇瓶培养。

此外，在大罐中进行培养时，为了避免在生产FR901228物质过程中生长迟滞，最好用细菌营养细胞在生产罐中接种培养。因此，希望通过用细菌细胞接种较少量的培养基并培养接种后的培养基，首先生产细菌的营养细胞，然后将经过培养的营养细胞转移到大罐中。生产营养细胞的培养基与用于生产FR901228物质的培养基实质上可以相同或不同。

培养混合物的搅拌和通气可用各种方法完成。搅拌可利用螺旋桨式或类似的机械搅拌装置进行，也可通过旋转或振摇发酵罐、用各种泵装置或将消毒的空气通入培养基。通气可通过将消毒的空气通入发酵混合物来进行。

发酵通常在约10°～40℃，最好在25°～35℃进行，发酵时间约为15～50小时，但可随发酵条件和规模而不同。

发酵完全后，用各种常用的回收和纯化生物活性物质的方法从肉汤培养基中回收FR901228物质，例如用适当的溶剂或某些溶剂的混合物进行溶剂提取，用适当的溶剂或某些溶剂的混合物进行层析或重结晶。

一般来说，本发明的FR901228物质主要存在于细菌细胞中。但滤液中也含有FR901228物质。因此，最好用全部肉汤培养基直接分离FR901228物质，例如用适当的溶剂如热水、丙酮或乙酸乙酯或这些溶剂的混合物进行提取。

提取液用常规方法处理，得到FR901228物质，例如通过蒸发或蒸馏使提取液浓缩到较小的量，得到含有活性物质（即FR901228物质）的残余物，用常规纯化方法进行纯化，例如用适当的溶剂或某些溶剂的混合物进行层析或重结晶。

FR901228物质的理化性质：

按照上述发酵方法得到的FR901228物质具有如下理化性质。

外观：无色棱柱状

性质：中性物质

熔点：235-245℃（分解）

旋光率：〔α〕²³ _D：+39°（C＝1.0，CHCl₃）

分子式：C₂₄H₃₆N₄O₆S₂

元素分析：C₂₄H₃₆N₄O₆S₂·CH₃CN：

计算值：C，53.68;H，6.76;N，12.04;S，11.02（%）

实测值：C，53.68;H，6.71;N，11.80;S，11.09（%）

分子量：540.72

FAB-MS m/z 541（M+H）⁺

溶解度：

能溶于氯仿、乙酸乙酯

微溶于甲醇、乙醇

不溶于水、己烷

颜色反应：

阳性：硫酸铈反应、硫酸反应、碘蒸气反应

阴性：茚三酮反应、氯化铁反应、埃尔利希反应、莫利施反应薄层层析：

固定相展开溶剂 R_f值

硅胶板^＊二氯甲烷∶甲醇（10∶1） 0.65

^＊硅胶板 Kieselgel 60 F₂₅₄

（E.Merck生产）

紫外吸收光谱：末端吸收（在甲醇中）

红外吸收光谱：

ν^KBr _max＝3360，3320，2950，2910，1740，1690，1660，1650，1630，1520，1460，1440，1400，1390，1370，1350，1300，1250，1220，1170，1100，1040，1020，1000，980，910cm^-1，如附图1所示。

¹H核磁共振谱：

[CDCl₃-CD₃OD（10∶1），400MHz]

δ：8.41（1H，s，可交换的），8.25（1H，d，J＝4Hz，可交换的），7.80（1H，d，J＝6.5Hz，可交换的），7.66（1H，d，J＝8Hz，可交换的），6.31（1H，q，J＝7Hz），5.76（1H，m），5.70-5.63（2H，m），4.69（1H，m），4.51（1H，m），3.97（1H，dd，J＝6 and 4Hz），3.20-3.07（3H，m），2.95（1H，m），2.83（1H，dd，J＝14 and 1.5Hz），2.66（1H，dd，J＝14 and 6Hz），2.65-2.60（2H，m），2.37（1H，m），2.22（1H，m），1.72（3H，d，J＝6.5Hz），1.10（3H，d，J＝7Hz），1.08（3H，d，J＝7Hz），1.00（3H，d，J＝6.5Hz），0.97（3H，d，J＝7Hz）ppm，如附图2所示。

¹³C核磁共振谱：

（CDCl₃-CD₃OD（10∶1），100MHz）

δ：172.34（s），171.43（s），169.17（s），168.37（s），165.59（s），130.36（d），129.64（d），129.62（s），129.04（d），70.15（d），62.42（d），58.10（d），56.57（d），37.75（t），37.56（t），34.46（t），31.65（d），30.02（t），28.88（d），19.09（q），18.96（q），18.29（q），18.03（q），13.04（q）ppm，如附图3所示。

氨基酸分析：

FR901228物质（4mg）用6N盐酸（2ml）在密封管中于110℃水解20小时。混合物用自动氨基酸分析仪分析。对FR901228物质进行氨基酸分析的结果表明，存在缬氨酸和氨（缬氨酸和氨的比率为2∶1）。

由包括上述数据在内的理化性质的分析，和从FR901228物质衍生的某些衍生物的化学结构，证明FR901228物质具有如下化学式：

从FR901228物质衍生的衍生物：

从FR901228物质制备一些衍生物。

制备方法1

从FR901228物质衍生FR123392物质和FR125441物质。

向FR901228物质（54mg）的甲醇（2ml）溶液中加入1N氢氧化钠水溶液（200ml）。在室温下搅拌12小时后，加入氯化氢水溶液调节pH到1，用乙酸乙酯提取。经硫酸镁干燥后过滤，蒸发溶剂。将残余物溶解在甲醇中并加入三甲基甲硅烷基重氮甲烷（1ml）。5分钟后，加1滴乙酸，蒸除溶剂。残余物通过制备薄层层析纯化（0.5mm×2），用10%甲醇的氯仿溶液展开，得到FR123392物质（15mg）和FR125441物质（10mg）。

FR123392物质：

¹H核磁共振谱：

[CDCl₃-CD₃OD（10∶1），200MHz]

δ：0.98（12H，m），1.75（3H，d，J＝7Hz），2.0-2.9（10H，m），3.05（1H，dd，J＝4 and 14Hz），3.71（3H，s），4.13（1H，d，J＝8Hz），4.37（2H，m），4.57（1H，dd，J＝5 and 10Hz），5.6（2H，m），6.64（1H，q，J＝7Hz），7.48（1H，d，J＝10Hz）

红外吸收光谱：

ν^KBr _max＝3260，2920，2400，1720，1620，1510，1430，1260，1200，1010cm^-1

FAB-MS m/z 541（M+H）⁺

FR125441物质：

¹H核磁共振谱：

[CDCl₃-CD₃OD（10∶1），400MHz]

δ：0.95（12H，m），1.76（3H，d，J＝7Hz），2.20（1H，m），2.35（3H，m），2.7（4H，m），2.98（1H，dd，J＝13 and 8Hz），3.08（1H，dd，J＝13 and 4.5Hz），3.72（3H，s），4.14（1H，d，J＝6Hz），4.35（1H，d，J＝7Hz），4.43（2H，m），5.67（1H，dd，J＝6 and 15Hz），5.78（1H，dt，J＝15 and 6Hz），6.70（1H，q，J＝7Hz）

FAB-MS m/z 573（M+H）⁺

制备方法2

从FR125441物质衍生FR123393物质。

向FR125441物质（10mg）的吡啶（0.8ml）溶液中加入乙酸酐（0.4ml）。在室温下搅拌12小时后，蒸除溶剂。残余物进行制备薄层层析（0.5mm×1），用5%甲醇的氯仿溶液展开，得到FR123393物质（10mg）。

FR123393物质：

¹H核磁共振谱：

[CDCl₃-CD₃OD（10∶1），200MHz]

δ：1.0（12H，m），1.75（3H，d，J＝7Hz），2.05（3H，s），1.9-3.3（10H，m），3.70（3H，s），4.20（1H，d，J＝8Hz），4.34（1H，d，J＝7Hz），4.84（1H，m），5.5（2H，m），5.84（1H，dt，J＝15 and 7Hz），6.65（1H，q，J＝7Hz）

红外吸收光谱：

ν^KBr _max＝3280，2950，2430，1720，1630，1500，1425，1360，1225，1010，960cm^-1

FAB-MS m/z 615（M+H）⁺

制备方法3

从FR901228物质衍生FR123395物质。

向FR901228物质（54mg）的二噁烷（2ml）溶液中加入三苯膦（55mg）。在室温下搅拌72小时后真空除去溶剂。残余物进行制备薄层层析（0.5mm×2），用2%甲醇的氯仿溶液展开，得到FR123395物质（10mg）。

FR123395物质：

¹H核磁共振谱：

[CDCl₃-CD₃OD（10∶1），200MHz]

δ：1.0（12H，m），1.5（1H，m），1.85（3H，d，J＝7Hz），2.1

-3.1（9H，m），3.90（1H，d，J＝8Hz），4.45（1H，d，J＝7Hz），5.65-6.0（4H，m），6.24（1H，q，J＝7Hz）

红外吸收光谱：

ν^KBr _max＝3300，2920，2470，1730，1640，1500，1420cm^-1

FR901228物质的生物学性质

以下给出一些生物实验数据，以举例证明FR901228物质的生物活性。

试验1

FR901228的抗微生物活性

FR901228的抗微生物活性试验以琼脂稀释法在萨布罗氏培养基中进行。

在25℃培养48小时后的最小抑制浓度（MIC）以μg/ml表示。结果示于表3。

表3 FR901228物质的抗微生物活性

微生物最小抑制浓度（μg/ml）

粟酒裂殖酵母 10

出芽短梗霉IFO4466 10

黑曲霉 100

试验2

在体外FR901228物质对人肿瘤细胞生长的抑制作用

细胞毒性试验在微量滴定板中进行，每孔含3×10³个肿瘤细胞，培养基为100μl添加了10%胎牛血清、青霉素（50单位/ml）和链霉素（50μg/ml）的Dulbecco氏基本必需培养基。细胞在37℃下培养4天，按照Mosmann所述的方法（J.Immunol.Methods，65：55-63，1983）进行MTT〔3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物，由Sigma生产〕比色试验。MTT以5mg/ml溶解在磷酸盐缓冲液（PBS）中，过滤灭菌，除去少量不溶的残渣。人肿瘤细胞培养结束后，将此MTT溶液（每100μl培养基加10μl）加到每个试验孔中，微量滴定板在37℃下再培养4小时。将酸-异丙醇（100μl 0.04NHCl的异丙醇溶液）加到所有的孔中，充分混合使深蓝色结晶溶解。待所有结晶都溶解后，用双波长微量滴定板光度计（MTP-22型;Corona Electric Co.，Ltd，Katsuta，Japan）在550nm处进行测量，参考波长为660nm。将本发明的目的化合物溶解在甲醇中，以Dulbecco氏基本必需培养液稀释，并加到培养物中使终浓度为1μg/ml或更低。结果示于表4。

表4 在体外FR901228物质对人肿瘤细胞生长的抑制作用

人肿瘤细胞系 IC₅₀（ng/ml）

A549（肺癌） 0.82

MCF-7（乳房癌） 0.99

SW480（结肠癌） 0.57

试验3

FR901228物质对P388鼠白血病的抗肿瘤活性

在鼠肿瘤系统中测定FR901228物质的抗肿瘤活性。将P388白血病细胞（1×10⁶个）经腹膜内移入BDF₁小鼠（雌性，8周龄）体内。接种肿瘤细胞24小时后，将FR901228物质经腹膜内给予小鼠。再经腹膜内给予FR901228物质3天，每天1次。FR901228物质是悬浮在0.9%盐水中。对照组小鼠经腹膜内给予0.9%盐水。

结果示于表5。抗肿瘤活性以各组的平均存活时间表示，也可以用T/C%（ (治疗组平均存活时间)/(对照组平均存活时间) ×100）表示。

表5 FR901228物质对P388鼠白血病的抗肿瘤活性

剂量 n 平均存活时间 T/C

（mg/kg/天）（天）（%）

对照 4 9.0 100

1.0 4 15.25 169.4

0.32 4 14.25 158.3

试验4

FR901228物质的急性毒性

BDF₁小鼠经腹膜内注射FR901228物质的急性毒性为5.6mg/kg。

以上试验结果表明，FR901228物质具有生物活性。

本发明的药用组合物可按药物制剂的形式（例如固体、半固体或液体）应用，药用组合物含有FR901228物质（作为有效成分）与适于外用、口服或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂的混合物。例如，有效成分可以与通常无毒的、药学上可接受的载体混合制成片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、乳剂、混悬剂以及任何其他适于应用的形式。另外，如果必要，可以应用辅料、稳定剂、增稠剂、着色剂及香精。FR901228物质可以按足够的量加在药用组合物中，以便对不同病程和病情产生所希望的抗肿瘤效果。

组合物应用于人时，最好是静脉给药、肌肉给药或口服给药。FR901228物质在治疗上的有效剂量取决于各个需治疗的患者的病情和年龄，但用于治疗肿瘤时，静脉给予FR901228物质的日剂量为0.1-100mg/kg体重;肌肉给予FR901228物质的日剂量为0.1-100mg/kg体重;口服给予FR901228物质的日剂量为0.1-100mg/kg体重。

从FR901228物质得到的上述衍生物也具有抗肿瘤活性。

列举下面一些实例对本发明作更详细的说明。

实例1

发酵

将含葡萄糖（1%）和肉汤（1%）的培养基（160ml）倒入各个500ml的锥形瓶中，120℃灭菌30分钟。将一环紫色色杆菌WB968斜面培养物接种于每个培养基中，在旋转摇床上于30℃培养24小时。将产生的培养物接种于预先在120℃灭菌30分钟的12个30升发酵罐内的培养基（15升）中，该培养基中含有葡萄糖（1%）、肉汤（1%）和Adekanol（消泡剂，商标，Asahi Denka Kogyo公司生产）（0.05%）。在每分钟通气20升、以200rpm搅拌的条件下，于30℃下培养24小时。

分离和纯化：

培养结束后，每个发酵罐于120℃灭菌30分钟。这样得到的肉汤培养基用硅藻土（10kg）助滤。滤液（150升）用乙酸乙酯（150升）提取二次。提取液减压蒸发得到油状残余物。将油状残余物与500g硅胶（Kiesel Gel 60，70-230目，E.Merck生产）混合，将混合物在甲醇中制成浆状物。蒸发除去溶剂后，将得到的干粉进行柱层析，柱中装有同样的硅胶，用该硅胶（0.5升）与正己烷一起装柱。层析柱用正己烷（2升）、正己烷和乙酸乙酯混合物（3∶1 V/V，3升;1∶1V/V，3升;1∶2 V/V，3升）以及乙酸乙酯（5升）展开。收集含有目的化合物的部分，减压浓缩，得到微黄色粉状物FR901228物质。将此粉状物溶解在二氯甲烷和甲醇的混合物（10∶1V/V，10ml）中。向此溶液中加入乙腈（20ml）。室温下放置，得到纯化的FR901228物质（920mg），为无色结晶。

Claims

1、具有下式的FR901228物质。

2、一种生产FR901228物质的方法，该方法包括，在有氧条件下，在含水营养培养基中培养能够产生FR901228物质的、属于色杆菌属的菌株，并回收FR901228物质。

3、一种按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色杆菌菌株是紫色色杆菌WB968（FERM BP-1968）。

4、一种生物学上纯净的紫色色杆菌WB968（FERM BP-1968）菌种。

5、一种药用组合物，该组合物含有作为有效成分的FR901228物质和一种无毒药用载体。